CN105995216A - 一种基于溶菌酶的鱼用饲料 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于溶菌酶的鱼用饲料，由面粉、豆粕、次粉、米糠粕、鱼粉、骨粉、单乳酸甘油酯、柠檬酸、酵母提取物、磷酸二氢钙、60％氯化胆碱、复合多维、复合矿物盐、氯化钾、中草药制剂及溶菌酶制剂按重量份数比制备而成；本发明适用于养殖鱼类，可有效增强鱼类的免疫力，其中的溶菌酶制剂能够替代抗生素，有效预防细菌性疾病，提高水产养殖效益，有效解决鱼类规模化健康养殖中的抗生素滥用问题、食品安全问题以及水域生态安全问题。而且本发明的水产鱼用饲料能够提高鱼类的增重率与成活率，降低饲料系数，并明显提高养殖鱼类的品质及养殖经济效益，适于基层养殖场推广应用。

Description

一种基于溶菌酶的鱼用饲料
技术领域
本发明涉及水产养殖领域中的饲料制备技术，尤其涉及一种基于溶菌酶的鱼用饲料。
背景技术
近年来随着我国水产养殖业的快速发展，构建健康、无公害的水产养殖体系已是大势所趋。开发一种成本低廉、绿色健康的水产养殖饲料是建立无公害的养殖体系的有效途径。我国是目前世界上最主要的鱼类养殖大国，鱼类养殖占全球养殖总量的一半以上，而为提高养殖鱼类的抗病能力和生长速度，在水产养殖过程中大量使用高剂量的抗生素等，使养殖鱼类对细菌产生耐药性，进而产生一系列的水产品食品安全及生态安全等问题，最终造成水产养殖环境的恶性循环，大大降低了水产养殖的效益。
溶菌酶(lysozyme,EC3.2.1.17)又称胞壁质酶，是一种碱性球蛋白，由Fleming在1922年首次发现。溶菌酶是广泛存在于各种生物中的一类抗菌分子。该酶的主要作用是能够切断细菌细胞壁肽聚糖中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的β-1,4糖苷键，从而破坏细胞壁，引起细胞裂解，细胞内容物逸出而使细菌死亡。溶菌酶在生物机体的免疫防御***中发挥重要作用。目前从蛋清中提取溶菌酶被认为是较为普遍的方式，然而由于生产工艺繁琐，溶菌酶产量不高，造成其价格居高不下，难以满足日益增长的市场需求。目前在水产品养殖中使用抗生素带来的耐药性问题、药物残留问题备受关注，其产生副作用是不容忽视的，人们不希望以牺牲人类健康为代价换取水产品生产性能的提高。利用基因工程技术构建基因工程菌将是提高溶菌酶产量，降低成本的有效途径。通过基因工程发酵途径获取的溶菌酶是一种天然无毒的酶制品，它对大多数水生动物而言即是体内自身的免疫因子，又可作为养殖生产中的抑菌剂，可降解并杀灭致病菌。近年来，已有研究人员对日本对虾、斑节对虾、海参、斑马鱼、草鱼、鲤鱼等水产动物的溶菌酶重组蛋白的溶菌活性进行了研究。但目前国内外基于溶菌酶而开发出的成熟的水产饲料产品不多。
发明内容
鉴于上述不足，本发明的目的在于研制一种基于溶菌酶的鱼用饲料，解决了现有技术中鱼用饲料安全性低、鱼免疫力差的问题。
本发明所采用的技术方案是：
一种基于溶菌酶的鱼用饲料，由下述原料按重量份数比制备而成：
面粉25～30份；豆粕20～25份；次粉15～20份；米糠粕10～15份；鱼粉10～15份；骨粉5～8份；单乳酸甘油酯4～8份；柠檬酸2～5份；酵母提取物2～5份；磷酸二氢钙1.5～2.5份；60％氯化胆碱1～1.5份；复合多维0.5～1.5份；复合矿物盐0.5～1.5份；氯化钾0.5～0.8份；中草药制剂0.05～0.1份；溶菌酶制剂0.05～0.15份。
