CN106000326B - 一种超耐受金属螯合亲和填料的制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及纯化填料的制备技术领域，特别是一种超耐受金属螯合亲和填料的制备和应用，该制备方法包括配体偶联和金属离子螯合步骤，所得金属螯合亲和填料(IMAC)，螯合有非常牢固的金属离子，可应用于带有组氨酸标签(His‑tag)蛋白的捕获和纯化；该类型亲和填料耐受性能优异，可在含有EDTA及DTT的情况下进行目的蛋白高效纯化，避免繁琐的纯化前切换缓冲液的处理；使用过程中金属离子脱落少，无需剥离金属离子，即可进行1M氢氧化钠在位清洗，可有效简化填料的再生处理步骤，具有强组分兼容性，适用于广泛底物及盐浓度的缓冲条件，具有载量高，纯化纯度高，使用寿命长，使用成本低的优点，适宜进一步推广应用。

Description

一种超耐受金属螯合亲和填料的制备和应用
技术领域
本发明涉及蛋白质纯化填料的制备技术领域，特别是一种超耐受金属螯合亲和填料的制备和应用。
背景技术
金属螯合亲和填料(IMAC)是蛋白质纯化领域十分关键的技术，在蛋白质功能与结构研究以及重组蛋白质药物纯化等方面具有广泛应用。它的基本原理是利用天然或者重组蛋白质上组氨酸、半胱氨酸等氨基酸残基和螯合在固相微球上的金属离子形成配位键，将目的蛋白从溶液中吸附到固相微球的表面，达到分离纯化的目的。天然蛋白含有的组氨酸、半胱氨酸等残基数量有限且很少连续分布，因此和金属螯合亲和填料结合力较低，达不到特异性亲和纯化的目的。当前常用解决方法是：利用基因重组技术，在目的蛋白上引入一段组氨酸标签(通常为六个连续的组氨酸，His6-tag)，增强特定目的蛋白与金属螯合亲和填料的结合强度；用低浓度的咪唑将结合力较弱的杂蛋白洗去，再用高浓度咪唑将目的蛋白洗脱。当前市场主流的金属螯合亲和填料的螯合配基主要有两个形式：乙酸基的亚胺二乙酸(IDA)和三个乙酸基的胺三乙酸(NTA)，也就是通常所说的IDA和NTA螯合填料；螯合的金属离子最为长见的是二价镍离子(Ni2+),此外也可以是其它二价金属离子例如Fe2+、Zn2+、Cu2+、Co2+等，少数其它价态的金属离子例如Fe3+、Ni3+、Cd4+、Ti4+等也可以用于金属螯合亲和填料的制备。
当前的金属螯合亲和填料纯化蛋白质存在两个主要问题：1)蛋白质是一类具有生物活性的物质，在纯化过程中可能发生蛋白酶解、物理变性等损伤而失去活性，因此纯化中需要使用缓冲溶液来稳定pH以及加入DTT等还原剂稳定氧化还原电位，有时还需要加入EDTA等蛋白酶抑制剂。重组蛋白常见的表达体系分为原核表达***例如大肠杆菌表达***和真核表达***例如CHO细胞表达体系。为提高重组蛋白的表达量，这些表达体系中通常会加入半胱氨酸、金属微量元素等成分。对于目前的IDA和NTA形式的金属螯合填料来说，EDTA、Cys、DTT、金属离子的耐受范围十分有限。超过耐受范围，填料对蛋白的特异性结合能力被破坏。因此，在重组蛋白纯化过程中，需要进行复杂的前处理程序，例如浓缩和置换缓冲液。2)纯化填料每一次纯化完成之后都需要进行清洗，当前的金属螯合亲和填料无法耐受0.1M以上浓度的氢氧化钠，在位清洗时必须先剥离金属离子，碱洗后再螯合金属离子。这一过程需要大量的时间，降低了使用效率，同时产生大量的游离金属离子造成环境污染。
针对上述问题，开发一种金属螯合亲和填料，使之具有超耐受的特性，减少蛋白纯化的上游样品前处理步骤以及简化下游填料清洗步骤是本领域技术人员要解决的重要问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：针对现有技术中的上述问题，提供一种超耐受金属螯合亲和填料的制备和应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种超耐受金属螯合亲和填料的制备方法，该制备方法是在固相微球表面偶联配体，配体通过多个配位键作用螯合金属离子，制备方法具体为：将偶联配体填料加入金属离子溶液10-30℃反应2-12h得金属螯合亲和填料；所述配体结构式为如下Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ或Ⅳ中的一种，其中，A为N、P或S中的一种，B为羟基、伯胺、仲胺、羧基、巯基、环氧基或烯丙基中的一种，M为羟基、伯胺、仲胺、羧基或磷酸根中的一种，n为1-3；
