CN105950562A

CN105950562A - 一株抗磺胺嘧啶特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株yh8及其应用

Info

Publication number: CN105950562A
Application number: CN201610580308.7A
Authority: CN
Inventors: 刘丽强; 王忠兴; 胥传来; 匡华; 徐丽广; 马伟; 吴晓玲; 宋珊珊; 胡拥明
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2016-07-22
Filing date: 2016-07-22
Publication date: 2016-09-21

Abstract

一株抗磺胺嘧啶特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株YH8及其应用，属于食品安全免疫检测领域。本发明提供的抗磺胺嘧啶特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株YH8，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 12023。所述杂交瘤细胞株YH8可以分泌产生对磺胺嘧啶具有较好的特异性和较高的灵敏度的抗体，对磺胺嘧啶的50%抑制浓度IC₅₀为5μg/L，可以用于制备磺胺嘧啶的免疫检测试剂盒以及胶体金试纸条，为食品安全中磺胺嘧啶的特异性检测和畜牧业快速健康的发展提供有力的检测方法及手段。

Description

一株抗磺胺嘧啶特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株YH8及其应用

技术领域

本发明涉及一株抗磺胺嘧啶特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株YH8及其应用，属于食品安全免疫检测领域。

背景技术

磺胺嘧啶(sulfadiazine，SD)具有较强的抑菌作用，长期应用于临床和作为兽用药物，然而磺胺嘧啶的副作用比较强，过量或者长期食用可造成肾损伤，肝损伤，末端神经炎以及药物过敏性皮炎、白细胞减少、溶血性贫血和药物热，甚至有可能导致癌症。因此，我国及美国、欧盟、日本等国家规定，动物性食品和饲料中磺胺嘧啶的最高残留限量为100μg/kg。

目前磺胺嘧啶检测多采用理化方法如高效液相色谱法、液相色谱与质谱联用法、气质联用法等。上述检测方法可进行定量分析并具有较低的检测限，但是通常需要昂贵的仪器和复杂的操作，前处理及检测时间长，严重制约了这些检测方法的推广。而免疫分析方法具有低成本、高通量、高灵敏、对技术人员相对要求低等特点，因此适用于大量样品的快速筛查。本发明的目的在于提供一种对磺胺嘧啶具有较高亲和力和检测灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备方法。为间接竞争 ELISA 试剂盒以及胶体金试纸条的研发推广奠定了基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗磺胺嘧啶特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株，由该细胞株制备的单克隆抗体对磺胺嘧啶具有较好的亲和力和特异性，可以用来建立磺胺嘧啶酶联免疫检测方法，或建立胶体金免疫层析试纸条快速检测方法。

本发明的技术方案，一株抗磺胺嘧啶特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株YH8，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCCNo.12023。

抗磺胺嘧啶特异性单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCC No.12023的抗磺胺嘧啶特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株YH8分泌产生。

所述抗磺胺嘧啶特异性单克隆抗体的应用，用于食品安全中磺胺嘧啶的残留检测。

本发明提供的YH8细胞株的制备基本步骤为：

（1）免疫原的制备与鉴定：以磺胺嘧啶为原料，通过重氮法与蛋白载体的氨基相连，反应结束后，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，完全抗原通过紫外吸收扫描方法鉴定；

（2）小鼠的免疫：选取6-8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。将免疫原与福氏佐剂乳化完全后，通过皮下多点注射免疫小鼠，首次免疫采用福氏完全佐剂，加强免疫使用福氏不完全佐剂，冲刺免疫时免疫剂量为前一次免疫剂量的一半，与生理盐水混合均匀后直接进行腹腔注射；各次免疫间隔为三周。第三次免疫后，间隔一周采血检测血清效价和抑制；

（3）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG 4000）法，使小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得杂交瘤细胞株YH8；

（4）杂交瘤细胞株性质的鉴定：采用小鼠单抗Ig类/亚类鉴定用酶标二抗套装测定；IC₅₀值、交叉反应率和亲和力的测定通过ELISA法。

本发明的有益效果：本发明获得的抗磺胺嘧啶单克隆抗体细胞株，对磺胺嘧啶有较好的检测灵敏度和亲和力，还提供了一种新的合成磺胺嘧啶免疫原的方法，半抗原的合成步骤更加简化，有效，为今后人们的研究提供了合成免疫原的思路与方法。

生物材料样品保藏：单克隆细胞株YH8，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.12023，保藏日期2016年1月20日。

附图说明

图1是免疫原的紫外吸收光谱表征（SD-BSA60表示小分子与蛋白的偶联比为60，SD-BSA90、SD-BSA120以此类推）。

图2是YH8单克隆抗体对磺胺嘧啶的标准抑制曲线。

具体实施方式

本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。

本发明通过将磺胺嘧啶完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过间接ELISA和间接竞争ELISA筛选细胞上清，最终得到了对磺胺嘧啶有较好亲和力和灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株YH8。

实施例1：抗磺胺嘧啶特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株YH8的制备

1、完全抗原的合成：取2.2mg磺胺嘧啶溶于2mL DMF(N,N-二甲基甲酰胺)中，再加入1mL的1M盐酸溶液，冰浴条件下放置0.5h后，缓慢加入现配的1mg/mL的亚硝酸钠进行活化反应，添加过程中以淀粉碘化钾试纸监控反应体系，当试纸变为蓝黑色时，停止加入亚硝酸钠溶液，活化0.5h后，缓慢逐滴加入到5mL 3mg/mL的BSA溶液中偶联，反应过夜，取出免疫原SD-BSA用PBS透析三天，-20℃分装保存。

