CN105999227A - FOXM1蛋白氮端（1-234 aa）的表达及其用途 - Google Patents

FOXM1蛋白氮端（1-234 aa）的表达及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了依据FOXM1蛋白氮端1‑234位氨基酸残基序列所产生的蛋白肽段的应用，其目的是提供一种以FOXM1为靶标开发蛋白类抗肿瘤药物的候选者。所述蛋白肽段具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1）序列表中SEQ ID NO：1；2）将序列表中SEQ ID NO：1取代、缺失、***和/或添加一个、两个或数个氨基酸残基，实现抑制或降低FOXM1的活性和功能的蛋白质。本发明依照FOXM1蛋白氮端1‑234位氨基酸序列所制备的具有穿膜能力的FOXM1‑氮端（1‑234aa）重组蛋白，表现出对多种肿瘤细胞的抑制作用，有望成为抗肿瘤蛋白类药物的候选者，将对研发具有自主知识产权的抗肿瘤药物具有重要意义。

Description

FOXM1蛋白氮端(1-234aa)的表达及其用途
技术领域
本发明属于基因工程学和肿瘤学领域，涉及一种人类FOXM1蛋白氮端(1-234aa)的表达及其用途。
背景技术
对多种人瘤样本进行基因表达分析后发现，转录因子FOXM1在肿瘤细胞中表达增高，对其表达水平的检测，已被用于多种肿瘤的诊断和预后(US 7056674、7081340、7308364、7526387、7531300、CN201510355817.5)。从基因功能角度，FOXM1首先被确认是一个调控细胞周期和细胞增殖的蛋白(Mol Cell Biol 1997.17:1626-1641)。在细胞增殖过程中，FOXM1参与调节细胞周期相关的多个基因转录，从而控制细胞的DNA复制与有丝***过程(Mol Cell Biol 1999.19:8570-8580,Proc Natl Acad Sci U S A 2002.99:16881-16886,Mol Cell Biol 2005.25:10875-10894)，还与DNA损伤修复有关(Mol Cell Biol2007.27:1007-1016,Cell Prolif 2010.43:494-504)，抑制其表达能有效终止细胞周期、阻断细胞生长(Proc Natl Acad Sci U S A 2002.99:16881-16886,Mol Cell Biol2005.25:10875-10894,Genes Dev 2004.18:830-850,Developmental Biology 2004.276:74-88,Proc Natl Acad Sci U S A 2001.98:11468-11473)。此外，FOXM1被确立是一个参与细胞干性维持的新因子(Nucleic Acids Res 2010.38:8027-8038)，抑制FOXM1导致无法获得诱导多能干细胞(iPSCs)，说明FOXM1是iPSCs重编程过程中的必须因子(PLoS One2014.9:e92304)。同时，FOXM1还被发现是刺激肿瘤细胞发生上皮间质转化的关键分子，抑制FOXM1可阻止癌细胞转移(Cancer Lett 2013.340:104-112)。在活体水平，不同器官中有条件敲除FOXM1可抑制肝癌、肺癌、结直肠癌等实体瘤的发生和发展(Genes Dev 2004.18:830-850,Cancer Res 2006.66:2153-2161,Gastroenterology 2007.132:1420-1431)。由于FOXM1在刺激细胞增殖、增强DNA损伤修复能力、促进细胞迁移、维持细胞干性等方面发挥主导作用，抑制FOXM1可有效抑制肿瘤的发生和发展，因此FOXM1被认为是肿瘤治疗药物开发的有效靶标(Biochim Biophys Acta 2007.1775:92-102)。以FOXM1为靶基因，通过腺病毒介导特异性干扰FOXM1的表达，从而实现肿瘤基因治疗的可能性已在多种实体瘤(肝癌、乳腺癌、鼻咽癌等)基因治疗研究中被证实(J Gene Med 2012.14:231-240,Cancer GeneTher 2013.20:117-124,Cancer Gene Ther 2014.21:133-138)。抑制FOXM1的小分子药物筛选工作也取得一定进展，其中，Thiostrepton、抗菌素Siomycin A等小分子化合物被发现能选择性抑制FOXM1的转录活性，从而抑制了肿瘤(PLoS One 2009.4:e5592,Nat Commun2014.5:5165,Mol Cancer Ther 2008.7:2022-2032,Cancer Res 2006.66:9731-9735)。本发明提出以FOXM1为靶标，开发抑制或降低FOXM1活性和功能的蛋白类药物，用于预防、治疗或延缓人类肿瘤。
