CN106018580A - 一种测定血浆中skullcapflavone II浓度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种测定血浆中5,2`‑二羟基,6,7,8,5`‑四甲氧基黄酮(skullcapflavone II)浓度的方法,采用液质联用***测定,先取待测样品,加入一定量的有机溶剂进行药物液液提取,预处理后,经色谱柱分离,用质谱检测器检测,本发明方法快速、准确、灵敏度高、操作简便,适合于测定血浆中skullcapflavone‑II的浓度。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域,具体涉及一种测定血浆中5,2`-二羟基,6,7,8,5`-四甲氧基黄酮(skullcapflavone II)浓度的方法。
背景技术
Skullcapflavone-II,即5,2`-二羟基,6,7,8,5`-四甲氧基黄酮,是从药用植物黄芩中分离得到的黄酮类新化合物。SKullcapflavone-II具有对抗炎症、病毒和免疫调节的作用。此外,许多成分有止痒、调节代谢紊乱、神经保护、促进血管新生、抗癌和抗HIV的作用。Skullcapflavone-II具有多种生物学特性,如细胞毒性的假定作用,对肥大细胞组胺释放的影响,通过胰蛋白酶抑制纤溶酶原激活物1型升高抑制剂和抗哮喘气道炎症反应。
其结构式如下:
目前尚未关于Skullcapflavone-II体内测定方法的文献报道。本发明建立了Skullcapflavone-II在beagle犬体内的测定方法,通过该方法对Skullcapflavone-II的药物代谢情况进行探索性研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是建立一种准确高效测定血浆中skullcapflavone-II浓度的方法。
为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案如下:
一种测定血浆中skullcapflavone-II浓度的方法,血浆样品经预处理后经液质联用***检测其浓度,具体方法包括如下步骤:
(1)血浆样品预处理:取血浆样品,加入内标新补骨脂异黄酮,加入一定量的乙酸乙酯进行有机溶剂萃取,取上清液在40℃氮气吹干后,用流动相溶解后进样分析;
(2)将步骤(1)预处理后的血浆样品进行液相色谱分离:色谱条件中色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18柱;流动相:体积比为80∶20的乙腈与水;流速:0.2mL·min-1; 柱温:40℃;洗脱方式为等度洗脱;
(3)质谱测定,条件为:
离子源:电喷雾离子化电离源ESI;离子检测方式:多反应监测MRM;离子极性:正离子;skullcapflavone-II碰撞电压23eV;内标新补骨脂异黄酮碰撞电压29eV;毛细管电压4.5kV;气帘气Curtain gas:20psi;离子源Gas1:70psi;离子源Gas2:80psi;脱溶剂温度:400℃;CXP:9V;碰撞气CAD:10V;DP:100V;EP:10V。检测对象的离子通道:skullcapflavone-II m/z 375.1→345.1,内标新补骨脂异黄酮m/z 323.3→255.1
(4)计算:采用内标法,以skullcapflavone-II和内标新补骨脂异黄酮的峰面积比值代入标准曲线方程计算skullcapflavone-II的浓度。
具体地,步骤(1)中,取血浆样品500μL,加入100ng·mL-1内标新补骨脂异黄酮20μL,加入4mL乙酸乙酯,震荡3min后3500×g离心10min,取上清液3.5mL在40℃氮气吹干后,用100μL流动相溶解后,10μL进样分析。
步骤(2)中,色谱柱长度为150mm,内径为2.1mm,填料粒径为5μm。
其中,所述的血浆为给予了含skullcapflavone-II药物的血浆。
在一个具体的实施方案中,所述血浆为人或动物的血浆。
在一个具体的实施方案中,所述血浆为犬血浆。所述的犬为beagle犬。
有益效果:本发明方法与现有技术相比具有如下优势:
(1)预处理方法简便:使用有机溶剂液页萃取法,适用于常规测定。
(2)专属性强:采用Agilem ZORBAX SB-C18色谱柱作为固定相,乙腈和水的混合液作为流动相,等度洗脱,Skullcapflavone-II保留时间为3.09min左右,内标新补骨脂异黄酮保留时间为2.88min左右,4.5min完成测定,内源性物质不干扰二者的测定。
(3)灵敏度高:血浆最低定量限为1ng·mL-1。