上述原料的优选重量份数比为：面粉25份；豆粕25份；次粉15份；米糠粕10份；鱼粉15份；骨粉5份；单乳酸甘油酯5份；柠檬酸4份；酵母提取物4份；磷酸二氢钙2份；60％氯化胆碱1份；复合多维1份；复合矿物盐1份；氯化钾0.5份；中草药制剂0.05份；溶菌酶制剂0.15份。
所述溶菌酶制剂活力为40～55U/mg，其载体为玉米淀粉。
所述溶菌酶制剂中溶菌酶的氨基酸序列为：
MKSLVFLLLVAGASAKVFERCQWARLLKAQGMDGYRGVSLANWVCLTQHESRFNTNAINHNRDGSTDYGIFQINSYWWCDDGKTGRVNGCKIPCSALLSDSVGTAIACAKRIVQDPSGIAAWVAWRDHCRGRDVSSYIQGCGF
所述的溶菌酶由如下核苷酸序列的基因编码得到：
ATGAAGAGCCTTGTGTTTTTGCTGTTGGTGGCCGGTGCCAGTGCCAAAGTGTTTGAGCGCTGTCAGTGGGCCCGCCTGCTGAAGGCTCAGGGAATGGATGGGTATCGCGGTGTGAGCCTGGCCAACTGGGTCTGCCTGACACAACATGAGTCTAGATTCAACACCAATGCCATCAACCACAACAGGGACGGGTCAACGGATTATGGCATCTTCCAGATCAACAGTTATTGGTGGTGTGACGATGGAAAAACCGGAAGAGTCAACGGGTGCAAAATTCCATGCAGCGCGCTTCTGTCTGACTCGGTGGGCACAGCCATCGCCTGTGCCAAACGCATCGTTCAGGATCCAAGTGGCATAGCTGCCTGGGTGGCTTGGCGTGATCACTGCAGAGGGAGAGACGTGAGTTCCTACATCCAGGGATGTGGATTCTGA。
所述溶菌酶的制备过程如下：
A、将该溶菌酶的编码基因与质粒PHIL-S1构建为表达载体；
B、将融合表达载体转化入毕赤酵母GS115，构建表达工程菌；
C、发酵培养表达基因工程菌，并进行甲醇诱导表达；
D、发酵产物经阳离子交换树脂层析得到纯化的溶菌酶融合蛋白；
E、溶菌酶融合蛋白经纯化得到溶菌酶制剂产品。
所述豆粕的粗蛋白重量百分比为45％～60％。
所述中草药制剂由下述原料按重量份数比制备而成：金银花18～22；丹参25～35；胡萝卜30～35；青蒿15～20。
中草药制剂的优选重量份数比为：金银花20；丹参30；胡萝卜32；青蒿18。
本发明的效果是：本发明提供一种基于溶菌酶制备的水产鱼用饲料，适用于养殖鱼类，可有效增强鱼类的免疫力，其中的溶菌酶制剂能够替代抗生素，有效预防细菌性疾病，提高水产养殖效益，有效解决鱼类规模化健康养殖中的抗生素滥用问题、食品安全问题以及水域生态安全问题。而且本发明的水产鱼用饲料能够提高鱼类的增重率与成活率，降低饲料系数，并明显提高养殖鱼类的品质及养殖经济效益，适于基层养殖场推广应用。
本发明使用方法操作方便，所需成本低于从蛋清原料制备的溶菌酶，且安全无毒，尤为适合淡水养殖鱼类，可大规模使用，而且对养殖设施和工序无特殊要求，适合于普通养殖场使用。
