CN105950635A - 万寿菊八氢番茄红素脱饱和酶基因及应用 - Google Patents

万寿菊八氢番茄红素脱饱和酶基因及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了万寿菊八氢番茄红素脱饱和酶基因及应用。其中万寿菊八氢番茄红素脱饱和酶基因(TePDS1)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。在色素万寿菊花瓣组织中克隆获得了TePDS1基因，叶黄素含量测定和实时定量分析结果表明TePDS1基因在万寿菊花中表达量较高，其表达水平与叶黄素含量相关。本发明万寿菊八氢番茄红素脱饱和酶基因在叶黄素等类胡萝卜素色素合成积累方面发挥作用。

Description

万寿菊八氢番茄红素脱饱和酶基因及应用
技术领域
本发明涉及植物基因工程领域，尤其涉及一种从色素万寿菊中克隆类胡萝卜素合成途径八氢番茄红素脱饱和酶基因TePDS1及其应用。
背景技术
万寿菊(Tagetes erecta L.)是菊科万寿菊属1年生草本植物，原产美洲墨西哥等地，因其花花形大、绚丽多彩、植株适应性强、生产周期短，目前已在世界各地广泛引种，在我国也成为一种新兴的具有重要经济价值的植物资源。由于同等条件下比种植玉米或大豆增收1～2倍，万寿菊种植面积逐年增长，现我国已成为世界万寿菊叶黄素主产地。
万寿菊花瓣呈现黄橙色主要是由于含有叶黄素，叶黄素在万寿菊中主要以脂的形式存在，可占花瓣色素含量的90％(汪殿蓓等，北方园艺，2007；Harikumar等，International Journal of Toxicology，2008)。人体不能合成叶黄素但可以利用食物中摄取的叶黄素酯，使其在体内转化成为游离叶黄素。由于叶黄素在人体不能合成，并有多种异构体，也难采用化学方法体外合成，因而最佳获取方法是从天然植物中提取。早在1985年经研究确定叶黄素是视网膜黄斑色素的组成成分后，国内外研究人员对叶黄素开展了深入研究，发现尽管叶黄素在多种水果和蔬菜中普遍存在，但其含量却极其微少，因而富含这一成分的万寿菊成为提取天然叶黄素的重要植物资源。叶黄素色泽鲜艳，高含量的叶黄素不仅可用作天然着色色素，还具有丰富的营养价值及药用价值，在医药、食品、禽类养殖、化妆品中广泛应用。用于药片糖衣、胶囊的着色、保健饮料着色，或将高纯度的叶黄素酯制成硬胶囊、软胶囊、片剂、口服液等(周曦等，国外医学医学地理分册，2011)。
叶黄素因其价格与黄金相当而有“软黄金”之称。做为有重要营养、药用价值的天然色素，国内外对叶黄素需求量正逐年增加，我国虽然是色素万寿菊主产地，但由于相应研究和产业化尚处于起步阶段，除少量自用外，国产浸膏绝大部分出口国外。而国内所需90％以上依靠进口，每年需花费大量外汇进口叶黄素制品，满足制药工业原料、食品添加剂以及饲料添加剂等需求(李娜等，北方园艺，2010；王旭梅，新疆农垦经济，2012；翟建英等，中国中医药信息杂志，2014)。我国在基础研究方面，李浦等(西北农业学报，2012)对万寿菊W217×W203组合的P1、P2、F1、B1、B2和F2共6个世代的叶黄素含量进行遗传分析，表明叶黄素含量性状以主基因遗传效应为主，多基因效应为辅。叶黄素是类胡萝卜素中的含氧多萜类物质。在植物体内，合成前体异戊烯基焦磷酸经多次缩合生成第一个类胡萝卜素-八氢番茄红素，再经脱氢、环化、羟基化、环氧化等转变为其它类胡萝卜素，整个过程由多种酶催化完成。通过拟南芥、番茄等模式植物的研究已经对这些类胡萝卜素生物合成途径基因有了比较多的了解，发现八氢番茄红素合成酶(phytoene synthase，PSY)、八氢番茄红素脱饱和酶(phytoene desaturase，PDS)、番茄红素环化酶(lycopene cyclase，LYC)、胡萝卜素脱饱和酶(carotene desaturase，ZDS)、紫黄质脱环氧化酶(violaxanthin de-epoxidase，VDE)等在叶黄素等类胡萝卜素合成积累中发挥重要作用(Shengxiong Huang等，Nature communication，2013)。但作为叶黄素重要植物来源的万寿菊，其叶黄素合成途径的一些重要基因尚未克隆分离。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种可用于类胡萝卜素类植物天然色素合成的基因——万寿菊八氢番茄红素脱饱和酶基因Tagetes erecta phytoenedesa turase 1(TePDS1)。
本发明要解决的另外一个技术问题是提供一种万寿菊八氢番茄红素脱饱和酶基因的编码蛋白。
本发明要解决的还有一个技术问题是提供一种万寿菊八氢番茄红素脱饱和酶基因在叶黄素等类胡萝卜素色素合成中的应用。
对于万寿菊八氢番茄红素脱饱和酶基因Tagetes erecta phytoenedesa turase 1(TePDS1)，本发明采用的技术方案是，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。
对于万寿菊八氢番茄红素脱饱和酶基因的编码蛋白，本发明采用的技术方案是，编码蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。
另外，万寿菊八氢番茄红素脱饱和酶基因在包括叶黄素在内的类胡萝卜素合成中的应用。
本发明的万寿菊八氢番茄红素脱饱和酶基因的克隆方法如下：
根据发明人对色素万寿菊的高通量转录组深度测序对TePDS1基因进行数据组装。然后利用引物设计软件Primer Premier 5.0设计2对巢式PCR特异引物，从万寿菊花瓣中提取总RNA，反转录PCR(RT-PCR)克隆到TePDS1基因。
本发明通过万寿菊叶、不同发育时期花组织的实时定量分析和叶黄素含量测量结果，表明本发明所述SEQ ID NO：1基因在类胡萝卜素色素合成方面具有作用。
本发明的有益效果是：
为在植物中提高叶黄素等类胡萝卜素色素含量提供了一种新的基因资源。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明实施例的色素万寿菊栽培品种菊王的叶、花蕾、成熟花中TePDS1基因定量表达分析、叶黄素含量测定结果。
具体实施方式
下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook Russell的分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：万寿菊不同组织转录组测序
1、试剂
植物RNA提取试剂盒V1.2(DNase I)购于成都百菲特科技有限公司，RNALibrary Prep Kit购于北京百迈客生物科技有限公司，其余试剂均为进口分装或国产分析纯产品。
2、植物材料
色素万寿菊(Tagetes erecta L.)栽培品种菊王由赤峰鑫卉园艺公司繁育提供。
3、方法
3.1 RNA提取
按照植物RNA提取试剂盒V1.2所述操作步骤进行RNA提取。
1)使用液氮研磨法破碎100mg植物组织，移至1.5mL离心管中，加入1ml溶液A；
2)离心管中加入300μL溶液B和200μL氯仿，振荡30s混匀；
3)室温13000rpm离心15min，RNA位于上清液，下侧有机相含有叶绿素等杂质；
4)将上清700μL移至另1.5mL离心管中，下层有机相和中间层还有蛋白质和其他杂质，避免触及吸取；
5)在上清液中加入0.5mL溶液C和0.2mL氯仿，上下颠倒振荡30s混匀；
6)室温13000rpm离心6min；
7)将上清转移至另一1.5mL离心管中，避免触及有机相；
8)在上清中加入0.5倍体积溶液D，放置2min，上下颠倒振荡30s混匀；
9)将混合物(每次最多900μL)加入离心吸附柱中，室温12000rpm离心1min，弃穿透液，清洗一次；
10)加入700μL漂洗液，12000rpm离心1min，弃去穿透液；
11)12000rpm离心2min；
12)将5-6μL的Recombinant DNase I加入到45-44μL DNase I Buffer中吹打混匀配制成DNase I工作液，然后将DNase I工作液加入到离心吸附柱中，室温放置15-20分钟；
13)加入500μL漂洗液，室温12000rpm离心1min，弃去穿透液；
14)加入500μL漂洗液，重复一遍；
15)12000rpm离心2min；
16)将离心吸附柱移至RNase-free收集管中，加入50-100μL RNase-freeH2O，室温放置3-5min；
17)12000rpm离心2min，离心管中溶液即为RNA样品；
18)分别采用Nanodrop、Qubit2.0、Aglient2100方法检测RNA样品的纯度、浓度和完整性。
通过提取色素万寿菊栽培品种菊王三个单株的叶片、花蕾、成熟花RNA各1份，进行后续的转录组序列测定。
3.2转录组测序组装与注释
转录组测序利用RNA Library Prep Kit试剂盒，通过北京百迈客生物科技有限公司Illumina HiSeq高通量测序平台，按以下步骤进行：
1)用带有Oligo(dt)的磁珠富集真核生物RNA，将mRNA进行随机打断；
2)以mRNA为模版，用六碱基随机引物合成第一条cDNA链，然后加入dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第二条cDNA链，利用AMPure XP beads纯化cDNA；
3)纯化的双链cDNA再进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后用AMPure XP beads进行片段大小选择，通过PCR富集得到cDNA文库；
4)对文库的浓度和***片段大小进行检测；
5)利用Illumina HiSeq高通量测序平台对cDNA文库进行测序，测序读长为PE125；
6)将测序片段(reads)截除测序接头、引物序列，过滤低质量值数据后，获得高质量的测序数据；
7)利用Trinity组装软件将高质量测序read延伸成较长的片段(contig)，并利用这些片段之间的重叠，得到片段集合(component)，最后利用De Bruijn图的方法获得转录本序列(unigene)；
8)使用BLAST软件将unigene序列与NR、Swiss-Prot、GO、COG、KOG、KEGG数据库比对，使用KOBAS2.0预测unigene的氨基酸序列，使用HMMER软件与Pfam数据库比对，获得unigene的注释信息。
4.结果
通过上述步骤将万寿菊组织材料进行高通量转录组深度测序，对测序进行组装和基因功能预测，获得万寿菊八氢番茄红素脱饱和酶基因Tageteserecta phytoene desa turase 1(TePDS1)基因的推测序列。
实施例2：万寿菊TePDS1基因的克隆
1、试剂
植物RNA提取试剂盒V1.2(DNase I)购于成都百菲特科技有限公司；反转录酶TransScript Reverse Transcriptase购于北京全式金生物技术有限公司；高保真DNA聚合酶PrimeStar购于TaKaRa公司；克隆载体pEASY-BluntSimple Cloning Vector购于北京全式金生物技术有限公司；引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成；其余试剂均为进口分装或国产分析纯产品。
2、大肠杆菌菌株和植物材料
大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5d购于北京全式金生物技术有限公司；色素万寿菊(Tagetes erecta L.)栽培品种菊王种子由赤峰鑫卉园艺公司繁育提供。
3、培养基和溶液
LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L。用NaOH调pH至7.0，高压灭菌。
SOB培养基：胰蛋白胨20g/L，酵母粉5g/L，NaCl 0.5g/L，KCl 0.19g/L，100×Mg2+10mL。用NaOH调pH至7.0，高压灭菌。
SOC培养基：方法同上述SOB培养基的配制，再加入2mL过滤除菌的1mol/L葡萄糖。
100×Mg2+溶液：20.33g MgCl2.6H2O和24.65g MgS04.7H2O定容于100mL H2O，高压灭菌。
4、方法
4.1万寿菊成熟花组织RNA提取
如实施例1所述，按照植物RNA提取试剂盒V1.2所述操作步骤进行。
4.2 RT-PCR
4.2.1 RT
1)取1μg总RNA与1μL polyT18(10μM)引物混合，用RNase-freeddH2O补足到12.75μL，轻轻混匀；
2)65℃保温5min，立即转移至冰浴中，放置2min；
3)加入5×反应缓冲液4μL，10mM dNTP 2μL，RNA抑制剂0.25μL(40U/μL)，TransScript Reverse Transcriptase反转录酶1μL(100U/μL)，42℃1h，合成第一链cDNA；
4)95℃加热5min，失活反转录酶，终止反应。
4.2.2 PCR
根据实施例1所述获得的TePDS1基因推测序列，利用Primer Premier 5.0软件设计引物序列如下：
TePDS1F1：5’ATAACAACAACCACCTCCGA 3’
TePDS1R1：5’GCCACTACACTTCTGCCCAT 3’
TePDS1F2：5’ATGTCTCTGTTATCAGCCACCA 3’
TePDS1R2：5’TTAGACCAGACTTGCTTCAGCA 3’
取上述4.2.1所获万寿菊成熟花的cDNA，进行TePDS1基因的克隆。将200μL EP管放置于冰上，加入试剂：
按以下程序进行扩增：98℃ 2min(预变性)；98℃ 10s(变性)，55℃ 20s(复性)，72℃100s(延伸)，所述变性-复性-延伸30个循环；72℃5min(总延伸)。
以上述PCR产物为模板，以引物TePDS1F2和TePDS1R2进行第二轮PCR，复性温度57℃，其它条件同上。
通过上述操作，获得了TePDS1基因PCR扩增产物。
4.3高保真PCR产物与克隆载体pEASY-Blunt连接
将由上述4.2所述获得的TePDS1基因PCR扩增产物与克隆载体pEASY-Blunt Simple Cloning Vector按摩尔分子数比1∶4连接(25℃，15min)，连接体系如下：
pEASY-Blunt Simple Cloning Vector(50μg/μL) 4μL
PCR产物(～150μg/μL) 1μL
4.4大肠杆菌转化
1)从液氮中取出大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5α感受态细胞冰浴解冻；
2)将4.3所述连接产物与大肠杆菌感受态细胞轻轻混匀，冰浴30min；
3)42℃热冲击90s，立即冰浴1-2min；
4)加入0.8mL SOC，混匀，37℃温和振荡培养1h；
5)室温13000rpm离心1min，倒掉一部分上清液，留约200μL的上清液，用吸头将上清液与细胞混匀，涂布于含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB平板，37℃培养过夜。
4.5快速裂解法鉴定重组克隆