(4)本发明方法快速、准确、灵敏度高、操作简便,为Skullcapflavone-II的血药浓度测定提供依据,具有新药开发的前景。本方法的血浆标准曲线线性范围为1~4000ng·mL-1,日内和日间精密度RSD均小于10%。
附图说明
图1为犬空白血浆的质谱图;
图2为犬空白血浆加入Skullcapflavone-II和内标对照品的质谱图;
图3为犬给予Skullcapflavone-II后血浆样品再加入内标对照品的的质谱图;
注:图中离子通道1为Skullcapflavone-II,[M-H]+,m/z 375.1→345.1,保留时间为3.09min左右;离子选择通道2为内标新补骨脂异黄酮,[M-H]+,m/z 323.3→255.1,保留时间为2.88min左右。
具体实施方式
根据下述实施例,可以更好地理解本发明。然而,本领域的技术人员容易理解,实施例所描述的内容仅用于说明本发明,而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例:犬血浆中Skullcapflavone-II浓度的测定
一、实验材料与仪器
skullcapflavone-II:由泽朗医药集团提供(南京,中国);新补骨脂异黄酮(内标):购于国家药品生物制品检定所购买(北京,中国);试验用水:超纯水;甲醇:色谱纯(Merck Company)。
Agilent ZORBAX SB-C18柱(150mm×2.1mm I.D.,5μm,Agilent Technologies,Wilmington,DE,USA);API4000 LC-MS/MS三重四级杆质谱仪(美国AB有限公司),色谱工作站为Analyst 1.4.2;CPA225D电子分析天平(德国赛多利斯有限公司);WH-2微型旋涡混合仪(上海沪西分析仪器厂);Milli-Q***纯水机(微孔,贝德福德,MA,USA);Biofuge PrimoR冷冻高速离心机(德国Heraeus公司)。
二、液质条件
1.液相色谱条件
色谱柱:Agilent ZORBAX SB-C18柱(150mm×2.1mm I.D.,5μm,Agilent Technologies,Wilmington,DE,USA);流动相:乙腈和水溶液(80∶20,v/v);流速:0.2mL·min-1;柱温:40℃。
2.质谱条件
离子源:电喷雾离子化电离源ESI;离子检测方式:多反应监测MRM;离子极性:正离子;skullcapflavone-II碰撞电压23eV;内标新补骨脂异黄酮碰撞电压29eV;毛细管电压4.5kV;Curtain gas:20;Gasl:70;Gas2:80;脱溶剂温度:400℃;CXP:9;CAD:10;DP:100;EP:10。检测对象的离子通道:skullcapflavone-II m/z 375.1→345.1,内标新补骨脂异黄酮m/z 323.3→255.1。
三、实验过程:
1.Skullcapflavone-II标准溶液的配制:
精密称取Skullcapflavone-II 10.08mg,置于10mL容量瓶中,加入甲醇溶解并定容至刻度,摇匀,即得1.008mg·mL-1Skullcapflavone-II的储备液。精密量取适量储备液以甲醇依次稀释,配成浓度分别为1,5,10,50,100,500,1000,4000ng·mL-1的Skullcapflavone-II标准溶液。
2.beagle犬血浆样品的采集与处理:
beagle犬静脉注射Skullcapflavone-II溶液,给药量为5mg·kg-1,于注射前及注射后5,10,15,30,45min和1,1.5,2,3,4,6,8,12h静脉采血1mL,注入肝素管内,3000rpm离心10min,制备血浆。取beagle犬血浆500μL,加入100ng·mL-1内标新补骨脂异黄酮20μL,加入4mL乙酸乙酯,震荡3min后3500×g离心10min,取上清液3.5mL在40℃氮气吹干后,用100μL流动相溶解后,10μL进样分析。
3.专属性:
取没有给予过Skullcapflavone-II的beagle犬空白血浆500μL,加入4mL乙酸乙酯,震荡3min后3500×g离心10min,取上清液3.5mL在40℃氮气吹干后,用100μL流动相溶解后,10μL进样分析。
取离心管数支,加入Skullcapflavone-II标准溶液10μL,40℃氮气吹干,加入没有给予过Skullcapflavone-II的beagle犬空白血浆500μL,旋涡30s混匀,加入新补骨脂异黄酮(内标,100ng.mL-1)10μL,加入4mL乙酸乙酯,震荡3min后3500×g离心10min,取上清液3.5mL在40℃氮气吹干后,用100μL流动相溶解后,10μL进样分析。