2、动物免疫：选择健康的6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。取磺胺嘧啶完全抗原（1mg/mL）与等量福氏佐剂乳化均匀后，通过皮下多点注射免疫BALB/c小鼠，每只100μL。首次免疫采用福氏完全佐剂，加强免疫使用福氏不完全佐剂，冲刺免疫时免疫剂量为前一次免疫剂量的一半，与生理盐水混合均匀后直接进行腹腔注射；各次免疫间隔为三周。第三次免疫后，间隔一周采血检测血清效价和抑制；选择抑制最好的小鼠，在五免后18天冲刺免疫，准备融合。

3、细胞融合：在冲刺免疫三天后，按照常规PEG（聚乙二醇，分子量为4000）方法进行细胞融合，具体步骤如下：

（1）无菌取小鼠脾脏，研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，并进行细胞计数；

（2）收集SP2/0细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；

（3）将脾细胞和SP2/0细胞按照计数比2-10︰1的比例混合，离心后用PEG融合，时间1min，之后按照从慢到快，加入RPMI-1640基础培养液，离心后悬浮于含20% 胎牛血清、2%的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，置于37℃、5% CO₂的培养箱中培养。

4、细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第三天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20% 胎牛血清、1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第七天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用间接ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用磺胺嘧啶为标准品，用间接竞争ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对磺胺嘧啶有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得细胞株YH8。

5、单克隆抗体的制备与鉴定：取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×10⁶杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-饱和硫酸铵法纯化，获得的单抗置于-20℃保存。

使用小鼠单抗亚型鉴定试剂盒对腹水纯化获得的单克隆抗体进行免疫球蛋白亚型鉴定，其亚型为IgG3型，具体如表1所示。

表1.磺胺嘧啶单克隆抗体的亚型鉴定

使用间接竞争ELISA法，测定单克隆抗体对磺胺嘧啶的IC₅₀为 5μg/L，并验证了其对磺胺甲基嘧啶，磺胺二甲基嘧啶，磺胺喹恶林，磺胺甲氧嘧啶，磺胺二甲氧嘧啶，磺胺吡啶等的IC₅₀和交叉反应率，具体如表2所示。

表2.YH8单克隆抗体对磺胺甲基嘧啶，磺胺二甲基嘧啶，磺胺喹恶林，磺胺甲氧嘧啶，磺胺二甲氧嘧啶，磺胺吡啶的IC₅₀和交叉反应率

6、抗体应用

将杂交瘤细胞株YH8通过体内腹水制备的单克隆抗体应用于磺胺嘧啶ELISA添加回收试验，具体步骤如下：

（1）用碳酸盐缓冲液（CBS）稀释好的0.1μg/mL的SD-OVA作为包被原包被96孔酶标板，每孔100μL，37℃包被2h后，用PBST洗液洗板三次，每次每孔200μL，每次3min，拍干；

（2）用含0.2%明胶的CBS进行封闭，每孔200μL，37℃封闭2h，用PBST洗液洗板三次，每次每孔200μL，每次3min，拍干；

（3）用磷酸盐缓冲液（PBS）分别配置0，0.02，0.05，0.1，0.2，0.5，1，2μg/L的磺胺嘧啶标准溶液。将标准溶液以及待检测样品提取液，分别加入到已经封闭好的酶标板中，每孔50μL，每个样品重复3个孔，再每孔加入50μL 1︰16000稀释的抗磺胺嘧啶单克隆抗体，37℃反应0.5h后，洗板拍干；

（4）每孔加入100μL用含0.1%明胶的PBS 1︰3000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃反应0.5h后，洗板拍干；

（5）每孔加入100μL TMB显色液，37℃显色15min后，每孔加入50μL 2M H₂SO₄终止液，450nm测吸光值；

（6）添加回收及样品前处理：称取1g鸡肉样本添加三个不同剂量的磺胺嘧啶标准品，分别为2ng、5ng及10ng。均质后，加入50μL葡萄苷酸酶-芳基磺酸酯酶，混匀后，加入10mL的乙腈超声提取20min。向溶液中加入0.13g的NaCl，震荡均匀。8000rpm离心10min后提取1mL有机相氮气吹干，加入正己烷1mL，震荡1min后再加入标准品稀释液2mL，8000rpm离心5min后，取下层液用于检测。滤液用含0.01%明胶的PBS稀释4倍后，作为ELISA样品提取液，采用间接竞争ELISA进行添加回收试验，其回收率分别为109%，98%，102%。

溶液的配置：

碳酸盐缓冲液（CBS）：称取Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用；

磷酸盐缓冲液（PBS）：8.00g NaCl，0.2g KCl，0.24g KH₂PO₄，3.62g Na₂HPO₄·12 H₂O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2-7.4，定容至1000mL；

PBST：含0.05% Tween 20的PBS；

TMB显色液：A液：Na₂HPO₄·12H₂O 18.43g，柠檬酸 9.33g，纯水定容至1000mL；B液：60mg TMB 溶于100mL乙二醇中。A、B液按体积比1︰5混合即为TMB显色液，现用现混。

综上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明申请专利范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明的技术范畴。

Claims

1.一株抗磺胺嘧啶特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株YH8，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.12023。

2.抗磺胺嘧啶特异性单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCC No.12023的抗磺胺嘧啶特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株YH8分泌产生。

3.权利要求2所述抗磺胺嘧啶特异性单克隆抗体的应用，其特征在于：用于食品安全中磺胺嘧啶的残留检测。