CN105874012B - 水溶性荧光染料或有色染料 - Google Patents

Abstract

公开了可用作荧光或有色染料的化合物。所述化合物具有以下结构(I)：式(I)，包括其立体异构体、盐或互变异构体，其中R^1a、R^1b、R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ、R^2j、R^2k、R^2l、R^2m、R²ⁿ、R^2o、R^2p、R^2q、R^2r和R^2s如本文所定义。还提供了与这类化合物的制备和使用相关的方法。

Description

水溶性荧光染料或有色染料

发明背景

发明领域

本发明涉及新的荧光染料或有色染料及其制备方法和在多种分析方法中的用途。

相关领域的描述

连续且扩大需要检测和定量研究和诊断混合物中的作为分析物的化学、生化和生物物质的快速、高度特异性的方法。特别有价值的是用于测量小量核酸、肽、糖、药物、代谢物、微生物、离子和其他有诊断价值的材料的方法。这类材料的实例包括麻醉剂和毒物，施用用于治疗目的的药物，激素，病原微生物和病毒，肽，例如抗体和酶，以及核酸，特别是牵涉于疾病状态的那些。

特定分析物的存在经常可以通过利用表征许多生化和生物***的高度特异性的的方法来确定。常用方法基于，例如，抗原-抗体***、核酸杂交技术和蛋白-配体***。在这些方法中，有诊断价值的复合物的存在通常通过连接至相互作用材料中的一种或多种的可观察的“标记”的存在或不存在来表示。选择的特异性标记方法经常决定用于检测目的分析物的特定***的有用性和通用性。优选的标记是便宜的，安全的，且能够被有效地连接至各种各样的化学、生化和生物材料，而不显著改变那些材料的重要结合亲和力。所述标记应当给予高度特征性信号，并且应当在自然界中罕见，优选从未发现。所述标记应当经范围长达数月的时间段在水***中是稳定且可检测的。所述标记的检测是优选快速、灵敏且可重复的，而不需要昂贵、专门的设备或者不需要保护人员的特别预防措施。所述标记的定量优选相对独立于变量如待测定的混合物的温度和组成。

已经开发了各种各样的标记，其各自具有特定的优点和缺点。例如，放射性标记是相当通用的，并且可以在非常低的浓度进行检测。然而，这类标记是昂贵的，危险的，并且它们的使用需要复杂的设备和受过训练的人员。因此，对于非放射性标记，特别是通过分光光度、自旋共振和发光技术可观察的标记，和反应性材料如产生这类分子的酶，存在广泛的兴趣。

使用荧光光谱学可检测的标记是特别感兴趣的，因为本领域中已知大量这类标记。此外，文献中充满了经衍生化以允许它们附接至其他分子的荧光标记的合成，并且许多这类荧光标记是商业可得的。

花青染料已被广泛用于标记生物分子包括抗体、DNA探针、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、脂质、生化类似物、肽和药物，以及用于各种应用包括DNA测序、DNA微阵列、western印迹、流式细胞术分析和蛋白微阵列，仅举几例。科学家喜欢在生物应用中使用花青染料，因为，除其他原因外，花青染料1)是生物相容；2)具有较高的摩尔吸光系数(约10⁵M^-1cm^-1)；3)容易修饰以匹配宽范围的期望的激发和检测波长(例如约500至约900nm)；4)能够掺入水溶性基团和连接基团；5)且具有有利的荧光特性。具体而言，Cy2缀合物(具有492nm左右的最大吸附/激发和510nm左右的发射，在可见光谱的绿色区域中)，由于对pH变化的降低灵敏度而通常用作FITC的替代物。然而，Cy2的低荧光量子产率、短荧光寿命、光漂白的倾向和差化学稳定性已经限制了其在化学和生命科学中的使用。

因此本领域需要在没有事先光照或化学激活或酶促激活情况下允许目视或荧光检测生物分子的水溶性染料和生物标记物。理想地，这类染料和生物标记物应当强烈显色或发荧光并且应当以多种颜色和荧光波长可获得。本发明满足这种需要并且进一步提供相关优点。

发明简述

简言之，本发明总体上涉及可用作能够目视检测生物分子和其他分析物的水溶性荧光染料或有色染料和探针的化合物，以及制备它们的试剂。还描述了用于目视检测生物分子以及用于确定生物分子大小的方法。本发明的水溶性荧光染料或有色染料强烈显色和/或发荧光并且可以通过视检或其他手段轻易地观察。在一些实施方案中，可以在没有事先光照或化学激活或酶促激活情况下观察所述化合物。有利地，所述染料的实施方案具有范围为约468nm至约508nm的最大吸光度和范围为约495nm至约525nm的最大发射。例如，在某些实施方案中，所述染料具有在约490nm处的最大吸光度和在约505nm处的最大发射。因此，所述染料对于各种分析方法中的使用是理想的。通过适宜地选择染料，如本文所述，可以获得具有多种颜色的目视可检测生物分子。

因此，在一个实施方案中，提供具有以下结构(I)的化合物：

或其盐、立体异构体或互变异构体，其中R^1a、R^1b、R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ、R^2j、R^2k、R^2l、R^2m、R²ⁿ、R²o、R^2p、R^2q、R^2r和R^2s如本文所定义。

在其他实施方案中，提供包含与具有以下结构(I')的化合物形成的共价键的分析物分子：

或其盐、立体异构体或互变异构体，其中R^1a、R^1b、R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ、R^2j、R^2k、R^2l、R^2m、R²ⁿ、R^2o、R^2p、R^2q、R^2r和R^2s如本文所定义，且其中R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ、R^2j、R^2k、R^2l、R^2m、R²ⁿ、R^2o、R^2p、R^2q、R^2r或R^2s中的至少一者是分析物分子或与之形成的键。

在另一个实施方案中，提供一种用于对样品进行染色的方法，所述方法包括向所述样品以足够在所述样品以适宜波长照亮时产生光学响应的量添加如本文所述的代表性化合物。

在还有其他实施方案中，本公开提供一种用于目视检测生物分子的方法，所述方法包括：

(a)提供本文所述的代表性化合物；并且

(b)通过其可视特性检测化合物。

所公开的其他方法包括一种用于目视检测生物分子的方法，所述方法包括：

(a)将任一种所公开的化合物与一种或多种生物分子混合；并且

(b)通过其可视特性检测化合物。

其他实施方案涉及一种组合物，所述组合物包含任一种公开的化合物和一种或多种生物分子。还提供了这类组合物在检测一种或多种生物分子的分析方法中的用途。

本发明的这些方面和其他方面会在参考以下详述后而显而易见。

附图描述

图1描绘化合物2在CDCl₃中的¹H NMR谱。

图2描绘化合物2的2μL注射体积的代表性总二极管阵列色谱图(215-500nm)。使用的***是Waters Acquity UHPLC***，其具有保持在45℃的2.1mm x 50mm Acquity BEH-C18柱。

图3描绘溴化的蒽衍生物2产物的减去背景的质谱图。预期质量：617.8。

图4描绘化合物3在CDCl₃中的¹H NMR谱。

图5描绘化合物3的2μL注射体积的代表性总二极管阵列色谱图(215-500nm)。使用的***是Waters Acquity UHPLC***，其具有保持在45℃的2.1mmx50mm Acquity BEH-C18柱。

图6描绘化合物3的减去背景的质谱图。预期质量929.1。

图7描绘化合物5(粗5'-NH3-(HEG)-AQ6-(HEG)-3'序列)的10μL注射体积在488nm处的代表性色谱图。使用的***是Waters Acquity UHPLC***，其具有保持在45℃的2.1mmx 50mm Acquity BEH-C18柱。

图8描绘化合物5(粗5'-NH3-(HEG)-AQ6-(HEG)-3'序列)的减去背景的质谱图。该方法采用负模式的电喷雾电离，且显示^-1、^-2和^-3电荷状态。

