CN105936906B - 被修饰的含CpG序列单元的寡聚脱氧核苷酸分子及其用途 - Google Patents

被修饰的含CpG序列单元的寡聚脱氧核苷酸分子及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种免疫治疗技术领域的被修饰的含CpG序列单元的寡聚脱氧核苷酸分子及其用途；本发明涉及被修饰的含CpG序列单元的寡聚脱氧核苷酸作为免疫增强剂的应用；同时还涉及被修饰的含CpG序列单元的寡聚脱氧核苷酸作为***的口服或者吸入制剂的应用。本发明涉及一种经结构修饰的CpG寡聚脱氧核苷酸（CpG ODN），由特定组合的肽段、特定链长的脂肪酸、或类脂结构修饰具有免疫调节功能的CpG ODN而得。这种结构修饰的CPG ODN具有更好的口服生物利用度以及免疫调节功能，可以作为口服免疫增强和免疫治疗药物，提高生物体对抗原的免疫应答，应用于过敏性疾病、传染性疾病、免疫缺陷性疾病及癌症等。

Description

被修饰的含CpG序列单元的寡聚脱氧核苷酸分子及其用途
本申请是原申请的分案申请，原申请的申请日为：2013.11.08；申请号为：201310554389.X；发明创造名称为：被修饰的含CpG序列单元的寡聚脱氧核苷酸分子及其用途。
技术领域
本发明属于免疫治疗技术领域，具体涉及一种被修饰的含CpG序列单元的寡聚脱氧核苷酸分子及其用途。
背景技术
早在19世纪90年代，美国肿瘤医生Coley发现将细菌粗提取物应用于900名长期肿瘤患者,有40％患者肿瘤能自行消退,当时人们认为是细菌粗提取物中的脂多糖起到活性作用，并未引起足够重视。后来，用卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin,BCG)进行的小鼠体内实验发现，用DNA酶处理过的BCG不具有抗肿瘤作用，说明细菌DNA才是介导这种抗肿瘤效应的物质[Tokunaga,T.,et al.,Antitumor activity of deoxyribonucleic acidfraction from Mycobacteriumbovis BCG.I.Isolation,physicochemicalcharacterization,and antitumor activity.J Natl Cancer Inst,1984.72(4):955-62]。随后，研究者证实细菌DNA具有直接的免疫刺激作用和抗肿瘤作用[Yamamoto,S.,etal.,DNA from bacteria,but not from vertebrates,induces interferons,activatesnatural killer cells and inhibits tumor growth.MicrobiolImmunol,1992.36(9):983-97]。Pisetsky课题组报道了纯化的细菌DNA(bDNA)和poly-(dG,dC)可以诱导B细胞增殖并分泌抗体，而哺乳动物的DNA不能[Messina,J.P.,G.S.Gilkeson,and D.S.Pisetsky,Stimulation of in vitro murine lymphocyte proliferation by bacterial DNA.JImmunol,1991.147(6):1759-64]。随后，研究者发现poly-(dG,dC)中胞嘧啶的甲基化会导致丝裂原活性丧失[Messina,J.P.,G.S.Gilkeson,and D.S.Pisetsky,The influence ofDNA structure on the in vitro stimulation of murine lymphocytes by naturaland synthetic polynucleotide antigens.Cell Immunol,1993.147(1):148-57]。但是当时的研究者并没有把CpG的甲基化与细菌和哺乳动物DNA的不同免疫活性联系起来，他们只是猜测甲基化破坏了bDNA的高级结构。
