CN105874056B - 用于生产第一代乙醇的酵母菌株 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及相对于第一代乙醇生产中所用的专用菌株具有改进性质的酵母菌株。具体地，本发明的菌株具有增加的乙醇收率、较低的甘油产量和与标准菌株D1B相似或稍慢的乙醇生产动力学。本发明还涉及通过培养所述菌株获得的酵母，以及所述酵母和/或所述菌株用于工业生产乙醇的用途。

Description

用于生产第一代乙醇的酵母菌株
技术领域
本发明涉及生产第一代乙醇的菌株、通过培养这些菌株获得的酵母、以及用于从所述酵母工业生产乙醇的方法。更具体地，本发明涉及对乙醇耐受性强、比目前乙醇生产工艺中所用的大多数有效菌株生产的甘油低、以及乙醇产量高的三个具体菌株。本发明的菌株还具有快的乙醇生产动力学。
背景技术
不可再生能源资源的减少和对温室气体排放增加越来越多的关注导致需要寻找化石燃料(石油、煤、天然气)替代物的能源资源。来自森林和/或农业或食品加工产品和/或副产品的植物生物质构成用于生产工业上感兴趣的分子的大量碳源。用植物所含的可发酵糖生产的乙醇用于具有燃烧发动机的车辆。因此，在北美和欧洲，生物乙醇的生产在过去几年已经经历了快速发展。2008年，全球用植物生物质生产了超过560亿升乙醇。
第一代生物乙醇通过发酵富含淀粉(玉米谷物、大麦、小麦、木薯、马铃薯块茎等)或蔗糖(甘蔗、甜菜、甜高粱等)的生物质中所含的己糖(包含6个碳的糖)来生产，而“第二代”生物乙醇通过转化农业废弃物(例如谷物秸秆和玉米秸秆)、森林残渣、木材、能源作物(例如柳枝稷)或具有短或非常短的旋转的矮树林(例如杨树)所含的纤维素和半纤维素来生产。
获得第一代方法的富含糖的发酵介质的方法相对简单且好控制。在甜植物例如甘蔗、甜高粱或甜菜的情况下，将植物研磨或切成片，直接或在水中浸泡后获得含糖汁液。可以用获得的粗汁液、用浓缩汁液或用多种浓缩汁液(例如提取初始所述的糖的一部分获得的糖浆)进行酒精发酵。在富含淀粉的植物部分例如玉米谷物的情况下，必须首先将淀粉水解成葡萄糖，然后才能将酵母转化成乙醇。标准的水解过程由以下组成：第一阶段，期间通过α-淀粉酶的作用将淀粉链转化为较短的链，然后是“SSF”(同时糖化和发酵)发酵步骤，期间通过添加葡萄糖苷酶来水解糊精，且期间酵母将葡萄糖发酵成乙醇。在发酵步骤之前，一些方法(称为冷方法)进行降低的淀粉水解或甚至没有淀粉水解。在用木质纤维素材料生产第二代乙醇的情况下，化学和酶促水解过程复杂得多并且费力，因为木质纤维素材料由难以解构以从木质素中释放纤维素和半纤维素的刚性基质组成。水解木质纤维素材料产生包含己糖和/或戊糖的水解物。无论使用何种生物质或采用何种产品，最终产物是相同的，仅生产过程不同。
在欧洲，甜菜和谷物(小麦、大麦、玉米)是用于生产农业来源的乙醇的主要资源。甜植物(甜菜、甘蔗)和淀粉类植物(谷物例如小麦或玉米)中所含的糖(葡萄糖、果糖或蔗糖)通过使用酵母的工业发酵工艺转化成酒精。然后将酒精蒸馏并脱水以获得生物乙醇。在生产工艺中获得的副产物(酒糟和浆料)意欲用于动物饲料。
第一代乙醇生产者所用的酵母主要是能够优化生产工艺收益率的专用酵母。这些酵母尤其是：Ethanol AngelSuper和(AB)。这些酵母的预期品质是在代表工业条件的温度和pH范围内，它们快速生产高浓度乙醇和耗尽发酵培养基的糖的能力。在使用谷物(尤其是玉米)产生具有高糖浓度的水解物的方法中尤其需要这些品质。实际上，生产者调节他们发酵培养基中的糖含量使其尽可能高，同时确保将糖尽可能快且完全地转化成乙醇。就像生产者希望酵母将培养基中的所有糖转化成乙醇，他们也希望消耗的糖转化成乙醇的总产量尽可能高，从而在发酵中产生最少的副产物例如甘油。