发明详述

在以下描述中，阐述某些具体细节，旨在提供对本发明多个实施方案的透彻理解。但是，本领域技术人员将理解本发明可以在没有这些细节的情况下实施。

除非情境需要，否则在本说明书和权利要求通篇范围内，词“包含”及其变例，如，“包含了”和“包含着”将解释成是开放、包括性意义，即，理解为“包括但不限于”。

本说明书通篇范围内对“一个实施方案“或“某个实施方案”的谈及意指在本发明的至少一个实施方案中包含与某实施方案联系所描述的具体特点、结构或特征。因此，短语“在一个实施方案中”或“在某个实施方案中”在本说明书通篇范围内多个位置的出现并不必然地全都指相同的实施方案。另外，具体特点、结构或特征可以在一个或多个实施方案中按任何适合的方式组合。

“氨基”指-NH₂基。

“羧基”指-CO₂H基。

“氰基”指-CN基。

“甲酰基”指-C(＝O)H基。

“羟”或“羟基”指OH基。

“亚胺基”指＝NH基。

“硝基”指-NO₂基。

“氧代”指＝O取代基。

“硫氢基”指-SH基。

“硫代”指＝S基。

“烷基”指仅由碳原子和氢原子组成的直链或分枝烃链基团，所述烃链基团是饱和或不饱和的(即，含有一个或多个双键和/或叁键)，具有1个至12个碳原子(C₁-C₁₂烷基)、优选地1个至8个碳原子(C₁-C₈烷基)或1个至6个碳原子(C₁-C₆烷基)，并且通过单键与分子的其余部分连接，例如，甲基、乙基、正丙基、1-甲基乙基(异丙基)、正丁基、正戊基、1,1-二甲基乙基(叔-丁基)、3-甲基己基、2-甲基己基、乙烯基、丙-1-烯基、丁-1-烯基、戊-1-烯基、戊-1,4-二烯基、乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基等。除非在本说明书中另外声明，否则烷基可以是任选取代的。

“亚烷基”或“亚烷基链”指仅由碳和氢组成的使分子的其余部分与取代基连接的直链或分枝二价烃链，所述二价烃链是饱和或不饱和的(即，含有一个或多个双键和/或叁键)并且具有1个至12个碳原子，例如，亚甲基、亚乙基、亚丙基、正-亚丁基、亚乙烯基、亚丙烯基、正-亚丁烯基、亚丙炔基、正-亚丁炔基等。亚烷基链通过单键或双键与分子的其余部分连接并通过单键或双键与取代基连接。亚烷基链与分子其余部分及与取代基的连接点可以是经过链内部的一个碳或任何两个碳。除非在本说明书中另外声明，否则亚烷基链可以是任选取代的。

“烷氧基”指式-OR_a的基团，其中R_a是如上文定义的含有1个至12个碳原子的烷基。“羟基烷氧基”是包含至少一个羟基取代基的烷氧基部分。“氨基烷氧基”是包含至少一个氨基取代基的烷氧基部分。除非在本说明书中另外声明，否则烷氧基、羟基烷氧基和/或氨基烷氧基是任选取代的。

“烷基氨基”指式-NHR_a或-NR_aR_a的基团，其中每个R_a独立地是如上文定义的含有1个至12个碳原子的烷基。除非在本说明书中另外声明，否则烷基氨基可以是任选取代的。

“烷基醚”指如上文定义的任何烷基，其中至少一个碳-碳键用碳-氧键替换。碳-氧键可以在末端上(如在烷氧基中)或碳氧键可以是内部的(即，C-O-C)。烷基醚包含至少一个碳氧键，但是可以包括多于一个碳氧键(即，“聚烷基醚”)。例如，在烷基醚的含义内部包括聚乙二醇(PEG)，其为聚烷基醚。“羟基聚烷基醚”指包含一个或多个羟基取代基的聚烷基醚。“氨基聚烷基醚”指包含一个或多个氨基取代基的聚烷基醚。除非在本说明书中另外声明，否则烷基醚、聚烷基醚、羟基聚烷基醚和/或氨基聚烷基醚基团是任选取代的。

“亚烷基醚”指如上文定义的任何亚烷基，其中至少一个碳-碳键用碳-氧键替换。碳-氧键可以在末端上(如在烷氧基中)或碳氧键可以是内部的(即，C-O-C)。亚烷基醚包含至少一个碳氧键，但是可以包括多于一个碳氧键。例如，在亚烷基醚的含义内部包括聚乙二醇(PEG)。除非在本说明书中另外声明，否则亚烷基醚基是任选取代的。

“烷基二氧磷基”指-RP(＝O)(R_a)R_b基团，其中R是亚烷基，R_a是OH、O^-或OR_c；并且R_b是-氧烷基或-氧烷基醚，其中R_c是反离子(例如，Na⁺等)。除非在本说明书中另外声明，否则烷基二氧磷基可以是任选取代的。例如，在某些实施方案中，烷基二氧磷基中的烷基或烷基醚部分(R_b)任选被以下一种或多种取代基取代：羟基、氨基、硫氢基、磷酸酯、硫代磷酸酯、二氧磷基烷基、硫代二氧磷基烷基、二氧磷基烷基醚或硫代二氧磷基烷基醚，所述取代基也是任选取代的。

“氧烷基二氧磷基”是通过氧原子与分子剩余部分连接的烷基二氧磷基。除非在本说明书中另外声明，否则氧烷基二氧磷基是任选取代的。例如，在某些实施方案中，氧烷基二氧磷基中的烷基、烷基醚或聚烷基醚部分(R_b)任选被以下一种或多种取代基取代：羟基、氨基、硫氢基、磷酸酯、硫代磷酸酯、二氧磷基烷基、硫代二氧磷基烷基、二氧磷基烷基醚或硫代二氧磷基烷基醚，所述取代基也是任选取代的。

“烷基醚二氧磷基”指-RP(＝O)(R_a)R_b基团，其中R是亚烷基，R_a是OH、O^-或OR_c；并且R_b是-氧烷基或-氧烷基醚，其中R_c是反离子(例如，Na⁺等)。除非在本说明书中另外声明，否则烷基醚二氧磷基可以是任选取代的。例如，在某些实施方案中，烷基醚二氧磷基中的烷基或烷基醚部分(R_b)任选被以下一种或多种取代基取代：羟基、氨基、硫氢基或磷酸酯、硫代磷酸酯、二氧磷基烷基、硫代二氧磷基烷基、二氧磷基烷基醚或硫代二氧磷基烷基醚，所述取代基也是任选取代的。

“氧烷基醚二氧磷基”是通过氧原子与分子剩余部分连接的烷基醚二氧磷基。除非在本说明书中另外声明，否则氧烷基醚二氧磷基是任选取代的。例如，在某些实施方案中，氧烷基醚二氧磷基中的烷基或烷基醚部分(R_b)任选被以下一种或多种取代基取代：羟基、氨基、硫氢基或磷酸酯、硫代磷酸酯、二氧磷基烷基、硫代二氧磷基烷基、二氧磷基烷基醚或硫代二氧磷基烷基醚，所述取代基也是任选取代的。

“烷基硫代二氧磷基”指-RP(＝R_a)(R_b)R_c基团，其中R是亚烷基，R_a是O或S，R_b是OH、O^-、S^-、OR_d或SR_d；且R_c是-氧烷基或-氧烷基醚，其中R_d是反离子(例如，Na⁺等)，且条件是：R_a是S或R_b是S^-或SR_d；或者条件是R_a是S且R_b是S^-或SR_d。除非在本说明书中另外声明，否则烷基硫代二氧磷基是任选取代的。例如，在某些实施方案中，烷基硫代二氧磷基中的烷基或烷基醚部分任选被以下一种或多种取代基取代：羟基、氨基、硫氢基、磷酸酯、硫代磷酸酯、二氧磷基烷基、硫代二氧磷基烷基、二氧磷基烷基醚或硫代二氧磷基烷基醚，所述取代基也是任选取代的。

“氧烷基硫代二氧磷基”是通过氧原子与分子剩余部分连接的烷基硫代二氧磷基。除非在本说明书中另外声明，否则氧烷基硫代二氧磷基是任选取代的。例如，在某些实施方案中，氧烷基硫代二氧磷基中的烷基或烷基醚部分任选被以下一种或多种取代基取代：羟基、氨基、硫氢基、磷酸酯、硫代磷酸酯、二氧磷基烷基、硫代二氧磷基烷基、二氧磷基烷基醚或硫代二氧磷基烷基醚，所述取代基也是任选取代的。