通过用合成的寡聚脱氧核糖核苷酸(oligodeoxynucleotides,ODN)进行的实验研究，发现细菌DNA具有免疫刺激作用是由于其中含有具有特异性侧翼序列的非甲基化CpG核苷酸基序[Yamamoto,T.,et al.,Lipofection of synthetic oligodeoxyribonucleotidehaving a palindromic sequence of AACGTT to murine splenocytes enhancesinterferon production and natural killer activity.MicrobiolImmunol,1994.38(10):831-6]。与细菌DNA不同，哺乳动物和其他脊椎动物DNA分子中CpG基序出现的频率很低，并且60％～90％的CpG基序中胞嘧啶的第五碳原子发生甲基化，因此，哺乳动物本身的DNA分子不具有免疫刺激作用[Barton,G.M.,J.C.Kagan,and R.Medzhitov,Intracellularlocalization of Toll-like receptor 9prevents recognition of self DNA butfacilitates access to viral DNA.Nature Immunology,2006.7(1):49-56]。ArthurM.Krieg等人通过分析合成的不同序列CpG ODN的免疫刺激活性，初步得出免疫刺激性CpGODN结构的基本规律：序列必须含有非甲基化的CpG基序；CpG基序的基本结构为5'-X 1X2CGY 1Y 2-3'，其中X 1代表一个嘌呤，X 2代表一个嘌呤或者一个胸腺嘧啶，Y 1和Y 2代表嘧啶。在一个CpG ODN中可以有一个或者多个CpG基序，CpG基序两侧特异的嘌呤和嘧啶，以及CpG基序间相隔碱基的不同都会影响CpG基序的免疫刺激类型和强度[Krieg,A.M.,etal.,CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B-cell activation.Nature,1995.374(6522):546-9；Krieg,A.M.,CpG motifs in bacterial DNA and their immuneeffects.Annual Review of Immunology,2002.20:709-760；Krieg,A.M.,G.Hartmann,andA.K.Yi,Mechanism of action of CpG DNA.Immunobiology of Bacterial Cpg-DNA,2000.247:1-21]。
人体免疫***能够发现病原体感染，并对感染进行归类以产生不同的细胞效应，关键的结构是免疫细胞(如T细胞，B细胞)上具有的特异的、高亲和力的抗原受体，称为模式识别受体(pattern-recognition receptor,PRR)。PRR能与病原体上面的抗原相结合，这些抗原被统称为病原体相关模式分子(pathogen-associated molecular pattern,PAMP)。含有非甲基化CpG二核苷酸的寡聚脱氧核苷酸就是PAMP之一。迄今为止，人们共发现了四种类型的CpG ODN：D型(或A型)，K型(或B型)，C型和P型，每种类型都有独特的结构和生物功能特点。它们被分布在细胞内质网上的TLR9识别，而表达TLR9的,小鼠体内主要是单核细胞、巨噬细胞、mDC细胞、pDC细胞和B细胞，人体内主要是后两种[Klinman,D.M.,Currie,D.,Gursel,I.&Verthelyi,D.Use of CpGoligodeoxynucleotides as immuneadjuvants.Immunological Reviews 199,201-216(2004)]。