结果显示,在本实验所采用的LC-MS/MS条件下,血浆样品无杂峰对检测组分造成干扰,Skullcapflavone-II保留时间在3.09min左右,内标补骨脂异黄酮保留时间在2.88min左右。Skullcapflavone-II和内标互不干扰,峰形良好,基线平稳。
4.线性试验
beagle犬血浆标准曲线:取离心管数支,分别精密加入不同浓度的Skullcapflavone-II标准溶液10μL,40℃氮气吹干,加入没有给予过Skullcapflavone-II的空白血浆500μL旋涡30s混匀,配成含Skullcapflavone-II的浓度分别为0.001,0.005,0.01,0.05,0.1,0.5,1,4μg/mL的含药血浆。加入新补骨脂异黄酮(内标,100ng·mL-1)10μL,加入4mL乙酸乙酯,震荡3min后3500×g离心10min,取上清液3.5mL在40℃氮气吹干后,用 100μL流动相溶解后,10μL进样分析。计算Skullcapflavone-II和内标峰面积的比值Y,以峰面积比值Y对血药浓度X作回归计算,得回归方程:Y=(0.00171±0.00035)X+(0.00067±0.00029)(n=5),Skullcapflavone-II血浆浓度在1~4000ng·mL-1范围内线性关系良好。最低定量限为1ng·mL-1。
5.准确度和精密度
按照beagle犬血浆标准曲线方法配制含Skullcapflavone-II浓度为0.002,0.02and2μg/mL的低、中、高的含Skullcapflavone-II血浆样品,按“beagle犬血浆样品的处理”处理方法分别处理。连续做3天,每天每个浓度各做5份样品,计算Skullcapflavone-II峰面积As和内标峰面积Ai的比值f,代入当天的血浆标准曲线中求得Skullcapflavone-II实测浓度,由实测浓度计算日内、日间精密度和相对标准偏差(RSD),实测浓度与加入浓度的比值即为准确度。结果显示,日内和日间精密度RSD均小于10%,准确度符合要求。
6.测定结果
上述6只给予过Skullcapflavone-II的beagle犬血浆中Skullcapflavone-II含量(给药后5min)分别为2.17、2.04、2.35、2.23、2.19、2.24μg/mL。
本发明通过采用Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱作为固定相,乙腈和水的混合液作为流动相,等度洗脱,Skullcapflavone-II保留时间为3.09min左右,内标新补骨脂异黄酮保留时间为2.88min左右,4.5min完成测定,内源性物质不干扰二者的测定,同时预处理方法简便;使用有机溶剂液页萃取法,适用于常规测定;灵敏度高,血浆最低定量限为1ng·mL-1,且本发明方法快速、准确、灵敏度高、操作简便,为Skullcapflavone-II的血药浓度测定提供依据,具有新药开发的前景。本方法的血浆标准曲线线性范围为1~4000ng·mL-1,日内和日间精密度RSD均小于10%。
Claims (6)
1.一种测定血浆中skullcapflavone II浓度的方法,其特征在于,血浆样品经预处理后经液质联用***检测其浓度,具体方法包括如下步骤:
(1)血浆样品预处理:取血浆样品,加入内标新补骨脂异黄酮,加入一定量的乙酸乙酯进行有机溶剂萃取,取上清液氮气吹干后,用流动相溶解得到预处理后的血浆样品;
(2)将步骤(1)预处理后的血浆样品进行液相色谱分离:色谱条件中,色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18柱;流动相为体积比为80∶20的乙腈与水;流速为0.2-0.5mL·min-1;柱温为40℃;洗脱方式为等度洗脱;
(3)质谱测定,条件为:
离子源:电喷雾离子化电离源ESI;离子检测方式:多反应监测MRM;离子极性:正离子;skullcapflavone-II碰撞电压23eV;内标新补骨脂异黄酮碰撞电压29eV;毛细管电压4.5kV;气帘气Curtain gas:20psi;离子源Gas1:70psi;离子源Gas2:80psi;脱溶剂温度:400℃;CXP:9V;CAD:10V;DP:100V;EP:10V,检测对象的离子通道:skullcapflavone-II m/z 375.1→345.1,内标新补骨脂异黄酮m/z 323.3→255.1
