CN105875292A - 卵磷脂结合葡萄汁有孢汉逊酵母防治柑橘采后病害的方法 - Google Patents

卵磷脂结合葡萄汁有孢汉逊酵母防治柑橘采后病害的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了卵磷脂结合葡萄汁有孢汉逊酵母防治柑橘采后病害的方法，属于水果采后病害生物防治领域。将葡萄汁有孢汉逊酵母接种到NYDB培养基中培养20h，离心得到菌体，配制含卵磷脂（15 mg/mL）的1×108 cells/mL酵母菌悬液；将菌悬液均匀喷洒于水果上，自然风干；放在塑料筐中，用保鲜膜密封后，放在室温（20℃）条件下存放。本发明利用卵磷脂结合葡萄汁有孢汉逊酵母处理柑橘，提高该酵母对柑橘采后病害生物防治的效力，使用简单，操作方便，效果好，成本低。本方法可以替代化学杀菌剂防治水果采后病害，避免使用化学杀菌剂对人的危害，具有显著的经济效益和社会效益。

Description

卵磷脂结合葡萄汁有孢汉逊酵母防治柑橘采后病害的方法
技术领域
本发明涉及一种卵磷脂(phosphatidylcholine)结合葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniasporauvarum)提高柑橘采后病害防治效力的方法，属于水果采后病害生物防治领域。
背景技术
柑橘(Citrus reticulata Blanco)属芸香科下属植物，主要种类有柠檬、柚、葡萄柚、橙子、宽皮柑橘等。柑橘组织柔嫩多汁，富含维生素C、矿物质、柠檬酸和膳食多糖等多种营养物质，深受人们的喜爱。柑橘是全球第一大柑橘是全球第一大水果，果实组织柔嫩多汁且富含糖分，在其采后贮运期间，易遭受多种病原菌的侵染产生采后病害，导致果实腐烂变质，经济损失严重。柑橘每年因腐烂损失在20-30％之间，严重时可高达50％以上。目前已知能引起柑橘采后腐烂的致病菌有20多种，其中由意大利青霉(Penicillium italicum)与指状青霉(Penicillium digitatum)引起的腐烂为柑橘两大主要病害，严重时可以占到柑橘采后病害损失的90％以上，其中以指状青霉引起的腐烂尤为严重，此类病原菌分布广泛，以腐生在有机物上的方式，将所产生的大量分生孢子扩散在空气之中，从而扩散到果实上，引起果实腐烂，损失极大。
目前，柑桔贮藏期间绿霉病的防治主要依靠化学药剂,如抑霉哇、噻菌灵、嘧菌酯、特克多、邻苯酚钠、仲丁胺以及苯并咪唑类杀菌剂等。生产上频繁和高浓度的使用化学药剂造成农药在果蔬产品上的残毒量增加而威胁着人类的健康。美国国家科学院(NAS)的报道(1987)指出，杀菌剂的应用对人类健康造成了危害；全美9种致瘤化合物的销售量中，杀菌剂占90％左右，在用于食物的全部农药中，杀菌剂构成60％的致瘤危险。此外，长期使用化学杀菌剂会使病原菌产生抗药性从而降低防治效果,据早前美国加利福尼亚的调查,抑霉哇(Imaziall)作为苯并咪哇类、仲丁胺药物的换代产品,连续在柑橘上使用5年以后,已经出现了指状青霉的抗抑霉哇菌株。而且据国内调查，单独使用多菌灵多年的地区，指状青霉对其产生了严重的抗性，使柑橘腐烂率回升，同时抗药性菌株对甲基托布津、苯来特、涕必灵等三种苯并咪唑类杀菌剂具有交叉抗性。因此，在很多发达国家和地区,一些化学杀菌剂已经开始被限制使用，如，克菌丹(Captan)和苯菌灵(benomyl)等几种杀菌剂已经被美国环保机构所禁用。
随着经济的发展和人们生活水平的不断提高，研究并开发替代化学杀菌剂的安全、无毒、高效的新型水果采后病害防治方法，具有重大的社会意义和广阔的应用前景。当前国际上越来越重视用有益微生物进行水果采后病害生物防治的研究，并认为这是最有希望取代化学杀菌剂的方向之一。