具有对乙醇显示更好耐受性的酵母和具有产生更少甘油，同时确保在普通发酵条件和发酵参数波动期间相等或更高的生产力(体积方面)的酵母将允许乙醇生产者通过提高乙醇产量来增加他们工厂的收益率。因此，仍然需要用于生产第一代乙醇的新的改进的酵母菌株。
发明简述
本发明涉及与第一代乙醇生产中通常使用的专用酵母菌株相比，具有改进性质的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)酵母菌株。
因此，具体地，本发明的一个主题是在布达佩斯条约条件下，以保藏号I-4791于2013年7月25日保藏于CNCM(Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes[法国国家微生物培养物保藏中心]of the Institut Pasteur,25rue du Docteur Roux,75724Paris,Cedex 15)的酿酒酵母菌株53-137。
本发明的另一个主题是在布达佩斯条约条件下，以保藏号I-4790于2013年7月25日保藏于CNCM(Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes[法国国家微生物培养物保藏中心]of the Institut Pasteur,25rue du Docteur Roux,75724Paris,Cedex 15)的酿酒酵母菌株53-005。
本发明的另一个主题是在布达佩斯条约条件下，以保藏号I-4792于2013年7月25日保藏于CNCM(Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes[法国国家微生物培养物保藏中心]of the Institut Pasteur,25rue du Docteur Roux,75724Paris,Cedex 15)的酿酒酵母菌株53-214。
本发明还涉及通过培养选自以保藏号I-4791于2013年7月25日保藏于CNCM的酿酒酵母菌株、以保藏号I-4790于2013年7月25日保藏于CNCM的酿酒酵母菌株和以保藏号I-4792于2013年7月25日保藏于CNCM的酿酒酵母菌株的酿酒酵母菌株获得的酵母。
本发明的一个主题还是选自以保藏号I-4791于2013年7月25日保藏于CNCM的酿酒酵母菌株、以保藏号I-4790于2013年7月25日保藏于CNCM的酿酒酵母菌株和以保藏号I-4792于2013年7月25日保藏于CNCM的酿酒酵母菌株的酿酒酵母菌株或通过培养这些菌株之一获得的酵母用于从生物质生产第一代乙醇的用途。
本发明的一个主题还是从生物质生产第一代乙醇的方法，包含使用选自以保藏号I-4791于2013年7月25日保藏于CNCM的酿酒酵母菌株、以保藏号I-4790于2013年7月25日保藏于CNCM的酿酒酵母菌株和以保藏号I-4792于2013年7月25日保藏于CNCM的酿酒酵母菌株的酿酒酵母菌株或通过培养这些菌株之一获得的酵母的发酵步骤。
在一些实施方案中，生物质富含糖和/或淀粉，并且选自或尤其源自玉米、小麦、大麦、黑麦、高粱、木薯、小黑麦、马铃薯、甘薯、甘蔗、甜菜和甜高粱。
在一些优选的实施方案中，生物质选自或源自玉米、小麦、大麦、木薯、甜菜和甘蔗。
本发明的一个主题还是用乙醇生产过程获得的发酵残渣生产酒糟和补充有可溶物质的酒糟。
以下给出本发明一些优选实施方案的更详细的描述。
发明详述
