CN105919864B

CN105919864B - 具有美白功效的竹叶黄酮复合纳米粒子及其制备方法

Info

Publication number: CN105919864B
Application number: CN201610380410.2A
Authority: CN
Inventors: 张英; 王楠
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2016-05-31
Filing date: 2016-05-31
Publication date: 2019-01-08
Anticipated expiration: 2036-05-31
Also published as: CN105919864A

Abstract

本发明公开了一种竹叶黄酮复合纳米粒子，该竹叶黄酮复合纳米粒子由以下三种重量含量的组分构成：6～13.5％的竹叶黄酮、70～86％的酸性多糖和0.5～24％阳离子交联剂。竹叶黄酮为竹叶提取物，竹叶黄酮中总黄酮含量为20～80％；酸性多糖为植物来源的、含有酸性基团的多糖；阳离子交联剂为化妆品领域可接受的阳离子交联剂。本发明还同时公开了上述竹叶黄酮复合纳米粒子的制备方法。该竹叶黄酮复合纳米粒子具有美白功效。

Description

具有美白功效的竹叶黄酮复合纳米粒子及其制备方法

技术领域

本发明属于日化技术领域，涉及一种纳米粒子，尤其涉及一种具有美白功效的竹叶黄酮复合纳米粒子及其制备方法，应用于日化行业。

背景技术

在化妆品市场中，美白产品一直受到极大的关注与追捧。通过美白护肤品的使用，东方人想要得到白皙、光洁的皮肤，而欧美消费者希望减轻和消除老年斑、黄褐斑等色素沉积。正常人体皮肤颜色主要取决于皮肤中的黑色素含量，黑色素的生成是发生在黑素细胞中，在酪氨酸酶等的催化下，由酪氨酸逐步氧化为多巴、多巴醌，最终转化为黑色素的酶促反应。黑素细胞将黑色素转移至表皮基底层细胞，再上移至角质层，最终随角质层脱落而***。当皮肤黑色素过速增长或分布不均时，就会引起色素沉着，导致皮肤变黑或形成色斑。

目前市场上使用比较广泛的美白添加剂主要有熊果苷、对苯二酚、曲酸及其衍生物等，它们通常是通过抑制黑素细胞增殖、抑制酪氨酸酶等相关限速酶活性以及抑制黑色素的转移，从而达到美白效果。

由于传统皮肤美白剂往往具有较强的致敏性和潜在的致癌性，随着消费者安全意识不断提高，纯天然、无公害、且功效显著的植物美白成分越来越受到追捧和青睐。因此，开发安全性高、美白功效强、且易于添加到配方中的天然植物美白剂成为化妆品领域的研究热点。竹叶黄酮(Bamboo Leaf Flavonoids,BLF)是从刚竹属(Phyllostachys)品种的叶子中得到的、具有我国本土资源特色和自主知识产权的植物黄酮制剂，原料来源丰富、制剂品质稳定、风味清香平和，是一种安全无毒的天然化合物，具有清除自由基、抗氧化、抗福射、抗炎、抗衰老、抑菌、抗病毒、提高免疫力等多种生物学功效。

竹叶黄酮优良的生物学功效尤其是出色的抗氧化、抗自由基能力使其在美白化妆品领域具有巨大的潜在用途。但同其它黄酮类化合物一样，竹叶黄酮存在溶解性较低、色泽较深、不易被皮肤吸收等问题，限制了其在美白制剂中的应用。采用药物载体技术(如微胶囊、脂质体等)对竹叶黄酮进行包裹是行之有效的方法。如公布号为CN 105342889 A的专利文本公开了一种包含竹叶黄酮的美白保湿组合物，在常温常压下对竹叶黄酮进行微胶囊化处理，制备过程中使用了丁二醇、丙二醇等有机溶剂。