近年来，生物防治已引起了世界各国的关注，拮抗微生物的应用被证明是一种行之有效的方法。其中酵母菌由于拮抗效果好、不产生毒素、可以和化学杀菌剂共同使用等优点成为研究热点。Chalitz等从柠檬表面分离得到一株汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)，对柑橘绿霉病、青霉病等有显著的防治效果。Torres等报道Pantoea agglomerans对柑橘Penicillium digitatum有很好的防治效果。Arras报道了Candida famata对柑橘绿霉病具有显著的防治效果，并探讨了其作用机制。目前部分拮抗菌已经商业化或者半商业化应用，如Candidaoleophilia isolate I-182已经在1995年作为生物杀菌剂在美国环境保护署(EPA)登记，并已经由美国Ecogen公司商业化生产。此外，在南非一株采后拮抗酵母白隐球酵母(Cryptococcusalbidus)也已经商业化生产，商品名为Yield Plus。
然而到目前为止，果蔬采后生物防治的研究虽然已有半个世纪的历史，但实际应用于生产的拮抗菌种类不多，只有Yield Plus，Biosave和Aspire等少数几种产品上市，而我国目前尚没有拮抗菌应用于商业生产。而且普遍来说，在果实的采后生物防治试验中，单独使用拮抗微生物来控制水果采后病害的效果往往不及化学杀菌剂的好，因此需要加以改善。研究发现，将拮抗菌与一些外源物质结合使用可以提高拮抗菌的拮抗效果。
大豆卵磷脂是一种性能优良的天然两性表面活性剂,具有良好的表面活性及特有的生理活性,并无毒、无污染、无刺激、易生物降解,根据磷脂的性质与功能,磷脂常作为乳化剂、分散剂、黏度调和剂、润滑剂、防油喷溅剂、膨松剂、抗氧化剂及营养剂等而广泛应用于医药、化工、轻纺工、食品、农药及化妆品等行业。上世纪日本学者，在田间条件下对卵磷脂做了试验，结果表明它对于黄瓜、茄子、草莓以及青椒的白粉病有效，并研制出了“磷脂农”(Lecithinon)。目前没有拮抗酵母结合磷脂对柑橘采后绿霉病的防治相关研究报道。
本发明选用本实验室自主分离鉴定的葡萄汁有孢汉逊酵母与不同浓度卵磷脂结合处理柑橘，利用卵磷脂提高葡萄汁有孢汉逊酵母对水果采后病害的生物防治效果，从而达到研究和开发新型高效、无毒、安全的柑橘防腐保鲜剂的目的。
发明内容
本发明利用卵磷脂结合葡萄汁有孢汉逊酵母，提高该酵母对水果采后病害生物防治的效力。与葡萄汁有孢汉逊酵母单独处理相比，结合处理可以明显提高酵母对柑橘绿霉病的防治效果，防治其采后腐烂。本发明具有安全，高效，成本低等优点，可以广泛地用于水果采后病害的生物防治，减少水果采后病害造成的损失。
本发明采用的技术方案
本发明提供的卵磷脂结合葡萄汁有孢汉逊酵母防治水果采后病害的方法，按照下述步骤进行：将葡萄汁有孢汉逊酵母接种到NYDB培养基培养20h后，离心得到菌体，配制含卵磷脂的1×108cells/mL的酵母菌悬液(卵磷脂终浓度为15mg/mL)；将菌悬液均匀喷洒在水果上，自然风干；放在塑料筐中，用保鲜膜密封后，放在室温(20℃)条件下存放。
其中所述的NYDB培养基为：牛肉浸膏8g，酵母膏5g，葡萄糖10g，蒸馏水1000mL，pH自然。
其中所述的菌株Y3为葡萄汁有孢汉逊酵母Hanseniaspora uvarum，系本实验室筛选得到,现保存于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所,中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏菌株编号为CGMCC No.2.5414，保藏日期为2016年3月31日，建议的分类名称为葡萄汁有孢汉逊酵母Hanseniaspora uvarum。
其中所述的卵磷脂的最终浓度为15mg/mL。