如上所述，本发明涉及有助于第一代乙醇生产的三个酿酒酵母菌株。本发明的三个菌株通过杂交和选择程序的方式获得。它们来自以保藏号I-4072于2008年9月4日保藏于CNCM的酿酒酵母菌株(属于申请人的菌株)和以保藏号I-4782于2013年6月26日保藏于CNCM的酿酒酵母克隆(也属于申请人)之间的杂交。
I-4072酵母菌株是申请人从21个评估菌株组中选择的对乙醇具有最强耐受性的菌株。
申请人选择酿酒酵母克隆I-4782，因为对乙醇具有高耐受性(虽然比I-4072菌株低)，但甘油生产低于I-4072菌株。
杂交选择程序导致本发明的三个菌株。这些菌株的每一个均构成目前第一代乙醇工艺生产中所用的最有效的专用菌株的替代物。实际上，本发明的三个菌株对乙醇的耐受性比I-4072参考菌株高，同时由于甘油(发酵反应的副产物)产量低，第一代乙醇的产量比I-4072菌株高。无论发酵期间的温度(32℃、35℃或38℃)、pH(4.0、5.0或5.5)和无机氮的供给(150-500ppm)，均观察到这种良好的耐受性，使这些菌株特别适用于其中发酵参数波动很常见的第一代乙醇的生产。并且，本发明的菌株具有乙醇生产动力学与I-4072参考菌株相似或稍慢的优势。
本发明还涉及通过培养本发明的菌株之一获得的酵母。培养酵母菌株的方法是本领域已知的，本领域技术人员知道如何根据其性质优化各菌株的培养条件。
本发明的酵母菌株和通过培养这些菌株获得的酵母用于从生物质生产第一代乙醇。本文的术语“生物质”意欲是指转化后能够变成能源的植物来源的任何有机物质。优选的，在本发明上下文中，生物质来自农业或食品加工产品和/或副产品。特别地，生物质优选富含蔗糖或淀粉，选自或源自例如玉米、小麦、大麦、黑麦、高粱、木薯、小黑麦、马铃薯、甘薯、甘蔗、甜菜和甜高粱。
在一些优选的实施方案中，生物质选自或源自玉米、小麦、大麦、木薯、甜菜和甘蔗。
用于从生物质生产第一代乙醇的方法和在发酵步骤中使用酵母是本领域已知的。最常见的工业方法使用物理、化学和生化处理，最终目的是允许糖的发酵并产生乙醇。存在该方法的一些变体，并且是本领域已知的。本发明的酵母菌株和通过培养这些菌株获得的酵母可以用于生产第一代乙醇的任何方法。
本发明尤其适用于生产作为燃料的乙醇，但也适用于生产食品、化学剂、药物和化妆品工业的乙醇。
除非另有定义，说明书中所用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的相同含义。而且，本文提及的所有出版物、专利申请、所有专利和任何其他参考文献通过引用的方式并入本文。
附图说明
图1：根据实施例1在液化发酵培养基上进行的发酵试验结束时的最终浓度。(A)乙醇浓度和(B)甘油浓度。培养基A、B和C描述于表1。
图2：在各种发酵条件下I-4072菌株(A)和杂交体I-4790(B)、I-4791(C)和I-4792(D)的乙醇生产动力学。
具体实施方式
以下实施例描述本发明的一些实施方案。然而，应当理解实施例和附图仅以说明性的方式呈现，而不以任何方式限制本发明的范围。
实施例1：选择与I-4072菌株杂交的亲本菌株
在酒精发酵中测试一组21个菌株或克隆。测试在同时糖化和发酵(SSF)条件下进行，其中糖相对于菌株转化成乙醇的能力过量。首先，使用添加或不添加来自蒸馏残渣的可溶物质的含有淀粉糊精的合成培养基。其次，使用按下表给出的比例的从玉米面粉、可溶物质部分、蒸馏残渣和工艺水制备的发酵培养基。这些各种成分从根据第一代方法生产工业乙醇的工厂获得。将pH调节至5.6后，将基于玉米面粉的混合物用LiquozymeTMSCDS(Novozymes)于85℃液化3小时。所用的LiquozymeTM剂量是0.8ml/kg所用面粉。接种前，将初始pH调节至5.0或4.5；如下表所示加入各种浓度的尿素(相当于300、600和1000ppm的氮)。以0.6ml/kg面粉的剂量加入Spyrizyme Fuel UltraTM(Novozymes)。将发酵温度调节为32℃。在500ml三角瓶中，预先在丰富合成培养基中繁殖菌株(微曝气繁殖)。