因此CpG寡聚脱氧核苷酸能直接刺激这些细胞,并间接激活T细胞、自然杀伤细胞，诱导以Th1型为主的免疫应答，而最新的研究的表明它可以直接抑制mMDSC细胞[Y.Shirota,H.Shirota,D.M.Klinman,Journal of immunology 2012,188,1592-1599]，被公认为一种新型的高效低毒的免疫佐剂或者免疫治疗药物，在治疗感染性疾病、过敏性疾病、免疫缺陷性疾病、及癌症肿瘤中有着强大的潜在应用价值，正受到越来越多科学家的关注。
目前对CpG寡聚脱氧核苷酸的骨架全硫代或者部分硫代修饰，能够部分解决CpG寡聚脱氧核苷酸被核酸酶水解的问题，但依然存在生物利用度不高的问题，因此本发明对CpG寡聚脱氧核苷酸进行小分子修饰以解决这一问题，特别是口服给药的生物利用度。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种被修饰的含CpG序列单元的寡聚脱氧核苷酸分子及其用途。本发明的结构修饰的CPG ODN具有更好的口服生物利用度以及免疫调节功能。
第一方面，本发明涉及一种被修饰的含CpG序列单元的寡聚脱氧核苷酸，所述修饰分子选择下式中的一种：
优选地，所述寡聚脱氧核苷酸含有1-5个CpG单元，其链长为10-30nt。
优选地，所述修饰分子修饰的位点是寡聚脱氧核苷酸的5’-末端、3’-末端或者中间位置。
优选地，所述寡聚脱氧核苷酸含有如下序列中的一种：
组别 序列(5’-3’)
CpG1826 tccatgacgttcctgacgtt
CpG-H1826 tccatgtcgttcctgtcgtt
CpG-7 tgacgttccgtt
CpG-H7 Tgtcgttccgtt
CpG-8 atgacgttgcgtt
CpG-H8 atgtcgttgcgtt
CpG-13 tccatgacgttcctgacgttcctgacgtt
CpG-H13 tccatgtcgttcctgtcgttcctgtcgtt
CpG7909(2606) tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt
在临床应用中，鼠敏感的CpG1826、CpG-7、CpG-8、CpG-13，按照已知的理论可以转换成人敏感的序列CpG-H1826、CpG-H7、CpG-H8、CpG-H13。
优选地，所述寡聚脱氧核苷酸的骨架为全硫代修饰、部分硫代修饰或者无硫代修饰。
第二方面，本发明涉及一种如前述的被修饰的含CpG序列单元的寡聚脱氧核苷酸作为免疫增强剂的应用。
第三方面，本发明还涉及一种如前述的被修饰的含CpG序列单元的寡聚脱氧核苷酸作为***的口服或者吸入制剂的应用。
本发明具有如下的有益效果：本发明涉及一种经结构修饰的CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN)，由特定组合的肽段、特定链长的脂肪酸、或类脂结构修饰具有免疫调节功能的CpG ODN而得。这种结构修饰的CPG ODN具有更好的口服生物利用度以及免疫调节功能，可以作为口服免疫增强和免疫治疗药物，提高生物体对抗原的免疫应答，应用于过敏性疾病、传染性疾病、免疫缺陷性疾病及癌症等。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为不同反应条件的click反应PAGE图；
图2为不同反应条件的click反应PAGE图和纯化过的偶联物PAGE图；
图3为叠氮月桂酸和炔基修饰CpG ODN的CuAAC反应图；