总结针对FOXM1的肽段提出的肿瘤治疗手段，包括以下已公开的发明：1)鉴定可结合于HLA-A2的源自FOXM1的肽以活化可杀死癌细胞的人杀伤T细胞和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，提供对于高水平表达FOXM1的癌症患者实现癌症免疫治疗的手段(CN201510127580.5、US201514729752、CN201080017145.2)。2)以FoxM1c的DNA结合区原核重组质粒诱导表达获得的蛋白为靶标，从噬菌体随机肽库筛选和获得一组靶向FoxM1c的高效结合多肽，该类多肽可潜在作为先导分子用于肿瘤等相关疾病的治疗药物研发和诊断(CN201010515471.8)。
以胞内靶标开发的抗肿瘤蛋白类药物都需要进入肿瘤细胞发挥作用，因此必须具备穿透细胞膜进入细胞的能力。细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides，CPPs)是由氨基酸组成且具有穿透细胞膜能力的多肽，最早从人HIV-1的TAT蛋白中发现：该蛋白中包含具有穿膜能力的特殊肽段区域(Proc Natl Acad Sci U S A 1991.88:1864-1868,Cell1988.55:1189-1193)；此后，其他天然蛋白也被发现包含穿膜能力的肽段(J Biol Chem1994.269:10444-10450)。以此为基础，人们相继筛选和开发了包含不同蛋白来源穿膜肽序列的嵌合体穿膜肽(如transportan)(FASEB J 1998.12:67-77)和纯人工合成的穿膜肽(如多聚精氨酸肽段R8或R9等)(J Biol Chem 2001.276:5836-5840)，并可对其加以修饰提高稳定性和穿膜效率(Nucleic Acids Res 2011.39:3972-3987)。由于具备穿膜能力，穿膜肽一经发现就被认为可用于介导生物活性物质、特别是大分子量的蛋白质、核酸等分子进入细胞发挥作用，成为一种具有转染效率高、细胞对象类型广、细胞毒性低、方法简便等突出优点的药物递送方法(Ther Deliv 2013.4:573-591)(CN200680049953、200810155949)。一般认为，穿膜肽介导药物进入细胞的模式主要通过是能量依赖型的细胞内吞机制(J BiolChem 2003.278:585-590)，也有研究表明可通过直接细胞膜转位(J Biol Chem 2009.284:33957-33965)或物理内吞方式进入细胞(Int J Biochem Cell Biol 2012.44:869-875)，随后逃逸出内涵体并释放于细胞质中(Int J Biochem Cell Biol 2012.44:869-875)，实现药物功能。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：本发明以FOXM1为靶标开发蛋白类抗肿瘤药物，具体地，是从FOXM1蛋白序列中选定其氮端1-234位氨基酸，制备了FOXM1-氮端(1-234aa)重组蛋白，证明此段蛋白能抑制肿瘤细胞、成为抗肿瘤蛋白类药物的候选者。
本发明与已公开发明的区别，体现在从FOXM1蛋白序列中选定其氮端1-234位氨基酸，制备了FOXM1-氮端(1-234aa)重组蛋白，并证明此段蛋白能抑制肿瘤细胞、成为抗肿瘤蛋白类药物的候选者。基于天然FOXM1蛋白的氮端抑制FOXM1转录活性的发现(Oncogene2008.27:1696-1704,Mol Cell Biol 2008.28:3076-3087)，本发明运用CMV启动子介导FOXM1-氮端(1-234aa)转录的真核表达质粒，在肿瘤细胞中高表达FOXM1-氮端(1-234aa)蛋白，可有效抑制FOXM1的转录激活功能。该蛋白区段还参与介导了FOXM1与肿瘤促进因子Smad3的相互作用，这一蛋白互作对肿瘤进程具有重要影响(J Clin Invest 2014.124:564-579)，因此在肿瘤细胞中增高FOXM1-氮端蛋白区段，能竞争性阻碍FOXM1全长蛋白与Smad3的互作，从而干预FOXM1的促瘤功能。另外，FOXM1蛋白受多种信号通路调节，如Cdk1等磷酸激酶可磷酸化FOXM1蛋白的氮端，激活FOXM1的转录活性(J Biol Chem 2009.284:30695-30707)，因此增高FOXM1-氮端蛋白区段，可充当竞争性底物，阻碍促瘤信号通路对FOXM1的修饰活化作用。
在本申请中，本发明人运用CMV启动子介导FOXM1-氮端(1-234aa)转录的真核表达质粒，在肿瘤细胞中高表达FOXM1-氮端(1-234aa)蛋白，抑制了FOXM1的转录激活功能。在穿膜肽的选择上，本发明中运用原核表达体系制备了融合多聚精氨酸R9穿膜肽的绿色荧光蛋白(R9-GFP)，证实其有效穿膜并分布于细胞质和细胞核，表明R9穿膜肽是介导外源蛋白进入胞内的有效工具。以此为基础，本发明人结合多聚精氨酸R9穿膜肽，构建了穿膜肽融合人FOXM1蛋白氮端(1-234aa)的原核表达质粒；采用原核表达***和His标签亲和纯化手段，规模化制备穿膜肽融合人FOXM1蛋白氮端(1-234aa)的重组蛋白(命名为R9-FOXM1-N)。体外EMSA实验证实，R9-FOXM1-N可抑制FOXM1与其DNA结合位点的结合，表明R9-FOXM1-N蛋白具备抑制FOXM1转录活性的潜能。进一步运用R9-FOXM1-N直接处理肿瘤细胞，制备细胞裂解液进行Western Blotting检测，证明R9-FOXM1-N可有效进入细胞；该重组蛋白进入细胞后也抑制了肿瘤细胞中的FOXM1转录活性。