“烷基醚硫代二氧磷基”指-RP(＝R_a)(R_b)R_c基团，其中R是亚烷基醚基团，R_a是O或S，R_b是OH、O^-、S^-、OR_d或SR_d；且R_c是-氧烷基或-氧烷基醚，其中R_d是反离子(例如，Na⁺等)，且条件是：R_a是S或R_b是S^-或SR_d；或者条件是R_a是S且R_b是S^-或SR_d。除非在本说明书中另外声明，否则烷基醚硫代二氧磷基是任选取代的。例如，在某些实施方案中，烷基醚硫代二氧磷基中的烷基或烷基醚部分任选被以下一种或多种取代基取代：羟基、氨基、硫氢基、磷酸酯、硫代磷酸酯、二氧磷基烷基、硫代二氧磷基烷基、二氧磷基烷基醚或硫代二氧磷基烷基醚，所述取代基也是任选取代的。

“氧烷基醚硫代二氧磷基”是通过氧原子与分子剩余部分连接的烷基醚硫代二氧磷基。除非在本说明书中另外声明，否则氧烷基醚硫代二氧磷基可以是任选取代的。例如，在某些实施方案中，氧烷基醚硫代二氧磷基中的烷基或烷基醚部分任选被以下一种或多种取代基取代：羟基、氨基、硫氢基、磷酸酯、硫代磷酸酯、二氧磷基烷基、硫代二氧磷基烷基、二氧磷基烷基醚或硫代二氧磷基烷基醚，所述取代基也是任选取代的。

“酰胺基”指-NR_aR_b原子团，其中R_a和R_b独立地是H、烷基或芳基。除非在本说明书中另外声明，否则酰胺基是任选取代的。

“芳基”指包含氢、6至18个碳原子和至少一个芳环的烃环***基团。出于本发明的目的，芳基可以是单环状、双环状、三环状或四环状环***，其可以包括稠合或桥环***。芳基包括但不限于衍生自苯并苊(aceanthrylene)、苊烯、荧蒽(acephenanthrylene)、蒽、薁、苯、荧烷、芴、不对称引达省(as-indacene)、对称引达省(s-indacene)、茚满、茚、萘、非那烯(phenalene)、菲、七曜烯(pleiadene)、芘、和三亚苯的芳基。除非在本说明书中另外声明，否则术语“芳基”或前缀“ar-”(如“芳烷基”中)意在包括任选取代的芳基。

“芳氧基”指式-OR_a的基团，其中R_a是如上文定义的芳基，例如苯氧基等。除非在本说明书中另外声明，否则芳氧基可以是任选取代的。

“芳烷基”指式-R_b-R_c的基团，其中R_b是如上文定义的亚烷基链并且R_c是如上文定义的一种或多种芳基，例如，苄基、二苯甲基等。除非在本说明书中另外声明，否则芳烷基可以是任选取代的。

“氧芳烷基”是通过氧键与分子剩余部分连接的芳烷基。“ODMT”指通过O原子与分子其余部分连接的二甲氧基三苯甲基。除非在本说明书中另外声明，否则氧芳烷基是任选取代的。

“氰烷基”指包含至少一个氰基取代基的烷基。一个或多个-CN取代基可以在伯、仲或叔碳原子上。除非在本说明书中另外声明，否则氰烷基是任选取代的。

“环烷基”或“碳环状环”指仅由碳原子和氢原子组成的稳定非芳族单环状或多环状烃基，所述非芳族单环状或多环状烃基可以包括稠合或桥环***，具有3个至15个碳原子，优选地具有3个至10个碳原子，并且是饱和或不饱和的以及通过单键与分子的其余部分连接。单环状环烷基例如包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。多环状环烷基例如包括金刚烷基、降冰片基、萘烷、7,7-二甲基-双[2.2.1]庚基等。除非在本说明书中另外声明，否则环烷基可以是任选取代的。

“环烷基烷基”指式-R_bR_d的基团，其中R_b是如上文定义的亚烷基链并且R_d是如上文定义的环烷基。除非在本说明书中另外声明，否则环烷基烷基可以是任选取代的。

“多环的”指具有多于一个环的任何分子。这些环可以稠合、为螺环状或由一个或多个原子分隔(例如，通过非环接头连接)。

“螺环的”指其中两个环共有单个碳原子的多环分子。

“稠合的”指本文所述的与本发明化合物中的现有环结构稠合的任何环结构。当稠环是杂环基环或杂芳基环时，在变成稠合杂环基环或稠合杂芳基环组成部分的现有环结构上的任何碳原子可以由氮原子替换。

“卤代”或“卤素”指溴、氯、氟或碘。

“卤代烷基”指如上文定义的烷基，所述烷基由一个或多个如上文定义的卤素基团取代，例如，三氟甲基、二氟甲基、三氯甲基、2,2,2-三氟乙基、1.2-二氟乙基、3-溴-2-氟丙基、1,2-二溴乙基等。除非在本说明书中另外声明，否则卤代烷基可以是任选取代的。

如本文所用，“杂环基”或“杂环”指由2至12个碳原子和1至6个选自氮、氧和硫的杂原子组成的稳定3元至18元非芳族环基团。除非在本说明书中另外声明，否则杂环基可以是单环状、双环状、三环状或四环状环***，所述环***可以包括稠合或桥环***；并且杂环基中的氮、碳或硫原子可以任选地氧化；氮原子可以任选地季化；并且杂环基可以是部分或完全饱和的。这类杂环基的实例包括但不限于二氧戊环基、噻吩基[1.3]二噻烷基、十氢异喹啉基、咪唑啉基、咪唑烷基、异噻唑烷基、异唑烷基、吗啉基、八氢吲哚基、八氢异吲哚基、2-氧代哌嗪基、2-氧代哌啶基、2-氧代吡咯烷基、唑啉基、哌啶、哌嗪基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、吡唑烷基、奎宁环基、噻唑烷基、四氢呋喃基、三噻烷基、四氢吡喃基、硫代吗啉、硫吗啉基、1-氧代-硫代吗啉、和1,1-二氧代-硫代吗啉基。除非在本说明书中另外声明，否则杂环基可以是任选取代的。

“N-杂环基”指如上文定义的杂环基，所述杂环基含有至少一个氮并且其中杂环基与分子其余部分附接的点经过杂环基中的氮原子。除非在本说明书中另外声明，否则N-杂环基基可以是任选取代的。

“杂环基烷基”指式-R_bR_e的基团，其中R_b是如上文定义的亚烷基链并且R_e是如上文定义的杂环基，并且如果杂环基是含氮杂环基，则该杂环基可以与烷基在氮原子处连接。除非在本说明书中另外声明，否则杂环基烷基是任选取代的。

“杂芳基”指包含氢原子、1个至13碳原子、1个至6个选自氮、氧和硫的杂原子和至少一个芳环的5元至14元环***基团。出于本发明的目的，杂芳基可以单环状、双环状、三环状或四环状环***，所述环***可以包括稠合或桥环***；并且杂芳基中的氮、碳或硫原子可以任选地氧化；氮原子可以任选地季化。实例包括但不限于吖庚因基、吖啶基、苯并咪唑基、苯并噻唑、苯并吲哚基、苯并二氧杂环戊烯基、苯并呋喃基、苯并唑基、苯并噻唑、苯并噻二唑基、苯并[b][1,4]二氧杂环庚基、1,4-苯并二烷基、苯并萘呋喃基、苯并唑基、苯并二氧杂环戊烯基、二烯基、苯并吡喃基、苯并吡喃酮基、苯并呋喃基、苯并吡喃酮基、苯并噻吩基(苯并苯硫基)、苯并***基、苯并[4,6]咪唑并[1.2-a]吡啶基、咔唑基、噌啉基、二苯并呋喃基、二苯并噻吩基、呋喃基、呋喃酮基、异噻唑基、咪唑基、吲唑基、吲哚基、吲唑基、异吲哚基、二氢吲哚基、异二氢吲哚基、异喹啉基、吲嗪基、异唑基、萘啶基、二唑基、2-氧代吖庚因基、唑基、环氧乙烷基、1-氧化吡啶基、1-氧化嘧啶基、1-氧化吡嗪基、1-氧化哒嗪基、1-苯基-1H-吡咯、吩嗪基、吩噻嗪基、吩嗪基、酞嗪基、蝶啶基、嘌呤基、吡咯基、吡唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、喹唑啉基、喹啉基、喹啉基、奎宁环基、异喹啉基、四氢喹啉基、噻唑基、噻二唑基、***基、四唑基、三嗪基和苯硫基(即，噻吩基)。除非在本说明书中另外声明，否则杂芳基是任选取代的。