纳米粒子(Nanoparticles)指的是生物活性物质、药物等吸附、附着于粒子表面，或者溶解、包裹于粒子内部，成为超微小球型载体的固状胶态粒子，包括纳米球(Nanospheres)和纳米囊(Nanocapsules)，直径在1～1000nm之间。当粒子进入纳米级时，由于小尺寸效应、表面效应、宏观量子隧道效应等，纳米粒会表现出低熔点、高反应活性、高膨胀系数、高强度、高韧性、高扩散率、强吸收率等一系列不同于宏观物质的新特性。正是由于这些特性，纳米粒子已成为化妆品、医药、功能食品等领域的应用研究热点。

目前用于制备纳米粒的材料主要有合成高分子材料和天然高分子材料，其中天然高分子材料具有生物相容性好、生物降解性好、毒副作用小，并具有特殊生物学功效等优点，因而更受青睐。天然高分子纳米粒的制备方法主要有离子交联法、凝聚法、乳化交联法、溶剂蒸发法等，其中离子交联法是通过相反电荷之间的相互作用发生物理交联反应，进而形成球状的凝胶纳米粒，具有反应条件温和、方便快捷、对天然成分破坏作用小等优点，且得到的纳米粒粒径均一、可设计，同时能避免有机溶剂的使用，是目前制备天然高分子纳米粒最具前景的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种具有美白功效的竹叶黄酮复合纳米粒子及其制备方法和用途，本发明采用离子交联法，在常温常压、不使用有机溶剂的条件下制备竹叶黄酮复合纳米粒子，工艺简单温和，得到的纳米粒子粒径均一、质量稳定、美白功效极其显著；其美白功效显著优于熊果苷。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种竹叶黄酮复合纳米粒子，该竹叶黄酮复合纳米粒子由以下三种重量含量的组分构成：6～13.5％的竹叶黄酮、70～86％(较佳为75～86％)的酸性多糖和0.5～24％(较佳为4.5～16％)阳离子交联剂。

作为本发明的竹叶黄酮复合纳米粒子的改进：竹叶黄酮为竹叶提取物，所述竹叶黄酮中总黄酮含量(以芦丁计)为20～80％(w/w)。优选40～60％(w/w)。

作为本发明的竹叶黄酮复合纳米粒子的进一步改进：所述酸性多糖为植物来源的、含有酸性基团的多糖；所述阳离子交联剂为化妆品领域可接受的阳离子交联剂。

作为本发明的竹叶黄酮复合纳米粒子的进一步改进：

所述酸性多糖为芫根多糖、竹茹多糖、海藻多糖中的至少一种；

所述阳离子交联剂为ε-多聚赖氨酸、氯化钙中的至少一种。

本发明还同时提供了上述竹叶黄酮复合纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：

1)、在蒸馏水中加入竹叶黄酮和酸性多糖，加热搅拌至竹叶黄酮和酸性多糖完全溶解，得竹叶黄酮-酸性多糖溶液；

所述竹叶黄酮与蒸馏水的质量比为1：500～4000；

2)、将阳离子交联剂与蒸馏水以1：400～1000的质量比相溶，并搅拌至阳离子交联剂完全溶解；

3)、在低速磁力搅拌的条件下将步骤2)所得溶液加入步骤1)所得的竹叶黄酮-酸性多糖溶液中；继续低速磁力搅拌10～30min，得到竹叶黄酮复合纳米粒子溶液(为稳定混悬液)。

