CN106011056A - 一种用于皮肤粉刺治疗的间充质干细胞的制备方法及其产品 - Google Patents

一种用于皮肤粉刺治疗的间充质干细胞的制备方法及其产品 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于皮肤粉刺治疗的间充质干细胞的制备方法，其中，所述方法包括构建过氧化物酶体增殖物激活受体α和γ的基因片段，重组到病毒表达载体上，两者共转染间充质干细胞，可高表达过氧化物酶体增殖物激活受体α和γ蛋白，发挥两者抗皮肤炎症反应和抑制细胞角化异常；同时也利用间充质干细胞自身增殖分化和调节免疫功能，参与皮肤修复和抗炎症反应，用于治疗皮肤粉刺的作用；本发明提供的间充质干细胞将对皮肤粉刺具有很好治疗和美容效果。

Description

一种用于皮肤粉刺治疗的间充质干细胞的制备方法及其产品
技术领域
本发明涉及一种用于皮肤粉刺治疗的间充质干细胞的方法以及通过所述方法获得治疗皮肤粉刺的间充质干细胞，特别地，本发明涉及构建过氧化物酶体增殖物激活受体α和γ(Peroxisome proliferator-activated receptor α and γ，PPARα and γ)的重组病毒载体，使得间充质干细胞能稳定表达过氧化物酶体增殖物激活受体α和γ，发挥两者抗皮肤炎症反应和抑制细胞角化异常，治疗皮肤粉刺的作用；同时本发明的用于皮肤粉刺治疗的间充质干细胞保持良好的增殖能力，间充质干细胞具有增殖分化和调节免疫功能，参与皮肤修复和抗炎症反应，而无成瘤性，将有望对皮肤粉刺达到更佳的治疗和美容效果。
背景技术
粉刺一种常见的皮肤病，也称痤疮、青春痘和暗疮，是一种常见的毛囊皮脂腺炎症性皮肤病，多发于面部，严重影响到青年男女青春靓丽的形象。毛囊皮脂腺开口被阻塞是发病机制中的重要因素。在毛囊闭塞的情况下，痤疮丙酸杆菌大量繁殖，导致炎症，形成痤疮最基本的损害炎性丘疹。在闭塞的毛囊皮脂腺内部，大量皮脂、大量脓细胞把毛囊皮脂腺结构破坏，形成结节、囊肿和粉瘤，最后破坏皮肤甚至形成疤痕。皮脂腺管过度角化也是粉刺发病的重要因素。
持续毛囊闭塞和痤疮丙酸杆菌繁殖导致炎症细胞侵入，从而分泌大量炎症因子，造成毛囊漏斗部的角质形成细胞角化异常。因而抑制炎症因子和改善毛囊角化异常，是改善痤疮皮损及病理改变的中心环节。口服中药及局部外用方面，其中以局部外用干预痤疮模型为主要方向：如复方颠倒散、复方紫金霜、黄连牡蛎膏、果酸等外用药物均有较强的抗角化作用，能够有效改善痤疮皮损。口服蛇丹合剂为主要成分为白花蛇舌草、丹参、黄芩、连翘、益母草、生山楂等，能够调节雌雄激素水平，促进创面修复，并且具有抗菌、抑制炎性因子释放的作用。
在临床治疗粉刺绝大多数为中药，具有一定的治疗效果。本发明使用间充质干细胞为蛋白表达载体及其本身的功能，对粉刺治疗产生更好的效果。间充质干细胞(humanmesenchymal stem cells，MSCs)已经用于临床治疗领域，在神经***疾病和骨科疾病治疗中取得了很好的疗效，已不存在的免疫排斥、伦理学及致瘤性等方面的限制，具有良好的临床应用前景。因而，本发明通过构建过氧化物酶体增殖物激活受体γ的重组病毒载体，转染间充质干细胞，发挥过氧化物酶体增殖物激活受体γ抗炎症和抗增殖的生物学功能，而无成瘤性。表达的过氧化物酶体增殖物激活受体γ和间充质干细胞将创造有利于皮肤粉刺修复的微环境，抑制炎症细胞分泌炎症细胞因子，从而阻止毛囊口上皮细胞角化过度，有望对皮肤粉刺治疗和美容产生更好的效果。
发明内容
本申请人经过潜心研究发现，PPARα对表皮屏障、表皮增殖和分化的作用，可增加表皮棘层/颗粒层结构蛋白的表达，还增加凋亡，减少增殖，加速表皮屏障功能的恢复。PPARγ虽然主要分布在脂肪组织中，但通过半定量荧光定量PCR检测证实了PPAR的3个亚型也存在于人的角质形成细胞中，而且PPARγ的表达会随着角质形成细胞的分化而增加；并发现银屑病患者皮损处的PPARγ含量较无皮损处的PPARγ含量减少。
已证实PPARα、γ具有部分抗炎特性，特异性的PPARγ配体下调T细胞、单核细胞、肥大细胞中的炎症性细胞因子，并负性调节巨噬细胞的活化。在许多良性和恶性细胞中，PPARγ配体限制了这些细胞的增殖而促进它们的分化。我们实验证明PPARα能增加分化相关基因如外披蛋白的表达，还可下调炎症介质性的细胞因子达到抗炎作用。PPARα缺陷小鼠对炎症介质刺激的反应延长；局部应用PPARα激动剂可防止UVB辐射后的皮肤炎症反应。在粉刺组皮损中PPARα、γ水平与非皮损区相比是降低的。PPARα的活化能抑制角质形成细胞增值，从而导致角质层厚度降低。
因而PPARα和PPARγ在皮肤内环境的稳定中起了非常关键的作用，调节着皮肤的分化、增殖以及炎症反应。
过氧化物酶体增殖物激活受体γ属于核受体超家族，生物学功能多样，参与糖类代谢、脂类代谢、脂肪细胞的分化、胰岛素抵抗、炎性反应及卵巢组织的周期性调控等方面均发挥重要作用，还可以抑制人脐静脉内皮细胞炎症因子的分泌，即肿瘤坏死因子(Tumornecrosis factor-α，TNF-α)和白介素6(Interleukin 6，IL-6)等。
本发明利用间充质干细胞增殖分化和“归巢”的特性，将构建的PPARα和PPARγ基因片段的重组病毒载体共转染MSCs，可高表达PPARα和PPARγ，发挥PPARα和PPARγ抗炎症和抗增殖的生物学作用及其间充质干细胞本身的功能，改善皮肤局部微环境，抑制炎症细胞分泌炎症细胞因子，从而阻止毛囊口上皮细胞角化过度。
本发明发明人意外发现间充质干细胞高表达PPARα和PPARγ可以维持皮肤屏障渗透性，抑制角质化细胞生长，促进角质化细胞末端分化和调节皮肤炎症，同时它们也对人毛囊上皮干细胞有着保护的作用。