1)挑取单克隆接种于500μL含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养液中，37℃振荡培养至A600为0.6～0.8；
2)取200μL菌液至0.5mL EP管中，13000rpm离心1min，去上清，留约20μL上清；
3)加入20μL 2×快速裂解液(0.2M NaOH 50mL，SDS 0.5g，蔗糖27.2g，加双蒸水至200mL)，剧烈振荡；
4)13000rpm离心15min；
5)取5μL上清进行琼脂糖凝胶电泳。与对照相比，电泳带滞后的即可能是重组载体。
4.6菌落PCR鉴定重组质粒
将4.5所述经快速裂解法鉴定的重组载体再进行菌落PCR鉴定，以确定***片段是目标片段，反应体系如下：
反应条件：94℃3min(预变性)；94℃30s(变性)，57℃20s(复性)，72℃100s(延伸)，所述变性-复性-延伸26个循环；72℃5min(总延伸)。
对菌落PCR鉴定的重组载体，命名为pEASY-TePDS1，进行测序。测序结果表明，获得了连接于pEASY-Blunt Simple克隆载体的TePDS1基因全长编码序列。
实施例3：HPLC方法测定万寿菊花瓣叶黄素含量
1、试剂
叶黄素标准品购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚购于国药集团化学试剂有限公司，其余试剂均为进口分装或国产分析纯产品。
2、方法
取万寿菊叶片、花蕾及成熟花瓣样品，液氮研磨，称重0.15g，加入1mL乙醇(含0.1％2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚)，涡旋15s，加入400mL 50％KOH水溶液，涡旋15s，于60℃水浴60min，每15min涡旋一次。用3.3mL正己烷提取3次，合并提取液，取50μL滤液上样。色谱条件：高效液相色谱仪(美国WATERS公司)；色谱柱SymmetryC18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相∶乙腈∶二氯甲烷∶甲醇为70∶20∶10(v∶v∶v)；流速1mL/min；检测波长475nm；柱温30℃。
3、结果
根据叶黄素标准品标准曲线和HPLC测定结果，测得万寿菊叶片、花蕾及成熟花瓣叶黄素含量分别为1.30、12.99、8.85mg/g鲜重。
实施例4：万寿菊TePDS1基因组织表达分析
1、试剂
植物RNA提取试剂盒V1.2(DNase I)购于成都百菲特科技有限公司；反转录酶TransScript Reverse Transcriptase购于北京全式金生物技术有限公司公司；实时定量PCR试剂TransStart Green qPCR SuperMix购于北京全式金生物技术有限公司；引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成；其余试剂均为进口分装或国产分析纯产品。
2、方法
取万寿菊植株叶片、花蕾及成熟花样品，液氮研磨后提取RNA，进行反转录，操作步骤如实施例1中3.1、实施例2中4.2所述。
以万寿菊Translation Initiation Factor6(TIF6)为内参对照基因，进行TePDS1基因表达水平的定量PCR分析。TePDS1基因引物为：TePDS1F3和TePDS1R3；TIF6基因引物为：TIF6F和TIF6R。引物序列如下：
TePDS1F3：5’GCTCATACTATTACGGCTCGTCATC 3’
TePDS1R3：5’GTGAAGGTGGAAGACAAGTAAGCAG 3’
TIF6F：5’TAAGACCTGGTGGTGGAAATAGA 3’
TIF6R：5’CAGCACCATGAGGACGAAGA 3’
实时定量PCR反应体系如下：
反应条件：95℃30s；95℃5s，60℃15s，72℃10s，40个循环。其中cDNA为实施例2中4.2.1方法所述获得cDNA模板稀释30倍后用于定量PCR。扩增后，65℃5s，每个循环增加0.5℃，60个循环，进行溶解曲线分析。每个样品重复三次。PCR反应在Bio-Rad CFX 96上运行。
3、结果
实时定量PCR分析结果显示，TePDS1在色素万寿菊的花组织，尤其是未成熟花中表达量较高，且TePDS1基因表达水平与相应组织中叶黄素含量呈正相关，见图1。
以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的权利要求保护范围之内。

Claims (3)

1.万寿菊八氢番茄红素脱饱和酶基因，其特征在于：其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。
2.如权利要求1所述万寿菊八氢番茄红素脱饱和酶基因的编码蛋白，其特征在于：所述编码蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。
3.如权利要求1所述万寿菊八氢番茄红素脱饱和酶基因在包括叶黄素在内的类胡萝卜素合成中的应用。
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