备注说明：上述加入是指以每分钟40～200滴的速度滴入。

本发明所得的竹叶黄酮复合纳米粒子溶液，粒径在300～550nm之间，可4℃下保存备用，也可冻干后保存。

作为本发明的竹叶黄酮复合纳米粒子的制备方法的改进：

所述竹叶黄酮复合纳米粒子溶液经干燥，得竹叶黄酮复合纳米粒子粉末。

作为本发明的竹叶黄酮复合纳米粒子的制备方法的进一步改进：

所述步骤3)中的低速磁力搅拌的转速为100～300r/min。

所述干燥为透析后冷冻干燥、或加入沉淀剂分离干燥。

本发明还同时提供了上述竹叶黄酮复合纳米粒子的用途：具有美白功效。

本发明中复合纳米粒子的粒径可通过改变酸性多糖与阳离子交联剂的种类和配比来调节。

本发明的复合纳米粒子的结构和组成比例如图1所示，复合粒子的粒径在300～550nm之间(较佳为400～550nm)。

本发明的具有美白功效的竹叶黄酮复合纳米粒子的制备方法，是通过离子交联法制备获得。该方法反应条件温和、粒径均匀可控、重现性好，不使用有机溶剂，简便易行，具有环保、高效、低成本的特点，同时可最大限度地保持天然物的活性成分。

根据本发明的功效实验证明，所述竹叶黄酮复合纳米粒子具有卓越的美白功效，其对黑素细胞酪氨酸酶活性、黑色素合成量及黑素细胞活性的抑制率均显著优于熊果苷。

本发明的具有卓越美白功效的竹叶黄酮复合纳米粒子，适合应用于美白化妆品领域中，将本发明所述的竹叶黄酮复合纳米粒子以一定比例加入到化妆品配方中(例如为12.5-100μg/mL)，可以制备成不同剂型的化妆品，如乳液、霜、精华等；然后按照常规的化妆品使用方式进行使用即可。也可以直接将本发明制备而得的竹叶黄酮复合纳米粒子溶液涂抹于皮肤表面。

本发明具有如下优点：

(1)发明了具有卓越美白功效的竹叶黄酮复合纳米粒子，其美白功效强于阳性对照熊果苷。

(2)采用离子交联法制备竹叶黄酮复合纳米粒子，工艺简便易行、条件温和、重复性好，制备过程完全在水溶液中完成，不涉及任何有机试剂及表面活性剂的使用，避免了对天然活性成分的破坏。

(3)所制备的纳米粒子粒径在300～550nm之间，外观为乳光悬液，质量和性能稳定。

(4)发明的竹叶黄酮复合纳米粒子具有优异的酪氨酸酶活性抑制作用，能很好地抑制黑素细胞的活性和黑色素的产生，效果显著优于阳性对照熊果苷。

(5)发明的竹叶黄酮复合纳米粒子均有天然物(或视同天然物)组成，制备过程不使用有机交联剂及表面活性剂，对皮肤无刺激，可作为美白功能因子应用于日化产品，具有广阔的市场前景。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为本发明制得的竹叶黄酮复合纳米粒子的组成结构示意；

图2为实施例1制得的竹叶黄酮复合纳米粒子的粒径分析结果；

图3为实施例2制得的竹叶黄酮复合纳米粒子的粒径分析结果；

图4为实施例3制得的竹叶黄酮复合纳米粒子的粒径分析结果；

图5为实施例4制得的竹叶黄酮复合纳米粒子的粒径分析结果；

图6为本发明制得的竹叶黄酮复合纳米粒子的电子显微镜表征；

图7为本发明制得的竹叶黄酮复合纳米粒子的透射电镜表征。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。实施例仅用于说明本发明，而不应限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件处，均按照本领域内相关文献所描述的技术条件进行。所用试剂未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

本实施例中所述的竹茹多糖和芫根多糖是发明人分别自竹茹和芫根中提取的酸性植物多糖，所述竹茹多糖可依据已经公开发表于《食品工业科技》的《竹茹多糖提取工艺优化及其理化性质分析》的方法制备而得；所述芫根多糖可参照已经公开发表于《International Journal of Biological Macromolecules》的《Composition analysisand anti-hypoxia activity of polysaccharide from Brassica rapa L.》、专利CN101524389A所述方法制备而得；经硫酸-苯酚法测定其纯度均在90％以上；竹叶黄酮和ε-聚赖氨酸均为市售；竹叶黄酮总黄酮含量约为50％。

实施例1、一种具有美白功效的竹叶黄酮复合纳米粒子制备方法：

(1)将4mg的竹叶黄酮溶于2mL的蒸馏水中，加热搅拌溶解；

(2)将24mg的竹茹多糖加入步骤(1)所得溶液并搅拌溶解，得竹叶黄酮-竹茹多糖溶液；

(3)将2mg的ε-多聚赖氨酸溶于1mL的蒸馏水中；

(4)在以转速为100～300r/min磁力搅拌的条件下将步骤(3)所得溶液用1分钟(即，约以200mL/h的流速)滴入竹叶黄酮-竹茹多糖溶液中；

(5)继续低速(100～300r/min)搅拌30min，得到的乳光悬液为具有美白功效的竹叶黄酮复合纳米粒子溶液(I)。

实施例2、一种具有美白功效的竹叶黄酮复合纳米粒子制备方法：

(1)将4mg的竹叶黄酮溶于2mL的蒸馏水中，加热搅拌溶解；

(2)将36mg的竹茹多糖加入步骤(1)所得溶液并搅拌溶解，得竹叶黄酮-竹茹多糖溶液；

(3)将2mg的ε-多聚赖氨酸溶于2mL的蒸馏水中；

(4)在以转速为100～300r/min磁力搅拌的条件下将步骤(3)所得溶液用1分钟(即，约以300mL/h的流速)滴入竹叶黄酮-竹茹多糖溶液中；

(5)继续低速搅拌30min，得到的乳光悬液为具有美白功效的竹叶黄酮复合纳米粒子溶液(II)。

实施例3、一种具有美白功效的竹叶黄酮复合纳米粒子制备方法：

(1)将4mg的竹叶黄酮溶于16mL的蒸馏水中，加热搅拌溶解；

(2)将50mg的芫根多糖加入步骤(1)所得溶液并搅拌溶解，得竹叶黄酮-芫根多糖溶液；

(3)将10mg的ε-多聚赖氨酸溶于4mL的蒸馏水中；

(4)在以转速为100～300r/min磁力搅拌的条件下将步骤(3)所得溶液用6分钟(即，约以200mL/h的流速)滴入竹叶黄酮-芫根多糖溶液中；

(5)继续低速搅拌30min，得到的乳光悬液为具有美白功效的竹叶黄酮复合纳米粒子溶液(III)。

实施例4、一种具有美白功效的竹叶黄酮复合纳米粒子制备方法：

(1)将6mg的竹叶黄酮溶于14mL的蒸馏水中，加热搅拌溶解；

(3)将10mg的ε-多聚赖氨酸溶于4mL的蒸馏水中；

(4)在以转速为100～300r/min磁力搅拌的条件下将步骤(3)所得溶液用5分钟(即，约以200mL/h的流速)滴入竹叶黄酮-芫根多糖溶液中；

(5)继续低速搅拌30min，得到的乳光悬液为具有美白功效的竹叶黄酮复合纳米粒子溶液(IV)。

上述实施例1～实施例4制备而得的竹叶黄酮复合纳米粒子溶液经过真空冷冻干燥至恒重，得竹叶黄酮复合纳米粒子。

实验1

利用Malvern Zetasizer Nano Zs90纳米粒径及电位分析仪，对本发明中实施例1-4中所得竹叶黄酮复合纳米粒子进行粒径分析。结果如表1及图2-5所示，由实施例1-4制得具有美白功效的竹叶黄酮复合纳米粒子，平均粒径介于400-550nm区间，粒径分布指数PDI为0.2左右，说明其粒径均一，分散度良好。

表1、纳米粒粒径测定分析表

实验2

利用透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope,TEM)和电子显微镜，对本发明中实施例3所得竹叶黄酮复合纳米粒子进行形态表征。如图6和图7所示，包埋所得的纳米粒呈球形或类球形，粒径较为均一，并没有产生一些巨大的丝状或无规则的纳米粒。

实验3、竹叶黄酮复合纳米粒子黄酮含量测定

(一)实验原理

竹叶黄酮复合纳米粒子中的黄酮含量直接影响其美白功效，采用硝酸铝比色法对实施例1-4中竹叶黄酮纳米粒子中的总黄酮含量进行测定。

(二)实验方法

1、标准曲线的制作

精密称取芦丁对照10mg于100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，从中吸取溶液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mL分别于25mL比色管中，加入30％乙醇溶液稀释至5mL，依次各加5％亚硝酸钠溶液0.3mL，振摇后放置5min；加入10％硝酸铝溶液0.3mL，振摇后放置6min；加入1.0mol/L氢氧化钠溶液4.0mL，30％乙醇溶液稀释至10.0mL，摇匀后放置10min；以零号管为空白，摇匀后用1cm的比色杯、在510nm的波长处测定吸光度，以吸收度为纵坐标、浓度为横坐标绘制标准曲线。

2、竹叶黄酮纳米粒子黄酮含量的测定

将已制备好的纳米粒子混悬液高速离心(15000r/30min)，测定离心后上清液的体积，取上清液1ml，按1中的方法测定其中的黄酮含量，进而得到总上清液中的黄酮含量，从而计算纳米粒子中的黄酮含量。

纳米粒子黄酮含量(％)＝(加入的总黄酮含量-上清液中总黄酮含量)/加入的总黄酮含量×100。

(三)实验结果

表2、竹叶黄酮复合纳米粒子中的黄酮含量测定(n＝3,)

组别	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4
					黄酮含量(％)	10.82±0.83	20.45±0.57	45.27±0.92	41.83±0.76

由于竹叶黄酮复合纳米粒子的组分中，具有美白功效的成分主要为竹叶黄酮，因此复合纳米粒子中竹叶黄酮的含量与其美白功效有密切关系。由表2可得，不同实施例所得的竹叶黄酮复合纳米粒子均对竹叶黄酮进行了有效包埋，其中实施例3的黄酮含量达到最高为45.27％，即，实施例3的包埋效果最佳。

实验4美白功效评价

(一)实验原理

黑色素含量是决定皮肤颜色的关键因素，而黑色素的合成是发生在黑素细胞、在酪氨酸酶等相关限速酶的催化下、由酪氨酸逐步氧化为多巴、多巴醌，最终转化为黑色素的酶促反应，因此美白剂发挥功效的途径通常有以下三种：抑制黑素细胞增殖、抑制酪氨酸酶活性和抑制黑色素的合成。

B-16黑素细胞的基本结构，尤其是黑色素合成功能与人体正常的皮肤黑素细胞基本一致，在人体原代皮肤黑色素细胞培养非常困难的情况下，B-16黑素瘤细胞成为医药部门进行色素病变研究和美白化妆品添加剂功效评价广泛使用的细胞。

本发明以B-16黑素细胞为受试细胞株，设立熊果苷为阳性对照，无药物作用的黑素细胞为阴性对照，从抑制黑素细胞增殖、抑制酪氨酸酶活性和抑制黑素合成三个方面，对本发明所得实施例1-4竹叶黄酮复合纳米粒子的美白功效进行评估。

(二)实验方法

1、受试物处理

设立本发明中实施例1-4所得竹叶黄酮复合纳米粒子为实验组，浓度为12.5-100μg/mL，以同浓度熊果苷溶液为阳性对照组，经0.22μm的滤膜过滤灭菌后备用。

2、细胞的培养及受试物准备

无菌条件下，将B-16黑素瘤细胞接种于含10％新生牛血清的RPMI1640培养基的培养瓶中，在二氧化碳培养箱中37℃，5％CO₂饱和湿度环境中培养，并每天换液。当细胞生长至汇合度为80％～90％时，经0.25％胰蛋白酶消化传代，继续培养。

3、受试物暴露

待细胞生长至近融合状态经0.25％胰蛋白酶消化，收集并调整细胞密度为5×10⁴个/mL，每孔100μL接种于96孔板，并补充培养液至200μL。在二氧化碳培养箱中37℃，5％CO₂饱和湿度环境中培养，过夜，贴壁后更换新培养基，每孔加入200μL不同浓度的受试物溶液，DMSO的体积分数小于0.5％，每个浓度设置6个复孔，空白对照组加入新鲜培养液代替受试物溶液，每天换液。

4、细胞增殖率的测定

细胞接板及受试物暴露处理同上。采用MTT法对细胞增殖率进行测定。在培养44时取出，每孔加入5mg/mL MTT溶液20μL，在在二氧化碳培养箱中37℃，5％CO₂饱和湿度环境中孵育4h，然后弃去培养基和MTT，向各孔中加入150μL的DMSO，以溶解残留的MTT-甲臜结晶，震荡10min，混匀后用酶标仪测定各孔在570nm下的吸光值。

计算细胞增殖率：

细胞增殖率(％)＝(OD_{570(实验孔)}—OD_{570(空白孔)})/(OD_{570(空白对照孔)}—OD_{570(空白孔)})×100

5、细胞内酪氨酸酶活性相对抑制率的测定

细胞接板及受试物暴露处理同上。采用多巴氧化法对细胞内酪氨酸酶活性进行测定。将作用时间已到的细胞弃上清，PBS缓冲液洗2次，每孔加入1％Triton-X100水溶液50μL，迅速放入-80℃冰箱内冻存30min，取出后37℃融化使细胞完全破裂(约20min)，加入1％L-DOPA溶液10μL/孔，以不加美白剂培养的细胞作为对照，37℃反应2h，置酶标仪测定475nm处OD₄₇₅值。

计算酪氨酸酶相对抑制率：

细胞内酪氨酸酶活性相对抑制率(％)＝(1–OD_实验组/OD_{空白对照组})/细胞增殖率×100

6、细胞内黑素含量测定

细胞接板及受试物暴露处理同上。培养48h后倾去培养液，用PBS缓冲液洗1次，加入100μL的0.25％胰酶消化，再用PBS缓冲液(2-3mL)将沉淀细胞吹打成悬液后计数，将密度调整至10⁵个/mL左右备用。取备用细胞悬液加PBS缓冲液，各吸取1mL细胞悬液分别置于离心管中，1500r/min离心10min后弃去上清液，先加入200μL PBS缓冲液使细胞重新悬浮，然后加入1mL乙醇∶***液(体积比为1∶1)以溶解非黑素的不透明颗粒，在室温下放置20min，3000r/min离心5min并弃去上清液，加入1mL含10％二甲基亚砜的1mol/L NaOH溶液，置于80℃水浴45min，使细胞团块完全溶解。转移入96孔板，每个浓度6个平行，用酶标仪在405nm波长处测定吸光度。

计算相对黑素含量：

单个细胞内相对黑素含量(％)＝(OD_实验组/OD_对照组)/细胞增殖率×100

(三)实验结果

1、竹叶黄酮复合纳米粒子对B-16细胞增殖率的影响

皮肤黑色素细胞组织能将黑色素转移到表皮基底层细胞中，从而引起局部皮肤过黑及色素沉着，因此细胞增殖率是判断美白效果的重要指标。

表3、不同美白剂对B-16细胞增殖率的影响(n＝3,)

注：^a与阴性对照组相比，P<0.05；^b与阳性对照组相比，P<0.05。

如表3所示，用不同浓度的美白剂处理B-16黑素瘤细胞，随着美白剂浓度的增大，与阴性对照组相比，各组样品对细胞增殖的抑制率增加，细胞活力逐渐降低，存活率下降。阳性对照组熊果苷在所有受试浓度时细胞存活率降低但不明显，细胞增殖率均在90％左右；当浓度达到50μg/mL时，各实施例所得竹叶黄酮复合纳米粒子对B-16细胞增殖开始有抑制作用，其中实施例3抑制作用最明显，细胞增殖率为(68.59±0.53)％；在100μg/mL浓度下，细胞增殖率下降至(40.86±0.83)％，与阳性对照熊果苷组相比有显著差异(P<0.05)。因此，竹叶黄酮复合纳米粒子可在一定程度上影响黑素瘤细胞的增殖；与阳性对照组熊果苷相比，其量效关系更加明显，即随着浓度的增加，细胞存活率降低幅度显著大于熊果苷，在50μg/mL和100μg/mL时可显著抑制黑素瘤细胞的增殖，从而成为美白功效的可能途径。

2、竹叶黄酮复合纳米粒子对B-16细胞内酪氨酸酶活性的影响

酪氨酸酶是黑素细胞合成黑色素过程中一种决定性的限速酶，其催化作用主要发生在酪氨酸转化成多巴和多巴转化为多巴醌这两个反应中。大部分美白剂是通过抑制酪氨酸酶活性或阻断酪氨酸生成黑色素的氧化途径，从而减少黑色素的生成达到美白功效，因此美白剂对酪氨酸酶活性的抑制率是衡量美白功效的重要依据。

表4、不同美白剂对B-16细胞内酪氨酸酶相对活性的影响(n＝3,)

如表4所示，阳性对照熊果苷组和竹叶黄酮复合纳米粒子对细胞内酪氨酸酶活性均有抑制作用，且具有剂量依赖关系，即随剂量的增加对酪氨酸酶活性的抑制率提高；实施例1-4中，实施例3、4所得竹叶黄酮复合纳米粒子对酪氨酸酶活的抑制效果更明显，当浓度为100μg/mL时酪氨酸酶活性分别为(30.32±2.30)％和(38.45±1.96)％，与阳性对照熊果苷组相比有显著差异(P<0.05)。说明竹叶黄酮复合纳米粒子组能显著抑制B-16细胞内酪氨酸酶相对活性。

3、竹叶黄酮复合纳米粒子对B-16细胞黑素合成的影响

黑素含量是决定皮肤颜色的主要因素，黑色素由黑素细胞合成后转移至角质细胞再上移至角质层，导致皮肤变黑或形成色斑。因此，黑素含量的多少是衡量美白剂美白功效的直接依据。经过不同种类及浓度的样品处理过的细胞内黑素含量如表5所示。

表5、不同美白剂对B-16细胞相对黑素含量的影响(n＝3,)

由表5可知，以空白对照的单个细胞内黑素含量为100％，则随着浓度的增加，各美白剂组黑素含量均有所降低，且呈现剂量依赖关系；当浓度为100μg/mL时，实施例1-4所得竹叶黄酮复合纳米粒子对黑素合成的抑制效果明显，其中实施例3、4实验组细胞内相对黑素含量分别降低至(37.65±3.14)％和(45.35±0.97)％，与阳性对照熊果苷组相比有显著差异(P<0.05)，说明竹叶黄酮复合纳米粒子能显著抑制B-16黑素细胞的黑素合成。

结论：竹叶黄酮复合纳米粒子具有显著的美白功效，其美白作用是通过对B-16黑色素细胞增殖、黑色素的合成、细胞内酪氨酸酶相对活性等多方面抑制来实现。此外，结合比较表3-5和表2的结果可验证如下结论：竹叶黄酮纳米粒子的美白功效与其中所含黄酮含量呈正相关，即，包埋效果与美白功效成正比。

对比例1-1、将实施例3中芫根多糖的用量由50mg改成70mg，其余等同于实施例3。

对比例1-2、将实施例3中芫根多糖的用量由50mg改成30mg，其余等同于实施例3。

对比例1-3、将实施例3中的芫根多糖改成竹茹多糖，其余等同于实施例3。

对比例2-1、将实施例3中ε-多聚赖氨酸的用量由10mg改成15mg，其余等同于实施例3。

对比例2-2、将实施例3中ε-多聚赖氨酸的用量由10mg改成5mg，其余等同于实施例3。

对比例2-3、将实施例3中的ε-多聚赖氨酸改成氯化钙，其余等同于实施例3。

对比例3-1、将实施例3中竹叶黄酮的用量由4mg改成8mg，其余等同于实施例3。

对比例3-2、将实施例3中竹叶黄酮的用量由4mg改成2mg，其余等同于实施例3。

对比例4-1、将实施例3中恒流泵流速由200mL/h改成400mL/h，即，滴入的时间由6分钟改成3分钟；其余等同于实施例3。

对比例4-2、将实施例3中恒流泵流速由200mL/h改成100mL/h，即，滴入的时间由6分钟改成12分钟；其余等同于实施例3。

将上述所有的对比例所得竹叶黄酮纳米粒子进行黄酮含量测定，所得结果如下：

表6、不同对比例所得竹叶黄酮纳米粒子的黄酮含量(n＝3,)

对比例	1-1	1-2	1-3	2-1	2-2
						黄酮含量(％)	41.03±0.23	19.58±0.17	10.07±0.82	25.41±0.76	35.07±0.53
对比例	2-3	3-1	3-2	4-1	4-2
						黄酮含量(％)	23.28±0.55	39.58±0.26	15.04±0.43	30.22±0.72	36.24±0.83

如表6所示，对上述所有对比例所得竹叶黄酮复合纳米粒子的黄酮含量进行测定，由测定结果可得：所有对比例所得纳米粒子均对竹叶黄酮进行了有效包埋，其中黄酮含量最高达到41.03％(对比例1-1)，均小于实施例3所得竹叶黄酮纳米粒子的黄酮含量(45.27％)。由实验4结论可知，上述所有对比例所得竹叶黄酮复合纳米粒子均具有美白功效，但由于其包埋效果不如本发明的实施例3，因此，其美白功效均不如本发明的实施例3。

以上所述描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本发明不受上述实施例的限制，凡在不脱离本发明精神和范围的前提下所做的任何修改、等同替换、组合、简化、改进等，均应包含在本发明的保护范围内。

Claims

1.竹叶黄酮复合纳米粒子，其特征是该竹叶黄酮复合纳米粒子由以下三种重量含量的组分构成：6～13.5％的竹叶黄酮、70～86％的酸性多糖和0.5～24％阳离子交联剂；

所述酸性多糖为芫根多糖、竹茹多糖中的至少一种，所述阳离子交联剂为ε-多聚赖氨酸；

该竹叶黄酮复合纳米粒子的制备方法为包括如下步骤：

所述竹叶黄酮与蒸馏水的质量比为1：500～4000；

3)、在低速磁力搅拌的条件下将步骤2)所得溶液加入步骤1)所得的竹叶黄酮-酸性多糖溶液中；继续低速磁力搅拌10～30min，得到竹叶黄酮复合纳米粒子溶液。

2.根据权利要求1所述的竹叶黄酮复合纳米粒子，其特征是：

竹叶黄酮为竹叶提取物，所述竹叶黄酮中总黄酮含量为20～80％。

3.根据权利要求2所述的竹叶黄酮复合纳米粒子，其特征是：

4.根据权利要求2或3所述的竹叶黄酮复合纳米粒子，其特征是：

所述步骤3)中的低速磁力搅拌的转速为100～300r/min。

5.根据权利要求3所述的竹叶黄酮复合纳米粒子的制备方法，其特征是：

所述干燥为透析后冷冻干燥、或加入沉淀剂分离干燥。

6.如权利要求1～5任一所述的竹叶黄酮复合纳米粒子的用途，其特征是：具有美白功效。