CN105999284A - 一种用于猪瘟活疫苗的耐热冻干保护剂、制备方法及其应用 - Google Patents

一种用于猪瘟活疫苗的耐热冻干保护剂、制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于猪瘟活疫苗的耐热冻干保护剂、制备方法及其应用，属于兽用生物制品制造技术领域。该保护剂，由以下质量百分含量的组分组成：菊糖0.2%～2.5%、葡聚糖0.5%～12%、聚乙烯吡咯烷酮1%～6%、乳糖0.5%～12%、蔗糖0.2%～6%、聚乙二醇0.05%～2.5%、组氨酸0.005%～0.6%、半胱氨酸0.05%～4%、DMEM培养基0.2%～4%，其余为注射用水。本发明还提供该耐热冻干保护剂制备方法及应用。本发明耐热冻干保护剂不含外源蛋白及明胶，避免了对动物的应激反应以及副作用，大大提高了疫苗的安全性，在冷冻干燥及储存过程中能够高效保护抗原活性，增加了疫苗的稳定性。

Description

一种用于猪瘟活疫苗的耐热冻干保护剂、制备方法及其应用
技术领域
本发明属于兽用生物制品制造技术领域，尤其是涉及用于猪瘟活疫苗的耐热冻干保护剂、制备方法及其应用。
背景技术
猪瘟(classical swine fever，CSF)俗称“烂肠瘟”，在欧美一些地区又称猪霍乱(hog cholera)、猪热病或古典猪瘟，是由黄病毒科瘟病毒属的猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)引起的一种急性、热性和高度接触性传染病，临床上以发病急、高热稽留、全身泛发性点状出血和脾梗死为主要特征。猪瘟的死亡率高，会给养猪业造成巨大的安全隐患和经济损失。
1908年，匈牙利Hutyra制备了CSFV高免血清，它能产生较强的保护力，但由于高免血清的价格昂贵，获取较困难，而且有散播的危险，故各国学者转向了灭活疫苗研究。灭活疫苗也存在免疫剂量大、免疫期短、产生免疫力较慢、不能引发局部免疫、仅能皮下或肌肉注射以及成本较高等缺点，故逐渐被猪瘟弱毒疫苗所取代。1955年，我国成功研制的猪瘟兔化弱毒疫苗(即C株)，在世界范围内的猪瘟免疫防控及最终根除的过程中起到了至关重要的作用，是防控猪瘟使用最多的疫苗。
市场上目前常见的猪瘟活疫苗有4种，均是以C株为基础，即猪瘟细胞活疫苗、猪瘟乳兔脾淋组织活疫苗、猪瘟成兔脾淋组织活疫苗和猪瘟-猪丹毒-猪肺疫三联苗。其中免疫效果较好的是猪瘟细胞活疫苗和猪瘟成兔组织脾淋苗，也是政府采购的专用猪瘟疫苗。
目前常用的猪瘟活疫苗冻干保护剂组方简单，大多含有蔗糖、明胶、牛血清白蛋白、水解乳蛋白等成分，但临床上已发现注射冻干疫苗时由明胶和外源蛋白引起的过敏等副作用；此外，传统的的保护剂耐热性能差，需要在冷冻条件下-15℃才能长期保存。
发明内容
本发明针对现有用于猪瘟活疫苗的耐热冻干保护剂因含外源蛋白、明胶带来副反应的问题，提供一种不含有外源蛋白和明胶、用于猪瘟活疫苗的耐热冻干保护剂，该耐热冻干保护剂在冷冻干燥及高温储存过程中能够高效保护抗原活性，而且对动物无刺激性和危害性，对猪安全。
本发明的另一目的是提供耐热冻干保护剂的制备方法，该方法操作方便。
本发明的再一目的是提供上述耐热冻干保护剂在制备猪瘟活疫苗方面的应用，制备的猪瘟活疫苗，能够耐受较高温度储存。
本发明的目的采用如下技术方案实现。
一种用于猪瘟活疫苗的耐热冻干保护剂，由以下质量百分含量的组分组成：菊糖0.2％～2.5％、葡聚糖0.5％～12％、聚乙烯吡咯烷酮1％～6％、乳糖0.5％～12％、蔗糖0.2％～6％、聚乙二醇0.05％～2.5％、组氨酸0.005％～0.6％、半胱氨酸0.05％～4％、DMEM培养基0.2％～4％，其余为注射用水。
在本发明中，菊糖的聚合度为2～10，葡聚糖为Dextran-40或Dextran-70，聚乙烯吡咯烷酮为PVP K30或PVP K90，聚乙二醇为PEG 200～400。