本发明提供了一种用于皮肤粉刺治疗的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括构建过氧化物酶体增殖物激活受体γ的基因片段，重组到病毒表达载体上，包装成病毒后并共转染间充质干细胞，制备成可高表达PPARα和PPARγ的间充质干细胞，提高间充质干细胞发挥更佳的抑制皮肤炎症反应、阻止毛囊上皮细胞角化异常和改善皮肤修复，能用于治疗皮肤粉刺。
本发明所述的过氧化物酶体增殖物激活受体γ基因片段是通过PCR技术扩增重组到表达质粒上，经酶切位点连接到病毒表达载体上，基因重组病毒载体转染间充质干细胞，获得治疗皮肤粉刺的间充质干细胞。
本发明所述间充质干细胞包括来源于废弃脐带、脐血、胎盘、自体骨髓或脂肪等，优选地，为来源脐带。由于间充质干细胞来源方便，细胞培养获得简单，可以从个体化获得能做到个体化应用。
本发明所述的病毒载体，可以在细胞内稳定增殖和表达目的基因，主要为慢病毒、腺病毒、逆转录病毒等，优选地，选择慢病毒表达***。
将人PPARα和PPARγ基因序列通过PCR从正常人外周血基因组DNA中扩增下来，将PPARα和PPARγ的目的DNA片段分别连接到表达质粒上构建成重组质粒后，经阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定后，构建好的质粒可以保存在-80℃超低温冰箱中。再将PPARα和PPARγ基因片段克隆到慢病载体上，包装好的重组PPARα和PPARγ慢病毒，可以共转染间充质干细胞，制备成PPARα和PPARγ慢病毒共转染的间充质干细胞。
感染后72小时荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)的发光情况，GFP显色超过90％以上，表明携带PPARα和PPARγ基因病毒转染间充质干细胞成功，获得持续表达PPARα和PPARγ的间充质干细胞。
通过荧光定量PCR试剂盒按照使用说明书检测，转染了PPARα和PPARγ病毒载体的MSCs传代培养到第10代后，其表达PPARα和PPARγ基因高于未转染的MSCs至少100倍以上。
所述间充质干细胞流式细胞检测，其标志物CD90、CD105、CD73和CD44表达90％以上；
所述转染了重组PPARα和PPARγ病毒的MSCs具有如下性能：抑制皮肤炎症反应、阻止毛囊上皮细胞角化异常和改善皮肤修复；且无瘤性。
本发明所述的用于皮肤粉刺治疗的间充质干细胞，可以体外传代培养，即重组PPARα和PPARγ慢病毒转染的MSCs通过完全培养液α-MEM(含2mM L-谷氨酰胺、5-100ng/ml碱性成纤维生长因子、5-100ng/ml表皮生长因子和5-10％胎牛血清)体外传代培养，当细胞培养到第5-6天，细胞生长融合达到90％以上，需要使用质量体积比为0.25％的胰酶(含0.05％EDTA)消化传代。
取传代培养到3代和10代MSCs倒置显微镜下观察的细胞形态，未转染的MSCs与其他转染目的基因的MSCs具有相似的细胞形态。
所述用于皮肤粉刺治疗的间充质干细胞过表达PPARα和PPARγ，体内、体外成瘤实验中未发现成瘤现象，保证了其安全性。
所述用于皮肤粉刺治疗的间充质干细胞对兔耳粉刺模型移植中，兔耳粉刺疗效可以达到毛囊角栓明显减少，部分角栓脱落后遗留点状凹陷的毛囊，丘疹变平减少；以及角化程度明显减轻、基本恢复正常和真皮浅层炎细胞浸润显著减少。重组PPARα和PPARγ慢病毒共转染的MSCs移植治疗兔耳粉刺模型后，抑制了兔耳粉刺模型炎症因子的TNF-α分泌，并其病理组织学分级分析发现，角化程度、表皮增厚程度、毛囊内角化物质多少、毛囊扩张程度和炎细胞浸润程度均明显好于单独MSCs移植的。
本发明还提供一种制备的用于皮肤粉刺治疗的间充质干细胞的试剂盒产品，其特征在于，所述试剂盒包括：
1)间充质干细胞基础培养基；
2)包装好的PPARα和PPARγ高表达病毒；
3)消化细胞的酶；
4)细胞因子以及；
5)使用说明书；
其中，所述使用说明书包括上述的方法。
本发明还提供所述用于皮肤粉刺治疗的间充质干细胞的应用，通过保证了体外培养获得足够数量的间充质干细胞，并具有稳定表达PPARα和PPARγ蛋白，发挥其对皮肤粉刺的抗炎症和抗细胞增殖等的作用，以及间充质干细胞修复皮肤中损伤的皮肤细胞的功能，有望用于治疗皮肤粉刺。
附图说明
图1表示为体外培养获得的MSCs的流式细胞图
图2表示为重组PPARα和PPARγ慢病毒在转染MSCs后免疫荧光图
图3表示为重组PPARα和PPARγ慢病毒在转染MSCs后PPARγ基因表达水平图
图4表示为兔耳粉刺模型体内实验后兔耳粉刺改善图
图5表示为兔耳粉刺模型体内实验后HE组化改善图
图6表示为兔耳粉刺模型体内实验后炎症因子TNF-α分泌水平图
具体实施方式
本发明提供了一种用于皮肤粉刺治疗的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括构建过氧化物酶体增殖物激活受体α和γ的基因片段，重组到病毒表达载体上，包装成病毒后并共转染间充质干细胞，制备成可高表达PPARα和PPARγ的间充质干细胞，提高间充质干细胞发挥更佳的抑制皮肤炎症反应、阻止毛囊上皮细胞角化异常和改善皮肤修复，能用于治疗皮肤粉刺。
本发明所述间充质干细胞来源方便，即废弃脐带、脐血、胎盘、自体骨髓或脂肪等，优选地，来源于脐带。由于间充质干细胞来源方便，细胞培养获得简单，可以从个体化获得能做到个体化应用。
本发明所述间充质干细胞制备方法，即：取废弃1-2cm脐带经含2倍青霉素和链霉素双抗的1×PBS(pH＝7.4)洗涤三次，使用眼科剪将脐带剪碎至1mm3左右，用含2倍青霉素和链霉素双抗的1×PBS(pH＝7.4)重悬后1000转每分钟离心，其上清后用间充质干细胞培养基(即α-MEM含2mM L-谷氨酰胺、5-100ng/ml碱性成纤维生长因子、5-100ng/ml表皮生长因子和5-10％胎牛血清)重悬，吸取10ml加入到75cm2细胞培养瓶中，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养48小时。更换新鲜含细胞因子的间充质干细胞培养基再连续培养，直到细胞从组织中爬出来。待细胞生长比较密时，使用0.25％(质量体积比)胰酶(含质量体积比0.02％EDTA)进行消化，用10ml含细胞因子的间充质干细胞培养基重悬后转移到新的75cm2培养瓶中，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养直到生长融合达到90％左右，使用0.25％胰酶(含0.02％ EDTA)进行消化传代培养，即1瓶传代2瓶，补充新鲜含细胞因子的间充质干细胞培养基继续培养，培养到第5代时，间充质干细胞使用0.25％胰酶(含0.02％ EDTA)消化，即获得间充质干细胞，可以重悬至含10％二甲基亚砜的胎牛血清中冻存在液氮中。
人间充质干细胞经流式细胞技术检测，MSCs标志物CD90、CD73、CD105和CD44表达分别为99.08％、99.85％、99.88％和99.60％；CD34、CD14、CD45和CD19表达为0.00％、0.21％、0.58％和0.04％。
本发明所述的PPARα和PPARγ基因片段是通过PCR技术扩增并重组到表达质粒上，经酶切位点连接到重组到表达质粒上，然后重组到病毒表达载体上，再包装293T细胞制备成高表达目的基因的病毒。
本发明所述的病毒载体，可以在细胞内稳定增殖和表达目的基因，主要为慢病毒、腺病毒、逆转录病毒等，优选地，选择慢病毒表达***，均为商业化产品，从商业公司可以购买到。
将人PPARα和PPARγ序列通过PCR从正常人外周血基因组DNA中扩增获得，使用PPARα引物为，正链：5’-GCTCGAGATGGTGGACACGGAAAGCCCA-3’，反义链：5’-CCATATGGTCAGTACATGTCCCTGTAG-3’；PPARγ引物为，正链：5’-GCTCGAGATGACCATGGTTGACAC-3’，反义链：5’-CCATATGGTGAACATGATCCATATGG-3’。PPARα和PPARγ目的片段分别和XhoI/Nde I双酶切的pET28a载体片段，在T4DNA连接酶作用下，于4℃、12小时连接反应制备克隆连接液，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a后进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定；PCR产物凝胶电泳检测和测序鉴定符合PPARα和PPARγ大小和序列后，将测序正确的菌液转接于10ml含氨苄抗生素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，用北京天根生物无内毒素质粒小提中量试剂盒进行质粒抽提，抽提合格的重组质粒放置-80℃超低温冰箱中长期保存；所述PPARα和PPARγ大小约为1407bp和1434bp；
分别将PPARα、PPARγDNA片段和GV358载体进行XhoI/Nde I双酶切，在T4 DNA连接酶作用下，将PPARα和PPARγ片段分别与酶切GV358载体于37℃、12小时连接反应制备克隆连接液，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a后进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定；
取细胞状态良好，处于对数生长期的293T细胞，细胞计数后，按照每个10cm的培养皿6×106个细胞数接种于培养皿中，37℃，5％CO2的培养箱中培养过夜；第二天转染前移去培养液，换5ml Opti-MEM培养液；取9μg包装混合液和3μg慢病毒表达质粒加入1.5ml Opti-MEM中，轻轻混匀，取36μl lipofectamine 2000加入1.5ml Opti-MEM中，轻轻混匀，室温放置5min；混合质粒溶液和lipofectamine 2000稀释液，置室温20min；混合液缓慢滴加至293T细胞的培养液中，混匀，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养；培养6h后弃去含有转染混和物的培养基，加入10ml的PBS液清洗一次，轻柔晃动培养皿以洗涤残余的转染混和物后倒弃；缓慢加入含10％血清的细胞培养基20ml，于37℃、含5％CO2培养箱内继续培养48-72h；
根据细胞状态，收集转染后48h的293T细胞上清液；于4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；以0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；分别配平样品，将带有病毒上清液的超速离心管逐一放入至超速离心机内，设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4℃；离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液，轻轻反复吹打重悬；经充分溶解后，高速离心10000rpm，离心5min后，取上清荧光法测定滴度，包装好的PPARα和PPARγ慢病毒分别按照50μl 2E+8TU/ml分装，保存于-80℃超低温冰箱；
将重组PPARα和PPARγ慢病毒分别以10μl 1E+7 TU/ml加入到间充质干细胞的六孔培养板中，体系为2ml，混匀，37℃、5％CO2的培养箱中孵育8-12个小时后，更换间充质干细胞培养基(即α-MEM含2mM L-谷氨酰胺、5-100ng/ml碱性成纤维生长因子、5-100ng/ml表皮生长因子和5-10％胎牛血清)；当细胞生长融合达到90％时，用0.25％胰酶消化，转入25cm2培养瓶中生长，1孔对应1个培养瓶，在25cm2培养瓶中融合达到90％时继续消化传代培养；生长转染分为3组：未转染对照组，空白慢病毒转染组，共转染了PPARα和PPARγ慢病毒共转染组；
感染后72小时荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)的发光情况，GFP显色超过90％以上，表明携带PPARα和PPARγ基因病毒共转染间充质干细胞成功，获得持续表达PPARα和PPARγ的间充质干细胞。
通过荧光定量PCR试剂盒按照使用说明书检测，使用PPARα引物为，正义链5’-GCGAACGATTCGACTCAAGC-3’，反义链：5’-CATCCCGACAGAAAGGCACT-3’；和PPARγ引物：正义链5’-TGGTGGGTTCTCTCTGAGTCTG-3’，反义链：5’-ATCCACGGAGCTGATCCCAA-3’；共转染了PPARα和PPARγ病毒载体的MSCs传代培养到第10代后，其表达PPARα和PPARγ基因高于未转染的MSCs为145.67和167.89倍。
本发明所述的用于皮肤粉刺治疗的间充质干细胞，可以体外传代培养，即重组PPARα和PPARγ慢病毒共转染的MSCs通过完全培养液α-MEM(含2mM L-谷氨酰胺、5-100ng/ml碱性成纤维生长因子、5-100ng/ml表皮生长因子和5-10％胎牛血清体外传代培养，当细胞培养到第5-6天，细胞生长融合达到90％以上，需要使用质量体积比为0.25％的胰酶(含0.05％EDTA)消化传代；
取传代培养到3代和10代MSCs倒置显微镜下观察的细胞形态，未转染的MSCs与其他转染目的基因的MSCs具有相似的细胞形态，细胞成梭形生长。
本发明所述的皮肤粉刺治疗的间充质干细胞，裸鼠体内皮下注射后，未发现成瘤现象，保证了其安全性，而接种的乳腺癌细胞系MCF-7阳性对照出现了成瘤。
所述用于皮肤粉刺治疗的间充质干细胞对兔耳粉刺模型移植中，兔耳粉刺疗效可以达到毛囊角栓明显减少，部分角栓脱落后遗留点状凹陷的毛囊，丘疹变平减少；以及角化程度明显减轻、基本恢复正常和真皮浅层炎细胞浸润显著减少。重组PPARα和PPARγ慢病毒共转染的MSCs移植治疗兔耳粉刺模型后，抑制了兔耳粉刺模型炎症因子的TNF-α分泌，并其病理组织学分级分析发现，角化程度、表皮增厚程度、毛囊内角化物质多少、毛囊扩张程度和炎细胞浸润程度均明显好于单独MSCs移植的。
本发明还提供一种制备的用于皮肤粉刺治疗的间充质干细胞的试剂盒产品，其特征在于，所述试剂盒包括：
1)间充质干细胞基础培养基；
2)包装好的PPARα和PPARγ高表达病毒；
3)消化细胞的酶；
4)细胞因子以及；
5)使用说明书；
其中，所述使用说明书包括上述的方法。
本发明还提供所述用于皮肤粉刺治疗的间充质干细胞的应用，通过保证了体外培养获得足够数量的间充质干细胞，并具有稳定表达PPARα和PPARγ蛋白，发挥其对维持皮肤屏障渗透性，抑制角质化细胞生长，促进角质化细胞末端分化和调节皮肤炎症的作用，以及间充质干细胞修复皮肤中损伤的皮肤细胞的功能，有望用于治疗皮肤粉刺。
以下，对本发明的具体实施例进行说明，但本发明的技术范围不限于这些示例。
实施例1 重组PPARα和PPARγ慢病毒载体的构建和包装
将人PPARα和PPARγ序列通过PCR从正常人外周血基因组DNA中扩增下来，使用PPARα引物为，正链：5’-GCTCGAGATGGTGGACACGGAAAGCCCA-3’，反义链：5’-CCATATGGTCAGTACATGTCCCTGTAG-3’；PPARγ引物为，正链：5’-GCTCGAGATGACCATGGTTGACAC-3’，反义链：5’-CCATATGGTGAACATGATCCATATGG-3’；经北京诺赛公司合成。PPARα和PPARγ目的片段分别和XhoI/Nde I(日本TAKARA公司)双酶切的pET28a载体(美国Invitrogen公司)片段，在T4DNA连接酶(日本TAKARA公司)作用下，于4℃、12小时连接反应制备克隆连接液，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a(美国Invitrogen公司)后进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定；鉴定PPARα和PPARγ基因片段大小约为1407bp和1434bp，符合PPARα和PPARγ大小和序列。将测序正确的菌液转接于10ml含氨苄抗生素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，用北京天根生物无内毒素质粒小提中量试剂盒进行质粒抽提，抽提合格的重组质粒放置-80℃超低温冰箱中长期保存。
将PPARα和PPARγDNA片段和GV358载体(上海吉凯)进行XhoI/Nde I双酶切，在T4DNA连接酶作用下，将PPARα和PPARγ片段分别与酶切GV358载体于37℃、12小时连接反应制备克隆连接液，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a后进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定正确。
取细胞状态良好，处于对数生长期的293T细胞(美国Invitrogen公司)，细胞计数后，按照每个10cm的培养皿6×106个细胞数接种于培养皿中，37℃，5％CO2的培养箱中培养过夜；第二天转染前移去培养液，换5ml Opti-MEM培养液；取9μg包装混合液和3μg慢病毒表达质粒加入1.5ml Opti-MEM中，轻轻混匀，取36μl lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司)加入1.5ml Opti-MEM中，轻轻混匀，室温放置5min；混合质粒溶液和lipofectamine2000稀释液，置室温20min；混合液缓慢滴加至293T细胞的培养液中，混匀，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养；培养6h后弃去含有转染混和物的培养基，加入10ml的PBS液清洗一次，轻柔晃动培养皿以洗涤残余的转染混和物后倒弃；缓慢加入含10％血清的细胞培养基20ml，于37℃、含5％CO2培养箱内继续培养48-72h；
根据细胞状态，收集转染后48h的293T细胞上清液；于4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；以0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；分别配平样品，将带有病毒上清液的超速离心管逐一放入至超速离心机内，设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4℃；离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液，轻轻反复吹打重悬；经充分溶解后，高速离心10000rpm，离心5min后，取上清荧光法测定滴度，包装好的PPARα和PPARγ慢病毒按照50μl 2E+8 TU/ml分装，保存于-80℃超低温冰箱。
实施例2 人间充质干细胞的制备
取1-2cm废弃脐带经含2倍青霉素和链霉素双抗的1×PBS(pH＝7.4)洗涤三次，使用眼科剪将脐带剪碎至1mm3左右，用含2倍青霉素和链霉素双抗的1×PBS(pH＝7.4)重悬后1000转每分钟离心，其上清后用间充质干细胞培养基(即α-MEM含2mM L-谷氨酰胺、5-100ng/ml碱性成纤维生长因子、5-100ng/ml表皮生长因子和5-10％胎牛血清)重悬，吸取10ml加入到75cm2细胞培养瓶中，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养48小时。更换新鲜含细胞因子的间充质干细胞培养基再连续培养，直到细胞从组织中爬出来。
待细胞生长比较密时，使用0.25％(质量体积比)胰酶(含质量体积比0.02％EDTA)进行消化，用10ml含细胞因子的间充质干细胞培养基重悬后转移到新的75cm2培养瓶中，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养直到生长融合达到90％左右，使用0.25％胰酶(含0.02％EDTA)进行消化传代培养，即1瓶传代2瓶，补充新鲜含细胞因子的间充质干细胞培养基继续培养，培养到第5代时，间充质干细胞使用0.25％胰酶(含0.02％ EDTA)消化，即获得间充质干细胞，可以重悬至含10％二甲基亚砜的胎牛血清中冻存在液氮中。
取苔盼兰染色计数后的1.0×106 MSC细胞，分三组，第一组分别添加到有20μLFITC-鼠抗人CD34单抗(美国BioLegend公司)；20μL PE-鼠抗人CD90单抗(美国BioLegend公司)；第二组分别添加20μL FITC-鼠抗人CD14单抗(美国BioLegend公司)；20μL PE-鼠抗人CD73单抗(美国BioLegend公司)；第三组分别添加20μL FITC-鼠抗人CD45单抗(美国BioLegend公司)；20μL PE-鼠抗人CD44单抗(美国BioLegend公司)；第四组分别添加20μLFITC-鼠抗人CD19单抗(美国BioLegend公司)；20μL PE-鼠抗人CD105单抗(美国BioLegend公司)；第五组为同型对照，分别添加到有20μL FITC标记鼠IgM和20μL PE标记鼠IgM。置于4℃冰箱染色30分钟，然后用1mL的1×磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤三次，最后用0.5mL的1×PBS重悬洗涤后的细胞，所得洗涤后的细胞用FACS Calibur流式细胞仪(美国BD公司)检测。
图1结果显示，人间充质干细胞经流式细胞技术检测，MSCs标志物CD90、CD73、CD105和CD44表达分别为99.08％、99.85％、99.88％和99.60％；CD34、CD14、CD45和CD19表达为0.00％、0.21％、0.58％和0.04％。
实施例3 重组PPARα和PPARγ慢病毒转染人皮肤间充质干细胞的制备
将重组PPARα和PPARγ慢病毒各10μl1E+7TU/ml加入到人间充质干细胞的50μg/ml的六孔培养板中，体系为2ml，混匀，37℃、5％ CO2的培养箱中孵育8-12个小时后，更换间充质干细胞培养基(即α-MEM含2mM L-谷氨酰胺、20ng/ml碱性成纤维生长因子、20ng/ml表皮生长因子和10％胎牛血清)；当细胞生长融合达到90％时，用0.25％胰酶消化，转入25cm2培养瓶中生长，1孔对应1个培养瓶，在25cm2培养瓶中融合达到90％时继续消化传代培养；生长转染分为3组：未转染对照组，空白慢病毒转染组，共转染了PPARα和PPARγ慢病毒转染组。
图2为重组PPARα和PPARγ慢病毒在共转染MSCs后免疫荧光图片。A图为在荧光倒置显微镜明场下观察的MSC细胞图，B图为荧光倒置显微镜暗场下观察的MSC细胞图，因重组PPARα和PPARγ慢病毒载体携带绿色荧光蛋白(GFP)，共转染了重组PPARα和PPARγ慢病毒的MSCs荧光倒置显微镜下呈绿色，表明重组PPARα和PPARγ慢病毒共转染MSCs构建成功。
