CN105982979B - 一种青刺尖嫩叶提取物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种青刺尖嫩叶提取物及其制备方法和应用。制备方法包括以下两种方法中的任意一种：方法I：将粉碎后的青刺尖嫩叶至于乙醇溶液中浸没，然后提取0.2‑1.5小时，固液分离得滤液，对滤液进行减压旋蒸至干，得青刺尖嫩叶粗提物；方法II：(1)制得方法I的青刺尖嫩叶粗提物；(2)将粗提物用去离子水溶解后，上样到大孔树脂填充柱，依次用溶剂I、溶剂II和溶剂III洗脱，分别收集再脱除溶剂后，得洗脱部位A、洗脱部位B和洗脱部位C，即可。制备方法简便，易操作，产率较高，适宜推广应用；提取物组分种类多，各种组分相互协同作用，具有较好的抗衰老、抗氧化和抗老化活性的功效。
Description
技术领域
本发明涉及一种青刺尖嫩叶提取物及其制备方法和应用。
背景技术
青刺尖(Prinsepia utilis)，学名扁核木，蔷薇科扁核木属植物，别名炮筒果、牛奶捶、鸡蛋糕、梅花刺、枪子果、阿那斯、蒙自扁核木。青刺尖种子富含油脂，一般出油率30％左右，油呈暗棕黄色，澄清透明，凝固后白色如猪油；油可供食用、制皂、点灯用。嫩尖可当蔬菜食用。青刺尖生长于海拔1000-2650m的山坡、溪边或灌木丛中，主要分布于云南、贵州、四川、台湾、西藏等省区。青刺尖始载于《滇南本草》，其日：“性散寒，味苦。攻一切疮毒痈疽，有脓出头，无脓立消；散结核，嚼细用酒服”；其根、茎、叶、果实均可入药，云南省纳西族、白族、彝族、摩梭族等少数民族中已有上千年的应用历史。据现代资料记载，青刺尖茎叶主治痈疽毒疮，风火牙痛，枪伤，骨折，蛇咬伤；根主治虚咳，久咳，积食，风湿关节炎；果主治目翳多泪，消化不良等。国内外医药工作者已从该植物中分离、鉴定出黄酮类成分左旋-表儿茶精，木脂素类成分刺尖醇，脂肪酸类成分棕榈酸、硬脂酸、花生酸、油酸、亚油酸、亚麻酸等；药理研究改善细胞新陈代谢、增强机体免疫、具有调节人体血脂、促进血管软化、延缓衰老的功能。
综合目前青刺尖的研究，主要集中于青刺尖果油的研究，关于青刺尖的嫩叶研究较少。青刺尖嫩叶资源丰富，开发青刺尖嫩叶对青刺尖进一步的研究及有效合理地开发利用是十分必要的。目前，民间使用青刺尖嫩叶梢煎服并可用煎液反复漱口治口腔湿热糜烂及小儿咽喉炎发热；青刺尖与蜂蜜糖炒，水煎服治外痔出血；青刺尖嫩叶梢外用敷治疮痈肿毒；青刺尖根煎水调米面煎汤耙吃治食积。目前，现有技术中对青刺尖叶的提取物的研究，仅对其抗肿瘤作用进行了筛选，尚未发现青刺尖嫩叶提取物在化妆品领域，尤其是抗老化、抗氧化活性和抗衰老的用途和报道，且现有技术中青刺尖叶提取物在具体的提取过程中，提取的活性成份的制备方法不易重现，产率较低，不适宜推广应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服了现有技术中对青刺尖嫩叶提取物在具体的提取过程中，提取的活性成份的方法不易重现，产率较低，不适宜推广应用以及仅对抗肿瘤作用进行了研究的缺陷，创新性地提供了一种青刺尖嫩叶提取物及其制备方法和应用。本发明青刺尖嫩叶提取物的制备方法简便，易操作，产率较高，适宜推广应用；本发明青刺尖嫩叶提取物组分种类多，各种组分相互协同作用对提取物本身抗衰老作用起到提升作用，具有较好的抗衰老、抗氧化和抗老化活性的功效。
本发明提供了一种青刺尖嫩叶提取物的制备方法，所述的制备方法包括以下两种方法中的任意一种：
方法I：
将粉碎后的青刺尖嫩叶至于体积浓度为50-80％的乙醇溶液中浸没，然后提取0.2-1.5小时，固液分离得滤液，对滤液进行减压旋蒸至干，得青刺尖嫩叶粗提物；其中，所述青刺尖嫩叶与所述乙醇溶液的质量体积比为(1：8)-(1：15)g/mL；