本发明还提供所述耐热冻干保护剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)将菊糖、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、乳糖、蔗糖、聚乙二醇溶于水，采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌；
(2)将组氨酸、半胱氨酸和DMEM培养基溶于水，采用过滤法进行除菌；
(3)将步骤(1)和(2)所得溶液混合，补足水，得到所述耐热冻干保护剂。
本发明还提供所述耐热冻干保护剂在制备猪瘟活疫苗方面的应用以及采用所述耐热冻干保护剂制备的猪瘟活疫苗。
本发明还提供猪瘟活疫苗的制备方法，包括如下步骤：将耐热冻干保护剂和猪瘟病毒液按体积比1:0.8～1.2混合，冷冻干燥后得到所述猪瘟活疫苗。
在本发明中，所述冷冻干燥方法如下：将耐热冻干保护剂和猪瘟病毒液的混合物放在冻干机箱体内的隔板上，在常压、2～5℃条件下预冷20～40min，然后按照0.5～1℃/min的速度降温至-38～-42℃并维持3～5h；将冻干机的冷阱降至-48～-52℃，箱体内抽真空至300～400mTorr；然后将所述隔板以0.2～0.8℃/min的速度升温至-22～-28℃并维持14～18h，之后以0.1～0.4℃/min的速度升温至-12～-17℃并维持8～12h，最后以0.2～0.8℃/min升温至20～24℃并维持5～7h。
与现有技术相比，本发明用于猪瘟活疫苗的耐热冻干保护剂的有益效果如下：本发明耐热冻干保护剂不含外源蛋白及明胶，避免了对动物的应激反应以及副作用，大大提高了疫苗的安全性。本发明耐热冻干保护剂在冷冻干燥及储存过程中能够高效保护抗原活性，有效解决了疫苗在保存、运输中的低温冷链问题，增加了疫苗的稳定性。采用本发明耐热冻干保护剂制备的猪瘟活疫苗，在2-8℃条件下至少能够储存36个月，在37℃条件下至少能够储存15天。因此，采用本发明耐热冻干保护剂制备的猪瘟活疫苗将大大降低失活风险，提高疫苗安全性。
具体实施方式
下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
实施例1耐热冻干保护剂1
耐热冻干保护剂1，由以下质量百分含量的组分组成：菊糖(聚合度(DP)为9)0.5％、葡聚糖(Dextran-70)5％、聚乙烯吡咯烷酮(PVP K30)3％、乳糖5％、蔗糖2％、聚乙二醇(PEG 200)1％、组氨酸0.3％、半胱氨酸1.5％、DMEM培养基(Gibco公司)3％，其余为注射用水。
耐热冻干保护剂1的具体制备步骤如下：
(1)称取菊糖(DP为9)、葡聚糖(Dextran-70)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP K30)、乳糖、蔗糖、聚乙二醇(PEG200)溶于少量注射用水中，高压蒸汽灭菌法灭菌30min，灭菌过程中控制温度为110℃，备用；
(2)称取组氨酸、半胱氨酸和DMEM培养基溶于少量注射用水中，用孔径为0.22μm的滤膜过滤除菌后备用；
(3)将步骤(1)和(2)制得的溶液混合，补足注射用水，得耐热冻干保护剂1。
制备猪瘟活疫苗1：将耐热冻干保护剂1与猪瘟病毒液(C株，病毒含量40×104RID/mL)以体积比1：1混合，分装至7ml西林瓶中，2ml/瓶，用丁基四叉塞半加塞后，置入冻干机箱体内进行冷冻干燥，得到猪瘟活疫苗1。
冷冻干燥的具体步骤为：将耐热冻干保护剂1与猪瘟病毒液的混合物放在冻干机箱体内的隔板上，在常压、4℃条件下预冷30min，然后按照1℃/min的速度降温至-40℃，在-40℃维持4h；将冻干机的冷阱降至-50℃，冻干机箱体内抽真空至350mTorr；然后将隔板以0.5℃/min的速度升温至-25℃，在-25℃维持16h，之后以0.25℃/min的速度升温至-15℃，在-15℃维持10h，最后以0.5℃/min升温至20℃，在20℃维持5h。