本发明人选择了不同类型的肿瘤细胞(乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7、肺癌A549、肝癌HepG2等)开展实验，研究R9-FOXM1-N的不同处理剂量和处理时间对肿瘤细胞的抑制效果，证实了R9-FOXM1-N对肿瘤细胞的抑制作用。选择乳腺癌MDA-MB-436细胞作为细胞模型，对比R9-FOXM1-N与已知FOXM1小分子抑制剂Thiostrepton的抑瘤效果，发现二者对肿瘤细胞具有类似的半致死剂量(1-2μmol/L)；在相同工作浓度下，二者都能明显抑制MDA-MB-436细胞的成球能力，减弱肿瘤干细胞特征，表明在细胞水平R9-FOXM1-N这一蛋白分子表现出与小分子药物相媲美的药效。为探讨R9-FOXM1-N如何抑制FOXM1功能，我们初步考察了R9-FOXM1-N与肿瘤细胞中的目标蛋白是否发生相互作用，发现R9-FOXM1-N可与FOXM1全长蛋白、已知的FOXM1互作蛋白Smad3发生互作，提示了R9-FOXM1-N发挥抑瘤作用的可能机制。
更具体地，本发明提供了如下：
[1]一个来源于FOXM1蛋白氮端的片段，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。
[2][1]中的蛋白片段，取代、缺失、***和/或添加一个、两个或数个氨基酸，实现抑制或降低FOXM1的活性和功能。
[3]编码[1]所述蛋白片段的DNA序列。
[4]根据[3]所述的DNA序列，其特征在于：其DNA序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。
[5]含[3]所述DNA序列的表达载体。
[6]一种表达[1]所述蛋白片段的方法，是将含所述蛋白片段的DNA序列与表达穿膜肽的DNA序列形成融合开放阅读框，构建重组表达载体导入宿主细胞，表达得到具有穿膜能力的所述蛋白片段。
[7]根据[6]所述的方法，其特征在于：所述重组表达载体为pHis-FOXM1(1-234aa)-R9。
[8]根据[6]或[7]所述的方法，其特征在于：所述宿主为大肠杆菌时，需加入IPTG进行诱导表达，所加入IPTG的浓度为8μM，诱导时间为6小时。
[9]如[6]所述的方法用于制备治疗和/预防和/或辅助治疗癌症或者抗肿瘤的药物中的用途。
[10]一种抗肿瘤的药物，它的活性成分为[1]所述蛋白片段。
附图说明
图1显示了融合多聚精氨酸R9穿膜肽的EGFP重组蛋白(R9-GFP)可有效进入肿瘤细胞。
图2显示了在肿瘤细胞中过表达FOXM1氮端可抑制FOXM1的转录活性。
图3显示了R9穿膜肽融合人FOXM1蛋白氮端(1-234aa)的重组蛋白R9-FOXM1-N的规模化制备。
图4显示了R9-FOXM1-N重组蛋白可抑制FOXM1与其DNA结合位点的结合。
图5显示了R9-FOXM1-N重组蛋白可抑制肿瘤细胞中的FOXM1转录活性。
图6显示了R9-FOXM1-N重组蛋白对不同类型肿瘤细胞增殖的抑制作用。
图7显示了对比R9-FOXM1-N重组蛋白与FOXM1小分子抑制剂Thiostrepton的抑瘤效果。
图8显示了R9-FOXM1-N重组蛋白与肿瘤细胞中的特定蛋白发生互作。
具体实施方式
下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。
实施例1验证多聚精氨酸R9穿膜肽的有效穿膜，证实融合多聚精氨酸R9穿膜肽的EGFP重组蛋白(R9-GFP)可有效进入肿瘤细胞。
1.原核表达载体pET15b-R9-GFP的构建
1)R9-GFP基因片段的扩增
设计引物，PCR扩增GFP基因片段，引物序列为：
引物1(上游引物)：GCG CCC ATG GTG CAT CAC CAT CAC CAT CAC ATG GTG AGCAAG GGC GA
引物2(下游引物)：GCG CCA TAT GCT ACC TTC TCC TTC TCC TTC TCC TTC TCCTGA TCC GGT GGA TCC CGG
以pEGFP-C2为模板，在引物1和引物2的引导下PCR扩增GFP，反应体系为：克隆质粒pEGFP-C2(80ng/μL)1μL、10X PCR Buffer for KOD-PLus-Neo(Thermo Scientific)5μL、dNTPs(2mM each)5μL、MgSO4溶液(25mM)4μL、KOD-PLus-Neo(1.0U/μL)1μL、引物11μL、引物21μL、DMSO 2μL，加去离子水补充至反应体系50μL。PCR反应条件：先94℃5min；再95℃30sec，57℃30sec，68℃50sec，共30个循环；然后68℃10min，4℃5min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析，回收并纯化扩增的目的片段，纯化产物溶于40μL TE缓冲液中，-20℃冻存备用。
2)PCR产物及pET-15b载体的酶切处理
利用NcoI、NdeI限制性内切酶切出克隆片段及载体的粘性末端。酶切体系：目的片段(150ng/μL)或pET-15b质粒(150ng/μL)6.7μL、NcoI限制性内切酶(Thermo Scientific)0.5μL、NdeI限制性内切酶(Thermo Scientific)0.5μL、10X FastDigest Buffer(ThermoScientific)1μL，加去离子水至总体积10μL，37℃水浴反应30min。