具体实施方案
本发明提供一种基于溶菌酶制备的水产养殖鱼用饲料，为使本发明的目的、技术方案及应用效果清晰明确，以下对本发明做详细阐述。以下所描述的具体实施例仅用以详细解释本发明，但并非局限于此。
本发明提供一种基于溶菌酶制备的水产饲料，其中，所述水产饲料按重量份数计包括：面粉25～30份；豆粕20～25份；次粉15～20份；米糠粕10～15份；鱼粉10～15份；骨粉5～8份；单乳酸甘油酯5份；柠檬酸2～5份；酵母提取物2～5份；磷酸二氢钙2份；60％氯化胆碱1～1.5份；复合多维0.5～1.5份；复合矿物盐0.5～1.5份；氯化钾0.5～0.8份；中草药制剂0.05～0.1份；溶菌酶制剂0.1～0.15份。
其中，所述面粉、次粉为沈阳市“香雪牌”市售产品；鱼粉、骨粉为市售“沈阳鸿达”鱼粉与骨粉；复合多维为上海仟爵生物科技有限公司的产品酶合电解多维；复合矿物盐为盐城市百诺生物科技有限公司的“百诺生物”品牌复合矿物盐；所述溶菌酶制剂活力为40～55U/mg，其载体为玉米淀粉。进一步分析得到上述溶菌酶制剂中溶菌酶的氨基酸序列为：
MKSLVFLLLVAGASAKVFERCQWARLLKAQGMDGYRGVSLANWVCLTQHESRFNTNAINHNRDGSTDYGIFQINSYWWCDDGKTGRVNGCKIPCSALLSDSVGTAIACAKRIVQDPSGIAAWVAWRDHCRGRDVSSYIQGCGF，通过对编码基因序列分析，所述溶菌酶由如下核苷酸序列的基因编码：
ATGAAGAGCCTTGTGTTTTTGCTGTTGGTGGCCGGTGCCAGTGCCAAAGTGTTTGAGCGCTGTCAGTGGGCCCGCCTGCTGAAGGCTCAGGGAATGGATGGGTATCGCGGTGTGAGCCTGGCCAACTGGGTCTGCCTGACACAACATGAGTCTAGATTCAACACCAATGCCATCAACCACAACAGGGACGGGTCAACGGATTATGGCATCTTCCAGATCAACAGTTATTGGTGGTGTGACGATGGAAAAACCGGAAGAGTCAACGGGTGCAAAATTCCATGCAGCGCGCTTCTGTCTGACTCGGTGGGCACAGCCATCGCCTGTGCCAAACGCATCGTTCAGGATCCAAGTGGCATAGCTGCCTGGGTGGCTTGGCGTGATCACTGCAGAGGGAGAGACGTGAGTTCCTACATCCAGGGATGTGGATTCTGA。
所述的溶菌酶的基因工程制备过程可通过下述过程实现：构建表达载体。根据该溶菌酶的编码序列与pHIL-S1质粒进行序列重组，转化大肠杆菌DH5α菌株，在含有氨苄青霉素抗性基因Amp平板上挑选转化子，并进行质粒提取，用限制性内切酶EcoRⅠ及XhoⅠ进行酶切，通过PCR进行序列扩增，在质量分数1.5％的琼脂糖凝胶电泳获得453bp的特异性条带。再与pPICZα-A质粒进行重组，经酶切及进一步凝胶电泳后，验证本溶菌酶基因序列正确，用锂盐法将重组质粒基因转化于毕赤酵母GS115，通过Zeocin平板对转化子进行筛选，获得溶菌酶基因毕赤酵母工程菌株。重组菌株的甲醇诱导表达及重组溶菌酶的纯化。在培养基中的工程菌进行37℃发酵培养，250转/min，24h至工程菌的OD600值达到0.6；加入终浓度为2％的甲醇，继续诱导表达96h。采用CM-Sephrose FF阳离子交换树脂纯化溶菌酶，用0.1mol/L乙酸-乙酸铵缓冲液饱和后，将溶菌酶发酵液注入，待吸附饱和后，用0.1～1.0mol/L的乙酸-乙酸盐梯度洗脱，控制流速5mL/min，留取活性峰液，再透析去离子并收集，喷雾干燥即得溶菌酶制剂。