实施例2耐热冻干保护剂2
耐热冻干保护剂2，由以下质量百分含量的组分组成：菊糖(DP为5)2％、葡聚糖(Dextran-70)10％、聚乙烯吡咯烷酮(PVP K90)2％、乳糖1％、蔗糖0.5％、聚乙二醇(PEG400)2％、组氨酸0.01％、半胱氨酸3％、DMEM培养基0.5％，其余为注射用水。
耐热冻干保护剂2的具体制备步骤如下：
(1)称取菊糖(DP为5)、葡聚糖(Dextran-70)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP K90)、乳糖、蔗糖、聚乙二醇(PEG400)溶于少量注射用水中，高压蒸汽灭菌法灭菌30min，灭菌过程中控制温度为110℃，备用；
(2)称取组氨酸、半胱氨酸和DMEM溶于少量注射用水中，用孔径为0.22μm的滤膜过滤除菌后备用；
(3)将步骤(1)和(2)制得的溶液混合，补足注射用水，得耐热冻干保护剂2。
制备猪瘟活疫苗2：将耐热冻干保护剂2与猪瘟病毒抗原液(C株，病毒含量40×104RID/mL)以体积比1：1混合，分装至7ml西林瓶中，2ml/瓶，用丁基四叉塞半加塞后，置入冻干机箱体内进行冷冻干燥，得到猪瘟活疫苗2。
冷冻干燥的具体步骤为：将耐热冻干保护剂2与猪瘟病毒液的混合物放在冻干机箱体内的隔板上，在常压、3℃条件下预冷25min，然后按照0.5℃/min的速度降温至-38℃，在-38℃维持5h；将冻干机的冷阱降至-48℃，冻干机箱体内抽真空至400mTorr；然后将隔板以0.2℃/min的速度升温至-28℃，在-28℃维持14h，之后以0.1℃/min的速度升温至-17℃，在-17℃维持8h，最后以0.4℃/min升温至24℃，在24℃维持7h。
实施例3猪瘟新型耐热冻干保护剂3
猪瘟新型耐热冻干保护剂3，由以下质量百分含量的组分组成：菊糖(DP为2)0.2％、葡聚糖(Dextran-40)1％、聚乙烯吡咯烷酮(PVP K30)5％、乳糖10％、蔗糖5％、聚乙二醇(PEG 250)0.1％、组氨酸0.5％、半胱氨酸0.1％、DMEM培养基1.5％，其余为注射用水。
耐热冻干保护剂3的具体制备步骤如下：
(1)称取菊糖、葡聚糖(Dextran-40)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP K30)、乳糖、蔗糖、聚乙二醇溶于少量注射用水中，高压蒸汽灭菌法灭菌30min，灭菌过程中控制温度为110℃，备用；
(2)称取组氨酸、半胱氨酸和DMEM溶于少量注射用水中，用孔径为0.22μm的滤膜过滤除菌后备用；
(3)将步骤(1)和(2)制得的溶液混合，补足加注射用水，得耐热冻干保护剂3。
制备猪瘟活疫苗3：将本发明耐热冻干保护剂3与猪瘟病毒液(C株，病毒含量40×104RID/mL)以体积1：1比混合，分装至7ml西林瓶中，2ml/瓶，用丁基四叉塞半加塞后，置入冻干机箱体内进行冷冻干燥，得到猪瘟活疫苗3。
冷冻干燥的具体步骤为：将耐热冻干保护剂3与猪瘟病毒液的混合物放在冻干机箱体内的隔板上，在常压、2℃条件下预冷20min，然后按照1℃/min的速度降温至-42℃，在-42℃维持3h；将冻干机的冷阱降至-52℃，冻干机箱体内抽真空至300mTorr，然后将隔板以0.8℃/min的速度升温至-22℃，在-22℃维持18h，之后以0.4℃/min的速度升温至-12℃，在-12℃维持12h，最后以0.7℃/min升温至22℃，在22℃维持6h。
实施例4对照耐热冻干保护剂1
对照耐热冻干保护剂1(公开于CN102793927A)，由以下重量百分含量的组分组成：海藻糖5％、聚乙烯吡咯烷酮(PVP K30)2.5％、明胶2％、谷氨酸钠2％，D-山梨醇3.5％、多聚蛋白胨4.5％、L-精氨酸0.75％、维生素C 0.75％、余量为灭菌后的注射用水。