方法II：
(1)将粉碎后的青刺尖嫩叶至于体积浓度为50-80％的乙醇溶液中浸没，然后提取0.2-1.5小时，固液分离得滤液，对滤液进行减压旋蒸至干，得青刺尖嫩叶粗提物；其中，所述青刺尖嫩叶与所述乙醇溶液的质量体积比为(1：8)-(1：15)g/mL；
(2)将所述的青刺尖嫩叶粗提物用去离子水溶解后，上样到大孔树脂填充柱，依次用溶剂I、溶剂II和溶剂III洗脱，分别收集洗脱液，再脱除溶剂后，相应地得到洗脱部位A、洗脱部位B和洗脱部位C，即可；其中，所述溶剂I为体积浓度25-35％的乙醇溶液，所述溶剂II为体积浓度45-55％的乙醇溶液，所述溶剂III为体积浓度65-75％的乙醇溶液。
方法I和方法II步骤(1)中，所述的浸没为本领域内常规，一般为在室温下进行。
方法I和方法II步骤(1)中，所述的提取为本领域常规操作，较佳地为超声提取。所述的超声提取的温度较佳地为在室温下进行。所述的室温为本领域常规，一般为15-25℃。所述的超声提取的时间较佳地为0.5小时。所述超声提取的次数较佳地为2次。
方法I和方法II步骤(1)中，所述的减压旋蒸为本领域内常规。
方法I和方法II步骤(1)中，所述乙醇溶液的体积浓度较佳地为65-75％，更佳地为70％。
方法I和方法II步骤(1)中，所述青刺尖嫩叶与所述乙醇溶液的质量体积比较佳地为(1：9)-(1：11)，更佳地为1：10。
方法II步骤(2)中，所述的大孔树脂填充柱为本领域常规的大孔树脂填充柱，一般为AB-8树脂填充柱。
方法II步骤(2)中，所述的溶剂Ⅰ较佳地为体积浓度为30％的乙醇溶液。所述溶剂Ⅱ较佳地为体积浓度为50％的乙醇溶液。所述溶剂Ⅲ较佳地为体积浓度为70％的乙醇溶液。
方法II步骤(2)中，所述的脱除溶剂的方法为本领域常规，较佳地为减压旋蒸。
本发明还提供了由上述制备方法制得的青刺尖嫩叶提取物。
本发明中，所述的青刺尖嫩叶提取物为所述青刺尖嫩叶粗提物、所述洗脱部位A、所述洗脱部位B和所述洗脱部位C中的一种或多种，较佳地为所述洗脱部位C。
本发明还提供了上述青刺尖嫩叶提取物在制备皮肤外用剂时作为抗老化活性成分、或者，抗氧化活性成分的应用。
较佳地，所述的青刺尖嫩叶提取物在制备皮肤外用剂时作为自由基清除剂、弹性蛋白酶抑制剂、纤维细胞增殖促进剂、或者，I型胶原蛋白生成促进剂的应用。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
1、本发明提供的青刺尖嫩叶提取物的组分种类多，各种组分相互协同作用对提取物本身抗衰老作用起到提升作用，具有较好的抗老化、抗氧化和抗衰老的功效。
2、本发明青刺尖嫩叶提取物的制备方法简便，易操作，产率较高，适宜推广应用。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1
青刺尖嫩叶干燥粉末20g，室温下以体积浓度为50％乙醇溶液200mL浸没，即青刺尖干燥粉末与乙醇溶液的质量体积比(料液比)为1：10，超声提取2次，每次30min(500W)，合并滤液，减压旋蒸至干，得青刺尖嫩叶粗提物2.05g，得率为10.25％。
实施例2
青刺尖干燥粉末20g，室温下以体积浓度为60％乙醇溶液200mL浸没，即青刺尖干燥粉末与乙醇溶液的质量体积比(料液比)为1：10，超声提取2次，每次30min(500W)，合并滤液，减压旋蒸至干，得青刺尖嫩叶粗提物2.12g，得率为10.60％。
实施例3