3)原核表达载体pET15b-R9-GFP的获得
将步骤2)获得的经NcoI、NdeI限制性内切酶处理的目的片段和载体进行连接，连接体系：酶切载体4.7μL、酶切目的片段3.3μL、T4DNA Ligase 1μL(5U/μL)、10X T4 DNALigase Buffer(TOYOBO)1μL，加去离子水至反应体系10μL。22℃反应20min，-20℃冻存备用。
取一管DH5α感受态细胞置于冰上溶解，待感受态完全溶解后，加入1μL的连接片段，混匀后冰上放置30min。热激转化过程：42℃90sec，冰上放置2min；加入1mL的LB培养基，37℃振荡培养45min；取200μL细胞涂布LB平板(含25μg/mL氨苄青霉素)，37℃培养过夜；任意挑取一个单克隆，接种到5mL的LB培养液(含25μg/mL氨苄青霉素)，37℃振荡培养过夜(12-16h)。用质粒小提试剂盒(OMEGA BIO-TEK)提取质粒，用限制性内切酶NcoI、NdeI进行酶切鉴定后，保种并分装测序。
2.pET15b-R9-GFP的表达及检测
将R9-GFP原核表达载体pET15b-R9-GFP转化大肠杆菌Rostta DE3感受态细胞，37℃培养过夜，随机挑选一个单克隆，接种到5mL的LB培养基(含25μg/mL氨苄青霉素和25μg/mL氯霉素)中，37℃振荡培养4-6h，将菌液加到100mL的LB培养液(含25μg/mL氨苄青霉素和25μg/mL氯霉素)37℃振荡培养过夜，取菌液检测OD600值，调整OD600值至0.8-1，加入IPTG诱导剂(终浓度8μM)，30℃诱导振荡培养6h。
4000rpm离心20min收集菌体，用15mL Binding Buffer(20mM Na3PO4,500mM NaCl,20mM imidazole,pH 7.4)重悬菌体，超声40min(超3sec，停2sec)破碎菌体。用Ni-Beads(GE)亲和纯化***进行纯化(按照商品化Ni-Beads亲和纯化实验流程)，纯化后产物用SDS-PAGE电泳检测，获得融合多聚精氨酸肽段R9穿膜肽的绿色荧光蛋白(R9-GFP)(图1，A，箭头所示)。
3.R9穿膜肽-绿色荧光蛋白(EGFP)(R9-GFP)穿膜效果验证。
R9-GFP(1μmoL/L)处理U2OS肿瘤细胞48h，PBS清洗后4％甲醛固定，荧光显微镜观察重组蛋白在细胞内的分布(400X)。发现该重组蛋白能有效穿膜并分布于细胞质和细胞核(图1，B)。
实施例2验证FOXM1-氮端(1-234aa)可抑制FOXM1的激活转录能力。
1.真核表达载体pCMV-FOXM1-N(1-234aa)的构建
1)FOXM1-N(1-234aa)基因片段的扩增
设计引物，PCR扩增FOXM1-N(1-234aa)基因片段，引物序列为：
引物3(上游引物)：GCT CTA GAA TGG GTA AGC CTA TCC CTA ACC CTC TCC TCGGTC TCG ATT CTA CGA TGA AAA CTA GCC CCC GTC G
引物4(下游引物)：GCC TCG AGC TAA GAC ACA GAG TTC TGC CAGG
以pcDNA3.1-FOXM1为模板，在引物3和引物4的引导下PCR扩增FOXM1-N(1-234aa)反应体系：克隆质粒pcDNA3.1-FOXM1(80ng/μL)1μL、10X PCR Buffer for KOD-PLus-Neo(Thermo Scientific)5μL、dNTPs(2mM each)5μL、MgSO4溶液(25mM)4μL、KOD-PLus-Neo(1.0U/μL)1μL、引物11μL、引物21μL、DMSO 2μL，加去离子水补充至反应体系50μL。PCR反应条件：先94℃5min；再95℃30sec,57℃30sec，68℃50sec，共30个循环；然后68℃10min，4℃5min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化扩增的目的片段，纯化产物溶于40μL TE缓冲液中，-20℃冻存备用。
2)PCR产物及pcDNA3.1载体的酶切处理
利用XbaI、XhoI限制性内切酶切出克隆片段及载体的粘性末端。酶切体系：目的片段(150ng/μL)或pcDNA3.1质粒(150ng/μL)6.7μL、NcoI限制性内切酶(Thermo Scientific)0.5μL、NdeI限制性内切酶(Thermo Scientific)0.5μL、10X FastDigest Buffer(ThermoScientific)1μL，加去离子水至总体积10μL，37℃水浴反应30min。
3)真核表达载体pCMV-FOXM1-N(1-234aa)的获得
将步骤2)获得的经XbaI、XhoI限制性内切酶处理的目的片段和载体进行连接，连接体系：酶切载体5.12μL、酶切目的片段2.87μL、T4DNA Ligase(5U/μL)1μL、10X T4DNALigase Buffer(TOYOBO)1μL，加去离子水至反应体系10μL。22℃反应20min，-20℃冻存备用。