图4为不同链长CpG的体外免疫刺激效果图；
图5为四种二肽结构图；
图6为CpG和四个二肽修饰的CpG初次免疫后第14天小鼠血清抗体浓度及IgG2a/IgG1比值图；
图7为CpG和四个二肽修饰的CpG初次免疫后第21天小鼠血清抗体浓度及IgG2a/IgG1比值图；
图8为CpG和四个二肽修饰的CpG不时间点的小鼠血清抗体浓度及IgG2a/IgG1比值图；
图9为不同剂量CpG、CpG-LP初次免疫后第21天小鼠血清抗体浓度图；
图10为CpG、CpG-SA、CpG-LA初次免疫后第21天小鼠血清抗体浓度图；
图11为CpG、CpG-SA、CpG-LA初次免疫后第28天小鼠血清抗体浓度图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，例如萨姆布鲁克等分子克隆：实验手册第三版(科学出版社，2002)中所述的条件，或者按照各制造商所建议的条件。
实施例1、叠氮和炔基浓度、催化剂、反应时间对CuAAC反应的影响
选择一个二肽AF来进行反应条件的优化，优化出的方法可以推广到其它小分子与CpG ODN的click反应。所有反应条件改变的前提都是反应在室温震荡下进行。
表1 不同浓度叠氮、炔基，不同比例催化剂和不同反应时间试验设计
图1为不同反应条件的click反应PAGE图，(a)和(b)中，M代表20bp DNA marker，lane 1为未经修饰的CpG ODN；按照表1的设计进行PAGE电泳；图1(a)中的反应条件是参照经典小分子click反应的条件[Rostovtsev,V.V.,et al.,A stepwise huisgencycloaddition process:copper(I)-catalyzed regioselective"ligation"of azidesand terminal alkynes.Angew Chem Int Ed Engl,2002.41(14):2596-9]，CpG ODN 5nmol(34μl)，AF 50nmol(8.5μl)，CuSO 4 0.005nmol(1μl)，sodium ascorbate0.5nmol(1μl)，三乙胺乙酸缓冲液300μl，lane 3组反应加入了TBTA 0.5nmol(6.75μl)，而lane 2组没有加入TBTA，两组反应都反应24小时。反应体系中CpG ODN的浓度是0.014mM。从PAGE结果来看，lane 2，lane 3和lane 1相比位置没有明显差异，说明click反应没有进行，没有偶联物的产生。说明适用于小分子click反应的条件对于大分子来说行不通。
提高炔基与叠氮在反应体系中浓度，同时将CuSO4的用量从原来CpG ODN的1/100提高到CpG ODN的20倍，TBTA和sodium ascorbate从原来CpG ODN用量的1/10提高到CpGODN的40倍，并减少缓冲液的体积，这样反应体系中CpG ODN的浓度为0.1mM。申请人考察了TBTA和反应时间对click反应的影响，得到了图1(b)。图1(b)中，lane 2，lane 4，lane 6的反应体系中没有加入TBTA，而lane 3，lane 5，lane 7的反应体系中加入TBTA；lane 2与lane 3反应时间为6小时，lane 4与lane 5反应时间为12小时，lane 6与lane 7反应时间为24小时。
图1(b)中的六组反应基本都有两个条带，而且位置与lane 1的未经修饰的CpGODN有明显差异，与图1(a)对比，申请人发现，当CpG ODN和AF在反应体系中的浓度提高后，且催化剂与CpG ODN的比例提高后，click反应发生，偶联产物出现，偶联产物在PAGE中的的条带高于未经修饰的CpG ODN的条带。这个结果说明高浓度的CpG ODN和多肽，高比例的催化剂，尽可能少的溶剂体积，对click反应的进行极为有利。