青刺尖干燥粉末20g，室温下以体积浓度为70％乙醇溶液200mL浸没，即青刺尖干燥粉末与乙醇溶液的质量体积比(料液比)为1：10，超声提取2次，每次30min(500W)，合并滤液，减压旋蒸至干，得青刺尖嫩叶粗提物2.24g，得率为11.20％。
实施例4
青刺尖干燥粉末20g，室温下以体积浓度为80％乙醇溶液200mL浸没，即青刺尖干燥粉末与乙醇溶液的质量体积比(料液比)为1：10，超声提取2次，每次30min(500W)，合并滤液，减压旋蒸至干，得青刺尖嫩叶粗提物2.28g，得率为11.40％。
实施例5
青刺尖干燥粉末20g，室温下以体积浓度为70％乙醇溶液160mL浸没，即青刺尖干燥粉末与乙醇溶液的质量体积比(料液比)为1：8，超声提取2次，每次30min(500W)，合并滤液，减压旋蒸至干，得青刺尖嫩叶粗提物2.02g，得率为10.10％。
实施例6
青刺尖干燥粉末20g，室温下以体积浓度为70％乙醇溶液240mL浸没，即青刺尖干燥粉末与乙醇溶液的质量体积比(料液比)为1：12，超声提取2次，每次30min(500W)，合并滤液，减压旋蒸至干，得青刺尖嫩叶粗提物2.27g，得率为11.35％。
实施例7
青刺尖干燥粉末20g，室温下以体积浓度为70％乙醇溶液300mL浸没，即青刺尖干燥粉末与乙醇溶液的质量体积比(料液比)为1：15，超声提取2次，每次30min(500W)，合并滤液，减压旋蒸至干，得青刺尖嫩叶粗提物2.29g，得率为11.45％。
实施例8
青刺尖干燥粉末50g，室温下以体积浓度为70％乙醇溶液500mL浸没，超声提取2次，每次30min(500W)，滤液合并约900mL，减压旋蒸至干，得青刺尖嫩叶粗提物5.63g，得率为11.25％。
将所述的青刺尖嫩叶粗提物用去离子水溶解后，上样到AB-8树脂填充柱，依次用体积浓度为30％的乙醇溶液、体积浓度为50％的乙醇溶液和体积浓度为70％的乙醇溶液洗脱，分别收集洗脱液(各约400mL)，脱除溶剂后，分别得到青刺尖嫩叶提取物的30％乙醇溶液洗脱部位1.85g，得率为30.85％，，50％乙醇溶液洗脱部位1.05g，得率为18.65％，70％乙醇溶液洗脱部位0.78g，得率为13.85％。
实施例9
青刺尖嫩叶粗提物的提取与实施例8的粗提物相同。
将所述的青刺尖嫩叶粗提物用去离子水溶解后，上样到AB-8树脂填充柱，依次用体积浓度为25％的乙醇溶液、体积浓度为55％的乙醇溶液和体积浓度为75％的乙醇溶液洗脱，分别收集洗脱液，脱除溶剂后，分别得到青刺尖嫩叶提取物的25％乙醇溶液洗脱部位，55％乙醇溶液洗脱部位，75％乙醇溶液洗脱部位。
实施例10
青刺尖嫩叶粗提物的提取与实施例8的粗提物相同。
将所述的青刺尖嫩叶粗提物用去离子水溶解后，上样到AB-8树脂填充柱，依次用体积浓度为35％的乙醇溶液、体积浓度为45％的乙醇溶液和体积浓度为65％的乙醇溶液洗脱，分别收集洗脱液，脱除溶剂后，分别得到青刺尖嫩叶提取物的35％乙醇溶液洗脱部位，45％乙醇溶液洗脱部位，65％乙醇溶液洗脱部位。
效果实施例1
1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)是一种稳定的氮中心有机自由基。DPPH法于1958年被提出，广泛用于地量测定生物试样、分类物质和食品的抗衰老能力。此法是根据DPPH自由基有单电子，在517nm处有一强吸收，其醇溶液呈紫色的特性。当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系，因而可用分光光度计进行快速的定量分析，来检测自由基清除情况，从而评价样品的抗氧化活性、抗衰老能力。