进一步，上述技术方案中所述偶联配体填料的制备方法为：采用氨基反应法将微球加入环氧氯丙烷、NaOH溶液，DMSO于30-45℃振荡活化1-2h，活化完毕后将微球清洗干净至无环氧氯丙烷；加入配体，在pH为9-11，30-50℃条件下反应24h得偶联配体填料；其中NaOH溶液为1-3M,环氧氯丙烷与微球加入量比例为(0.1-0.5)mg：1mL或(0.1-0.5)mg：1g，配体与微球加入量比例为(10-100)mg：1mL或(10-100)mg：1g。
进一步，上述技术方案中所述偶联配体填料的制备方法为采用羧基反应法，首先将微球加入环氧氯丙烷、NaOH溶液，DMSO于30-45℃振荡活化1-2h，活化完毕后将微球清洗干净至无环氧氯丙烷；加入胺在pH为9-11，30-50℃条件下反应24h得氨基活化填料；其中，NaOH溶液为1-3M,环氧氯丙烷与微球加入量比例为(0.1-0.5)mg：1mL或(0.1-0.5)mg：1g，胺与微球加入量比例为(0.01-0.1)mg：1mL或(0.01-0.1)mg：1g；然后将配体溶于0.1M MES，加入上述氨基活化填料，在pH为5.0时加入0.1M EDC,20-30℃反应1h后，在pH为5.0时继续反应24h得偶联配体填料；其中，配体与微球加入量比例为(10-100)mg：1mL或(10-100)mg：1g；所述胺为含有两个或以上氨基的有机胺类，优选乙二胺或己二胺。
进一步，上述技术方案中所述金属离子溶液为二价金属离子Fe2+、Ni2+、Zn2+、Cu2+或Co2+中的一种或是Fe3+、Ti4+等其它价态金属离子中的一种；所述微球为天然高聚物微球、化学合成的高聚物微球、天然高聚物和人工合成高聚物混合微球、包含磁性壳层或者磁核的磁性微球，其中，天然高聚物微球包括琼脂糖微球、葡聚糖微球、壳聚糖微球；化学合成的高聚物微球包括聚苯乙烯微球、聚苯二乙烯微球、聚丙烯酸微球、聚甲基丙烯酸酯的微球；所述微球粒径为0.1μm-500μm，优选20-300μm。
进一步，所述的一种超耐受金属螯合亲和填料的应用是指该填料在组氨酸标记蛋白的捕获和纯化的应用、在含有EDTA及DTT的情况下进行目的蛋白高效纯化的应用。
有益效果：采用本发明的技术方案制备的IMAC填料，螯合有非常牢固的金属离子，可应用于组氨酸标记蛋白的捕获和纯化或分泌到真核培养液上清中的组氨酸标记蛋白的捕获和纯化，无需置换缓冲液和浓缩；可耐受常规试剂，金属离子脱落少，使用寿命较长，可在含有EDTA及DTT的情况下进行目的蛋白高效的纯化，有效节约使用成本；具有强组分兼容性，适用于广泛底物及盐浓度的缓冲条件，具有载量高，纯化纯度较高，使用成本低的优点，适宜进一步推广应用。
附图说明
下面将对实施例描述中所需要使用的附图做简单地介绍。
图1是实施例四的电泳结果图；
图2和3是实施例五的电泳结果图；
图4是实施例五填料重复使用率效果图；
图5是G公司和本发明的Ni Smart Beads 6FF产品纯化效果对比图；
图5中S1是Ni Smart Beads 6FF，S2是G公司同类产品。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不局限于下述实施例。
实施例一