其中所述的含卵磷脂的1×108cells/mL的酵母菌悬液(卵磷脂终浓度为15mg/mL)，按照下述步骤进行配制：将葡萄汁有孢汉逊酵母接种到NYDB培养基培养20h后，离心得到菌体，菌体用无菌水洗涤三次，将菌体用无菌水稀释制备成2×108cells/mL菌悬液，与浓度为两倍终浓度的卵磷脂按体积比1:1混合，而卵磷脂的最终浓度为15mg/mL。
本发明的优点：
(1)本发明所使用的葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)为本实验室筛选，其拮抗效力强，对人体安全无害。
(2)本发明所使用的卵磷脂来源广泛，价格低廉，无毒无害。
(3)本发明利用卵磷脂结合葡萄汁有孢汉逊酵母处理水果，与葡萄汁有孢汉逊酵母单独处理相比，结合处理可以显著提高葡萄汁有孢汉逊酵母的拮抗活性，从而降低水果的腐烂率，进而达到水果贮藏保鲜的目的。
(4)本发明使用卵磷脂结合葡萄汁有孢汉逊酵母，可以代替化学杀菌剂防治水果采后病害，避免使用化学杀菌剂对人的危害，具有显著的经济效益和社会效益。
附图说明
图1为卵磷脂与葡萄汁有孢汉逊酵母结合对柑橘绿霉病的控制效果。注：CK：无菌蒸馏水，即对照组；Y：用无菌蒸馏水配置的H.uvarum菌悬液(1×108cells/mL)；Y+0.1％P：用卵磷脂配置的1×108cells/ml的H.uvarum菌悬液(含终浓度为1mg/mL的卵磷脂)；Y+0.5％P：用卵磷脂配置的1×108cells/ml的H.uvarum菌悬液(含终浓度为5mg/mL的卵磷脂)；Y+1％P：用卵磷脂配置的1×108cells/ml的H.uvarum菌悬液(含终浓度为10mg/mL的卵磷脂)；Y+1.5％P：用卵磷脂配置的1×108cells/ml的H.uvarum菌悬液(含终浓度为15mg/mL的卵磷脂)；Y+2％P：用卵磷脂配置的1×108cells/ml的H.uvarum菌悬液(含终浓度为20mg/mL的卵磷脂)；Y+2.5％P：用卵磷脂配置的1×108cells/ml的H.uvarum菌悬液(含终浓度为25mg/mL的卵磷脂)；Y+3％P：用卵磷脂配置的1×108cells/ml的H.uvarum菌悬液(含终浓度为30mg/mL的卵磷脂)；Y+4％P：用卵磷脂配置的1×108cells/ml的H.uvarum菌悬液(含终浓度为40mg/mL的卵磷脂)；Y+5％P：用卵磷脂配置的1×108cells/ml的H.uvarum菌悬液(含终浓度为50mg/mL的卵磷脂)。不同字母代表差异显著(P<0.05)。
图2为卵磷脂结合葡萄汁有孢汉逊酵母处理对柑橘自然腐烂的影响。注：CK：无菌蒸馏水，即对照组；Y：用无菌蒸馏水配置的H.uvarum菌悬液(1×108cells/mL)；Y+1.5％P：用卵磷脂配置的1×108cells/ml的H.uvarum菌悬液(含终浓度为15mg/mL的卵磷脂)；不同字母代表差异显著(P<0.05)。
具体实施方式
借助以下实施实例将更加详细的说明本发明。以下实施例仅是说明性的,本发明并不受这些实施实例的限制。
实施例1葡萄汁有孢汉逊酵母Y3(Hanseniaspora uvarum)系本实验室筛选得到,现保存于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所,中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏菌株编号为CGMCC No.2.5414，保藏日期为2016年3月31日，建议的分类名称为葡萄汁有孢汉逊酵母Hanseniaspora uvarum。