图1(b)中lane 3，lane 5，lane 7与lane 2，lane 4，lane 6的条带相比明显清晰，这显示出TBTA对CpG ODN的click反应是不可或缺的。而且lane 2，lane3与lane 4，lane 5和lane 6，lane 7两组相比，条带更加清晰，12小时和24小时并没有显示出更高的转化率，所以申请人根据选择实验安排选择6小时或者过夜12h反应。
PAGE过程：
(1)制胶原料和用量：4.2g的尿素，1mlTBE缓冲液，4.44ml丙烯酰胺，40ulAP，4ulTBMB。注意制胶的时候不要有尿素析出。
(2)将配好的胶液快速加入已准备好的玻璃板中,待1个小时左右，等胶凝好之后加入TBE缓冲液，加过缓冲液后，要保证缓冲液不会漏出来，之后上样。等胶凝固期间可配制样品。
上完样品后打开电泳仪，开始跑胶，大约三四个小时后，即样品已经到胶体边缘的时候，停止电泳。将胶取下，放入表面皿，加入染色剂supergreen开始染色，大约染半个小时左右的时候，将胶取出，显影。
实施例2、叠氮小分子与CpG ODN的比例及反应缓冲液对CuAAC反应的影响
确定了最佳反应时间，明确了TBTA的作用，优化了CpG ODN与AF的浓度及催化剂的比例后，考察AF与CpG ODN的不同比例及反应缓冲液对click反应的影响，并确定偶联产物的纯化方法。
表2 不同缓冲液，AF与CpG ODN不同比例的试验设计
图2为不同反应条件的click反应PAGE图和纯化过的偶联物PAGE图(a)和(b)中，M代表20bp DNA marker，lane 1为未经修饰的CpG ODN；(a)按照表2的设计进行电泳；(b)纯化方法的PAGE验证，lane 3为纯化过的CpG-AF；
图2(a)中，lane 2，lane 3的反应体系中加入了2M pH 7.0的三乙胺乙酸缓冲液，lane 4，lane 5的反应体系中没有缓冲液；lane 3，lane 5的反应体系中二肽与CpG ODN的比例为50:1，而lane 2，lane 4的反应体系中AF与CpG ODN的比例为10:1，其他反应条件均与前面筛选出来的条件一致。四组实验综合比较，申请人看出lane 3的反应效率最高，这说明缓冲液和高的AF与CpG ODN比例对click反应有利。所以申请人选择50:1作为AF与CpGODN的反应比例，同时确定了CpG ODN与AF的click反应需要三乙胺乙酸缓冲液。
用丙酮沉淀法来纯化click产物。具体方法为：向反应体系中加入5倍反应体积的丙酮，充分涡旋混匀，放于-20℃冰箱中30分钟。4℃，10000rpm，离心20分钟，弃掉上清，再加入1ml丙酮，反复吹打，清洗析出的固体，然后4℃，10000rpm离心20分钟，再弃掉上清，干燥得到的固体，固体再用超纯水溶解，用3,500Da的透析袋4℃透析过夜，透析结束样品冻干。申请人将用此方法纯化图2(a)中lane 3的反应组，并将得到的CpG-AF进行PAGE验证，得到图2(b)，lane 2是纯化后的CpG-AF，lane 1是未经修饰的CpG ODN，可以看出lane 2与lane1有明显的位置差异，而且反应产率很高，经过click反应得到的CpG-AF稳定，基本没有降解情况发生。
实施例3、上述CuAAC反应条件应用于其他小分子
以脂肪酸月桂酸为例，图3为叠氮月桂酸和炔基修饰CpG ODN的CuAAC反应示意图；
反应物储备液配置；
①0.5mM炔基修饰CpG ODN储备液：
先将装有炔基修饰CpG ODN粉末的离心管离心。每管含有CpG ODN 25nmol，加入50μl的超纯水，震荡使混合均匀，-20℃贮存。
②0.02M叠氮月桂酸储备液:2.3mg叠氮月桂酸，加入353μlDMF，震荡溶解，密封4℃保存。