一种超耐受金属螯合亲和填料Ni Smart Beads 6FF的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(1)氨基反应：将琼脂糖微球加入环氧氯丙烷、NaOH溶液，DMSO于35℃振荡活化2h，活化完毕后将琼脂糖微球清洗干净至无环氧氯丙烷；加入配体，在pH为10，40℃条件下反应24h得配体偶联填料；其中NaOH溶液为2M,环氧氯丙烷与微球加入量比例为0.2mg：1g，配体与微球加入量比例为100mg：1g；
(2)金属离子螯合
将上述偶联配体填料加入50-100mg/ml NiSO4溶液，25℃反应2h即得超耐受金属螯合亲和填料；其中所述配体结构式为
实施例二
一种超耐受金属螯合亲和填料Co Smart Beads 6FF的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(1)配体偶联
利用羧基反应：将琼脂糖微球加入环氧氯丙烷、NaOH溶液，DMSO于30℃振荡活化2h，活化完毕后将微球清洗干净至无环氧氯丙烷；加入乙二胺，在pH为11，30℃条件下反应24h得氨基活化填料；其中NaOH溶液为1M,环氧氯丙烷与微球加入量比例为0.4mg：1g，胺与微球加入量比例为0.1mg：1g；
将配体溶于0.1M MES，加入上述氨基活化填料，在pH为5.0时加入0.1M EDC,20-30℃反应1h后，在pH为5.0时继续反应24h得偶联配体填料；其中，配体的的加入量50mg/ml填料；
(2)金属离子螯合
将上述偶联配体填料加入100mg/ml CoSO4 30℃反应2h即得超耐受金属螯合亲和填料；所述配体结构式为：
实施例三
一种超耐受金属螯合亲和填料Cu Smart Beads 6FF的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(1)配体偶联
利用羧基反应：将配体溶于0.1M MES，加入氨基磁性微球，在pH为5.0时加入0.1MEDC,20℃反应1h后，在pH为5.0时继续反应24h得偶联配体填料；其中，配体的加入量100mg/ml填料；
(2)金属离子螯合
将上述偶联配体填料加入75mg/ml CuSO4 10℃反应8h即得超耐受金属螯合亲和填料；所述配体结构式为：
实施例四组氨酸标记蛋白的捕获和纯化的应用
将上述实施例一所得填料标记为Ni Smart Beads 6FF，采用对比填料Ni IDABeads 6FF进行对比试验。首先，将发酵菌体悬浮于裂解液中，超声破碎，样品量为200ml，样品中含有大量的金属离子化合物：Fe2SO4、CuSO4、KI、MnSO4、Na2MoO4、Zn2SO4、CoCl2、CaCl2，普通镍柱很难实现直接上样纯化，使用一次后柱子外观发生变化需要再生；分别取Ni SmartBeads 6FF 10ml和Ni IDA Beads 6FF 10ml装柱；以无咪唑缓冲液作为平衡缓冲液和洗杂缓冲液；分别用含20mM和250mM咪唑的缓冲液作为洗脱缓液；收集流穿，洗脱组分进行检测，结果如下：
电泳结果如附图1所示，由附图1可知，超耐受纯化填料纯化的His标签蛋白，可以在低浓度咪唑条件下洗脱，洗脱样品纯度更高，其中1为原样；2为20mM咪唑洗脱；3为250mM咪唑洗脱，Ni Smart Beads 6FF在使用前后外观无变化，Ni IDA Beads 6FF使用后颜色明显变浅，载量明显降低。
实施例五在含有EDTA及DTT等的情况下进行目的蛋白高效纯化的应用
将上述实施例二所得填料标记为Co Smart Beads 6FF进行EDTA及DTT耐受性试验，结果如下：
上样前的Co Smart Beads 6FF、含有10mM DTT的样品处理过的Co Smart Beads6FF、含有100mM EDTA的样品处理过的Co Smart Beads 6FF颜色无明显变化。将上述实施例三所得填料标记为Cu Smart Beads 6FF进行酸碱耐受性试验，结果如下：
试剂 时间 载量(mg/ml)
0.01M HCl 10天 28.08
0.01M NaOH 10天 23.34
6M盐酸胍 24h 30.49
1M NaOH 24h 27.4
酸碱耐受试验后填料的电泳结果如附图2和3所示，由图可知，填料对试剂耐受能力很强，用0.01M HCl和0.01M NaOH浸泡10天后的填料仍可以使用，用6M盐酸胍和1M NaOH浸泡24小时，填料仍可以使用，其中，4为原样，5为流出，6为0.01M HCl处理后洗脱，7为0.01M NaOH处理后洗脱，8为原样，9为流出，10为6M盐酸胍处理24h后洗脱，11为1M NaOH处理24h后洗脱。
将本发明的实施例一所得填料在使用后用0.1M NaOH或0.5M NaOH清洗5CV，然后平衡液平衡后正常检测，结果如附图4所示，由图可知，采用本发明的技术方案所得的填料在清洗后重复使用率较好，具有使用寿命较长，使用成本低的优点，适宜进一步推广应用。
实施例六
将本发明的实施例一所得填料在His标签蛋白纯化中应用，以0-200mM咪唑线性梯度洗脱，结果如附图5所示，S1代表Ni Smart Beads 6FF S2代表G公司同类产品，，由图可知，采用本发明的技术方案所得的填料比现有的G公司的同类产品洗脱咪唑浓度更低，峰更集中，纯化效果更好。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (4)

1.一种超耐受金属螯合亲和填料的制备方法，其特征是：该填料制备方法为：将偶联配体的填料加入金属离子溶液10-30℃反应2-12h得金属螯合亲和填料；所述偶联配体结构式为如下Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ或Ⅳ中的一种，其中，A为N、P或S中的一种，B为羟基、伯胺、仲胺、羧基、巯基、环氧基或烯丙基中的一种，M为羟基、伯胺、仲胺、羧基或磷酸根中的一种，n为1-3；
所述偶联配体的填料的制备方法为：采用氨基反应法将微球加入环氧氯丙烷、NaOH溶液，DMSO于30-45℃振荡活化1-2h，活化完毕后将微球清洗干净至无环氧氯丙烷；加入配体，在pH为9-11，30-50℃条件下反应24h得偶联配体的填料；其中NaOH溶液为1-3M,环氧氯丙烷与微球加入量比例为(0.1-0.5)mg：1mL或(0.1-0.5)mg：1g，偶联配体与微球加入量比例为(10-100)mg：1mL或(10-100)mg：1g；
或者，所述偶联配体的填料的制备方法为采用羧基反应法，首先将微球加入环氧氯丙烷、NaOH溶液，DMSO于30-45℃振荡活化1-2h，活化完毕后将微球清洗干净至无环氧氯丙烷；加入胺在pH为9-11，30-50℃条件下反应24h得氨基活化填料；其中，NaOH溶液为1-3M,环氧氯丙烷与微球加入量比例为(0.1-0.5)mg：1mL或(0.1-0.5)mg：1g，胺与微球加入量比例为(0.01-0.1)mg：1mL或(0.01-0.1)mg：1g；
然后将偶联配体溶于0.1M MES，加入上述氨基活化填料，在pH为5.0时加入0.1M EDC，20-30℃反应1h后，在pH为5.0时继续反应24h得偶联配体的填料；其中，偶联配体与微球加入量比例为(10-100)mg：1mL或(10-100)mg：1g；
所述金属离子为Fe2+、Ni2+、Zn2+、Cu2+、Fe3+、Ti4+或Co2+中的一种。
2.根据权利要求1所述的一种超耐受金属螯合亲和填料的制备方法，其特征是：所述微球为天然高聚物微球、化学合成的高聚物微球、天然高聚物和人工合成高聚物混合微球、具有磁性壳层或者磁核的磁性微球、微球粒径为0.1μm-500μm。
3.根据权利要求1所述的一种超耐受金属螯合亲和填料的制备方法，其特征是：所述胺为含有两个或两个以上氨基的有机胺类。
4.根据权利要求1所述的一种超耐受金属螯合亲和填料的应用，其特征是：该填料在组氨酸标记蛋白的捕获和纯化的应用、在含有EDTA及DTT的情况下进行目的蛋白高效纯化的应用。
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