培养程序为：(1)固体活化：将葡萄汁有孢汉逊酵母接种于NYDA培养基中,在28℃培养48h；(2)液体培养：在250mL的三角瓶中装入50mL的NYDB种子培养基，用接种环接入一环活化好的葡萄汁有孢汉逊酵母，在180rpm，28℃条件下培养20h；(3)离心分离再悬浮：上述酵母培养混合物在8000g条件下，离心10min，并用无菌蒸馏水洗涤3次，以去除培养介质，分别用无菌蒸馏水和卵磷脂悬浮，并用血球计数板计数，调节酵母细胞浓度为1×108cells/mL。
实施例2卵磷脂结合葡萄汁有孢汉逊酵母对柑橘绿霉病的控制效果
一)试验方案
供试的果实经过精细挑选,尽量选择果实均匀一致,表面无擦伤或机械损伤和病虫伤害。用无菌打孔器水果赤道出打孔,柑橘的表面伤口为5mm(直径)×3mm(深)。每个伤口处等量加入30μL以下处理液：(1)1×108cells/mL的葡萄汁有孢汉逊酵母悬液(无菌蒸馏水配置)；(2)用卵磷脂配置的1×108cells/mL的葡萄汁有孢汉逊酵母悬液(卵磷脂终浓度分别为1mg/mL，5mg/mL，10mg/mL，15mg/mL，20mg/mL，25mg/mL，30mg/mL，40mg/mL，50mg/mL)；(3)无菌蒸馏水。2h后,再向柑橘伤口处分别接种30μL 1×105spores/mL的指状青霉(P.digitatum)孢子悬浮液。自然晾干后,将果实放入塑料筐并用保鲜膜密封,恒温培养箱中培养(湿度95％),置于20℃。每处理重复3次,每次重复12个果实。整个试验重复2次。经过若7天的培养，记录果实发病率，以此评价卵磷脂结合葡萄汁有孢汉逊酵母的抑菌效果。
发病率的计算公式如下：
发病率(％)＝发病的果实/果实总数×100％
二)试验结果
如图1所示，柑橘人为接种指状青霉孢子悬浮液前应用卵磷脂结合H.uvarum，与对照相比，H.uvarum单独处理的柑橘发病率显著低于对照(P<0.05)，说明葡萄汁有孢汉逊酵母在20℃下能够有效控制由指状青霉造成的柑橘采后绿霉病。不同浓度卵磷脂结合H.uvarum处理的柑橘腐烂率显著低于H.uvarum单独处理组和对照组(P<0.05)，说明卵磷脂显著提高了H.uvarum对柑橘绿霉病的防治效果。尤其是H.uvarum与15mg/mL卵磷脂结合处理的柑橘防病效果最好，其发病率仅为4.63％，显著低于H.uvarum单独使用时的腐烂率(33.33％)。
实施例3卵磷脂结合葡萄汁有孢汉逊酵母对柑橘自然腐烂和贮藏品质的影响
一)试验方案
将以下处理液均匀喷于柑橘表面:(1)1×108cells/mL的葡萄汁有孢汉逊酵母菌悬液(无菌蒸馏水配置)；(2)用卵磷脂配置的1×108cells/mL的葡萄汁有孢汉逊酵母菌悬液(卵磷脂终浓度分别为15mg/mL)；(3)无菌蒸馏水，作为对照。将柑橘自然晾干，将处理好的果实放入塑料筐用保鲜膜密封。在室温(20℃)下贮藏1个月。取出水果统计腐烂水果个数,并观察腐烂情况和测定水果的品质。每处理重复3次,每次重复36个果实，整个实验重复2次。卵磷脂结合葡萄汁有孢汉逊酵母对水果自然腐烂的抑制效果以发病率表示。
1)发病率的计算公式如下：
发病率(％)＝发病的果实/果实总数×100％
2)贮藏品质测定方法如下：
①失重率：称重法。失重率＝(处理前质量-储藏后质量)/处理前质量×100％
②硬度：采用TA-XT2i质构分析仪测试，探头直径为5mm，探头测试前、测试中、测试后的运行速度分别为4.0mm s-1、1.0mm s-1、5.0mm s-1，草莓测试深度为6mm，桃果和苹果测试深度为10mm，探头***水果时所受的最大阻力(单位为牛顿)就被定义为水果的硬度。每个水果绕赤道处每120°测定3次。
③总可溶性固形物：采用WYT(0-80％)手持糖量计进行测定，测定结果表示为g/100g样品。