③4mM TBTA储备液：称取4.2mg TBTA粉末，溶解于2ml DMF中，震荡使混合均匀，-20℃贮存。
④0.5mMCuSO4储备液：称取12.5mg CuSO4·5H 2O，溶解于1ml超纯水中，现用现配。
⑤0.2M Sodium Ascorbate储备液：称取16mg抗坏血酸钠粉末，溶解于400μl超纯水中，现用现配。
⑥2M三乙胺乙酸缓冲液：混合2.78ml三乙胺和1.14ml乙酸，加入超纯水定容至10ml，调节pH至7.0，室温贮存。在0.5ml离心管中加入依次加入1μl储备液④、26μl储备液③、5μl储备液⑥、5μl储备液①、5μl储备液②、1μl储备液⑤，每加入一种新物质vortex，全部加完后密闭，恒温振荡器室温震荡反应过夜。
实施例4、不同链长的CpG寡核苷酸序列体外免疫效果差异
1.脾细胞的体外收集与培养：取8周Balb/c小鼠一只，脱颈法处死，75％酒精浸泡5分钟。解剖小鼠，打开腹腔，取出脾脏。将脾脏放于细胞筛上，加入PBS，研磨。吸管收集研磨后的液体，加入离心管，4度1400rpm离心5min。离心后，弃去上清液，加入5ml红细胞裂解液，重悬，4度1400转离心5分钟，弃去上清液，重复此步骤至管底细胞为白色。用1640培养基，重悬细胞，吸取10μl滴入细胞计数板，显微镜下细胞计数。加入到96孔板中。将96孔板放置于37℃，5％CO2培养箱内分别培养2h。
2.样品溶液制备：用PBS配制浓度相同的如下表3所示的CpG的溶液；
表3
3.细胞给药：取出样品溶液加入到96孔板中，每个样品三个复孔。恒温细胞培养箱中，37度，CO2浓度5％培养24小时后，4℃，1400rpm离心5mim，收集上清液用于ELISA测定。
4.结果：通过上结果可以看出，不同链长的CpG刺激脾细胞分泌IL-6存在差异，与空白组相比，CpG1826,CpG-7,CpG-8,CpG-13,CpG2006刺激脾细胞分泌IL-6的表达有了显着性提高；图4为不同链长CpG的体外免疫刺激效果图。
实施例5、不同骨架修饰的CpG寡核苷酸序列免疫效果的差异
1.脾细胞的体外收集与培养：取8周Balb/c小鼠一只，脱颈法处死，75％酒精浸泡5分钟。解剖小鼠，打开腹腔，取出脾脏。将脾脏放于细胞筛上，加入PBS，研磨。吸管收集研磨后的液体，加入离心管，4度1400rpm离心5min。离心后，弃去上清液，加入5ml红细胞裂解液，重悬，4度1400转离心5分钟，弃去上清液，重复此步骤至管底细胞为白色。用10ml 1640培养基，重悬细胞，吸取10μl滴入细胞计数板，显微镜下细胞计数。加入96孔板中，将96孔板放置于37℃，5％CO2培养箱内分别培养2h。
2.样品溶液制备：用PBS配制浓度相同的不同骨架修饰的CpG的溶液，包括全硫代修饰，部分硫代修饰，无硫代修饰的CpG.
3.细胞给药：取出不同浓度的样品溶液5μl,加入到96孔板中，每个样品三个复孔。恒温细胞培养箱中，37度，CO2浓度5％培养24小时后，4℃，1400rpm离心5mim，收集上清液用于ELISA测定。
4.结果：通过上结果可以看出，不同骨架修饰的CpG刺激脾细胞分泌IL-6存在差异，全硫代修饰组的刺激效果最好。但是与空白组相比，不同骨架修饰的CpG刺激脾细胞分泌IL-6的表达有了显着性提高。
实施例6、小分子修饰的CpG ODN的胃肠稳定性
模拟胃消化液：称取20mg NaCl、100mg胃蛋白酶，加入7ml去离子水、73μl浓盐酸，再用盐酸调PH至1.2，加水定容至10ml，现用现配。
模拟肠消化液:称取70mg KH2PO4溶于2.5ml去离子水，完全溶解后，加入100mg胰酶，调PH至7.5，加水定容至10ml。
将小分子修饰的CpG ODN加入到模拟胃消化液和肠消化液中，37℃恒温震荡分别0.5h和2h，跑胶显示均未见明显降解，小分子修饰的CpG ODN具有良好的胃肠稳定性。
实施例7、二肽修饰后CpG ODN作为免疫增强剂的效果差异