表1
在测试的各菌株中，保留以保藏号I-4072保藏于CNCM的菌株，因为其是在测试的所有菌株中产生最多乙醇的菌株。在测试的各菌株中，保留I-4782菌株，因为其是产生大量乙醇(尽管少于I-4072)，并且产生的甘油量比I-4072菌株少的菌株。
有趣地注意到，与I-4072菌株的乙醇生产动力学相比，I-4782克隆的乙醇生产动力学相当慢。图1A和1B示出了试验期间获得的乙醇和甘油的最终浓度。
因此，目的是通过杂交获得至少一个对乙醇的耐受性比I-4072菌株高、甘油产量比I-4072菌株低、且乙醇生产动力学至少与I-4072菌株相似的杂交体。
实施例2：获得新杂交体
一旦选择亲本菌株，进行通过杂交产生新菌株发展的各种技术步骤，包含：
–通过产孢然后萌发获得两个亲本菌株的分离子，并表征它们的性别类型，
–建立杂交表后进行杂交，和
–分离并鉴定新杂交体。
选择I-4072菌株的精华分离子。制备I-4072菌株的分离子，并评估它们的乙醇产量。然后，根据这些结果，选择具有最佳酒精性能水平的8个“α”性别类型的孢子和12个“a”性别类型的孢子。
进行杂交并获得新菌株。为了获得新菌株，在选择的I-4072分离子和随机选择的I-4782分离子之间进行若干系列的杂交。
鉴定新杂交体。通过交配型PCR鉴定新杂交体。
因此，在进行的杂交结束时，产生并验证很多菌株。在杂交体中，如下所示，本申请主题的I-4791、I-4790和I-4792尤其突出。
实施例3：选择新杂交体
为了能够从292个新产生的菌株中选择最佳杂交体，开发了四个水平的选择。这些选择基于以下：监测与I-4072对照相比，酒精发酵培养基用待研究的菌株接种后的质量损失，以及测量各种温度(35℃和38℃)下发酵72小时后产生的乙醇浓度、剩余葡萄糖和甘油。所用的发酵培养基是含有在测试菌株转化乙醇的能力之上的高葡萄糖浓度的合成培养基。选择标准是比I-4072菌株更好的质量损失动力学和/或比I-4072菌株降低的甘油产量。根据化学计量方程：1mol葡萄糖→2mol CO2+2mol乙醇，质量损失是通过酵母生产乙醇的间接指示，这使得能够整体上将产生和蒸发的CO2形式的培养基质量的质量损失和产生的乙醇质量联系起来。
最后，从292个菌株中选择18个杂交体，包括I-4790、I-4791和I-4792菌株。选择这些菌株因为它们具有以下特征：
–杂交体I-4790：在35℃和38℃的温度下，对于与I-4072菌株相等的乙醇产量，甘油产量降低15-20％。然而，质量损失动力学比I-4072菌株低；
–杂交体I-4791：在35℃和38℃的温度下，与I-4072菌株相比乙醇产量增加3.5％，质量损失动力学比I-4072菌株快，且甘油产量与I-4072菌株相等；
–杂交体I-4792：在35℃和38℃的温度下，乙醇产量与I-4072相等(在38℃稍微提高)，质量损失动力学与I-4072相等，且甘油产量比I-4072低7.5-8％。
实施例4：杂交体在糖过量的培养基中从玉米面粉生产乙醇
在基于玉米面粉和来自工业蒸馏残渣的可溶物质部分的培养基中进行测试。在各种发酵温度下，用各种添加的氮，并在各种初始pH值下进行测试。研究的特征是：菌株对乙醇的最大耐受性、甘油产量和乙醇生产动力学。
测量随时间的发酵培养基的质量损失。一旦质量损失达到稳定，进行发酵培养基的取样并通过HPLC分析乙醇和甘油浓度。从测量的浓度和为了进行分析而取样的时间点的发酵液的质量以及初始浓度和质量值计算产生的乙醇和甘油的质量。