所述酵母提取物的加工过程。将以糖蜜为原料发酵的新鲜酵母以每10L计，经过滤及洗脱离心后，转速为4500r/min，离心30min，在离心洗脱后的菌体中加入100000IU胰蛋白酶及30000IU的木瓜蛋白酶，在反应器中控制在45℃下进行保温反应24h；随后提高温度到95℃，再保温2h，再进行喷雾干燥，保持喷头转速为15000r/min，进口及出口温度分别设定为210℃和100℃，设定负压为95mpa，冷却后即得到酵母提取物。
本发明所述鱼用饲料的加工过程：按配方比例准备原料混合均匀、熟化制粒并包装。
实施例1
将试验虹鳟置于16个0.9m×0.5m×0.5m的玻璃容器中，随机进行分组。每个玻璃容器饲养30尾虹鳟幼鱼，平均初始体重为18.75±1.46g。选择饱食方式实施投喂试验，每日投喂4次饲料。保持水温为25.0±1.5℃，保持各饲喂组的水质相同，饲喂试验共计8周。
优选实施例中，所述水产饲料按重量份数计包括：面粉25份；豆粕25份；次粉15份；米糠粕10份；鱼粉15份；骨粉5份；单乳酸甘油酯5份；柠檬酸4份；酵母提取物4份；磷酸二氢钙2份；60％氯化胆碱1份；复合多维1份；复合矿物盐1份；氯化钾0.5份；中草药制剂0.05份；溶菌酶制剂0.15份。
优选实施例中，所述鱼用饲料含有中草药制剂按重量百分比计由下述成分组成：金银花20％；丹参30％；胡萝卜32％；青蒿18％。
试验结果：
基于溶菌酶的饲料对虹鳟生长指标与干物质消化率的影响，见表1。
基于溶菌酶的饲料对虹鳟血液白细胞的吞噬活性的影响，见表2。
基于溶菌酶的饲料对虹鳟血清和肝胰脏LSZ活力的影响，见表3。
基于溶菌酶的饲料对虹鳟血清和肝胰脏SOD活力的影响，见表4。
基于溶菌酶的饲料对虹鳟肠绒毛的高度、宽度和密度的影响，见表5。
上述实验表明：本发明的基于溶菌酶制备的鱼用饲料能显著提高虹鳟的增重率；能够增强虹鳟血液中白细胞的吞噬能力、血清和肝胰脏LSZ与SOD的酶活力，改善鱼体的免疫状态，提高鱼体的免疫水平；改善虹鳟的肠道环境，对肠绒毛高度、宽度和密度具有正向促进作用，有利于营养物质的消化吸收，进而提高养殖效益。
实施例2
将试验鲤鱼置于16个0.9m×0.5m×0.5m的玻璃容器中，随机进行分组。每个玻璃容器饲养30尾鲤鱼幼鱼，平均初始体重为19.55±1.43g。选择饱食方式实施投喂试验，每日投喂4次饲料。保持水温为25.0±1.5℃，保持各饲喂组的水质相同，饲喂试验共计8周。
优选实施例中，所述水产饲料按重量份数计包括：面粉25份；豆粕25份；次粉15份；米糠粕10份；鱼粉15份；骨粉5份；单乳酸甘油酯5份；柠檬酸4份；酵母提取物4份；磷酸二氢钙2份；60％氯化胆碱1份；复合多维1份；复合矿物盐1份；氯化钾0.5份；中草药制剂0.05份；溶菌酶制剂0.15份。
优选实施例中，所述鱼用饲料含有中草药制剂按重量百分比计由下述成分组成：金银花20％；丹参30％；胡萝卜32％；青蒿18％。
试验结果：
基于溶菌酶的饲料对鲤鱼生长指标与干物质消化率的影响，见表6。
基于溶菌酶的饲料对鲤鱼血液白细胞的吞噬活性的影响，见表7。
基于溶菌酶的饲料对鲤鱼血清和肝胰脏LSZ活力的影响，见表8。
基于溶菌酶的饲料对鲤鱼血清和肝胰脏SOD活力的影响，见表9。
基于溶菌酶的饲料对鲤鱼肠绒毛的高度、宽度和密度的影响，见表10。
上述实验表明：本发明的基于溶菌酶制备的鱼用饲料能显著提高鲤鱼的增重率；能够增强鲤鱼血液中白细胞的吞噬能力、血清和肝胰脏LSZ与SOD的酶活力，改善鱼体的免疫状态，提高鱼体的免疫水平；改善鲤鱼的肠道环境，对肠绒毛高度、宽度和密度具有正向促进作用，有利于营养物质的消化吸收，进而提高养殖效益。
实施例3
一种基于溶菌酶制备的水产饲料，面粉25份；豆粕20份；次粉15份；米糠粕10份；鱼粉10份；骨粉5份；单乳酸甘油酯4份；柠檬酸2份；酵母提取物2份；磷酸二氢钙1.5份；60％氯化胆碱1份；复合多维0.5份；复合矿物盐0.5份；氯化钾0.5份；中草药制剂0.05份；溶菌酶制剂0.05份。
所述中草药制剂由下述原料按重量份数比制备而成：金银花18；丹参25；胡萝卜30；青蒿15。
实施例4
面粉30份；豆粕25份；次粉20份；米糠粕15份；鱼粉15份；骨粉8份；单乳酸甘油酯8份；柠檬酸5份；酵母提取物5份；磷酸二氢钙2.5份；60％氯化胆碱1.5份；复合多维1.5份；复合矿物盐1.5份；氯化钾0.8份；中草药制剂0.1份；溶菌酶制剂0.15份。
所述中草药制剂由下述原料按重量份数比制备而成：金银花22；丹参35；胡萝卜35；青蒿20。
实施例5
面粉27份；豆粕23份；次粉18份；米糠粕12份；鱼粉13份；骨粉7份；单乳酸甘油酯6份；柠檬酸3份；酵母提取物4份；磷酸二氢钙2份；60％氯化胆碱1.2份；复合多维1份；复合矿物盐1份；氯化钾0.7份；中草药制剂0.75份；溶菌酶制剂0.1份。
所述中草药制剂由下述原料按重量份数比制备而成：金银花20；丹参30；胡萝卜32；青蒿18。
上述实施例仅是具体列举本发明的优选方案，对于本领域的一般技术人员而言，在不背离本发明精神的范围内所做的任何非本质上的变化与修改，均应被视为本发明的一部分。
表1实施例1各组虹鳟生长指标与干物质消化率试验结果
表2实施例1各组虹鳟血液白细胞的吞噬活性试验结果
表3实施例1溶菌酶饲料对虹鳟血清和肝胰脏LSZ活力的影响
表4实施例1溶菌酶饲料对虹鳟血清和肝胰脏SOD活力的影响
表5实施例1溶菌酶饲料对虹鳟肠绒毛的高度、宽度和密度的影响
表6实施例2各组鲤鱼生长指标与干物质消化率试验结果
表7实施例2各组鲤鱼血液白细胞的吞噬活性试验结果
表8实施例2溶菌酶饲料对鲤鱼血清和肝胰脏LSZ活力的影响
表9实施例2溶菌酶饲料对鲤鱼血清和肝胰脏SOD活力的影响
表10实施例2溶菌酶饲料对鲤鱼肠绒毛的高度、宽度和密度的影响

Claims (9)

1.一种基于溶菌酶的鱼用饲料，其特征在于由下述原料按重量份数比制备而成：
面粉25～30份；豆粕20～25份；次粉15～20份；米糠粕10～15份；鱼粉10～15份；骨粉5～8份；单乳酸甘油酯4～8份；柠檬酸2～5份；酵母提取物2～5份；磷酸二氢钙1.5～2.5份；60％氯化胆碱1～1.5份；复合多维0.5～1.5份；复合矿物盐0.5～1.5份；氯化钾0.5～0.8份；中草药制剂0.05～0.1份；溶菌酶制剂0.05～0.15份。