“N-杂芳基”指如上文定义的杂芳基，所述杂芳基含有至少一个氮并且其中杂芳基与分子其余部分附接的点经过杂芳基中的氮原子。除非在本说明书中另外声明，否则N-杂芳基是任选取代的。

“杂芳基烷基”指式-R_bR_f的基团，其中R_b是如上文定义的亚烷基链并且R_f是如上文定义的芳基。除非在本说明书中另外声明，否则杂芳基烷基可以是任选取代的。

“羟基烷基”指包含至少一个羟基取代基的烷基。一个或多个-OH取代基可以在伯、仲或叔碳原子上。除非在本说明书中另外声明，否则羟基烷基可以是任选取代的。

“羟基烷基醚”指包含至少一个羟基取代基的烷基醚基。一个或多个-OH取代基可以在伯、仲或叔碳原子上。除非在本说明书中另外声明，否则羟基烷基醚基可以是任选取代的。

“磷酸酯”指-OP(＝O)(R_a)R_b基团，其中R_a是OH、O^-或OR_c；并且R_b是OH、O^-、OR_c、又一个磷酸酯基团(如在二磷酸酯和三磷酸酯中)、硫代磷酸酯、二氧磷基烷基、硫代二氧磷基烷基、二氧磷基烷基醚或硫代二氧磷基烷基醚，其中R_c是反离子(例如，Na⁺等)。除非在本说明书中另外声明，否则磷酸酯基可以是任选取代的。

“二氧磷基”指-P(＝O)(R_a)R_b基团，其中R_a是OH、O^-或OR_c；并且R_b是OH、O^-、OR_c、磷酸酯基团(如在二磷酸酯和三磷酸酯中)、硫代磷酸酯、二氧磷基烷基、硫代二氧磷基烷基、二氧磷基烷基醚或硫代二氧磷基烷基醚，其中R_c是反离子(例如，Na⁺等)。除非在本说明书中另外声明，否则二氧磷基可以是任选取代的。

“二氧磷基烷基”指-P(＝O)(R_a)R_b基团，其中R_a是OH、O^-或OR_c；并且R_b是-氧烷基，其中R_c是反离子(例如，Na⁺等)。除非在本说明书中另外声明，否则二氧磷基烷基是任选取代的。例如，在某些实施方案中，二氧磷基烷基中的烷基部分任选被以下一种或多种取代基取代：羟基、氨基、硫氢基或磷酸酯、硫代磷酸酯、二氧磷基烷基、硫代二氧磷基烷基、二氧磷基烷基醚或硫代二氧磷基烷基醚，所述取代基是任选取代的。

“氧二氧磷基烷基”是通过氧原子与分子剩余部分连接的二氧磷基烷基。除非在本说明书中另外声明，否则氧二氧磷基烷基可以是任选取代的。例如，在某些实施方案中，氧二氧磷基烷基中的烷基部分任选被以下一种或多种取代基取代：羟基、氨基、硫氢基或磷酸酯、硫代磷酸酯、二氧磷基烷基、硫代二氧磷基烷基、二氧磷基烷基醚或硫代二氧磷基烷基醚，所述取代基是任选取代的。

“二氧磷基烷基醚”指-P(＝O)(R_a)R_b基团，其中R_a是OH、O^-或OR_c；并且R_b是-氧烷基(包括聚醚如聚氧化乙烯醚等)，其中R_c是反离子(例如，Na⁺等)。除非在本说明书中另外声明，否则二氧磷基烷基醚基团是任选取代的。例如，在某些实施方案中，二氧磷基烷基醚基团中的烷基醚部分任选被以下一种或多种取代基取代：羟基、氨基、硫氢基、磷酸酯、二氧磷基、硫代二氧磷基、硫代磷酸酯、二氧磷基烷基、硫代二氧磷基烷基、二氧磷基烷基醚或硫代二氧磷基烷基醚，所述取代基是任选取代的。

“氧二氧磷基烷基醚”是通过氧原子与分子剩余部分连接的二氧磷基烷基醚基团。除非在本说明书中另外声明，否则氧二氧磷基烷基醚基团是任选取代的。例如，在某些实施方案中，氧二氧磷基烷基醚基团中的烷基醚部分任选被以下一种或多种取代基取代：羟基、氨基、硫氢基、磷酸酯、二氧磷基、硫代二氧磷基、硫代磷酸酯、二氧磷基烷基、硫代二氧磷基烷基、二氧磷基烷基醚或硫代二氧磷基烷基醚，所述取代基是任选取代的。

“磷酰亚胺”指-OP(OR^a)(NR^b ₂)基团，其中R^a是烷基，且每个R^b独立地是H或烷基。除非在本说明书中另外声明，否则磷酰亚胺基团是任选取代的。

“激活的磷”指包含能够与亲核体反应(例如，在磷原子处与亲核体反应)的磷的任何部分。例如，磷酰亚胺和包含P-卤素键的部分被包括于激活的含磷部分的定义内。除非在本说明书中另外声明，否则激活的含磷基团是任选取代的。

“受保护的羟基”指羟基部分，其中H已经被保护基团可逆地替换。保护基团是本领域中熟知的。在某些实施方案中，受保护的羟基将是醚(例如，烷氧基、芳烷氧基或芳氧基)。受保护的羟基的非限制性的实例是二甲基三苯甲基醚。其他受保护的羟基部分是本领域中熟知的。除非在本说明书中另外声明，否则受保护的羟基基团是任选取代的。

“硫氢基烷基”指包含至少一个硫氢基取代基的烷基。一个或多个-SH取代基可以在伯、仲或叔碳原子上。除非在本说明书中另外声明，否则硫氢基烷基是任选取代的。

“硫氢基烷基醚”指包含至少一个硫氢基取代基的烷基醚基团。一个或多个-SH取代基可以在伯、仲或叔碳原子上。除非在本说明书中另外声明，否则硫氢基烷基醚基可以是任选取代的。

“磺酸酯”指-OS(O)₂R_a基团，其中R_a是烷基或芳基。除非在本说明书中另外声明，否则磺酸酯基是任选取代的。

“硫代烷基”指式-SR_a的基团，其中R_a是如上文定义的含有1个至12个碳原子的烷基。除非在本说明书中另外声明，否则硫代烷基是任选取代的。

“硫代磷酸酯”指-OP(＝R_a)(R_b)R_c基团，其中R_a是O或S，R_b是OH、O^-、S^-、OR_d或SR_d；并且R_c是OH、O^-、OR_d、磷酸酯基团、硫代磷酸酯、二氧磷基烷基、硫代二氧磷基烷基、二氧磷基烷基醚或硫代二氧磷基烷基醚，其中R_d是反离子(例如，Na⁺等)并且条件是：R_a是S或R_b是S^-或SR_d；或条件是R_a是S并且R_b是S^-或SR_d。除非在本说明书中另外声明，否则硫代磷酸酯基是任选取代的。

“硫代二氧磷基”指-P(＝R_a)(R_b)R_c基团，其中R_a是O或S，R_b是OH、O^-、S^-、OR_d或SR_d；并且R_c是OH、O^-、OR_d、磷酸酯基团、硫代磷酸酯、二氧磷基烷基、硫代二氧磷基烷基、二氧磷基烷基醚或硫代二氧磷基烷基醚，其中R_d是反离子(例如，Na⁺等)并且条件是：R_a是S或R_b是S^-或SR_d；或条件是R_a是S并且R_b是S^-或SR_d。除非在本说明书中另外声明，否则硫代二氧磷基是任选取代的。

“硫代二氧磷基烷基”指-P(＝R_a)(R_b)R_c基团，其中R_a是O或S，R_b是OH、O^-、S^-、OR_d或SR_d；并且R_c是-氧烷基，其中R_d是反离子(例如，Na⁺等)并且条件是：R_a是S或R_b是S^-或SR_d；或条件是R_a是S并且R_b是S^-或SR_d。除非在本说明书中另外声明，否则硫代二氧磷基烷基是任选取代的。例如，在某些实施方案中，硫代二氧磷基烷基中的烷基部分任选被以下一种或多种取代基取代：羟基、氨基、硫氢基、磷酸酯、硫代磷酸酯、二氧磷基烷基、硫代二氧磷基烷基、二氧磷基烷基醚或硫代二氧磷基烷基醚，所述取代基是任选取代的。

“氧硫代二氧磷基烷基”是通过氧原子与分子剩余部分连接的硫代二氧磷基烷基。除非在本说明书中另外声明，否则氧硫代二氧磷基烷基是任选取代的。例如，在某些实施方案中，氧硫代二氧磷基烷基中的烷基部分任选被以下一种或多种取代基取代：羟基、氨基、硫氢基、磷酸酯、硫代磷酸酯、二氧磷基烷基、硫代二氧磷基烷基、二氧磷基烷基醚或硫代二氧磷基烷基醚，所述取代基是任选取代的。

“硫代二氧磷基烷基醚”指-P(＝R_a)(R_b)R_c基团，其中R_a是O或S，R_b是OH、O^-、S^-、OR_d或SR_d；并且R_c是-氧烷基醚，其中R_d是反离子(例如，Na⁺等)并且条件是：R_a是S或R_b是S^-或SR_d；或条件是R_a是S和R_b是S^-或SR_d。除非在本说明书中另外声明，否则硫代二氧磷基烷基醚基是任选取代的。例如，在某些实施方案中，硫代二氧磷基烷基中的烷基醚部分任选被以下一种或多种取代基取代：羟基、氨基、硫氢基、磷酸酯、二氧磷基、硫代二氧磷基、硫代磷酸酯、二氧磷基烷基、硫代二氧磷基烷基、二氧磷基烷基醚或硫代二氧磷基烷基醚，所述取代基是任选取代的。

“氧硫代二氧磷基烷基醚是通过氧原子与分子剩余部分连接的硫代二氧磷基烷基醚基。除非在本说明书中另外声明，否则氧硫代二氧磷基烷基醚基是任选取代的。例如，在某些实施方案中，氧硫代二氧磷基烷基中的烷基醚部分任选被以下一种或多种取代基取代：羟基、氨基、硫氢基、磷酸酯、二氧磷基、硫代二氧磷基、硫代磷酸酯、二氧磷基烷基、硫代二氧磷基烷基、二氧磷基烷基醚或硫代二氧磷基烷基醚，所述取代基是任选取代的。

如本文所用的术语“取代的”意指任何上述基团(例如，烷基、亚烷基、烷氧基、烷基氨基、烷基醚、聚烷基醚、羟基聚烷基醚、氨基聚烷基醚、亚烷基醚、烷基二氧磷基、烷基醚二氧磷基、烷基硫代二氧磷基、烷基醚硫代二氧磷基、酰胺基、硫代烷基、芳基、芳氧基、芳烷基、氧芳烷基、氰基烷基、环烷基、环烷基烷基、卤代烷基、杂环基、N-杂环基、杂环基烷基、杂芳基、N-杂芳基、杂芳基烷基、羟基烷基、氨基烷基、羟基烷基醚、二氧磷基、二氧磷基烷基、二氧磷基烷基醚、磷酰亚胺、激活的磷、受保护的羟基、硫氢基烷基、硫氢基烷基醚、磺酸酯、硫代烷基、硫代二氧磷基、硫代二氧磷基烷基和/或硫代二氧磷基烷基醚)，其中至少一个氢原子由与非氢原子形成的键替换，所述非氢原子如，但不限于卤原子如F、Cl、Br和I；多种基团如羟基、烷氧基和酯基中的氧原子；多种基团如硫醇基、硫代烷基、砜基团、磺酰基和亚砜基团中的硫原子；多种基团如胺、酰胺、烷基胺、二烷基胺、芳基胺、烷基芳基胺、二芳基胺、N-氧化物、二酰亚胺和烯胺中的氮原子；多种基团如三烷基甲硅烷基、二烷基芳基甲硅烷基、烷基二芳基甲硅烷基和三芳基甲硅烷基中的硅原子；和多种其他基团中的其他杂原子。“取代的”还意指上述任一基团，其中一个或多个氢原子由与杂原子(如氧代、羰基、羧基和酯基中的氧；和多种基团如亚胺、肟、腙和腈中的氮)形成的更高级键替换(例如，双键或叁键)。例如，“取代的”包括其中一个或多个氢原子由-NR_gR_h、-NR_gC(＝O)R_h、-NR_gC(＝O)NR_gR_h、-NR_gC(＝O)OR_h、-NR_gSO₂R_h、-OC(＝O)NR_gR_h、-OR_g、-SR_g、-SOR_g、-SO₂R_g、-OSO₂R_g、-SO₂OR_g、＝NSO₂R_g和-SO₂NR_gR_h替换的上述任一基团。例如，“取代的”包括其中一个或多个氢原子由-C(＝O)R_g、-C(＝O)OR_g、-C(＝O)NR_gR_h、-CH₂SO₂R_g、-CH₂SO₂NR_gR_h替换的上述任一基团。在前述基团中，R_g和R_h是相同或不同的并且独立地是氢、烷基、烷氧基、烷基氨基、硫代烷基、芳基、芳烷基、环烷基、环烷基、卤代烷基、杂环基、N-杂环基、杂环基烷基、杂芳基、N-杂芳基和/或杂芳基烷基。“取代的”还意指上述任一基团，其中一个或多个氢原子由与氨基、氰基、羟基、亚胺基、硝基、氧代、硫代、卤素、烷基、烷氧基、烷基氨基、硫代烷基、芳基、芳烷基、环烷基、环烷基、卤代烷基、杂环基、N-杂环基、杂环基烷基、杂芳基、N-杂芳基和/或杂芳基烷基形成的键替换。此外，前述取代基的每一者也可以任选由一个或多个上述取代基取代。

“荧光”指能够吸收特定频率的光并发射不同频率的光的分子。荧光是本领域普通技术人员熟知的。

“有色”指吸收有色光谱(即，红色、黄色、蓝色等)内光的分子。

“接头”指至少一个原子(如碳、氧、氮、硫、磷及其组合)的连续链，所述连续链将分子的一部分连接至相同分子的另一个部分或连接至不同分子、部分或固相支持物(例如，微粒子)。接头可以经共价键或其他方式如离子相互作用或氢键相互作用连接分子。

为了本发明的目的，术语“生物分子”指多种生物物质的任一者，所述生物物质包括核酸、碳水化合物、氨基酸、多肽、糖蛋白、激素、适配体及其混合物。更具体地，该术语意在包括而不限于RNA、DNA、寡核苷酸、修饰或衍生化的核苷酸、酶、受体、朊病毒、受体配体(包括激素)、抗体、抗原和毒素，以及细菌、病毒、血细胞和组织细胞。如本文进一步描述，通过以下方式制备本发明的目视可检测生物分子(即，与生物分子连接的结构(I)的化合物)：使生物分子与具有反应基团的化合物接触，所述反应基团能够借助生物分子上的任何可用原子或官能团如氨基、羟基、羧基或硫氢基，使该生物分子与化合物连接。

