CN106011116A - 一种人凝血酶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及血液制品领域,特别是涉及一种人凝血酶的制备方法。本发明提供一种人凝血酶的制备方法,包括如下步骤:1)将人血浆Cohn级分得到的组分III复溶、病毒灭活,所得料液通过阴离子交换树脂纯化,获得凝血酶原复合物洗脱液;2)在步骤1)所得洗脱液中加入钙离子,孵育至凝血酶原被有效活化;3)将步骤2)所得料液通过阳离子交换树脂进行分离纯化;4)将步骤3)所得料液进行纳米膜过滤,即得所述人凝血酶成品。本发明所提供的制备方法利用本工艺市场的凝血酶制品,不仅活力高、得率高,而且长期稳定性也好,符合临床应用的安全有效的要求,具有较明显的经济价值和现实意义。
Description
技术领域
本发明涉及血液制品领域,特别是涉及一种人凝血酶的制备方法,所述制备方法可以用于从人血浆中大规模生产人凝血酶。
背景技术
凝血酶属于丝氨酸蛋白类水解酶,由308个氨基酸残基组成,分子量36KD,是由轻链和重链通过二硫键连接而成的双链分子。其中轻链有49个氨基酸残基,对凝血酶的结构稳定性起到重要作用;重链有259个氨基酸残基,是凝血酶的酶活功能区。凝血酶的前体是凝血酶原(FII),是一种维生素K依赖蛋白,在肝脏合成,血浆中含量约10-15毫克/分升,分子量68KD。
凝血酶的形成在整个凝血机制中起到中心的作用。凝血机制启动后,产生的微量凝血酶能够激活凝血因子V,VIII,IX等因子而放大凝血反应,进而产生大量的凝血酶。这些凝血酶会迅速将可溶性的纤维蛋白原裂解成不可溶的纤维蛋白,并通过活化XIII在纤维蛋白之间进行共价交联而形成稳定的网状结构。凝血酶还能够与血小板表面的凝血酶受体结合而活化血小板,促使血小板的释放和聚集,并与凝固的纤维蛋白一起,在血管损伤处形成稳定的血栓,从而达到止血的目的。另一方面,凝血酶能够激活蛋白C***,灭活内源性凝血因子Va和VIIIa的活性,终止凝血反应,与AT-III***和组织因子途径抑制物***共同阻止血液凝块的形成。此外,凝血酶在激活纤溶***,清除血块,促进伤口愈合也有重要生理功能。
在临床上,凝血酶可直接作用于凝血反应的最后环节,将血液中的纤维蛋白原转变为纤维蛋白,促使血小板凝聚,加速血液凝固,达到迅速止血的目的,是一种公认的速效局部止血首选药,适用于各种因素引起的出血症状,如消化道,气管,以及各种手术出血等。凝血酶还可与纤维蛋白原配合,制成纤维蛋白胶粘合剂,用于外科出血,粘合组织和处置难度大的创伤。临床研究发现,凝血酶可以促进上皮细胞的生成,使创面愈合时间缩短一半。在中枢神经***正常发育和损伤保护中的研究表明,小剂量凝血酶可产生神经保护作用,而大剂量则具有细胞毒性作用。随着对凝血酶制剂临床研究的不断深入,凝血酶的市场需求必将呈现逐渐扩大的趋势。
相对于动物血浆来源的凝血酶,人血浆来源制备的凝血酶不会引起异源性免疫反应,也不存在感染CJDV等病毒的风险,无疑具有更加良好的市场前景。
制备人凝血酶的原料主要有去冷胶血浆,Cohn组分I上清,Cohn组分III,凝血酶原复合物等。US PATENT 5354682报道,以去冷胶血浆为原料,通过DEAE介质富集II因子并洗脱收集。在洗脱液中加入钙离子和兔脑凝血活酶激活凝血酶原,孵育约1小时后生成凝血酶。经过SD除病毒步骤,凝血酶经过S-Sepharose进一步纯化,得到高比活的凝血酶制品。USPATENT 5907032同样报道了一种以去冷胶血浆为原料生成凝血酶的方法。通过DEAE-cellose吸附去冷胶血浆中的凝血因子后,洗脱液中加入约70mM的钙离子,PH控制在6.4-6.6,在20℃孵育18小时即可大量生成凝血酶。作者认为DEAE-cellose洗脱液中含有活化与非活化的因子IX和X,促凝磷脂以及足够的因子V和VIII,在钙离子存在的情况下,通过内源凝血途径大量生成凝血酶。为去除潜在的病毒污染,文中采用SD结合干热法两步措施实现除病毒效果。US PATENT 5714370也介绍了一种单钙离子激活产生凝血酶的工艺条件,即2.5mM钙离子,PH7.0,30℃孵育80min后,1U的凝血酶原可产生48U的凝血酶活性。专利特殊的地方在于,凝血酶原被DEAE富集洗脱后即进行冻干,然后进行60℃干热10hrs,80℃干热1hr,先行干热除病毒步骤。之后复溶冻干品,进入下一步纯化步骤。作者认为,因为凝血酶对高温的天然敏感性,而凝血酶原却对温度有较好的耐受性,因此在凝血酶原阶段进行干热出病毒,能够大幅提高凝血酶的得率。干热除病毒阶段添加稳定剂可以提高凝血酶的得率,但同时也可能增强病毒抗热能力,从而削弱干热除病毒的效果。中国专利CN02117151.3也介绍了一种低钙离子激活产生凝血酶的工艺条件,从8公斤Cohn组分III得到70000单位的凝血酶半成品,得率为每公斤血浆制得约800单位凝血酶。由于该专利采用干热病毒灭活法处理凝血酶冻干品,可能对凝血酶的活力造成影响,凝血酶活力的长期稳定性也无法得到保证。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点,本发明的目的在于提供一种人凝血酶的制备方法,用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的,本发明提供一种人凝血酶的制备方法,包括如下步骤:
1)将人血浆Cohn级分得到的组分III复溶、病毒灭活,所得料液通过阴离子交换树脂纯化,获得凝血酶原复合物洗脱液;
2)在步骤1)所得洗脱液中加入钙离子,孵育至凝血酶原被有效活化;
3)将步骤2)所得料液通过阳离子交换树脂进行分离纯化;
4)将步骤3)所得料液进行纳米膜过滤,即得所述人凝血酶成品。
所述步骤1)中,复溶所采用的溶剂通常可以是本领域各种适用于对人血浆Cohn级分得到的组分III进行纯化的溶液,例如可以是包括但不限于柠檬酸钠水溶液、氯化钠水溶液中的一种或多种的组合,再例如,柠檬酸钠水溶液中柠檬酸钠的浓度可以为0.01M~0.02M,氯化钠水溶液中氯化钠的浓度可以为0.1M~0.2M,水溶液的pH可以为6.5~7.0。
在本发明一些实施方式中,所述步骤1)中,病毒灭活采用S/D法病毒灭活。
所述步骤1)中,所述S/D(Solvent/detergent)法病毒灭活通常指有机溶剂/去污剂混合物(S/D)破坏包膜病毒的脂膜。本领域技术人员可选择合适的条件对复溶后的人血浆Cohn级分得到的组分III进行S/D法病毒灭活,例如,S/D法病毒灭活的条件可以是25℃,5~6小时,再例如可以是0.3%TNBP+1%Triton-X100,再例如可以是0.3%TNBP+1%吐温-80。
所述步骤1)中,阴离子交换树脂主要是用于吸附经病毒灭活后的料液中的凝血因子。本领域技术人员可选用合适种类的阴离子交换树脂对所述料液进行纯化,具体可选用的阴离子交换树脂可以是例如DEAE Sephadex A50、DEAE Sepharose FF、Q Sepharose FF、QSepharose XL、Capto DEAE、Capto Q、Q、EMD TMAE、EMDDEAE等凝胶中的一种或多种的组合。本领域技术人员可选择合适的条件使用阴离子交换树脂对所述料液进行纯化,以获得凝血酶原复合物洗脱液。所述纯化通常包括吸附、洗涤、洗脱等步骤,例如,洗涤时采用的溶液可以是柠檬酸钠水溶液、氯化钠水溶液中的一种或多种的组合,再例如,柠檬酸钠水溶液中柠檬酸钠的浓度可以为0.01M~0.02M,氯化钠水溶液中氯化钠的浓度可以为0.1M~0.2M,水溶液的pH可以为6.5~7.0,再例如,洗脱时采用的溶液可以是柠檬酸钠水溶液、氯化钠水溶液中的一种或多种的组合,再例如,柠檬酸钠水溶液中柠檬酸钠的浓度可以为0.01M~0.02M,氯化钠水溶液中氯化钠的浓度可以为0.5M~2.0M,水溶液的pH可以为6.5~7.0。
在本发明一些实施方式中,所述步骤2)中,孵育至凝血酶原通常被钙离子有效活化,在孵育过程中,通常可以通过检测凝血酶活性,判断凝血酶原是否被有效活化,例如,孵育至凝血酶原被有效活化可以通过检测人凝血酶效价(中国药典2015版三部)判断凝血酶原是否有效活化。更具体的,可以通过凝血酶活性检测,凝血酶含量趋于稳定而不再增加,即可判断料液中的凝血酶原已有效活化。在本发明一些实施方式中,所述步骤2)中,洗脱液中钙离子的浓度为10mM~100mM。
在本发明一些实施方式中,所述步骤2)中,洗脱液中加入钙离子的具体方法为:洗脱液中加入可溶性钙盐。
在本发明一些实施方式中,所述步骤2)中,所述可溶性钙盐可以为水溶性钙盐,所述可溶性钙盐选自氯化钙等中的一种或多种的组合。
所述步骤3)中,阳离子交换树脂主要是用于吸附料液中的凝血酶。本领域技术人员可选用合适种类的阳离子交换树脂对所述料液进行纯化,具体可选用的阳离子交换树脂可以是例如SP-Sepharose FF,SP-Sephadex C50,CM-Sepharose FF,EMD SO3-(M)等中的一种或多种的组合。本领域技术人员可选择合适的条件使用阳离子交换树脂对所述料液进行纯化,以获得较高纯度的凝血酶。所述纯化通常包括吸附、洗涤、洗脱等步骤,例如,洗涤时采用的溶液可以是氯化钠水溶液、Tris-HCL水溶液等,氯化钠水溶液中氯化钠的浓度为0.1~0.2M,Tris-HCL水溶液的浓度可以为0.01~0.02M,水溶液的pH可以为6.5~7.5,再例如,洗脱时采用的溶液可以是氯化钠水溶液、Tris-HCL水溶液等,氯化钠水溶液中氯化钠的浓度为0.5~2.0M,Tris-HCL水溶液的浓度可以为0.01~0.02M,水溶液的pH可以为6.5~7.5。
在本发明一些实施方式中,所述步骤3)和/或步骤4)中,还可以根据需要调整料液中凝血酶的浓度,例如,可以在纳米膜过滤前调整料液中凝血酶的浓度,调整后的凝血酶浓度可以为100IU/ml~2000IU/ml。
在本发明一些实施方式中,所述步骤4)中,纳米膜过滤所使用的纳米膜的孔径为10nm~50nm。
在本发明一些实施方式中,还可以将步骤4)所得产物进行除菌和/或冻干。
本领域技术人员可选择合适的条件对料液进行除菌,例如,可选用除菌过滤的方法,更具体可以使用除菌膜进行除菌过滤,所述除菌膜可以是例如0.22um孔径滤膜(用于过滤除菌)等。