取一管DH5α感受态细胞置于冰上溶解，待感受态完全溶解后，加入1μL的连接片段，用拇指轻弹混匀，冰上放置30min。热激过程：42℃热激90min，冰上放置2min；加入1mL的LB培养基，37℃放置45min；取200μL涂布LB平板(含25μg/mL氨苄青霉素)，37℃培养过夜(12-16h)；任意挑取一个单克隆，接种到20mL的LB培养液(含25μg/mL氨苄青霉素)37℃振荡过夜培养(12-16h)。提取质粒，用限制性内切酶XbaI、XhoI进行酶切鉴定，保种并分装测序。
3.在肿瘤细胞中过表达FOXM1氮端可抑制FOXM1的转录活性。
荧光素酶报告基因检测实验：运用pCMV-FOXM1和pCMV-FOXM1-N(1-234aa)真核表达载体，与pCdc25B promoter-Luciferase报告基因质粒共转染U2OS肿瘤细胞，48h后检测不同剂量的pCMV-FOXM1-N(0.5μg、1μg、2μg)对FOXM1刺激Cdc25B启动子转录作用的抑制效果(图2，A)。FOXM1氮端抑制FOXM1对Cdc25B的上调功能：共转染pCMV-FOXM1表达质粒(1μg)和pCMV-FOXM1-N(1-234aa)表达质粒(0.5μg、1μg、2μg)进U2OS细胞48h后，制备细胞裂解液。运用Western BLotting分别检测Cdc25B、FOXM1(Santa Cruz SC-502抗体识别FOXM1碳端)与FOXM1氮端(Santa Cruz SC-500抗体识别FOXM1氮端)蛋白的表达水平，同时检测β-actin蛋白水平作为上样对照(图2，B)。
实施例3构建并规模化制备了穿膜肽融合人FOXM1蛋白氮端(1-234aa)的重组蛋白R9-FOXM1-N。
1.原核表达载体pHis-FOXM1(1-234aa)-R9的构建
1)R9-FOXM1-N基因片段的扩增
设计引物，PCR扩增基因片段，引物序列为：
引物5(上游引物)：GCG CCC ATG GTG CAT CAC CAT CAC CAT CAC ATG AAA ACTAGC CCC CGT CG
引物6(下游引物)：GCG GAT CCC TAC CTT CTC CTT CTC CTT CTC CTT CTC CTAGAC ACA GAG TTC TGC CAG G
以pcDNA3.1-FOXM1为模板，在引物5和引物6的引导下PCR扩增R9-FOXM1-N反应体系为：克隆质粒pcDNA3.1-FOXM1(80ng/μL)1μL、10X PCR Buffer for KOD-PLus-Neo(Thermo Scientific)5μL、dNTPs(2mM each)5μL、MgSO4溶液(25mM)4μL、KOD-PLus-Neo(1.0U/μL)1μL、引物11μL、引物21μL、DMSO 2μL，加去离子水补充至反应体系50μL。PCR反应条件：先94℃5min；再95℃30sec,57℃30sec，68℃50sec，共30个循环；然后68℃10min，4℃5min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化扩增的目的片段，纯化产物溶于40μL TE缓冲液中，-20℃冻存备用。
2)PCR产物及pET-15b载体的酶切处理
利用NcoI、BamHI限制性内切酶切出克隆片段的粘性末端。酶切体系：目的片段(150ng/μL)或pET-15b质粒(150ng/μL)6.7μL、NcoI限制性内切酶(Thermo Scientific)0.5μL、BamHI限制性内切酶(Thermo Scientific)0.5μL、10X FastDigest Buffer(ThermoScientific)1μL，加去离子水至总体积10μL，37℃水浴反应30min。
3)原核表达载体pHis-FOXM1(1-234aa)-R9的获得
将步骤2)获得的经NcoI、BamHI限制性内切酶处理的目的片段和载体进行连接，连接体系及反应条件为：酶切载体5.63μL、酶切目的片段2.36μL、T4DNA Ligase(5U/μL)1μL、10X T4DNA Ligase buffer(TOYOBO)1μL，加去离子水至反应体系10μL。22℃反应20min，-20℃冻存备用。
取一管DH5α感受态细胞置于冰上溶解，待感受态完全溶解后，加入1μL的连接片段，用拇指轻弹混匀，冰上放置30min。热激过程：42℃热激90min，冰上放置2min；加入1mL的LB培养基，37℃放置45min；取200μL涂布LB平板(氨苄青霉素浓度为25μg/mL)，37℃培养过夜(12-16h)；挑取单克隆，接种到5mL的LB培养液(含25μg/mL氨苄青霉素)37℃振荡培养过夜(12-16h)。提取质粒，用限制性内切酶NcoI、BamHI进行酶切鉴定，保种并分装测序。pHis-FOXM1(1-234aa)-R9原核表达质粒结构示意图(图3，A)。
2.pHis-FOXM1(1-234aa)-R9的表达及检测
将R9-FOXM1-N原核表达载体pHis-FOXM1(1-234aa)-R9转化大肠杆菌Rostta DE3感受态细胞，37℃培养过夜(12-16h)，随机挑选一个单克隆，接种到5mL的LB培养基(含25μg/mL氨苄青霉素和25μg/mL氯霉素),37℃振荡培养4-6h。将菌液加到100mL的LB培养液(含25μg/mL氨苄青霉素和25μg/mL氯霉素)37℃振荡培养过夜(12-16h)，取菌液检测OD600值，调整OD600值至0.8-1，加入IPTG诱导剂(终浓度8μM)，30℃诱导振荡培养6h。