图3为PPARα和PPARγ在共转染重组PPARα和PPARγ慢病毒了的第10代MSCs中的表达水平。在通过荧光定量PCR试剂盒按照使用说明书(美国Invitrogen公司)检测，使用PPARα引物为，正义链5’-GCGAACGATTCGACTCAAGC-3’，反义链：5’-CATCCCGACAGAAAGGCACT-3’；和PPARγ引物：正义链5’-TGGTGGGTTCTCTCTGAGTCTG-3’，反义链：5’-ATCCACGGAGCTGATCCCAA-3’；经北京诺赛公司合成。转染了重组PPARα和PPARγ慢病毒载体的MSCs传代培养到第10代后，其表达PPARα和PPARγ基因均高于未转染的第1代MCCs 145.67和167.89倍。
实施例4 制备的用于皮肤粉刺治疗的间充质干细胞的试剂盒产品
用于皮肤粉刺治疗的间充质干细胞的试剂盒包括：
1)人间充质干细胞基础培养基，即αMEM培养基；
2)包装好的PPARα和PPARγ高表达病毒；
3)消化细胞的酶，0.25％(质量体积比)胰酶(含质量体积比0.02％EDTA)；
4)细胞因子和胎牛血清，即2mM L-谷氨酰胺、5-100ng/ml碱性成纤维生长因子、20ng/ml表皮生长因子和10％胎牛血清；
5)使用说明书；
其中，所述使用说明书包括实施例1-3中描述的方法。
实施例5 兔耳粉刺模型皮肤体内实验
购自军事医学科学院动物中心的18只实验新西兰大白兔，雄性，清洁级，于实验组每只兔左耳内侧面耳导管开口处约2cm×2cm范围，每日涂2％煤焦油溶液1次，每次约涂1-0.5ml，连续2周以制作动物痤疮模型。右耳不涂抹作正常对照。实验组兔耳涂药1周后，耳部皮肤增厚、***，毛孔***大，可见白头粉刺及黑色角栓；涂药2周，可见涂药处毛孔变得更粗大，其毛囊口处见明显黑色角栓，呈黑头粉刺状，同时毛囊口***可见较多红色丘疹及少许脓疱，整个兔耳表面粗糙，按痤疮分类属轻到中度(I-II级)。而正常兔右耳薄、柔软，其上毛囊口排列整齐，未见粉刺、丘疹及脓疱等。
造模成功后，随机分为A、B和C三组，每组6只，A组为实施例3制备的重组PPARα和PPARγ慢病毒共转染MSCs移植组，于裸鼠背部和腹部取两处皮肤进行真皮层皮下注射5×105细胞，体积50μl；B组实施例2制备的间充质干细胞移植组，与A组同样方案注射间充质干细胞；C组为生理盐水对照组，同样注射50μl生理盐水。
末次给药后对三组家兔造模耳造模部位及正常右耳做肉眼观察，并取病理活检，以10％***固定，石蜡包埋、切片，苏木素-伊红(HE)染色，应用购买北京碧云天生产的苏木素-伊红染色试剂盒按照使用说明书进行，光镜下观察组织学改变。
造模前兔耳颜色粉红、菲薄、柔软，其上可见清晰的毛细血管，毛囊口排列整齐，造模后第4-5天，兔的外耳道毛囊口出现黑色角栓，呈黑色粉刺状，毛囊口***呈丘疹状，后逐渐增多。图4A为生理盐水对照组兔左耳粉刺HE组化显示外耳道毛囊口的黑色粉刺状角栓和丘疹显著增多。图4B为经PPARα和PPARγ慢病毒共转染MSCs移植2周后，与MSCs移植和生理盐水对照组比较，毛囊角栓明显减少，部分角栓脱落后遗留点状凹陷的毛囊，丘疹变平减少；表明PPARα和PPARγ慢病毒共转染MSCs表达PPARα和PPARγ后更好地改善了兔耳粉刺的外观，达到美容效果。
正常右耳组织学表现：表皮组织2-4层，毛囊上皮轻度增厚，真皮层偶见单核炎细胞浸润。图5A为生理盐水对照组兔左耳角化过度，表皮和毛囊上皮不规则增厚，其中颗粒层增厚明显；毛囊扩张，其中充满角化物质，相邻的毛囊相互融合；真皮浅层炎细胞浸润。图5B为经PPARα和PPARγ慢病毒共转染MSCs移植2周后，与MSCs移植和生理盐水对照组比较，角化程度明显减轻，基本恢复正常，真皮浅层少量炎细胞浸润；表明PPARα和PPARγ慢病毒共转染MSCs表达PPARα和PPARγ后更好地抑制了毛囊口上皮细胞角化和炎症反应。
实施例6 兔耳粉刺模型病理组织学分级分析
实施例5中兔耳粉刺模型使用实施例3制备的重组PPARα和PPARγ慢病毒共转染MSCs体内实验，移植2周后通过耳中央动脉采集兔外周血，通过1000rpm离心10分钟后获得血清。使用TNF-α酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒检测TNF-α分泌水平(购自美国R&D公司)，根据美国R&D公司TNF-αELISA试剂盒使用说明进行检测。图6中PPARα和PPARγ慢病毒共转染MSCs移植组TNF-α分泌显著低于MSCs移植组合和生理盐水对照组，均值分别为266.93pg、449.36pg和967.92pg；表明PPARα和PPARγ慢病毒共转染MSCs抑制了兔耳粉刺模型炎症因子的TNF-α分泌。
实施例5中兔耳粉刺模型移植2周后病理组织学分级分析，即：
角化程度：与正常组织相同(-)；角化物质轻度增厚(+)；中度增厚(2+)；最著增厚(3+)；
表皮增厚程度：与正常组织相同(-)；细胞层数4～5层(+)；6-7层(2+)；8～9层(3+)；
毛囊内角化物质多少：与正常组织相同(-)；角化物质增多，但不致密，且未充满毛囊(+)；角化物质致密，但未充满毛囊，或角化物质不致密，但充满毛囊(2+)；角化物质致密，充满毛囊(3+)；
毛囊扩张程度：与正常组织相同(-)；轻度扩张(+)；中度扩张(2+)；高度扩张(3+)；
炎细胞浸润程度：与正常组织相同(-)；局灶性炎细胞浸润，细胞散在(+)；局灶性炎细胞浸润，细胞较密集，或出现多个浸润灶(2+)；弥漫性炎细胞浸润(3+)。正常组织学表现：表皮组织2-4层，毛囊上皮轻度增厚，真皮层偶见单核炎细胞浸润。
表1 兔耳痤疮模型的病理改变情况
从表1可以看出，在角化程度、表皮增厚程度、角化物质多少、毛囊扩张程度及炎细胞浸润五方面，PPARα/γ-MSCs移植组和MSCs移植组明显好于生理盐水对照组，均具有显著性差异(p＜0.05)。而且PPARα/γ-MSCs移植组也比MSC移植组在上述五个方面均明显下降，并得到很好的改善，具有显著性差异(p＜0.05)。这一结果表明PPARα/γ-MSCs移植表达PPARγ后，抑制了细胞角化和炎症反应，从而提高了粉刺的治疗效果。

Claims (10)

1.一种用于皮肤粉刺治疗的间充质干细胞(MSCs)的制备方法，其特征在于，所述方法包括构建过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)和γ(PPARγ)的基因片段，重组到病毒表达载体上，包装成病毒后并共转染间充质干细胞，制备成可高表达PPARα和PPARγ的间充质干细胞；其中，感染后72小时荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白GFP(Green fluorescentprotein)的发光情况，GFP显色超过90％以上；
按照荧光定量PCR试剂盒的使用说明书进行检测，转染了PPARα和PPARγ病毒载体的MSCs传代培养到第10代后，其表达PPARα和PPARγ基因高于未转染的MSCs至少100倍以上；
所述间充质干细胞经流式细胞检测，其标志物CD90、CD105、CD73和CD44表达90％以上；
所述转染了重组PPARα和PPARγ病毒的MSCs具有如下性能：抑制皮肤炎症反应、阻止毛囊上皮细胞角化异常和改善皮肤修复；且无瘤性。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过PCR技术扩增过氧化物酶体增殖物激活受体α和γcDNA序列，重组到表达质粒上，经酶切位点连接到病毒表达载体上，基因重组病毒载体转染间充质干细胞。
3.根据权利要求1-2任一项所述的方法，其特征在于，所述间充质干细胞来源废弃脐带、脐血、胎盘、自体骨髓或脂肪；优选地来源于脐带。
4.一种用于皮肤粉刺治疗的间充质干细胞的方法，其特征在于，将人PPARα和PPARγ序列通过PCR从正常人外周血基因组DNA中扩增下来，使用PPARα引物为，正链：5’-GCTCGAGATGGTGGACACGGAAAGCCCA-3’，反义链：5’-CCATATGGTCAGTACATGTCCCTGTAG-3’；PPARγ引物为，正链：5’-GCTCGAGATGACCATGGTTGACAC-3’，反义链：5’-CCATATGGTGAACATGATCCATATGG-3’；将PPARα和PPARγ目的片段分别和XhoI/Nde I双酶切的pET28a载体片段，在T4DNA连接酶作用下，于4℃、12小时连接反应制备克隆连接液，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a后，进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定；PCR产物凝胶电泳检测和测序鉴定符合PPARα、PPARγ大小和序列后，将测序正确的菌液转接于10ml含氨苄抗生素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，用无内毒素质粒小提中量试剂盒进行质粒抽提，抽提合格的重组质粒放置-80℃超低温冰箱中长期保存；所述PPARα和PPARγ基因片段大小为1407bp和1434bp；
分别将PPARα、PPARγDNA片段和GV358载体进行XhoI/Nde I双酶切，在T4DNA连接酶作用下，将PPARα、PPARγ片段和酶切GV358载体于37℃、12小时连接反应制备克隆连接液，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a后，进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定；
取细胞状态良好，处于对数生长期的293T细胞，细胞计数后，按照每个10cm的培养皿6×106个细胞数接种于培养皿中，37℃，5％CO2的培养箱中培养过夜；第二天转染前移去培养液，换5ml Opti-MEM培养液；取9μg包装混合液和3μg慢病毒表达质粒加入1.5ml Opti-MEM中，轻轻混匀，取36μl lipofectamine2000加入1.5ml Opti-MEM中，轻轻混匀，室温放置5min；混合质粒溶液和lipofectamine 2000稀释液，置室温20min；混合液缓慢滴加至293T细胞的培养液中，混匀，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养；培养6h后弃去含有转染混和物的培养基，加入10ml的PBS液清洗一次，轻柔晃动培养皿以洗涤残余的转染混和物后倒弃；缓慢加入含10％血清的细胞培养基20ml，于37℃、含5％CO2培养箱内继续培养48-72h；
根据细胞状态，收集转染后48h的293T细胞上清液；于4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；以0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；分别配平样品，将带有病毒上清液的超速离心管逐一放入至超速离心机内，设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4℃；离心结束后，弃去上清，去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液，反复吹打重悬；经充分溶解后，高速离心10000rpm，离心5min后，取上清荧光法测定滴度，包装好的PPARα和PPARγ慢病毒按照50μl 2E+8TU/ml分装，保存于-80℃超低温冰箱；