如上所述,本发明的人凝血酶的制备方法结合以往凝血酶制备工艺的经验以及药典要求,针对凝血酶产品特点以及工艺特要求,创新性地提供了一种以纳米膜进行病毒去除的大规模工业化的凝血酶生产方法。所述人凝血酶的制备方法利用本工艺市场的凝血酶制品,不仅活力高、得率高(制备的凝血酶得率每公斤血浆约5000-10000单位,比活每毫克蛋白约800-900单位),而且长期稳定性也好,符合临床应用的安全有效的要求,具有较明显的经济价值和现实意义。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式,本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用,本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用,在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前,应理解,本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案;还应当理解,本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案,而不是为了限制本发明的保护范围;在本发明说明书和权利要求书中,除非文中另外明确指出,单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时,应理解,除非本发明另有说明,每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义,本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外,根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载,还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明,本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明,具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,Second edition,Cold Spring HarborLaboratory Press,1989 and Third edition,2001;Ausubel等,CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY,John Wiley&Sons,New York,1987 and periodic updates;the seriesMETHODS IN ENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego;Wolffe,CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION,Third edition,Academic Press,San Diego,1998;METHODSIN ENZYMOLOGY,Vol.304,Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe,eds.),AcademicPress,San Diego,1999;和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,Vol.119,ChromatinProtocols(P.B.Becker,ed.)Humana Press,Totowa,1999等。
实施例中所使用的检测方法如下:
一.凝血酶含量的检测
参***药典2015版二部,“凝血酶冻干粉”所列方法。标准品为凝血酶国家标准品(GB20021105,5IU/via),纤维蛋白原为人纤维蛋白原制品,如上海RAAS公司生产的HFNG(201202H2A0)。
二.样品蛋白浓度的检测
利用岛津UV-1800,调整波长至280,可以测定样品在280nm的紫外吸收值(OD280)。
实施例1
1. 2.3吨健康人血浆经乙醇级分法得到的80公斤组分III,经过SD病毒灭活和离子交换树脂分离纯化得到11.5公斤凝血酶原复合物溶液(具体方法参见凝血酶原复合物病毒灭活的研究[J].中国生物制品学杂志,1995,8(3):101-104;人凝血酶原复合物的病毒灭活与验证[J].中国输血杂志,1998,11(4):195-197)。经过10mM钙离子激活,检测凝血酶活性大于1000IU/ml并趋于稳定时,停止钙离子孵育,进行阳离子交换树脂分离纯化凝血酶。层析介质为SP-Sephadex C50,平衡缓冲液为0.1M氯化钠,0.02M Tris-HCL,pH6.5的溶液,洗脱缓冲液是0.5M氯化钠,0.02M Tris-HCL,pH6.5的溶液。洗脱液为15.2公斤凝血酶溶液,总活力为1.5×107单位,总蛋白含量为18500毫克。活力回收每公斤血浆为6500单位凝血酶,比活为每毫克蛋白810单位凝血酶。
2.用0.15M氯化钠,20mM Tris,1%甘氨酸超滤换液,配制成25公斤凝血酶原液,每毫升含600单位凝血酶活力。用1平方米的20纳米孔径的纳米膜过滤去除病毒,用除菌膜过滤后分装成12000瓶凝血酶半成品,每瓶装量2毫升,含1200单位凝血酶。