清除DPPH自由基能力的测定步骤为：将实施例1-7青刺尖嫩叶粗提物分别用去离子水配制成水溶液，移取2mL于10mL具塞试管中，加入2mLDPPH乙醇溶液(2×10-4mol/L)，充分混匀，室温静置，30min后用分光光度计测定517nm波长的吸光度A517；同时测定2mL提取物溶液与2mL乙醇混合后的吸光度A0，2mL水与2mL DPPH乙醇溶液混合后的吸光度C以及2mL水与2mL乙醇溶液混合后的吸光度C0。平行测定三次，取平均值，根据以下公式计算自由基清除率，清除率越大，说明提取物的抗氧化能力越强。实施例1-7青刺尖嫩叶粗提物的自由基清除活性的测定结果如表1所示。
自由基清除率(％)＝[1-(A517-A0)/(C-C0)]×100％。
表1 实施例1-7的自由基清除活性的测定结果
由表1可见，青刺尖嫩叶在乙醇体积浓度70％、料液比为1:10—1:12时，提取制得的青刺尖嫩叶粗提物具有优异的清除自由基能力。
效果实施例2
取实施例8所制备的青刺尖提取物，测定其清除DPPH自由基能力。测定步骤为：将青刺尖嫩叶提取物分别用去离子水配制成水溶液，移取2mL于10mL具塞试管中，加入2mLDPPH乙醇溶液(2×10-4mol/L)，充分混匀，室温静置，30min后用分光光度计测定517nm波长的吸光度A517；同时测定2mL提取物溶液与2mL乙醇混合后的吸光度A0，2mL水与2mL DPPH乙醇溶液混合后的吸光度C以及2mL水与2mL乙醇溶液混合后的吸光度C0。平行测定三次，取平均值，根据以下公式计算自由基清除率，清除率越大，说明提取物的抗氧化能力越强。实施例8青刺尖嫩叶提取物的自由基清除活性的测定结果如表2所示。
自由基清除率(％)＝[1-(A517-A0)/(C-C0)]×100％。
表2 实施例8的自由基清除活性的测定结果
由表2可见，青刺尖提取物具有很强清除自由基的能力，经AB-8树脂分离后得到的青刺尖70％乙醇洗脱部位清除自由基的活性最强。
效果实施例3
本效果实施例考察的是青刺尖嫩叶提取物的抗老化活性。取实施例8所制备的青刺尖嫩叶提取物，溶于去离子水，配制成水溶液，用于测定弹性蛋白酶抑制活性。测定方法按照文献(Am.J.Pharmacol.Toxicol.,2009,4,127-129)方法进行，测定步骤为：在96孔板中加入10uL样品溶液和130uL含有1.015mM反应底物Succ-Ala-Ala-Ala-p-硝基酰替苯胺的0.1M Tris-Cl缓冲溶液(pH值为8.0)，在25℃下温育5分钟，加入15uL弹性蛋白酶溶液(0.5U/mL)，继续在25℃下温育30min，然后用酶标仪测定410nm波长的吸光度A410。用去离子水替换样品水溶液，作为参比溶液同样测定吸光度，结果见表3。计算抑制率，抑制率越大，活性越好。
弹性蛋白酶活性抑制率计算公式为：抑制率(％)＝(A0-(A410-B))/A0×100％，其中A0是参比溶液的吸光度，A410是样品溶液的吸光度，B是样品水溶液稀释3倍后的吸光度。
表3 实施例8青刺尖嫩叶提取物的弹性蛋白酶抑制作用结果
由表3可知，在本发明中使用的青刺尖嫩叶提取物均具有抑制弹性蛋白酶作用，其中青刺尖嫩叶70％乙醇洗脱部位抑制弹性蛋白酶作用最强，可以将青刺尖提取物配合在外用剂中，作为防止肌肤老化、维持年轻健康的肌肤状态的抗老化剂使用。
效果实施例4
本效果实施例考察的是青刺尖提取物对成纤维细胞增殖及I型胶原蛋白生成的促进作用。取实施例8所制备的青刺尖嫩叶提取物，用去离子水配制成0.02％浓度溶液，加入到人成纤维细胞培养液中，以不含样品的去离子水为空白对照。培养48小时后，用MTT法对细胞染色后，用酶标仪测定550nm处吸光度A550，评估对人成纤维细胞的增殖作用，空白对照的增殖率为100％，增殖率高于120％为对细胞有增殖作用。取细胞上清样本，用I型胶原蛋白测定试剂盒测定胶原蛋白的生成，空白对照的增加率为100％，增加率大于100％为有促进胶原蛋白生成作用。