对照耐热冻干保护剂1的制备方法如下：(1)按所述重量配比称取聚乙烯吡咯烷酮(PVP K30)、明胶、D-山梨醇、多聚蛋白胨溶于少量注射用水中，110℃灭菌30min备用；(2)按所述重量配比称取海藻糖、谷氨酸钠、L-精氨酸、维生素C溶于少量注射用水中，用孔径为0.22μm的滤膜过滤除菌后备用；(3)将步骤(1)、(2)制得的溶液混合，加注射用水至全量即得。
对照猪瘟活疫苗1：取对照耐热冻干保护剂1与猪瘟病毒抗原液(C株，病毒含量40×104RID/mL)按照体积比为1:1.2混合，分装至7ml西林瓶中，2ml/瓶，用丁基胶塞半加塞后，冻干机箱体内。
冻干的具体步骤为：将混合液置入2℃的冻干箱中，以1℃/min的降温速率降至-35℃，在此温度下维持3.5h，开启真空泵，至箱内真空度达0.01mbar时开始升温，20h升至-6℃，再以6℃/h的升温速率升至25℃，在此温度下维持3h。
实施例5对照耐热冻干保护剂2
对照耐热冻干保护剂2(公开于CN103341176A)，具体制备方法如下：(1)A液配制：取NZ-胺3g、谷氨酸单钾盐0.375g，蔗糖25g、水解乳蛋白1.875g，将以上成分按顺序溶于100mL注射用水中，充分溶解后摇匀，用0.22μm的滤膜过滤除菌后2～8℃备用；(2)B液配制：取水解明胶20g，用70～80℃的注射用水100mL充分溶解后，121℃、15磅高压灭菌30分钟，灭菌后保存在37℃；(3)将A液与B液按4：1的比例进行配比，混合均匀即为耐热冻干保护剂，其中各组分的质量体积百分比浓度如下：2.4％NZ-胺、0.3％谷氨酸单钾盐、20％蔗糖、1.5％水解乳蛋白、4％水解明胶。
对照猪瘟活疫苗2：取对照耐热冻干保护剂2与猪瘟病毒抗原液(C株，病毒含量40×104RID/mL)按照体积比为1:4混合，分装至7ml西林瓶中，2ml/瓶，用丁基胶塞半加塞后，冻干机箱体内。
具体冻干步骤为：将混合液置入冻干箱中，选取预冻温度为-50℃，预冻时低温保持时间为2h、预冻前期控制在-15℃，待产品释放解析热后快速冷冻：升华阶段产品温度为-33℃、板层温度设定为-8℃、升华时间为11h；解析温度为26℃、解析时间为4h，冻干全程为24h，加塞出箱，得到对照猪瘟活疫苗2。
实施例6猪瘟活疫苗的检测
测定实施例1～5中各猪瘟活疫苗的物理性状、残余水分，在37℃条件下储存0d、10d对活疫苗病毒含量的影响，在2～8℃条件下储存不同时间对活疫苗病毒含量的影响。
冻干制品的物理性状、剩余水分测定按照现行《中华人民共和国兽药典》附录的方法和标准进行。具体结果见表1。从表1可以看出，均符合《中华人民共和国兽药典》附录的规定，且猪瘟活疫苗1、2和3在物理性状、真空度等方面均符合规定，残余水分比对照猪瘟活疫苗1和2均略低。猪瘟活疫苗冻干制品病毒含量检测方法按照现象《中华人民共和国兽用生物制品规程》进行。
表1猪瘟活疫苗的物理性状、残余水分测定结果
组别 物理性状 残余水分(﹤4％,n＝4) 真空度
猪瘟活疫苗1 疏松海绵状 1.01±0.09 符合规定
猪瘟活疫苗2 疏松海绵状 1.25±0.03 符合规定
猪瘟活疫苗3 疏松海绵状 1.09±0.12 符合规定
对照猪瘟活疫苗1 疏松海绵状 1.88±0.22 符合规定
对照猪瘟活疫苗2 疏松海绵状 1.69±0.19 符合规定
表2猪瘟活疫苗37℃10d和15d后病毒含量的测定结果
表2中：冻干损失是指湿毒和冻干后0d疫苗病毒含量的差值。耐热损失是指疫苗冻干0天后与37℃保存10天或15天后疫苗病毒含量的差值。
从表2可以看出，猪瘟活疫苗1、2和3在冻干过程中病毒含量损失在0.3～0.43Lg RID/1mL以下；在37℃条件下储存10天后，病毒含量损失均≤1.0LgRID/1mL，37℃条件下储存15天后，病毒含量损失为1.3Lg RID/1mL。猪瘟新型耐热活疫苗1、2和3在冻干和耐热过程中的病毒含量损失均小于或等于对照猪瘟耐热活疫苗。
表3猪瘟活疫苗于2～8℃保存不同时间后的病毒含量测定结果