3.经过冻干后,真空上塞密封,凝血酶成品放在2至8度低温保存。
实施例2
1. 2.3吨健康人血浆经乙醇级分法得到的81公斤组分III,经过SD病毒灭活和离子交换树脂分离纯化得到12公斤凝血酶原复合物溶液(具体方法参见凝血酶原复合物病毒灭活的研究[J].中国生物制品学杂志,1995,8(3):101-104;人凝血酶原复合物的病毒灭活与验证[J].中国输血杂志,1998,11(4):195-197)。经过100mM钙离子激活,检测凝血酶活性大于1000IU/ml并趋于稳定时,停止钙离子孵育,进行阳离子交换树脂分离纯化凝血酶。层析介质为SP-Sepharose FF,平衡缓冲液为0.15M氯化钠,0.01M Tris-HCL,pH7.0的溶液,洗脱缓冲液是1.0M氯化钠,0.01M Tris-HCL,pH7.0的溶液。得到15.4公斤凝血酶洗脱液,总活力为1.55×107单位,总蛋白含量为19000毫克。活力回收每公斤血浆为6740单位凝血酶,比活为每毫克蛋白815单位凝血酶。
2.用0.15M氯化钠,20mM Tris,1%甘氨酸超滤换液,配制成25.8公斤凝血酶原液,每毫升含600单位凝血酶活力。用1平方米的20纳米孔径的纳米膜过滤去除病毒,用除菌膜过滤后分装成12400瓶凝血酶半成品,每瓶装量2毫升,含1200单位凝血酶。
3.经过冻干后,真空上塞密封,凝血酶成品放在2至8度低温保存。
实施例3
将实施例2制备的凝血酶成品于25℃放置,并分别于0,1,2,3个月取出样品,用2ml水复溶,检测凝血酶活性,观察凝血酶的稳定性,结果如下表:
检测数据表明,经过纳米膜除病毒得到的凝血酶活力具有良好的长期稳定性。
综上所述,本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效,而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下,对上述实施例进行修饰或改变。因此,举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变,仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (9)
1.一种人凝血酶的制备方法,包括如下步骤:
1)将人血浆Cohn级分得到的组分III复溶、病毒灭活,所得料液通过阴离子交换树脂纯化,获得凝血酶原复合物洗脱液;
2)在步骤1)所得洗脱液中加入钙离子,孵育至凝血酶原被有效活化;
3)将步骤2)所得料液通过阳离子交换树脂进行分离纯化;
4)将步骤3)所得料液进行纳米膜过滤,即得所述人凝血酶成品。
2.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤1)中,病毒灭活采用S/D法病毒灭活。
3.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤1)中,所述阴离子交换树脂选自DEAE Sephadex A50、DEAE Sepharose FF、Q Sepharose FF、Q Sepharose XL、Capto DEAE、Capto Q、Q、EMD TMAE、EMD DEAE中的一种或多种的组合。
4.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤2)中,洗脱液中钙离子的浓度为10mM~100mM。
5.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤2)中,洗脱液中加入钙离子的具体方法为:洗脱液中加入可溶性钙盐。
6.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤3)中,所述阳离子交换树脂选自SP-Sepharose FF,SP-Sephadex C50,CM-Sepharose FF,EMD SO3 -(M)中的一种或多种的组合。
7.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤4)中,在纳米膜过滤前调整料液中凝血酶的浓度至100IU/ml~2000IU/ml。
8.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤4)中,纳米膜过滤所使用的纳米膜的孔径为10nm~50nm。
9.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,还可以将步骤4)所得产物进行除菌和/或冻干。
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Legal Events
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C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20161012 |
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |