CN105986012A - 临界转化态emt基因在制备或筛选诊断肺癌的药物或试剂盒、或筛选治疗肺癌的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及临界转化态EMT基因在制备或筛选诊断肺癌的药物或试剂盒、或筛选治疗肺癌的药物中的用途。本发明提供临界转化态EMT基因在制备或筛选诊断肺癌的药物或试剂盒、或筛选治疗肺癌的药物中的用途。本发明发明人发现通过检测瘤株中临界转化态EMT基因的表达水平，能够识别出临界转化态EMT基因高表达的瘤株，并可进一步预测该类瘤株为高风险、预后差的类型。

Description

临界转化态EMT基因在制备或筛选诊断肺癌的药物或试剂盒、或筛选治疗肺癌的药物中的 用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及临界转化态EMT基因在制备或筛选诊断肺癌的药物或试剂盒、或筛选治疗肺癌的药物中的用途。

背景技术

恶性肿瘤是威胁人民健康的最大危险因素之一，我国每年仅肿瘤死亡人数近200万人，恶性肿瘤造成的经济损失高达1400多亿元人民币。肿瘤预后是指对发病后，疾病未来过程的一种预先估计。在医学上，“预后”是指根据经验预测的疾病发展情况。预后主要涉及到三方面，将发生什么结果、发生不良结局的可能性有多大、什么时候会发生。预后分析是对疾病发病后发展为各种不同结局的预测；是临床非常实用、对临床很有指导作用的临床研究。研究和评价预后的目的，为了便于了解各种疾病对人类危害性的大小、探索影响预后的因素、研究改善预后的具体措施。

上皮细胞向***的转变(epithelial to mesen-chymal transition,EMT)的概念在22年前被首次提出以来，越来越多的研究表明它与上皮细胞恶性肿瘤的发生和发展关系密切，受到了高度的关注。EMT是一种哺乳动物胚胎发育过程中必需的生理现象。造肠运动前期原始中胚层的形成、发育中期神经脊发育成体节、骨和肌肉等组织需要EMT的密切参与。由于EMT是上皮细胞获得迁移能力的有效方式，在成体中成为了占恶性肿瘤90％以上的上皮细胞癌浸润转移的一个重要途径。目前体内和体外实验证据都表明，EMT在乳腺癌、结肠癌、肺癌、***癌、肝癌、胰腺癌等多种癌症的原发性浸润和继发性转移中起着举足轻重的作用。因此，研究EMT的发生和调控机制，对于寻找治疗恶性肿瘤特别是肿瘤细胞转移的目标靶点有重要意义。

另外，有研究表明，在由E状态向M状态转化的过程中存在着一种中间状态，即，临界转化态EMT(P状态)。处于P状态的细胞既保留了上皮细胞的特性也展示出***的特征。同时，有实验表明，E状态向P状态的转变是可逆的，因此P状态代表了一种可转移的表型；而P状态向M状态的转变则较为依赖于细胞类型，在某些细胞中可逆，某些细胞中不可逆。类似于EMT的过程，由E状态向P状态的转变以及可逆的P状态向E状态的转变都可能与疾病的发生进程相关，例如，肿瘤的转移。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供临界转化态EMT基因在制备或筛选诊断肺癌的药物、或筛选治疗肺癌的药物中的用途，用于解决现有技术中的问题。本发明发明人发现临界转化态EMT基因高表达与高风险肺癌的联系，通过检测肺癌样株中临界转化态EMT基因的表达水平，识别出临界转化态EMT基因高表达的肿瘤株，并可进一步预测出该类肿瘤株可能具有较高的恶性程度，并表现出较差的预后。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供临界转化态EMT基因在制备或筛选诊断肺癌的药物或试剂盒、或筛选治疗肺癌的药物中的用途。

所述临界转化态EMT基因是指调控细胞由E状态经由临界转化态P状态转变为M状态的基因。

所述筛选诊断肺癌药物具体指使用临界转化态EMT基因，通过监测临界转化态EMT基因表达量对可能作为诊断肺癌药物使用的物质进行生物活性、药理作用或药用价值的评估。

所述筛选诊断肺癌的试剂盒具体指使用临界转化态EMT基因，通过监测临界转化态EMT基因的表达量对可能作为诊断肺癌的试剂盒进行性能的评估，所述性能如准确性、特异性、稳定性等。

所述筛选治疗乳腺癌药物具体指使用临界转化态EMT基因，通过监测临界转化态EMT基因表达量对可能作为治疗肺癌药物使用的物质进行生物活性、药理作用或药用价值的评估。

优选的，所述制备诊断肺癌的药物或试剂盒中，所述诊断肺癌具体指对肺癌恶性程度的预测和/或对肺癌预后的判断。

更优选的，所述肺癌恶性程度的预测具体指通过临界转化态EMT基因表达量的检测对肿瘤样株的恶性程度进行预测。

更优选的，所述肺癌预后的判断具体指通过临界转化态EMT基因表达量的检测对肿瘤病人的病程和/或结局进行预后判断。

具体的，临界转化态EMT基因高表达表示肺癌样株具有较高的恶性程度，并表现出较差的预后；临界转化态EMT基因低表达表示肺癌样株具有较低的恶性程度，并表现出较好的预后。

优选的，所述临界转化态EMT基因选自HNF4A、JUNB、ETS2中的任意一种或多种的组合。

本发明第二方面提供一种基于临界转化态EMT基因高表达的高风险肺癌的新型诊断法，所述诊断方法具体为通过检测肺癌样株中临界转化态EMT基因的表达水平对肺癌病人的预后进行判断。

具体的，所述检测肺癌样株中临界转化态EMT基因的表达水平是指将现有数据库中的肿瘤样株信息进行数据分布分析，再检测肺癌样株中EMT基因的表达水平，根据数据识别出EMT基因高表达的肺癌样株。

在本发明的实施例中，优选采用在在统计学软件R工作平台中调用聚类分析程序包mclust进行数据分布分析。

所述肺癌病人的预后进行判断具体指，临界转化态EMT基因高表达的这类肺癌株可能具有较高的恶性程度，并表现出较差的预后。

本发明发明人发现通过检测瘤株中临界转化态EMT基因的表达水平，能够识别出临界转化态EMT基因高表达的瘤株，并可进一步预测该类瘤株为高风险、预后差的类型。此外，经公开可得的肺癌病人微阵列和二代测序的基因表达数据和存活数据证实，通过临界转化态EMT基因表达量的表征，能够有效预测出高风险、预后差的瘤株，可见临界转化态EMT基因在制备或筛选诊断肺癌的药物或试剂盒、或筛选治疗肺癌的药物的用途中具有高度产业利用价值。

附图说明

图1显示为本发明的基于高表达临界转化态EMT基因的新型肿瘤预后诊断法的示意图

图2显示为多个连续时间点采样下表达差异较大的基因的聚类分析热图

图3显示为公开可得的五套临界转化态EMT基因HNF4A高表达瘤株的存活曲线分析图

具体实施方式

如图1所示，本发明发明人通过识别处于临界转化态的EMT基因，检测所选肺癌样株中临界转化态EMT类基因的表达水平，并进一步应用临界转化态的EMT基因的表达水平预测肺癌的预后，从而提供了EMT基因在制备或筛选诊断肺癌的药物(试剂盒)、或筛选治疗肺癌的药物中的用途。

具体包括如下步骤：

步骤1，检测肺癌样株中临界转化态EMT类基因的表达水平，包括临界转化态的EMT基因的识别和临界转化态的EMT基因表达水平的测定；

步骤2，应用高表达临界转化态EMT基因进行预后判断，包括单个基因或多个基因组合的高表达瘤株的识别以及预测出临界转化态EMT类基因具有较高表达水平的肺癌样株可能具有较高的恶性程度，并表现出较差的预后。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the seriesMETHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODSIN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例

步骤1，检测肿瘤样株中临界转化态EMT类基因的表达水平。

EMT样品制备：

1、在37℃、5％CO2条件下，用含10％胎牛血清和1％青链霉素的DMEM/F-12培养基(完全培养基)，在10厘米培养皿中培养人肺腺癌细胞A549细胞至对数生长期。

2、当细胞生长至对数生长期时，将培养皿中的培养基弃掉，加入1mlPBS清洗一遍，之后再加入1ml浓度为0.25％的胰酶37℃消化5分钟左右。

3、将培养皿放在光学显微镜下观察，当80％的细胞漂浮起来时，在培养皿中加入2ml完全培养基终止消化，并将细胞悬液收集至50ml离心管。

4、按适当比例稀释细胞悬液之后，使用血球计数板计算细胞密度。按照5x10^6个细胞每个10厘米皿的密度将细胞悬液铺至8个10厘米的培养皿，放置于37℃，5％CO2条件下培养24小时。

5、培养24小时之后，弃掉培养皿中的培养基，换成无血清的培养基饥饿处理16-18小时。

6、饥饿处理之后，弃掉培养基，换成含5ng/ml TGF-β的诱导培养基(无血清、无双抗)诱导。

7、分别在诱导0小时、6小时、12小时、24小时、36小时、48小时、72小时和96小时的时间点，用Trizol法收集细胞提取total RNA进行测序。

数据分析：

对制备的样本采用二代测序方法(具体为RNASEQ技术)进行测定，采用RSEM算法(版本号1.2.12)进行序列比对和表达值的计算，参考库选用ensemble_125，序列比对工具选用bowtie2，计算环境为ROCKS集群，其他参数采用默认，最终得到57773个基因的表达水平数据，并以TPM的形式进行表示。

随后，计算每个基因在这8个时间点下的表达最大值与最小值之比，以比值大于或等于4倍作为过滤标准1；至少一个时间点下的表达值大于或等于10个TPM作为过滤标准2。以上述两个过滤标准筛选所有基因的表达水平数据，选出表达差异较大的1633个基因进行聚类分析。如图2所示，定义仅在12小时-36小时区间取得最大表达值的基因为临界转化态EMT类基因，共识别出201个该类基因。

步骤2，应用高表达临界转化态EMT基因进行预后判断。

搜索NCBI的GEO数据库以及TCGA数据库，并设置过滤标准为肺癌，肿瘤样本数大于等于70例并具有临床信息，特别是病人随访的存活时间数据，共得到7套数据，具体如下：

1)SeriesAccession:GSE29016ID:200029016Samples(72)

2)SeriesAccession:GSE31210ID:200031210Samples(246)

3)SeriesAccession:GSE33072ID:200033072Samples(131)

4)SeriesAccession:GSE8894ID:200008894Samples(138)

5)TCGA-LUCA-mRNA-Level3 Samples(512)

6)Series Accession:GSE13213 ID:200013213 Samples(117)

7)Series Accession:GSE11969 ID:200011969 Samples(163)

在识别出的临界转化态EMT类基因中选定已有报道的EMT相关的肝细胞核因子HNF4A作为检测对象，提取每套基因表达数据中HNF4A的表达数据，取log2后的数值作为最终的表达水平，在统计学软件R工作平台(版本号：3.1.2)中调用聚类分析程序包mclust(版本号4.4)，将表达数据分为高表达和低表达的两类。其中GSE13213和GSE11969中HNF4A的表达水平较低(大部分数值在0附近)，因此不再进行下步处理。随后，对HNF4A的表达水平按照数值大小进行由小到大地排序，以低表达类的最大值和高表达类的最小值的平均值作为表达水平的区分标准。

各套数据的分割标准如下：

GSE29016：HNF4A的分割界限为7.0，其中HNF4A高表达组7例，HNF4A低表达组65例。

GSE31210：HNF4A的分割界限为6.3，其中HNF4A高表达组7例，HNF4A低表达组239例。

GSE33072：HNF4A的分割界限为7.7，其中HNF4A高表达组16例，HNF4A低表达组115例。

GSE8894：HNF4A的分割界限为2.1，其中HNF4A高表达组7例，HNF4A低表达组65例。

TCGA-LUCA-mRNA-Level3：HNF4A的分割界限为4.5，其中HNF4A高表达组138例，HNF4A低表达组374例。

不同样株系列本身的基因表达量略有差异，且检测方法略有不同，导致高表达和低表达分割界限的差异。

依据瘤株样本的存活数据进行存活曲线分析，结果如图3所示。其中，横坐标表示的是瘤株样本来源的病人存活时间，纵坐标表示的是瘤株样本来源的病人肺癌转移几率。由图3中各图可见，相对于HNF4A低表达组而言(向下箭头所示)，HNF4A高表达组表示肺癌样株具有较高的恶性程度，并表现出较差的预后(向上箭头所示)。

综上所述，本发明发明人发现通过检测瘤株中临界转化态EMT类基因如HNF4A的表达水平，识别出这类基因高表达的瘤株，并可进一步预测该类瘤株为高风险、预后差的类型。此外，经公开可得的肺癌病人微阵列和二代测序的基因表达数据和存活数据证实，本发明能够有效预测出高风险、预后差的瘤株，具有高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (5)

1.临界转化态EMT基因在制备或筛选诊断肺癌的药物或试剂盒、或筛选治疗肺癌的药物中的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述诊断肺癌具体指对肺癌恶性程度的预测和/或对肺癌预后的判断。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述肺癌恶性程度的预测具体指通过临界转化态EMT基因表达量的检测对肺癌样株的恶性程度进行预测。

4.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述肺癌预后的判断具体指通过临界转化态EMT基因表达量的检测对肺癌病人的病程和/或结局进行预后判断。

5.如权利要求3或4任一权利要求所述的用途，其特征在于，临界转化态EMT基因高表达表示肺癌样株具有较高的恶性程度，并表现出较差的预后。