四种二肽结构见图5所示；免疫方案：在第0天对小鼠进行初次免疫，第7天和14天加强免疫，每次免疫先对小鼠腹腔注射10μg OVA(溶于100μl PBS中)，然后灌胃口服一定剂量的CpG ODN或CpG-dipeptide(未特别注明均是100μg)。
血样收集：在不同的时间点进行血样收集，用于免疫效果评价。特别指出在，第14天，第三次免疫之前，先收集血样，用来评价第二次免疫的免疫效果。取血的方法为眼眶后静脉丛取血。收集的血样通过室温离心(3000rpm，10min)，取上清，如仍然有血色，可重复离心过程，直到完全无血色。保存至-20℃；
ELISA检测小鼠血清抗体水平：申请人通过ELISA方法主要检测小鼠血清中IgG，IgG2a，IgG1三种抗体的水平。结果：四种二肽修饰的CpG ODN对小鼠血清特异性抗体的影响：CpG-LP剂量对小鼠血清特异性抗体水平的影响：综上所述，AF、LP修饰后的CpG具有更好的免疫增强效果，具体参见图6，7，8，9。
实施例8、硬脂酸和月桂酸修饰后CpG ODN作为免疫增强剂的效果差异
免疫方案：在第0天对小鼠进行初次免疫，第7天和14天加强免疫，每次免疫先对小鼠腹腔注射10μg OVA(溶于100μl PBS中)，然后灌胃口服一定剂量的CpG ODN或CpG-FA(未特别注明均是100μg)。
血样收集：在不同的时间点进行血样收集，用于免疫效果评价。特别指出在，第14天，第三次免疫之前，先收集血样，用来评价第二次免疫的免疫效果。取血的方法为眼眶后静脉丛取血。收集的血样通过室温离心(3000rpm，10min)，取上清，如仍然有血色，可重复离心过程，直到完全无血色；保存至-20℃。ELISA检测小鼠血清抗体水平：通过ELISA方法主要检测小鼠血清中IgG，IgG1两种抗体的水平。硬脂酸和月桂酸修饰后的CpG具有更好的免疫增强效果，具体可见图10和图11。
实施例9、比较胆酸、胆固醇、甘氨酸胆酸酯盐、牛磺酸胆酸酯盐修饰后CpG ODN作 为免疫增强剂的效果差异
免疫方案：在第0天对小鼠进行初次免疫，第7天和14天加强免疫，每次免疫先对小鼠腹腔注射10μg OVA(溶于100μl PBS中)，然后灌胃口服一定剂量的CpG ODN或修饰后的CpG。
血样收集：在不同的时间点进行血样收集，用于免疫效果评价。特别指出在，第14天，第三次免疫之前，先收集血样，用来评价第二次免疫的免疫效果。取血的方法为眼眶后静脉丛取血。收集的血样通过室温离心(3000rpm，10min)，取上清，如仍然有血色，可重复离心过程，直到完全无血色。保存至-20℃；
ELISA检测小鼠血清抗体水平：通过ELISA方法主要检测小鼠血清中IgG，IgG1两种抗体的水平。结果：胆酸、胆固醇、甘氨酸胆酸酯盐、牛磺酸胆酸酯盐修饰的CpG ODN相对于未修饰的CpG ODN，小鼠血清抗体IgG、IgG1水平都不同程度地提高。
实施例10、比较四个二肽修饰的CpG ODN对肿瘤生长抑制作用的差异
模型建立：BALB/c鼠源性乳腺癌细胞系4T1-PGL3培养于含10％FBS，1％双抗的RPMI 1640培养基中，37℃，5％CO2，待单层细胞片层达到90％融合时，0.25％胰蛋白酶消化细胞进行传代。收集对数生长期的4T1细胞，PBS洗1次，细胞计数。BALB/c小鼠的左上侧乳腺皮下以5*105细胞/只种瘤。待肿瘤长到直径有5mm左右开始给药。
肿瘤生长观察：观察肿瘤增长情况，每隔两天用游标卡尺测量一次肿瘤体积(V＝)1/2*长*宽2。一个月后结束观察。结果：二肽AF、LP修饰的CpG ODN均有不同程度的抗肿瘤活性。
实施例11、比较硬脂酸、月桂酸修饰的CpG ODN对肿瘤生长抑制作用的差异