从表3可以看出，猪瘟新型活疫苗1、2和3在冻干后在2～8℃保存36个月内，病毒含量损失为0.87～1.0LgRID/1mL，冻干损失与耐热损失之和为1.3LgRID/1mL，在不添加外源蛋白、明胶情况下，本发明耐热冻干保护剂的耐热损失小于对照组；同时降低了对动物的副作用，增加了制品的安全性。
实施例7猪瘟活疫苗的安全性
用生理盐水将猪瘟活疫苗1、猪瘟活疫苗2、猪瘟活疫苗3分别复溶成溶液，每头份含量为7500RID，按照1头份、5头份以及10头份剂量免疫。
动物试验共分为4组(表4)，分别是1头份、5头份以及10头份，免疫途径为肌肉注射，以及空白对照组(不免疫)。试验选取20日龄的仔猪，每组10只。
表4为耐热冻干保护剂的安全性动物试验分组
组别 猪只数量(只) 免疫剂量 免疫体积
A 10 1头份 0.5ml
B 10 5头份 2.5ml
C 10 10头份 5ml
D 10 不免疫 /
耐热冻干保护剂的安全性动物试验方法和研究的指标：
临床观察：在接种后的24h内，每隔2h观察一次仔猪有无不良反应；48h～72h，每隔8h观察一次仔猪有无不良反应；接种后3～14d内，每24h观察有无不正常反应。如有非特异性死亡，免疫组与对照组均应不超过1只。
结果：采用猪瘟活疫苗1、猪瘟活疫苗2、猪瘟活疫苗3分别按照1头份、5头份以及10头份剂量免疫20日龄仔猪后，猪只精神状况、采食、饮水、生长发育情况均正常，均未发现不良反应。因此本发明耐热冻干保护剂对猪只是安全的。

Claims (7)

1.一种用于猪瘟活疫苗的耐热冻干保护剂，其特征在于由以下质量百分含量的组分组成：菊糖 0.2%～2.5%、葡聚糖 0.5%～12%、聚乙烯吡咯烷酮 1%～6%、乳糖0.5%～12%、蔗糖0.2%～6%、聚乙二醇 0.05%～2.5%、组氨酸0.005%～0.6%、半胱氨酸0.05%～4%、DMEM培养基0.2%～4%，其余为注射用水。
2.根据权利要求1所述用于猪瘟活疫苗的耐热冻干保护剂，其特征在于菊糖的聚合度为 2～10，葡聚糖为Dextran-40或Dextran-70，聚乙烯吡咯烷酮为PVP K30或PVP K90，聚乙二醇为PEG 200～400。
3.权利要求1或2所述耐热冻干保护剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）将菊糖、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、乳糖、蔗糖、聚乙二醇溶于水，采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌；
（2）将组氨酸、半胱氨酸和DMEM培养基溶于水，采用过滤法进行除菌；
（3）将步骤（1）和（2）所得溶液混合，补足水，得到所述耐热冻干保护剂。
4.权利要求1或2所述耐热冻干保护剂在制备猪瘟活疫苗方面的应用。
5.采用权利要求1-2之一所述耐热冻干保护剂制备的猪瘟活疫苗。
6.权利要求5所述猪瘟活疫苗的制备方法，其特征在于包括如下步骤：将耐热冻干保护剂和猪瘟病毒液按体积比1:0.8～1.2混合，冷冻干燥后得到所述猪瘟活疫苗。
7.根据权利要求6所述猪瘟活疫苗的制备方法，其特征在于所述冷冻干燥方法如下：将耐热冻干保护剂和猪瘟病毒液的混合物放在冻干机箱体内的隔板上，在常压、2～5℃条件下预冷20～40min，然后按照0.5～1℃/min的速度降温至-38～-42℃并维持3～5h；将冻干机的冷阱降至-48～-52℃，箱体内抽真空至300～400mTorr；然后将所述隔板以0.2～0.8℃/min的速度升温至-22～-28℃并维持14～18h，之后以0.1～0.4℃/min的速度升温至-12～-17℃并维持8～12h，最后以0.2～0.8℃/min 升温至20～24℃并维持5～7h。
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