2.根据权利要求1所述的一种基于溶菌酶的鱼用饲料，其特征在于上述原料的优选重量份数比为：面粉25份；豆粕25份；次粉15份；米糠粕10份；鱼粉15份；骨粉5份；单乳酸甘油酯5份；柠檬酸4份；酵母提取物4份；磷酸二氢钙2份；60％氯化胆碱1份；复合多维1份；复合矿物盐1份；氯化钾0.5份；中草药制剂0.05份；溶菌酶制剂0.15份。
3.根据权利要求1或2所述的一种基于溶菌酶的鱼用饲料，其特征在于所述溶菌酶制剂活力为40～55U/mg，其载体为玉米淀粉。
4.根据权利要求1或2所述的一种基于溶菌酶的鱼用饲料，其特征在于所述溶菌酶制剂中溶菌酶的氨基酸序列为：
MKSLVFLLLVAGASAKVFERCQWARLLKAQGMDGYRGVSLANWVCLTQHESRFNTNAINHNRDGSTDYGIFQINSYWWCDDGKTGRVNGCKIPCSALLSDSVGTAIACAKRIVQDPSGIAAWVAWRDHCRGRDVSSYIQGCGF。
5.根据权利要求1或2所述的一种基于溶菌酶的鱼用饲料，其特征在于所述的溶菌酶由如下核苷酸序列的基因编码得到：
ATGAAGAGCCTTGTGTTTTTGCTGTTGGTGGCCGGTGCCAGTGCCAAAGTGTTTGAGCGCTGTCAGTGGGCCCGCCTGCTGAAGGCTCAGGGAATGGATGGGTATCGCGGTGTGAGCCTGGCCAACTGGGTCTGCCTGACACAACATGAGTCTAGATTCAACACCAATGCCATCAACCACAACAGGGACGGGTCAACGGATTATGGCATCTTCCAGATCAACAGTTATTGGTGGTGTGACGATGGAAAAACCGGAAGAGTCAACGGGTGCAAAATTCCATGCAGCGCGCTTCTGTCTGACTCGGTGGGCACAGCCATCGCCTGTGCCAAACGCATCGTTCAGGATCCAAGTGGCATAGCTGCCTGGGTGGCTTGGCGTGATCACTGCAGAGGGAGAGACGTGAGTTCCTACATCCAGGGATGTGGATTCTGA。
6.根据权利要求1或2所述的一种基于溶菌酶的鱼用饲料，其特征在于所述溶菌酶的制备过程如下：
A、将该溶菌酶的编码基因与质粒PHIL-S1构建为表达载体；
B、将融合表达载体转化入毕赤酵母GS115，构建表达工程菌；
C、发酵培养表达基因工程菌，并进行甲醇诱导表达；
D、发酵产物经阳离子交换树脂层析得到纯化的溶菌酶融合蛋白；
E、溶菌酶融合蛋白经纯化得到溶菌酶制剂产品。
7.根据权利要求1或2所述的一种基于溶菌酶的鱼用饲料，其特征在于所述豆粕的粗蛋白重量百分比为45％～60％。
8.根据权利要求1或2所述的一种基于溶菌酶的鱼用饲料，其特征在于所述中草药制剂由下述原料按重量份数比制备而成：金银花18～22；丹参25～35；胡萝卜30～35；青蒿15～20。
9.根据权利要求8所述的一种基于溶菌酶的鱼用饲料，其特征在于中草药制剂的优选重量份数比为：金银花20；丹参30；胡萝卜32；青蒿18。
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