④可滴定酸度(％)：采用滴定法，从6个果中称取20g果肉,加蒸馏水20ml匀浆，用40ml蒸馏水洗入100ml容量瓶。置于80℃水浴浸提30min，每隔5min搅拌一次，取出冷却，定容至刻度。过滤,取20ml滤液置于100ml小烧杯中，投入一片红色石蕊试纸，用0.1mol l-1NaOH进行滴定。当石蕊试纸变蓝或溶液至微红时为滴定终点。结果以含柠檬酸百分含量表示。每处理3次重复。
⑤维生素C含量的测定：紫外快速测定法。从6个水果上取20g果肉样品加20ml 1％盐酸匀浆，50ml容量瓶定容至刻度。10000×g，4℃条件下离心10mim，上清用于测定。取0.4ml提取液，放入盛有0.8ml 10％HCl的10ml刻度试管中，用蒸馏水稀释至刻度后摇匀。
以蒸馏水为空白，在243nm处测定吸光度。另吸取0.4ml提取液，分别加入4ml蒸馏水和1.6ml 1moll-1NaOH溶液至10ml至刻度试管，摇匀，静置15min后。加入1.6ml 10％HCl，混匀，加蒸馏水定容至刻度。以蒸馏水为空白，在243nm处测定吸光度。由待测液及碱处理待测液的A243值之差，查标准曲线，计算样品中维生素C的含量。每处理3次重复。
二)试验结果
①按照上述步骤试验,统计的柑橘自然腐烂率结果见图2所示。
从图2可以看出,葡萄汁有孢汉逊酵母单独处理组及葡萄汁有孢汉逊酵母与卵磷脂结合处理组的柑橘发病率均显著低于对照(P<0.05)。此外，卵磷脂与葡萄汁有孢汉逊酵母结合处理对柑橘自然腐烂的控制效果要显著优于葡萄汁有孢汉逊酵母单独处理组。说明卵磷脂显著提高了葡萄汁有孢汉逊酵母对柑橘采后病害的生物防治效果。
②按照上述步骤试验，统计的柑橘贮藏品质结果见下表1所示。
表1 卵磷脂结合葡萄汁有孢汉逊酵母处理对柑橘贮藏品质的影响
注：CK：无菌蒸馏水，即对照组；Y：用无菌蒸馏水配置的H.uvarum菌悬液(1×108cells/mL)；Y+1.5％P：用卵磷脂配置的1×108cells/ml的H.uvarum菌悬液。不同字母代表差异显著(P<0.05)。
如表1所示,与对照相比，H.uvarum单独处理对柑橘贮藏品质各项指标如失重率、硬度、可溶性固形物、可滴定酸、Vc含量并没有显著影响。H.uvarum与卵磷脂结合处理的柑橘失重率显著低于对照和H.uvarum单独处理的柑橘失重率，对柑橘的其余贮藏品质指标如硬度、可溶性固形物、Vc和可滴定酸并没有产生显著影响。

Claims (5)

1.卵磷脂结合葡萄汁有孢汉逊酵母防治水果采后病害的方法，其特征在于按照下述步骤进行：将葡萄汁有孢汉逊酵母活化，用NYDB培养基培养葡萄汁有孢汉逊酵母，离心得到菌体，配制含卵磷脂（15 mg/mL）的1×108 cells/mL酵母菌悬液；将菌悬液均匀喷洒在水果上，自然风干；放在塑料筐中，用保鲜膜密封后，放在室温（20℃）条件下存放。
2.根据权利要求1所述的卵磷脂结合葡萄汁有孢汉逊酵母使用防治水果采后病害的方法，其特征在于其中所述的NYDB培养基为：酵母膏5 g，牛肉浸膏8 g，葡萄糖10 g，蒸馏水1000 ml，pH自然。
3.根据权利要求1所述的卵磷脂结合葡萄汁有孢汉逊酵母使用防治水果采后病害的方法，其特征在于其中所述的葡萄汁有孢汉逊酵母，保藏菌株编号为CGMCC No. 2.5414 ，建议的分类名称为葡萄汁有孢汉逊酵母Hanseniaspora uvarum 。
4.根据权利要求1所述的卵磷脂结合葡萄汁有孢汉逊酵母防治水果采后病害的方法，其特征在于含卵磷脂（15 mg/mL）的1×108 cells/mL酵母菌悬液，按照下述步骤进行配制：将菌体用无菌水稀释制备成2×108 cells/mL菌悬液,与浓度为两倍终浓度的卵磷脂按体积比1:1混合，而卵磷脂的最终浓度为15 mg/mL。
5.根据权利要求1所述的卵磷脂结合葡萄汁有孢汉逊酵母防治水果采后病害的方法，其特征在于其中所述的水果为柑橘。
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