CN106018580A - 一种测定血浆中skullcapflavone II浓度的方法 - Google Patents

一种测定血浆中skullcapflavone II浓度的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种测定血浆中5，2`‑二羟基，6，7，8，5`‑四甲氧基黄酮(skullcapflavone II)浓度的方法，采用液质联用***测定，先取待测样品，加入一定量的有机溶剂进行药物液液提取，预处理后，经色谱柱分离，用质谱检测器检测，本发明方法快速、准确、灵敏度高、操作简便，适合于测定血浆中skullcapflavone‑II的浓度。

Description

一种测定血浆中skullcapflavone II浓度的方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种测定血浆中5，2`-二羟基，6，7，8，5`-四甲氧基黄酮(skullcapflavone II)浓度的方法。
背景技术
Skullcapflavone-II，即5，2`-二羟基，6，7，8，5`-四甲氧基黄酮，是从药用植物黄芩中分离得到的黄酮类新化合物。SKullcapflavone-II具有对抗炎症、病毒和免疫调节的作用。此外，许多成分有止痒、调节代谢紊乱、神经保护、促进血管新生、抗癌和抗HIV的作用。Skullcapflavone-II具有多种生物学特性，如细胞毒性的假定作用，对肥大细胞组胺释放的影响，通过胰蛋白酶抑制纤溶酶原激活物1型升高抑制剂和抗哮喘气道炎症反应。
其结构式如下：
目前尚未关于Skullcapflavone-II体内测定方法的文献报道。本发明建立了Skullcapflavone-II在beagle犬体内的测定方法，通过该方法对Skullcapflavone-II的药物代谢情况进行探索性研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是建立一种准确高效测定血浆中skullcapflavone-II浓度的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种测定血浆中skullcapflavone-II浓度的方法，血浆样品经预处理后经液质联用***检测其浓度，具体方法包括如下步骤：
(1)血浆样品预处理：取血浆样品，加入内标新补骨脂异黄酮，加入一定量的乙酸乙酯进行有机溶剂萃取，取上清液在40℃氮气吹干后，用流动相溶解后进样分析；
(2)将步骤(1)预处理后的血浆样品进行液相色谱分离：色谱条件中色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18柱；流动相：体积比为80∶20的乙腈与水；流速：0.2mL·min-1； 柱温：40℃；洗脱方式为等度洗脱；
(3)质谱测定，条件为：
离子源：电喷雾离子化电离源ESI；离子检测方式：多反应监测MRM；离子极性：正离子；skullcapflavone-II碰撞电压23eV；内标新补骨脂异黄酮碰撞电压29eV；毛细管电压4.5kV；气帘气Curtain gas：20psi；离子源Gas1：70psi；离子源Gas2：80psi；脱溶剂温度：400℃；CXP：9V；碰撞气CAD：10V；DP：100V；EP：10V。检测对象的离子通道：skullcapflavone-II m/z 375.1→345.1，内标新补骨脂异黄酮m/z 323.3→255.1
(4)计算：采用内标法，以skullcapflavone-II和内标新补骨脂异黄酮的峰面积比值代入标准曲线方程计算skullcapflavone-II的浓度。
具体地，步骤(1)中，取血浆样品500μL，加入100ng·mL-1内标新补骨脂异黄酮20μL，加入4mL乙酸乙酯，震荡3min后3500×g离心10min，取上清液3.5mL在40℃氮气吹干后，用100μL流动相溶解后，10μL进样分析。
步骤(2)中，色谱柱长度为150mm，内径为2.1mm，填料粒径为5μm。
其中，所述的血浆为给予了含skullcapflavone-II药物的血浆。
在一个具体的实施方案中，所述血浆为人或动物的血浆。
在一个具体的实施方案中，所述血浆为犬血浆。所述的犬为beagle犬。
有益效果：本发明方法与现有技术相比具有如下优势：
(1)预处理方法简便：使用有机溶剂液页萃取法，适用于常规测定。
(2)专属性强：采用Agilem ZORBAX SB-C18色谱柱作为固定相，乙腈和水的混合液作为流动相，等度洗脱，Skullcapflavone-II保留时间为3.09min左右，内标新补骨脂异黄酮保留时间为2.88min左右，4.5min完成测定，内源性物质不干扰二者的测定。
(3)灵敏度高：血浆最低定量限为1ng·mL-1。
(4)本发明方法快速、准确、灵敏度高、操作简便，为Skullcapflavone-II的血药浓度测定提供依据，具有新药开发的前景。本方法的血浆标准曲线线性范围为1～4000ng·mL-1，日内和日间精密度RSD均小于10％。
附图说明
图1为犬空白血浆的质谱图；
图2为犬空白血浆加入Skullcapflavone-II和内标对照品的质谱图；
图3为犬给予Skullcapflavone-II后血浆样品再加入内标对照品的的质谱图；
注：图中离子通道1为Skullcapflavone-II，[M-H]+，m/z 375.1→345.1，保留时间为3.09min左右；离子选择通道2为内标新补骨脂异黄酮，[M-H]+，m/z 323.3→255.1，保留时间为2.88min左右。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例：犬血浆中Skullcapflavone-II浓度的测定
一、实验材料与仪器
skullcapflavone-II：由泽朗医药集团提供(南京，中国)；新补骨脂异黄酮(内标)：购于国家药品生物制品检定所购买(北京，中国)；试验用水：超纯水；甲醇：色谱纯(Merck Company)。