将重组PPARα和PPARγ慢病毒分别以10μl 1E+7TU/ml加入到间充质干细胞的六孔培养板中共转染，体系为2ml，混匀，37℃、5％CO2的培养箱中孵育8-12个小时后，更换完全培养液α-MEM；所述完全培养液优选含α-MEM含2mM L-谷氨酰胺、5-100ng/ml碱性成纤维生长因子、5-100ng/ml表皮生长因子和和5-10％胎牛血清；当细胞生长融合达到90％时，用0.25％胰酶消化，转入25cm2培养瓶中生长，1孔对应1个培养瓶，在25cm2培养瓶中融合达到90％时继续消化传代培养；生长转染分为3组：未转染对照组、空白慢病毒转染组和转染了PPARα和PPARγ慢病毒共转染组；
感染后72小时荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)的发光情况，GFP显色超过90％以上；
通过荧光定量PCR试剂盒按照使用说明书检测，使用PPARα引物为，正义链5’-GCGAACGATTCGACTCAAGC-3’，反义链：5’-CATCCCGACAGAAAGGCACT-3’；和PPARγ引物：正义链5’-TGGTGGGTTCTCTCTGAGTCTG-3’，反义链：5’-ATCCACGGAGCTGATCCCAA-3’；共转染了PPARα和PPARγ慢病毒转染间充质干细胞传代培养到第10代后，其表达PPARα和PPARγ基因高于未转染的MSCs分别为145.67倍和167.89倍。
5.一种如权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于，
重组PPARα和PPARγ慢病毒转染的MSCs通过完全培养液α-MEM体外传代培养，当细胞培养到第5-6天，细胞生长融合达到90％以上，需要使用质量体积比为0.25％的胰酶消化传代；
取传代培养到1代和10代MSCs倒置显微镜下观察的细胞形态，未转染的MSCs与其他转染目的基因的MSCs具有相似的细胞形态，细胞成梭形生长。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述人间充质干细胞的制备，采用以下步骤：
取1-2cm废弃脐带经含2倍青霉素和链霉素双抗的1×PBS洗涤三次，使用眼科剪将脐带剪碎至1mm3，用含2倍青霉素和链霉素双抗的1×PBS重悬后1000转每分钟离心，其上清后用间充质干细胞培养基重悬，吸取10ml加入到75cm2细胞培养瓶中，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养48小时；更换新鲜含细胞因子的间充质干细胞培养基再连续培养，直到细胞从组织中爬出来；所述细胞培养基α-MEM优选含2mM L-谷氨酰胺、5-100ng/ml碱性成纤维生长因子、5-100ng/ml表皮生长因子和5-10％胎牛血清；
待细胞生长比较密时，使用质量体积比为0.25％的胰酶进行消化，用10ml含细胞因子的间充质干细胞培养基重悬后转移到新的75cm2培养瓶中，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养直到生长融合达到90％，使用0.25％胰酶进行消化传代培养，即1瓶传代2瓶，补充新鲜含细胞因子的间充质干细胞培养基继续培养，培养到第5代时，间充质干细胞使用0.25％胰酶消化，即获得间充质干细胞；重悬至含10％二甲基亚砜的胎牛血清中冻存在液氮中；所述胰酶优选含质量体积比0.02％的EDTA；
取苔盼兰染色计数后的1.0×106MSC细胞，分三组，第一组分别添加到有20μL FITC-鼠抗人CD34单抗；20μL PE-鼠抗人CD90单抗；第二组分别添加20μL FITC-鼠抗人CD14单抗；20μL PE-鼠抗人CD73单抗；第三组分别添加20μL FITC-鼠抗人CD45单抗；20μL PE-鼠抗人CD44单抗；第四组分别添加20μL FITC-鼠抗人CD19单抗；20μL PE-鼠抗人CD105单抗；第五组为同型对照，分别添加到有20μL FITC标记鼠IgM和20μL PE标记鼠IgM；置于4℃冰箱染色30分钟，然后用1mL的1×磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤三次，最后用0.5mL的1×PBS重悬洗涤后的细胞，所得洗涤后的细胞用FACS Calibur流式细胞仪检测；
结果显示，人间充质干细胞经流式细胞技术检测，MSCs标志物CD90、CD73、CD105和CD44表达分别为99.08％、99.85％、99.88％和99.60％；CD34、CD14、CD45和CD19表达为0.00％、0.21％、0.58％和0.04％。
7.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述治疗皮肤粉刺的间充质干细胞，在兔耳粉刺模型体内实验中，与单独的MSCs移植和生理盐水对照组相对比，抑制了兔耳粉刺模型炎症因子的TNF-α分泌，均值分别为266.93pg、449.36pg和967.92pg。
8.一种制备如权利要求1-7任一项所述的用于皮肤粉刺治疗的间充质干细胞的试剂盒产品，其特征在于，所述试剂盒包括：
1)间充质干细胞基础培养基；
2)包装好的PPARα和PPARγ高表达病毒；
3)消化细胞的酶；
4)细胞因子以及；
5)使用说明书；
其中，所述使用说明书包括权利要求1-7任一项所述的的方法。
9.一种如权利要求1-7任一项所述的制备方法，其特征在于，所述治疗皮肤粉刺的间充质干细胞过表达细胞生长因子，体内体外实验表明均无瘤性。
10.一种如权利要求1-9任一项所述转染了重组PPARα和PPARγ病毒的间充质干细胞及其应用。
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