4000rpm离心20min收集菌体，用15mL Binding Buffer(20mM Na3PO4,500mM NaCl,20mM imidazole,pH 7.4)重悬菌体，超声40min(超3sec，停2sec)破碎菌体。用Ni-Beads(GE)亲和纯化***进行纯化(按照商品化Ni-Beads亲和纯化实验流程)，纯化后产物用SDS-PAGE电泳检测。
3.R9穿膜肽融合人FOXM1蛋白氮端(1-234aa)的重组蛋白R9-FOXM1-N的规模化制备。运用原核诱导表达***扩大培养规模，获得细菌裂解液。通过AKTApurifier蛋白纯化仪结合His-tag亲和纯化手段，采用不同洗脱强度收集纯化蛋白，实现规模化制备纯化穿膜肽融合人FOXM1蛋白氮端(1-234aa)的重组蛋白R9-FOXM1-N，并获得纯化过程的HPLC分析谱图(图3，B，箭头所示该重组蛋白吸收峰)。SDS-PAGE凝胶电泳方法检测蛋白制备不同阶段的蛋白样品，上样量均为10μg(图3，C，箭头所示R9-FOXM1-N重组蛋白)。
实施例4验证R9-FOXM1-N可抑制FOXM1与其DNA结合位点的结合。
R9-FOXM1-N重组蛋白可抑制FOXM1与其DNA结合位点的结合。运用EMSA实验，在FOXM1全长重组蛋白与其荧光标记的DNA结合探针发生结合反应的体系中，按照摩尔比1:1、1:10、1:20加入R9-FOXM1-N重组蛋白，检测R9-FOXM1-N重组蛋白对FOXM1蛋白结合DNA的干扰作用(图4)。结果表明，在摩尔比1:1的条件下，R9-FOXM1-N重组蛋白可显著抑制FOXM1与其DNA结合位点的结合，进一步增大摩尔比，R9-FOXM1-N重组蛋白能完全抑制FOXM1与其DNA结合位点的结合。
实施例5证实R9-FOXM1-N可有效进入肿瘤细胞并抑制FOXM1的转录活性。
R9-FOXM1-N重组蛋白可抑制肿瘤细胞中的FOXM1转录活性。不同浓度R9-FOXM1-N重组蛋白(1μmoL/L、3μmoL/L、5μmoL/L)处理U2OS肿瘤细胞24h后，Western BLotting实验检测胞内的重组蛋白(Santa Cruz SC-500抗体识别FOXM1氮端)，同时检测β-actin蛋白水平作为上样对照(图5，A)。荧光素酶报告基因检测实验：运用pCMV-FOXM1和pCdc25Bpromoter-Luciferase质粒共转染细胞24h后，再分别用不同浓度R9-FOXM1-N重组蛋白或R9-GFP重组蛋白(1μmoL/L、3μmoL/L、5μmoL/L)处理细胞，24h后检测Luciferase的活性，考察R9-FOXM1-N对FOXM1转录活性的抑制效果(图5，B)。结果表明，R9-FOXM1-N重组蛋白在1μmoL/L的处理浓度下就可有效进入细胞，并随处理浓度增加，体现剂量依赖型地抑制FOXM1激活基因转录的能力。
实施例6证实R9-FOXM1-N对乳腺癌、肺癌、肝癌等肿瘤细胞的抑制作用。
R9-FOXM1-N重组蛋白对不同类型肿瘤细胞增殖的抑制作用。运用MTT实验考察R9-FOXM1-N对肿瘤细胞增殖表型的影响：选择乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7、肺癌A549、肝癌HepG2细胞，用不同浓度的R9-FOXM1-N(1μmoL/L、3μmoL/L、5μmoL/L、7μmoL/L、9μmoL/L)进行处理，24h时后检测细胞的活性，R9-GFP处理作为对照，获得剂量依赖曲线。针对所选细胞，固定R9-FOXM1-N处理浓度(1μmoL/L)，在处理后不同时间点(1天、2天、3天)检测细胞活性，获得相关细胞的生长曲线(图6)。结果表明，与R9-GFP对照处理的样本相比，R9-FOXM1-N可明显抑制乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7、肺癌A549、肝癌HepG2细胞的增殖。
实施例7对比发现R9-FOXM1-N与已知FOXM1小分子抑制剂Thiostrepton对肿瘤细胞具有类似的半致死剂量和抑瘤效果。
对比R9-FOXM1-N重组蛋白与FOXM1小分子抑制剂Thiostrepton的抑瘤效果。选择乳腺癌MDA-MB-436细胞作为细胞模型。不同浓度R9-FOXM1-N处理MDA-MB-436细胞24h后，通过MTT实验检测细胞活性，确定该重组蛋白对此肿瘤细胞的半致死剂量(图7，A)，半致死剂量为1-2μmol/L。R9-FOXM1-N(1μmoL/L或2μmoL/L)明显抑制MDA-MB-436细胞的成球能力，预示R9-FOXM1-N能抑制肿瘤干细胞特征(图7，B)。不同浓度FOXM1小分子抑制剂Thiostrepton处理MDA-MB-436细胞24h后，通过MTT实验检测细胞活性(图7，C)，发现其对此肿瘤细胞的半致死剂量也接近1-2μmol/L。FOXM1小分子抑制剂Thiostrepton(2μmoL/L)也显示出对MDA-MB-436细胞成球能力的抑制(图7，D)。