术语“可视的”和“目视可检测的”在本文中用来指没有事先光照或化学激活或酶促激活情况下通过视检可观察的物质。这类目视可检测的物质在范围从约300nm至约900nm的光谱区吸收并发光。优选地，这类物质强烈有色，优选地具有至少约40,000、更优选地至少约50,000、仍然更优选地至少约60,000、仍更优选地至少约70,000和最优选地至少约80,000M^-1cm^-1的摩尔消光系数。可以通过用肉眼观察，或借助基于光学的检测装置，包括而不限于，吸收分光光度计、透射光学显微镜、数码照相机和扫描仪，检测到本发明的生物分子。目视可检测的物质不限于在可见光谱发射和/或吸收光的那些。“目视可检测的”物质的范围内还包括在紫外(UV))区(约10nm至约400nm)、红外(IR)区(约700nm至约1mm)发射和/或吸收光的物质和在其他电磁波谱区发射和/或吸收的物质。

为了本发明的目的，术语“光稳定的可视染料”指如上文所定义那样目视可检测并且暴露于光后没有显著改变或分解的化学部分。优选地，在暴露于光至少1小时后，光稳定的可视染料不显示明显的漂白作用或分解。更优选地，在暴露于光至少12小时、仍然更优选地至少24小时、然而仍更优选地至少1周和最优选地至少1个月后，可视染料是稳定的。适用于本发明化合物和方法中的光稳定可视染料的非限制性实例包含偶氮染料、硫靛蓝染料、喹吖啶酮颜料、二嗪、酞菁、芘酮(perinone)、二酮吡咯并吡咯、喹酞酮和truarycarbonium。

本发明的目视可检测生物分子可用于广泛类型的生物化学应用和生物医学应用，其中需要确定特定生物分子的存在、位置或量。在另一个方面，因此，本发明提供一种用于目视检测生物分子的方法，包括：(a)向生物***提供包含与生物分子连接的结构(I)的化合物的目视可检测生物分子；并且(b)通过其可视特性检测生物分子。为了本发明的目的，短语“通过其可视特性检测生物分子”意指在没有光照或化学激活或酶促激活的情况下用肉眼或借助基于光学的检测装置观察生物分子，所述检测装置包括而不限于吸收分光光度计、透射光学显微镜、数码照相机和扫描仪。光密度计可以用来对存在的目视可检测生物分子的量定量。例如，可以通过测量相对光学密度确定两份样品中生物分子的相对量。如果已知染料分子/生物分子的化学计量并已知染料分子的消光系数，则也可以从光学密度的测量值确定生物分子的绝对浓度。如本文所用，术语“生物***”用来指除目视可检测生物分子之外还包含一种或多种生物分子的任何溶液或混合物。这类生物***的非限制性实例包括细胞、细胞提取物、组织样品、电泳凝胶、分析混合物和杂交反应混合物。

“微粒子”指可用于与本发明化合物连接的众多小粒子的任一个，包括但不限于玻璃珠、磁珠、聚合物珠、非聚合物珠等。在某些实施方案中，微粒子包含聚苯乙烯，如聚苯乙烯珠。

本文公开的发明的实施方案还意在涵盖通过一个或多个原子由具有不同原子质量或质量数的原子替换而进行同位素标记的全部的结构(I)化合物。可以掺入所公开化合物的同位素的实例分别包括氢、碳、氮、氧、磷、氟、氯和碘的同位素，如²H、³H、¹¹C、¹³C、¹⁴C、¹³N、¹⁵N、¹⁵O、¹⁷O、¹⁸O、³¹P、³²P、³⁵S、¹⁸F、³⁶Cl、¹²³I和¹²⁵I。

同位素标记的结构(I)化合物通常可以通过本领域技术人员已知的常规技术或通过与下文和以下实施例中所述的那些相似的方法，使用适宜的同位素标记试剂而非先前所用的非标记试剂来制备。

“稳定化合物”和“稳定结构”意指这样的化合物，所述化合物充分稳健以承受从反应混合物分离至有用纯度和配制成有效治疗剂。

术语“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或环境可能出现或可能不出现，并且这种描述包括其中所述事件或环境出现的情况及其中它不出现的情况。例如，“任选取代的烷基”意指烷基可以是取代的或可以是未取代的并且该描述包括取代的烷基和没有取代的烷基。

“盐”包括酸加成盐和碱加成盐。

“酸加成盐”指与无机酸和与有机酸形成的那些盐，所述无机酸例如是但不限于氢氯酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等，所述有机酸例如是但不限于乙酸、2,2-二氯乙酸、己二酸、海藻酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰氨基苯甲酸、樟脑酸、樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、甲酸、延胡索酸、乳糖二酸、龙胆酸、葡庚糖酸、葡糖酸、葡糖醛酸、谷氨酸、戊二酸、2-氧代-戊二酸、甘油磷酸、乙醇酸、马尿酸、异丁酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、雄性酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、甲磺酸、黏酸、萘-1,5-二磺酸、萘-2-磺酸、1-羟-2-萘酸、尼克酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、帕莫酸、丙酸、焦谷氨酸、丙酮酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、硫氰酸、对-甲苯磺酸、三氟乙酸、十一烯酸等。

“碱加成盐”指从添加无机碱或有机碱至游离酸所制备的那些盐。衍生自无机碱的盐包括但不限于钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、铝盐等。衍生自有机碱的盐包括但不限于以下的盐：伯胺、仲胺和叔胺、取代胺(包括天然存在的取代胺)、环状胺和碱性离子交换树脂，如氨、异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙基、三丙基、二乙醇胺、乙醇胺、丹醇、2-二甲氨基乙醇、2-二乙基氨基、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、哈胺、胆碱、甜菜碱、苯乙苄胺、苄星、乙二胺、氨基葡萄糖、甲基葡糖胺、可可碱、三乙醇胺、氨丁三醇、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、多胺树脂等。特别优选的有机碱是异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己胺、胆碱和咖啡因。

经常，结晶产生本发明化合物的溶剂化物。本发明包括所描述化合物的全部溶剂化物。如本文所用，术语“溶剂化物”指包含一个或多个分子的本发明化合物与一个或多个分子的溶剂的聚集物。溶剂可以是水，在这种情况下溶剂化物可以是水合物。可选地，溶剂可以是有机溶剂。因此，本发明的化合物可以作为水合物存在，包括一水合物、二水合物、半水合物、倍半水合物、三水合物、四水合物等以及相应的溶剂化形式。本发明的化合物可以是真溶剂化物，而在其他情况下，本发明的化合物可以仅保留外来水或另一种溶剂或是水外加一些外来溶剂的混合物。

本发明的化合物或其盐、互变异构体或溶剂化物可以含有一个或多个非对称中心并且因此可以产生可以根据绝对立体化学定义相对于氨基酸而定义为(R)-或(S)-或定义为(D)-或(L)-定义的对映异构体、非对映异构体及其他立体异构形式。本发明意在包括全部这类可能的异构体以及其消旋形式和光学纯形式。光学活性的(+)和(-)、(R)-和(S)-或(D)-和(L)-异构体可以使用手性合成子或手性试剂制备，或使用常规技术例如色谱和分级结晶拆分。用于制备/分离各种对映异构体的常规技术包括从适合的光学纯前体中手性合成或例如使用手性高压液相色谱(HPLC)拆分消旋物(或盐或衍生物的消旋物)。当本文所述的化合物含有烯属双键或其他几何非对称性中心时并且除非另外说明指定，否则该化合物意在包括E和Z几何异构体。同样，还意在包括全部互变异构形式。

“立体异构体”指由不可互换的借助相同键键合、但具有不同三维结构的相同原子组成的化合物。本发明构思了多种立体异构体及其混合物并且包括“对映异构体”，所述对映异构体涉及其分子彼此是不可叠加镜像的两种立体异构体。

“互变异构体”指质子从分子的一个原子移动至同一分子的另一个原子。本发明包括任何所述化合物的互变异构体。化合物的多种互变异构形式可由本领域普通技术人员容易地衍生。

使用ACD/命名9.07版软件程序和/或ChemDraw Ultra 11.0版软件命名程序(CambridgeSoft)，本文所用的化学命名方案和结构简图是I.U.P.A.C.命名***的修改形式。还使用本领域普通技术人员熟悉的通用名。

如上文所示，在本发明的一个实施方案中，提供可用作各种分析方法中荧光染料和/或有色染料的化合物。化合物具有以下结构(I)：

或其盐、立体异构体或互变异构体，其中：

R^1a和R^1b各自独立地是羟基或烷氧基；且

R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ、R^2j、R^2k、R^2l、R^2m、R²ⁿ、R^2o、R^2p、R^2q、R^2r和R^2s各自独立地是H、卤素或-L¹-R³；

R³，在每次出现时，独立地是被以下中的一种或多种取代的分析物分子或烷基：羟基、受保护的羟基、氨基、烷基氨基、烷氧基、聚烷基醚、羟基烷氧基、氨基烷氧基、羟基聚烷基醚、氨基聚烷基醚、磷酸酯、硫代磷酸酯、二氧磷基、硫代二氧磷基、二氧磷基烷基醚、氧二氧磷基烷基醚、硫代二氧磷基烷基醚、氧硫代二氧磷基烷基醚、磷酰亚胺或激活的磷；或者R³是微粒子；且

L¹是任选的接头部分。

在一些其他实施方案中，所述化合物具有以下结构(Ia)或(Ib)之一：

在更多实施方案中，所述化合物具有以下结构(Ic)或(Id)之一：

在还有其他实施方案中，所述化合物具有以下结构(Ie)或(If)之一：

在上述的一些具体实施方案中，所述化合物具有结构(If)。

在各个实施方案中，R^1a或R^1b为羟基。在其他实施方案中，R^1a或R^1b为烷氧基。例如，在一些实施方案中，R^1a和R^1b各自为烷氧基。

在前述实施方案的一些中，烷氧基是C₁-C₆烷氧基，如甲氧基。

在任何前述实施方案的一些中，R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ、R^2j、R^2k、R^2l、R^2m、R²ⁿ、R^2o、R^2p、R^2q、R^2r或R^2s中的至少一者是H。

在前述实施方案的其他中，R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ、R^2j、R^2k、R^2l、R^2m、R²ⁿ、R^2o、R^2p、R^2q、R^2r或R^2s中的至少一者是卤素。在一些更具体实施方案中，R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g或R^2h中的至少一者是卤素，例如，在一些实施方案中，R^2b是卤素。在任何前述实施方案的一些中，卤素是溴。

在各个其他实施方案中，R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ、R^2j、R^2k、R^2l、R^2m、R²ⁿ、R^2o、R^2p、R^2q、R^2r或R^2s中的至少一者是-L¹-R³。例如，在一些实施方案中，R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g或R^2h中的至少一者是-L¹-R³。在更具体实施方案中，R^2b是-L¹-R³。

在还有其他实施方案中，R^2b是-L¹-R³且R^2a、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ、R^2j、R^2k、R^2l、R^2m、R²ⁿ、R^2o、R^2p、R^2q、R^2r和R^2s中的至少一者是H。

在一些实施方案中，R³，在每次出现时，独立地是被以下中的一种或多种取代的分析物分子或烷基：羟基、受保护的羟基、氨基、烷基氨基、烷氧基、聚烷基醚、羟基烷氧基、氨基烷氧基、羟基聚烷基醚、氨基聚烷基醚、磷酸酯、硫代磷酸酯、二氧磷基、硫代二氧磷基、二氧磷基烷基醚、硫代二氧磷基烷基醚、磷酰亚胺或激活的磷；或者R³是微粒子。在前述实施方案的一些中，所述二氧磷基烷基醚是氧二氧磷基烷基醚。在前述实施方案的其他中，所述硫代二氧磷基烷基醚是氧硫代二氧磷基烷基醚。

在前述实施方案的一些中，R³，在每次出现时，独立地是被以下中的一种或多种取代的烷基：羟基、受保护的羟基、氨基、烷基氨基、烷氧基、聚烷基醚、羟基烷氧基、氨基烷氧基、羟基聚烷基醚、氨基聚烷基醚、磷酸酯、硫代磷酸酯、二氧磷基、硫代二氧磷基、二氧磷基烷基醚、硫代二氧磷基烷基醚、磷酰亚胺或激活的磷。例如，在一些实施方案中，R³是被一种或多种选自以下的取代基取代的烷基：羟基、氨基、三苯甲基醚、磷酰亚胺、二氧磷基、二氧磷基烷基醚、磷酸酯和聚乙二醇。

在前述实施方案的一些中，R³，在每次出现时，独立地是被以下中的一种或多种取代的烷基：羟基、受保护的羟基、氨基、烷基氨基、烷氧基、聚烷基醚、羟基烷氧基、氨基烷氧基、羟基聚烷基醚、氨基聚烷基醚、磷酸酯、硫代磷酸酯、二氧磷基、硫代二氧磷基、二氧磷基烷基醚、氧二氧磷基烷基醚、硫代二氧磷基烷基醚、氧硫代二氧磷基烷基醚、磷酰亚胺或激活的磷。例如，在一些实施方案中，R³是被一种或多种选自以下的取代基取代的烷基：羟基、氨基、三苯甲基醚、磷酰亚胺、二氧磷基、二氧磷基烷基醚、氧二氧磷基烷基醚、磷酸酯和聚乙二醇。

在一些实施方案中，R³，在每次出现时，独立地是被一个或多个氧二氧磷基烷基醚取代的烷基。

例如，在上述的一些实施方案中，R³，在每次出现时，独立地是被一个或多个二氧磷基烷基醚基(如氧二氧磷基烷基醚基)取代的烷基，且所述聚烷基醚的烷基醚是聚烷基醚如乙二醇。在这些实施方案的一些中，所述二氧磷基烷基醚的烷基醚被取代基取代，所述取代基选自羟基和其他二氧磷基烷基醚部分，如其他氧二氧磷基烷基醚部分，其可以被羟基和/或氨基取代。

在其他实施方案中，R³，在每次出现时，独立地是被两个氧二氧磷基烷基醚基取代的烷基。在这些实施方案的一些中，所述烷基醚部分是聚烷基醚，如聚氧化乙烯。在这些实施方案的一些其他中，所述烷基醚部分被一个或多个取代基取代，所述取代基选自羟基、氨基和其他氧二氧磷基烷基醚部分，且所述其他氧二氧磷基烷基醚部分的烷基醚任选被羟基和/或氨基取代。

应当理解，结构(I)的化合物的一些实施方案包含两个或更多个R³基团。在这类实施方案中，R³基团可以相同或不同的。在某些实施方案中，结构(Ⅰ)的化合物包含单个R³基团，即，R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ、R^2j、R^2k、R^2l、R^2m、R²ⁿ、R^2o、R^2p、R^2q、R^2r或R^2s中的仅一者是-L¹-R³。

在任何前述的各个其他实施方案中，R³具有以下结构之一：

其中：

n¹、n²和n³各自独立地是1至6的整数；且

x和y各自独立地是1至10的整数。

在上述实施方案的一些中，n¹、n²和n³各自是1。在其他实施方案中，L¹不存在且R³直接连接至结构(I)的化合物的剩余部分。

在上述的一些其他实施方案中，x是5。在其他实施方案中，y是5。在一些更多实施方案中，x和y各自是5。

在一些不同的实施方案中，R³是分析物分子，如生物分子。在某些实施方案中，R³是选自核酸、氨基酸及其聚合物(例如，DNA、寡核苷酸、蛋白质、多肽等)的生物分子。

在还有其他实施方案中，R³是生物分子，且所述生物分子是核酸、肽、碳水化合物、脂质、酶、受体、受体配体、抗体、糖蛋白、适配体、抗原或朊病毒。

在一些不同的实施方案中，R³是选自药物、维生素和小分子的分析物分子。

在前述实施方案的一些中，接头L¹存在。当存在时，方便地选择L¹以提供R³和结构(I)的化合物的剩余部分之间的共价附接。示例性L¹部分包括，但不限于，O、N、S、P和亚烷基键及其组合。合适的L¹基团是本领域普通技术人员可衍生的。