方案.用玉米面粉、来自蒸馏残渣的可溶物质部分和工艺水制备发酵培养基。为了尽可能像地模拟工业生产条件，从根据第一代方法生产工业乙醇的工厂获得这些各种成分。三种工业成分的比例是：玉米面粉(36％w/w)、来自蒸馏残渣的可溶物质部分(35％w/w)和工艺水(29％w/w)。将pH调节至5.6后，将混合物用LiquozymeTMSCDS(Novozymes)于85℃液化3小时。所用的LiquozymeTM剂量是0.8ml/kg所用面粉。接种前，将初始pH调节至5或4(根据表)，并加入各种浓度的尿素(相当于300、600和1000ppm的氮)。以0.6ml/kg面粉的剂量加入Spyrizyme Fuel UltraTM(Novozymes)。在500ml三角瓶中，预先在丰富合成培养基中繁殖菌株(微曝气繁殖)。通过离心繁殖培养基并将离心沉淀重悬于水中来制备酵母膏。测定酵母膏的固体含量，并用所述膏接种发酵培养基以具有0.5g干酵母当量/kg培养基的接种水平。
进行测试.下表表示进行的发酵测试和所用菌株的条件。
表2.发酵测试条件
A：36％玉米面粉、35％来自蒸馏残渣的可溶物质部分、29％工艺水
B：36％玉米面粉、35％来自蒸馏残渣的可溶物质部分、29％工艺水
N：氮的供给
结果.所得结果如下表所示。
表3-4.在测试1-9中产生的乙醇和甘油的最终浓度以及乙醇和甘油的质量。
表3
表4
这些结果清楚表明，杂交体对乙醇的耐受性比I-4072起始菌株好(相对于I-4072菌株显示2-3％的优势)，且它们产生的甘油比I-4072菌株少。I-4790、I-4791和I-4792菌株的这种甘油低产量逻辑上应当导致消耗的糖转化成乙醇的更好收率。
乙醇生产动力学.以举例方式，图2示出了测试10-13的质量损失动力学。
这些结果表明，在测试的所有菌株中，I-4072菌株具有最快的乙醇生产动力学。在本发明的杂交体中，I-4791杂交体的乙醇生产动力学或多或少与I-4072菌株相似。另一方面，I-4790杂交体在pH5显示最慢的动力学，延迟高达10小时。
实施例5：杂交体在糖浓度有限的培养基中从玉米面粉生产乙醇的测试
转化成乙醇的收率.为了加强之前的结果，用比实施例4的测试中所用的玉米面粉浓度低的玉米面粉浓度进行一些测试，从而菌株完全可以消耗培养基中的可发酵糖。进行的测试如下表5所示：
表5.发酵条件
C：32℃：33％玉米面粉、35％来自蒸馏残渣的可溶物质部分、32％工艺水
D：35℃：30％玉米面粉、35％来自蒸馏残渣的可溶物质部分、35％工艺水
结果如下表6和7所示。
表6
表7
所得结果证实了之前测试的观察结果：杂交体I-4790、I-4791和I-4792产生比I-4072参考菌株明显少的甘油和多的乙醇，尤其是在提供的氮(N)剂量降低时。
结论.所得结果清楚表明：
–I-4791杂交体具有：与I-4072相同或相似的乙醇生产动力学、对乙醇更好的耐受性(+2％)、更低的甘油产量(-5％)和更好的乙醇收率(+2％)；
-I-4790杂交体具有：比I-4072对乙醇更好的耐受性(+3％)、更低的甘油产量(-10％)和更好的乙醇收率(+2％)，但乙醇生产动力学比I-4072慢；
-I-4792杂交体具有：除了在苛刻条件下(38℃/pH 4)，比I-4072对乙醇更好的耐受性(+3％)、与I-4072相似的乙醇生产动力学、更低的甘油产量(-5％)和更好的乙醇收率(+1％)。
实施例6：用选择的三个杂交体生产酵母的测试
根据本领域技术人员熟知的补料-分批方案，在曝气条件下，在中试规模繁殖选择的杂交体。根据常规技术干燥所得酵母。这些酵母生产测试在没有注意到任何特别问题下进行。