模型建立：BALB/c鼠源性乳腺癌细胞系4T1-PGL3培养于含10％FBS，1％双抗的RPMI 1640培养基中，37℃，5％CO2，待单层细胞片层达到90％融合时，0.25％胰蛋白酶消化细胞进行传代。收集对数生长期的4T1细胞，PBS洗1次，细胞计数。BALB/c小鼠的左上侧乳腺皮下以5*105细胞/只种瘤。待肿瘤长到直径有5mm左右开始给药。
肿瘤生长观察：观察肿瘤增长情况，每隔两天用游标卡尺测量一次肿瘤体积(V＝)1/2*长*宽2。一个月后结束观察。结果：硬脂酸、月桂酸修饰的CpG ODN的CpG ODN均有不同程度的抗肿瘤活性。
实施例12、比较胆酸、胆固醇、甘氨酸胆酸酯盐、牛磺酸胆酸酯盐修饰的CpG ODN对 肿瘤生长抑制作用的差异
模型建立：BALB/c鼠源性乳腺癌细胞系4T1-PGL3培养于含10％FBS，1％双抗的RPMI 1640培养基中，37℃，5％CO2，待单层细胞片层达到90％融合时，0.25％胰蛋白酶消化细胞进行传代。收集对数生长期的4T1细胞，PBS洗1次，细胞计数。BALB/c小鼠的左上侧乳腺皮下以5*105细胞/只种瘤。待肿瘤长到直径有5mm左右开始给药。
肿瘤生长观察：观察肿瘤增长情况，每隔两天用游标卡尺测量一次肿瘤体积(V＝)1/2*长*宽2。一个月后结束观察。结果：胆酸、胆固醇、甘氨酸胆酸酯盐、牛磺酸胆酸酯盐修饰的CpG ODN均有不同程度的抗肿瘤活性。
综上所述，本发明涉及的经结构修饰的CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN)，由特定组合的肽段、特定链长的脂肪酸、或类脂结构修饰具有免疫调节功能的CpG ODN而得。这种结构修饰的CPG ODN具有更好的口服生物利用度以及免疫调节功能，可以作为口服免疫增强和免疫治疗药物，提高生物体对抗原的免疫应答，应用于过敏性疾病、传染性疾病、免疫缺陷性疾病及癌症等。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (7)

1.一种被修饰的含CpG序列单元的寡聚脱氧核苷酸，其特征在于，所述被修饰的含CpG序列单元的寡聚脱氧核苷酸的结构式如下式所示：
2.如权利要求1所述的被修饰的含CpG序列单元的寡聚脱氧核苷酸，其特征在于，所述寡聚脱氧核苷酸含有1-5个CpG单元，其链长为10-30nt。
3.如权利要求1所述的被修饰的含CpG序列单元的寡聚脱氧核苷酸，其特征在于，所述修饰分子修饰的位点是寡聚脱氧核苷酸的5’-末端、3’-末端或者中间位置。
4.如权利要求1所述的被修饰的含CpG序列单元的寡聚脱氧核苷酸，其特征在于，所述寡聚脱氧核苷酸含有如下序列中的一种：
组别 序列(5’-3’) 序号编号(SEQ ID NO.) CpG1826 tccatgacgttcctgacgtt 1 CpG-H1826 tccatgtcgttcctgtcgtt 16 CpG-7 tgacgttccgtt 8 CpG-H7 tgtcgttccgtt 17 CpG-8 atgacgttgcgtt 9 CpG-H8 atgtcgttgcgtt 18 CpG-13 tccatgacgttcctgacgttcctgacgtt 14 CpG-H13 tccatgtcgttcctgtcgttcctgtcgtt 19 CpG7909(2006) tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt 15
。
5.如权利要求1所述的被修饰的含CpG序列单元的寡聚脱氧核苷酸，其特征在于，所述寡聚脱氧核苷酸的骨架为全硫代修饰、部分硫代修饰或者无硫代修饰。
6.一种如权利要求1所述的被修饰的含CpG序列单元的寡聚脱氧核苷酸用于制备免疫增强剂的应用。
7.一种如权利要求1所述的被修饰的含CpG序列单元的寡聚脱氧核苷酸用于制备***的口服或者吸入制剂的应用。
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