表4 实施例8青刺尖嫩叶提取物对成纤维细胞增殖及I型胶原蛋白生成的影响
由表4可知，在本发明中使用的青刺尖提取物均对成纤维细胞增殖及I型胶原蛋白的生成具有促进作用，其中青刺尖70％乙醇部位对成纤维细胞增殖和胶原蛋白生成的促进作用最强。
Claims (10)
1.一种抗老化或者抗氧化的青刺尖嫩叶提取物的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括以下两种方法中的任意一种：
方法I：
将粉碎后的青刺尖嫩叶置于体积浓度为65-80％的乙醇溶液中浸没，然后提取0.2-1.5小时，固液分离得滤液，对滤液进行减压旋蒸至干，得青刺尖嫩叶粗提物；其中，所述青刺尖嫩叶与所述乙醇溶液的质量体积比为1：9-1：15g/mL；
方法II：
(1)将粉碎后的青刺尖嫩叶置于体积浓度为65-80％的乙醇溶液中浸没，然后提取0.2-1.5小时，固液分离得滤液，对滤液进行减压旋蒸至干，得青刺尖嫩叶粗提物；其中，所述青刺尖嫩叶与所述乙醇溶液的质量体积比为1：9-1：15g/mL；
(2)将所述的青刺尖嫩叶粗提物用去离子水溶解后，上样到大孔树脂填充柱，依次用溶剂I、溶剂II和溶剂III洗脱，分别收集洗脱液，再脱除溶剂后，相应地得到溶剂II对应的洗脱部位B和溶剂III对应的洗脱部位C，即可；其中，所述溶剂I为体积浓度25-35％的乙醇溶液，所述溶剂II为体积浓度45-55％的乙醇溶液，所述溶剂III为体积浓度65-75％的乙醇溶液；
方法I和方法II步骤(1)中，所述的提取为超声提取，温度为在室温下进行。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的超声提取的时间为0.5小时；
和/或，所述超声提取的次数为2次。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，方法I和方法II步骤(1)中，所述乙醇溶液的体积浓度为65-75％。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，方法I和方法II步骤(1)中，所述青刺尖嫩叶与所述乙醇溶液的质量体积比为1：9-1：11。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，方法II步骤(2)中，所述的大孔树脂填充柱为AB-8树脂填充柱；
和/或，方法II步骤(2)中，所述的脱除溶剂的方法为减压旋蒸。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述溶剂Ⅱ为体积浓度为50％的乙醇溶液，所述溶剂Ⅲ为体积浓度为70％的乙醇溶液。
7.一种如权利要求1-6中任一项所述的制备方法制得的青刺尖嫩叶提取物。
8.如权利要求7所述的青刺尖嫩叶提取物，其特征在于，所述的青刺尖嫩叶提取物为所述青刺尖嫩叶粗提物、所述洗脱部位B和所述洗脱部位C中的一种或多种。
9.一种如权利要求7或8所述的青刺尖嫩叶提取物作为抗老化活性成分、或者，抗氧化活性成分在制备皮肤外用剂中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的青刺尖嫩叶提取物在制备皮肤外用剂时作为自由基清除剂、弹性蛋白酶抑制剂、纤维细胞增殖促进剂、或者，I型胶原蛋白生成促进剂的应用。
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