(4)计算:采用内标法,以skullcapflavone-II和内标新补骨脂异黄酮的峰面积比值代入标准曲线方程计算skullcapflavone-II的浓度。
2.根据权利要求1所述的测定血浆中skullcapflavone-II浓度的方法,其特征在于,步骤(1)中,取血浆样品500μL,加入100ng·mL-1内标新补骨脂异黄酮20μL,加入4mL乙酸乙酯,震荡3min后3500×g离心10min,取上清液3.5mL在40℃氮气吹干后,用100μL流动相溶解后,10μL进样分析。
3.根据权利要求1所述的测定血浆中skullcapflavone-II浓度的方法,其特征在于,步骤(2)中,色谱柱长度为150mm,内径为2.1mm,填料粒径为5μm。
4.根据权利要求1所述的测定血浆中skullcapflavone-II浓度的方法,其特征在于,所述的血浆为给予了含skullcapflavone-II药物的血浆。
5.根据权利要求1所述的测定血浆中skullcapflavone-II浓度的方法,其特征在于,所述血浆为人或动物的血浆。
6.根据权利要求1所述的测定血浆中skullcapflavone-II浓度的方法,其特征在于,所述血浆为犬血浆。
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109444301A (zh) * | 2018-12-18 | 2019-03-08 | 江苏省中医院 | 一种测定血浆中普芦卡必利浓度的方法 |
CN109633039A (zh) * | 2019-02-03 | 2019-04-16 | 北京中医药大学 | 生物样品中羟基多甲氧基黄酮化合物及其代谢产物的检测方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1395573A (zh) * | 2000-01-11 | 2003-02-05 | 比奥雷克斯健康有限公司 | 类黄酮的提取方法 |
KR20130120849A (ko) * | 2012-04-26 | 2013-11-05 | 한국생명공학연구원 | 스컬캅플라본ⅱ 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 천식의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 |
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Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1395573A (zh) * | 2000-01-11 | 2003-02-05 | 比奥雷克斯健康有限公司 | 类黄酮的提取方法 |
KR20130120849A (ko) * | 2012-04-26 | 2013-11-05 | 한국생명공학연구원 | 스컬캅플라본ⅱ 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 천식의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
HA-YOUNG JANG ET AL.: "Skullcapflavone II inhibits ovalbumin-induced airway inflammation in a mouse model of asthma", 《INTERNATIONAL IMMUNOPHARMACOLOGY》 * |
陈佩东 等: "黄芩中黄酮类成分的分离鉴定及其体外对凝血***的影响", 《中草药》 * |
黄勇 等: "UPLC-MS/MS法同时测定家兔血浆中6个黄酮类成分及其药代动力学研究", 《药物分析杂志》 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109444301A (zh) * | 2018-12-18 | 2019-03-08 | 江苏省中医院 | 一种测定血浆中普芦卡必利浓度的方法 |
CN109633039A (zh) * | 2019-02-03 | 2019-04-16 | 北京中医药大学 | 生物样品中羟基多甲氧基黄酮化合物及其代谢产物的检测方法 |
CN109633039B (zh) * | 2019-02-03 | 2021-09-10 | 北京中医药大学 | 生物样品中羟基多甲氧基黄酮化合物及其代谢产物的检测方法 |
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