Agilent ZORBAX SB-C18柱(150mm×2.1mm I.D.，5μm，Agilent Technologies，Wilmington，DE，USA)；API4000 LC-MS/MS三重四级杆质谱仪(美国AB有限公司)，色谱工作站为Analyst 1.4.2；CPA225D电子分析天平(德国赛多利斯有限公司)；WH-2微型旋涡混合仪(上海沪西分析仪器厂)；Milli-Q***纯水机(微孔，贝德福德，MA，USA)；Biofuge PrimoR冷冻高速离心机(德国Heraeus公司)。
二、液质条件
1.液相色谱条件
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱(150mm×2.1mm I.D.，5μm，Agilent Technologies，Wilmington，DE，USA)；流动相：乙腈和水溶液(80∶20，v/v)；流速：0.2mL·min-1；柱温：40℃。
2.质谱条件
离子源：电喷雾离子化电离源ESI；离子检测方式：多反应监测MRM；离子极性：正离子；skullcapflavone-II碰撞电压23eV；内标新补骨脂异黄酮碰撞电压29eV；毛细管电压4.5kV；Curtain gas：20；Gasl：70；Gas2：80；脱溶剂温度：400℃；CXP：9；CAD：10；DP：100；EP：10。检测对象的离子通道：skullcapflavone-II m/z 375.1→345.1，内标新补骨脂异黄酮m/z 323.3→255.1。
三、实验过程：
1.Skullcapflavone-II标准溶液的配制：
精密称取Skullcapflavone-II 10.08mg，置于10mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得1.008mg·mL-1Skullcapflavone-II的储备液。精密量取适量储备液以甲醇依次稀释，配成浓度分别为1，5，10，50，100，500，1000，4000ng·mL-1的Skullcapflavone-II标准溶液。
2.beagle犬血浆样品的采集与处理：
beagle犬静脉注射Skullcapflavone-II溶液，给药量为5mg·kg-1，于注射前及注射后5，10，15，30，45min和1，1.5，2，3，4，6，8，12h静脉采血1mL，注入肝素管内，3000rpm离心10min，制备血浆。取beagle犬血浆500μL，加入100ng·mL-1内标新补骨脂异黄酮20μL，加入4mL乙酸乙酯，震荡3min后3500×g离心10min，取上清液3.5mL在40℃氮气吹干后，用100μL流动相溶解后，10μL进样分析。
3.专属性：
取没有给予过Skullcapflavone-II的beagle犬空白血浆500μL，加入4mL乙酸乙酯，震荡3min后3500×g离心10min，取上清液3.5mL在40℃氮气吹干后，用100μL流动相溶解后，10μL进样分析。
取离心管数支，加入Skullcapflavone-II标准溶液10μL，40℃氮气吹干，加入没有给予过Skullcapflavone-II的beagle犬空白血浆500μL，旋涡30s混匀，加入新补骨脂异黄酮(内标，100ng.mL-1)10μL，加入4mL乙酸乙酯，震荡3min后3500×g离心10min，取上清液3.5mL在40℃氮气吹干后，用100μL流动相溶解后，10μL进样分析。
结果显示，在本实验所采用的LC-MS/MS条件下，血浆样品无杂峰对检测组分造成干扰，Skullcapflavone-II保留时间在3.09min左右，内标补骨脂异黄酮保留时间在2.88min左右。Skullcapflavone-II和内标互不干扰，峰形良好，基线平稳。
4.线性试验
beagle犬血浆标准曲线：取离心管数支，分别精密加入不同浓度的Skullcapflavone-II标准溶液10μL，40℃氮气吹干，加入没有给予过Skullcapflavone-II的空白血浆500μL旋涡30s混匀，配成含Skullcapflavone-II的浓度分别为0.001，0.005，0.01，0.05，0.1，0.5，1，4μg/mL的含药血浆。加入新补骨脂异黄酮(内标，100ng·mL-1)10μL，加入4mL乙酸乙酯，震荡3min后3500×g离心10min，取上清液3.5mL在40℃氮气吹干后，用 100μL流动相溶解后，10μL进样分析。计算Skullcapflavone-II和内标峰面积的比值Y，以峰面积比值Y对血药浓度X作回归计算，得回归方程：Y＝(0.00171±0.00035)X+(0.00067±0.00029)(n＝5)，Skullcapflavone-II血浆浓度在1～4000ng·mL-1范围内线性关系良好。最低定量限为1ng·mL-1。
5.准确度和精密度
按照beagle犬血浆标准曲线方法配制含Skullcapflavone-II浓度为0.002，0.02and2μg/mL的低、中、高的含Skullcapflavone-II血浆样品，按“beagle犬血浆样品的处理”处理方法分别处理。连续做3天，每天每个浓度各做5份样品，计算Skullcapflavone-II峰面积As和内标峰面积Ai的比值f，代入当天的血浆标准曲线中求得Skullcapflavone-II实测浓度，由实测浓度计算日内、日间精密度和相对标准偏差(RSD)，实测浓度与加入浓度的比值即为准确度。结果显示，日内和日间精密度RSD均小于10％，准确度符合要求。
6.测定结果
上述6只给予过Skullcapflavone-II的beagle犬血浆中Skullcapflavone-II含量(给药后5min)分别为2.17、2.04、2.35、2.23、2.19、2.24μg/mL。
本发明通过采用Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱作为固定相，乙腈和水的混合液作为流动相，等度洗脱，Skullcapflavone-II保留时间为3.09min左右，内标新补骨脂异黄酮保留时间为2.88min左右，4.5min完成测定，内源性物质不干扰二者的测定，同时预处理方法简便；使用有机溶剂液页萃取法，适用于常规测定；灵敏度高，血浆最低定量限为1ng·mL-1，且本发明方法快速、准确、灵敏度高、操作简便，为Skullcapflavone-II的血药浓度测定提供依据，具有新药开发的前景。本方法的血浆标准曲线线性范围为1～4000ng·mL-1，日内和日间精密度RSD均小于10％。