实施例8发现R9-FOXM1-N可与FOXM1全长蛋白、Smad3发生互作，提示了R9-FOXM1-N发挥抑瘤作用的可能机制。
R9-FOXM1-N重组蛋白与肿瘤细胞中的特定蛋白发生互作。R9-FOXM1-N重组蛋白含有His标签。乳腺癌MDA-MB-231细胞裂解液(1mg)与R9-FOXM1-N孵育后，加入Ni-beads进行PuLL-down实验，Western BLotting实验检测相关蛋白。R9-FOXM1-N与FOXM1全长蛋白发生互作。分别用Santa Cruz SC-502抗体识别FOXM1全长蛋白(89KD)、Santa Cruz SC-500抗体识别FOXM1氮端蛋白(30KD)(图8，A)。R9-FOXM1-N与Smad3发生互作。R9-GFP(含His标签)作为阴性对照(图8，B)。
<110>湖南大学
<120>FOXM1蛋白氮端（1-234 aa）的表达及其用途
<160> 2
<210> 1
<211> 234
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 1
Met Lys Thr Ser Pro Arg Arg Pro Leu Ile Leu Lys Arg
1 5 10
Arg Arg Leu Pro Leu Pro Val Gln Asn Ala Pro Ser Glu
15 20 25
Thr Ser Glu Glu Glu Pro Lys Arg Ser Pro Ala Gln Gln
30 35
Glu Ser Asn Gln Ala Glu Ala Ser Lys Glu Val Ala Glu
40 45 50
Ser Asn Ser Cys Lys Phe Pro Ala Gly Ile Lys Ile Ile
55 60 65
Asn His Pro Thr Met Pro Asn Thr Gln Val Val Ala Ile
70 75
Pro Asn Asn Ala Asn Ile His Ser Ile Ile Thr Ala Leu
80 85 90
Thr Ala Lys Gly Lys Glu Ser Gly Ser Ser Gly Pro Asn
95 100
Lys Phe Ile Leu Ile Ser Cys Gly Gly Ala Pro Thr Gln
105 110 115
Pro Pro Gly Leu Arg Pro Gln Thr Gln Thr Ser Tyr Asp
120 125 130
Ala Lys Arg Thr Glu Val Thr Leu Glu Thr Leu Gly Pro
135 140
Lys Pro Ala Ala Arg Asp Val Asn Leu Pro Arg Pro Pro
145 150 155
Gly Ala Leu Cys Glu Gln Lys Arg Glu Thr Cys Ala Asp
160 165
Gly Glu Ala Ala Gly Cys Thr Ile Asn Asn Ser Leu Ser
170 175 180
Asn Ile Gln Trp Leu Arg Lys Met Ser Ser Asp Gly Leu
185 190 195
Gly Ser Arg Ser Ile Lys Gln Glu Met Glu Glu Lys Glu
200 205
Asn Cys His Leu Glu Gln Arg Gln Val Lys Val Glu Glu
210 215 220
Pro Ser Arg Pro Ser Ala Ser Trp Gln Asn Ser Val Ser
225 230 234
<211> 2
<212> 702
<213> DNA
<214> 人类（Homo Sapiens）
<400> 2
atgaaaacta gcccccgtcg gccactgatt ctcaaaagac ggaggctgcc ccttcctgtt 60
caaaatgccc caagtgaaac atcagaggag gaacctaaga gatcccctgc ccaacaggag 120
tctaatcaag cagaggcctc caaggaagtg gcagagtcca actcttgcaa gtttccagct 180
gggatcaaga ttattaacca ccccaccatg cccaacacgc aagtagtggc catccccaac 240
aatgctaata ttcacagcat catcacagca ctgactgcca agggaaaaga gagtggcagt 300
agtgggccca acaaattcat cctcatcagc tgtgggggag ccccaactca gcctccagga 360
ctccggcctc aaacccaaac cagctatgat gccaaaagga cagaagtgac cctggagacc 420
ttgggaccaa aacctgcagc tagggatgtg aatcttccta gaccacctgg agccctttgc 480
gagcagaaac gggagacctg tgcagatggt gaggcagcag gctgcactat caacaatagc 540