用产生的即溶干酵母进行乙醇生产测试，目的是验证酵母生产过程不损害产生的菌株的性能水平。
方案.用玉米面粉、来自蒸馏残渣的可溶物质部分和工艺水制备发酵培养基。从生产工业乙醇的工厂获得这些各种成分。三种工业成分的比例是：玉米面粉(36％w/w)、来自蒸馏残渣的可溶物质部分(35％w/w)和工艺水(29％w/w)。将pH调节至5.6后，将混合物用LiquozymeTMSCDS(Novozymes)于85℃液化3小时。所用的LiquozymeTM剂量是0.8ml/kg所用面粉。
在用水稀释的液化培养基(70％w/w、30％w/w)上繁殖从杂交体I-4790、I-4791和I-4792产生的干酵母以及商业酵母Ethanol RedTM。接种水平是0.5g干酵母/kg培养基，将pH调节至5，繁殖温度是32℃，加入尿素(500ppm)和Spirizyme Fuel UltraTM(0.6ml/kg面粉)。以10％重量/重量的转移将繁殖培养基转移至发酵培养基。
在表8所示的条件下进行发酵。
表8
B：36％玉米面粉、35％来自蒸馏残渣的可溶物质部分、29％工艺水
如表9所示，在进行的测试的精确度极限内，所得结果证实已经获得的结果，并证实生产并干燥I-4790、I-4791和I-4792菌株的可能性。
结论.根据本发明获得的结果能够获得当它们用于从源自植物生物质的糖生产乙醇时，具有在生产力和收率上显著改进的性能水平的工业酵母。
与市场上的参考产品(Ethanol RedTM)相比：
–I-4790工业菌株能够将乙醇生产力提高+2％，由于产生的甘油量降低10％，乙醇/糖收率提高；
–I-4791工业菌株能够将乙醇生产力提高+2％，由于产生的甘油量降低5％，乙醇/糖收率提高；
–I-4792工业菌株能够将乙醇生产力提高+1％，由于产生的甘油量降低5％，乙醇/糖收率提高.
表9

Claims (11)

1.酿酒酵母菌株，选自以保藏号I-4791于2013年7月25日保藏于CNCM的酵母菌株、以保藏号I-4790于2013年7月25日保藏于CNCM的酵母菌株和以保藏号I-4792于2013年7月25日保藏于CNCM的酵母菌株，其中所述酿酒酵母菌株来自以保藏号I-4072于2008年9月4日保藏于CNCM的酵母菌株和以保藏号I-4782于2013年6月26日保藏于CNCM的酵母菌株的杂交，且其中所述酿酒酵母菌株对乙醇的耐受性高于以保藏号I-4072保藏的酵母菌株对乙醇的耐受性。
2.通过培养权利要求1所述的酵母菌株获得的酿酒酵母。
3.权利要求1所述的酵母菌株或权利要求2所述的酵母用于从生物质生产第一代乙醇的用途。
4.权利要求3所述的用途，其中所述生物质富含糖和/或淀粉。
5.权利要求4所述的用途，其中所述生物质包含或源自甘蔗、甜菜、甜高粱、玉米、小麦、大麦、黑麦、高粱、小黑麦、马铃薯、甘薯和/或木薯。
6.用于从生物质生产第一代乙醇的方法，包含使用权利要求1所述的酵母菌株或权利要求2所述的酵母将生物质发酵成乙醇的步骤。
7.权利要求6所述的方法，其中所述生物质富含糖和/或淀粉。
8.权利要求7所述的方法，其中所述生物质包含甘蔗、甜菜、甜高粱、玉米、小麦、大麦、黑麦、高粱、小黑麦、马铃薯、甘薯和/或木薯。
9.权利要求6所述的方法，其中所述发酵步骤在32℃-35℃的温度下和5-5.5的pH下进行。
10.权利要求7所述的方法，其中所述发酵步骤在32℃-35℃的温度下和5-5.5的pH下进行。
11.权利要求8所述的方法，其中所述发酵步骤在32℃-35℃的温度下和5-5.5的pH下进行。
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