Claims (6)

1.一种测定血浆中skullcapflavone II浓度的方法，其特征在于，血浆样品经预处理后经液质联用***检测其浓度，具体方法包括如下步骤：
(1)血浆样品预处理：取血浆样品，加入内标新补骨脂异黄酮，加入一定量的乙酸乙酯进行有机溶剂萃取，取上清液氮气吹干后，用流动相溶解得到预处理后的血浆样品；
(2)将步骤(1)预处理后的血浆样品进行液相色谱分离：色谱条件中，色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18柱；流动相为体积比为80∶20的乙腈与水；流速为0.2-0.5mL·min-1；柱温为40℃；洗脱方式为等度洗脱；
(3)质谱测定，条件为：
离子源：电喷雾离子化电离源ESI；离子检测方式：多反应监测MRM；离子极性：正离子；skullcapflavone-II碰撞电压23eV；内标新补骨脂异黄酮碰撞电压29eV；毛细管电压4.5kV；气帘气Curtain gas：20psi；离子源Gas1：70psi；离子源Gas2：80psi；脱溶剂温度：400℃；CXP：9V；CAD：10V；DP：100V；EP：10V，检测对象的离子通道：skullcapflavone-II m/z 375.1→345.1，内标新补骨脂异黄酮m/z 323.3→255.1
(4)计算：采用内标法，以skullcapflavone-II和内标新补骨脂异黄酮的峰面积比值代入标准曲线方程计算skullcapflavone-II的浓度。
2.根据权利要求1所述的测定血浆中skullcapflavone-II浓度的方法，其特征在于，步骤(1)中，取血浆样品500μL，加入100ng·mL-1内标新补骨脂异黄酮20μL，加入4mL乙酸乙酯，震荡3min后3500×g离心10min，取上清液3.5mL在40℃氮气吹干后，用100μL流动相溶解后，10μL进样分析。
3.根据权利要求1所述的测定血浆中skullcapflavone-II浓度的方法，其特征在于，步骤(2)中，色谱柱长度为150mm，内径为2.1mm，填料粒径为5μm。
4.根据权利要求1所述的测定血浆中skullcapflavone-II浓度的方法，其特征在于，所述的血浆为给予了含skullcapflavone-II药物的血浆。
5.根据权利要求1所述的测定血浆中skullcapflavone-II浓度的方法，其特征在于，所述血浆为人或动物的血浆。
6.根据权利要求1所述的测定血浆中skullcapflavone-II浓度的方法，其特征在于，所述血浆为犬血浆。
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