ctatccaaca tccagtggct tcgaaagatg agttctgatg gactgggctc ccgcagcatc 600
aagcaagaga tggaggaaaa ggagaattgt cacctggagc agcgacaggt taaggttgag 660
gagccttcga gaccatcagc gtcctggcag aactctgtgt ct 702

Claims (10)

1.一种抗肿瘤的药物，它的活性成分为FOXM1蛋白氮端1-234位氨基酸残基序列所示蛋白肽。
2.一种FOXM1蛋白氮端1-234位氨基酸残基序列所示蛋白肽在制备抑制肿瘤细胞的抑制剂中的用途。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述蛋白肽与穿膜肽融合使用。
4.一个来源于FOXM1蛋白氮端的片段，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。
5.编码如权利要求4所述蛋白片段的DNA序列。
6.如权利要求5所述蛋白片段的DNA序列，其特征在于：其DNA序列如序列表中SEQ IDNO：2所示。
7.含如权利要求5或6所述蛋白片段的DNA序列所述DNA序列的表达载体。
8.一种表达如权利要求4所述片段的方法，是将含所述蛋白片段的DNA序列与表达穿膜肽的DNA序列形成融合开放阅读框，构建重组表达载体导入宿主细胞，表达得到具有穿膜能力的所述蛋白片段。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：其中穿膜肽是多聚精氨酸R9穿膜肽。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述重组表达载体为pHis-FOXM1(1-234aa)-R9。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107827970A (zh) * 2017-11-16 2018-03-23 长沙新生康源生物医药有限公司 一种抑制foxm1的抗肿瘤蛋白肽
CN108440671A (zh) * 2018-03-05 2018-08-24 长沙新生康源生物医药有限公司 一种来源于foxm1蛋白的抗肿瘤多肽
CN112500457A (zh) * 2020-11-02 2021-03-16 长沙新生康源生物医药有限公司 一种双重靶向foxm1/cdk1的抗肿瘤多肽
CN114907447A (zh) * 2022-02-23 2022-08-16 湖南大学 一种抗菌肽

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101596316A (zh) * 2009-06-12 2009-12-09 长沙新生康源生物医药有限公司 表达FoxMlsiRNA的重组腺病毒及其在肿瘤治疗和预防中的应用
CN102405285A (zh) * 2009-02-18 2012-04-04 肿瘤疗法科学股份有限公司 Foxm1肽及包含它的疫苗

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102405285A (zh) * 2009-02-18 2012-04-04 肿瘤疗法科学股份有限公司 Foxm1肽及包含它的疫苗
CN101596316A (zh) * 2009-06-12 2009-12-09 长沙新生康源生物医药有限公司 表达FoxMlsiRNA的重组腺病毒及其在肿瘤治疗和预防中的应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HJ PARK等: "An N-terminal inhibitory domain modulates activity of FoxM1 during cell cycle", 《ONCOGENE》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107827970A (zh) * 2017-11-16 2018-03-23 长沙新生康源生物医药有限公司 一种抑制foxm1的抗肿瘤蛋白肽
CN107827970B (zh) * 2017-11-16 2021-06-01 长沙新生康源生物医药有限公司 一种抑制foxm1的抗肿瘤蛋白肽
CN108440671A (zh) * 2018-03-05 2018-08-24 长沙新生康源生物医药有限公司 一种来源于foxm1蛋白的抗肿瘤多肽
CN112500457A (zh) * 2020-11-02 2021-03-16 长沙新生康源生物医药有限公司 一种双重靶向foxm1/cdk1的抗肿瘤多肽
CN112500457B (zh) * 2020-11-02 2022-06-17 长沙新生康源生物医药有限公司 一种双重靶向foxm1/cdk1的抗肿瘤多肽
CN114907447A (zh) * 2022-02-23 2022-08-16 湖南大学 一种抗菌肽
CN114907447B (zh) * 2022-02-23 2023-07-25 湖南大学 一种抗菌肽

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