在其他实施方案中，L¹不存在。

在一些实施方案中，当L¹存在时，L¹包含与分析物分子形成的磷酸酯键。在这些实施方案的一些中，L¹具有以下结构：

其中n¹、n²和n³各自独立地是1至6的整数。在各个其他实施方案中，n¹、n²和n³各自是1。

结构(I)的化合物的结构经选择以优化吸光度和或发射波长。因此，在各个实施方案中，结构(I)的化合物具有范围为约468nm至约508nm、例如约478nm至约498nm的最大吸光度。在其他实施方案中，结构(I)的化合物具有范围为约495nm至约525nm、例如约495nm至约515nm的最大发射。例如，在某些实施方案中，所述染料具有在约490nm处的最大吸光度和在约505nm处的最大发射。

在一些更具体实施方案中，结构(I)的化合物具有以下结构之一：

其中R³是分析物分子。

在各个其他实施方案中，本发明提供包含与具有以下结构(I')的化合物形成的共价键的分析物分子：

或其盐，其中：

R^1a和R^1b各自独立地是羟基或烷氧基；且

R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ、R^2j、R^2k、R^2l、R^2m、R²ⁿ、R^2o、R^2p、R^2q、R^2r和R^2s各自独立地是H、卤素或-L¹-R³；

R³是分析物分子；且

L¹是任选的接头部分，

其中R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ、R^2j、R^2k、R^2l、R^2m、R²ⁿ、R^2o、R^2p、R^2q、R^2r或R^2s中的至少一者是-L¹-R³。

所述分析物分子可以选自任何适当的分析物分子，包括本文上述的分析物分子。

在各个其他实施方案中提供包含前述任一化合物和一种或多种生物分子的组合物。在一些实施方案中，还提供这类组合物在检测一种或多种生物分子的分析方法中的用途，如下文更详细描述。

可以理解，如上所述的结构(I)化合物的任何实施方案和本文对如上所述的结构(I)化合物中R^1a、R^1b、R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ、R^2j、R^2k、R^2l、R^2m、R²ⁿ、R^2o、R^2p、R^2q、R^2r、R^2s、L¹或R³变量所述的任何具体选择可以独立地与其他实施方案和/或结构(I)化合物的变量组合以形成上文没有具体描述的本发明实施方案。此外，在一个具体实施方案和/或权利要求中针对任何特定R或L基团列出一系列选择的情况下，可以理解，每种独立选择可以从该具体实施方案和/或权利要求删除并且剩余选择的列表将视为处于本发明的范围内。

可以理解，在本说明书中，允许所述式的取代基和/或变量的组合，只要这类组合产生稳定的化合物。

本领域技术人员还将领会，在本文所述的方法中，中间化合物的官能团可能需要由合适的保护基保护。这类官能团包括羟基、氨基、巯基和羧酸。羟基的合适保护基包括三烷基甲硅烷基或二芳基烷基甲硅烷基(例如，叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基或三甲基甲硅烷基)、四氢吡喃基、苄基等。氨基、脒基和胍基的合适保护基包括叔丁氧基羰基、苯甲氧基羰基等。巯基的合适保护基包括-C(O)-R”(其中R”是烷基、芳基或芳基烷基)，对甲氧基苄基、三苯甲基等。羧酸的合适保护基包括烷基、芳基或芳基烷基酯。可以根据本领域技术人员已知和如本文所述的标准技术添加或移除保护基。保护基的用途是在Green,T.W.和P.G.M.Wutz,Protective Groups in Organic Synthesis(1999),第3版,Wiley中详述。如本领域技术人员将领会，保护基也可以是聚合物树脂如Wang树脂、Rink树脂或2-氯三苯甲基氯脂。

另外，可以借助本领域技术人员已知方法通过用适宜的无机碱或酸或有机碱或酸处理，将本发明的以游离碱或酸形式存在的全部化合物转化成它们的盐。可以通过标准技术，将本发明化合物的盐转化成它们的游离碱或酸形式。

以下反应方案说明制备本发明的化合物(即，结构(I)的化合物)的示例性方法：

其中R^1a、R^1b、R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ、R^2j、R^2k、R^2l、R^2m、R²ⁿ、R^2o、R^2p、R^2q、R^2r和R^2s如上面所定义。

可以理解，本领域技术人员可能通过相似的方法或通过组合本领域技术人员已知其他方法，能够产生这些化合物。还应当理解，通过使用适宜的起始组分并根据需要修改合成的参数，本领域技术人员将能够以如下文描述的相似方式产生下文没有具体描述的其他的结构(I)化合物。通常而言，起始组分可以从多种来源如Sigma Aldrich、LancasterSynthesis,Inc.、Maybridge、Matrix Scientific、TCI和Fluorochem USA等获得或根据本领域技术人员已知的来源(参见，例如，Advanced Organic Chemistry:Reactions,Mechanisms,and Structure,第5版(Wiley,December 2000)合成或如本发明中所述那样制备。

反应方案I

反应方案I显示了用于制备结构I的化合物的示例性方法。参考反应方案1，结构A和B的化合物可以买到或通过本领域普通技术人员熟知的方法制备。用强碱如正丁基锂处理2个当量的A、随后与B反应导致产生结构(I)的化合物。尽管反应方案I描绘结构(I)的对称(即，相同的萘基)化合物的制备，但对于本领域普通技术人员将显而易见的是，结构(I)的其他、非对称的化合物可以通过类似的方法(例如，不同取代的的萘基的逐步反应)来制备。

进一步，通过上述方法获得的结构(I)的化合物可以进一步修饰，以获得结构(I)的不同的化合物。例如，在某些实施方案中，结构(I)的化合物包含至少一个部分。在这类实施方案中，-L¹-R³部分或其前体可以经由任何熟知的方法如Suzuki偶联来安装。分析物分子(例如，生物分子)可以经由任选的L¹接头通过许多常见方法中的任一种来附接。例如，对上述方案的修改以包括能够与分析物分子上的官能团形成共价键的反应性基团是用于附接分析物分子的一种方式。反应性基团包括，但不限于激活的磷化合物(例如，磷酰亚胺)、激活酯、胺、醇等。用于制备这类化合物和使其与分析物分子反应以形成共价键的方法是本领域中熟知的。

在一些实施方案中，结构(I)的化合物包含与寡核苷酸形成的共价键。这类键可以通过在结构(I)的化合物中包括磷酰亚胺基团且在标准DNA合成条件下使其与寡聚体(或磷酰亚胺单体)反应而形成。DNA合成方法是本领域熟知的。简而言之，两个醇基团分别用二甲氧基三苯甲基(DMT)基团和2-氰基乙基-N,N-二异丙基氨基磷酰亚胺基团官能化。磷酰亚胺基团与醇基团一般在激活物如四唑存在下偶联，随后用碘氧化磷原子。二甲氧基三苯甲基可以用酸(例如，氯乙酸)移除以暴露游离醇，所述游离酸可以与磷酰亚胺基反应。2-氰基乙基可以在寡聚化后通过用氨水处理移除。

寡聚化方法中所用的磷酰亚胺的制备也是本领域熟知的。例如，伯醇可以通过与DMT-Cl反应作为DMT基团受到保护。随后通过与适宜试剂如2-氰基乙基N,N-二异丙基氯磷酰亚胺反应，仲醇官能化为磷酰亚胺。用于制备磷酰亚胺及其寡聚化的方法是本领域熟知并且在实施例中更详细地描述。

在还有其他实施方案中，所述化合物可用于各种分析方法中。例如，在某些实施方案中，本公开提供一种用于对样品进行染色的方法，所述方法包括向所述样品以足够在所述样品以适宜波长照亮时产生光学响应的量添加结构(I)的化合物。

在前述方法的还有其他实施方案中，R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ、R^2j、R^2k、R^2l、R^2m、R²ⁿ、R^2o、R^2p、R^2q、R^2r或R^2s之一是-L¹-R³，其中R³是分析物分子，如生物分子。例如，在一些实施方案中，所述生物分子是核酸、氨基酸或其聚合物(例如，多核苷酸或多肽)。在还有更多实施方案中，所述生物分子是酶、受体、受体配体、抗体、糖蛋白、适配体或朊病毒。

在前述方法的还有其他实施方案中，R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ、R^2j、R^2k、R^2l、R^2m、R²ⁿ、R^2o、R^2p、R^2q、R^2r或R^2s之一是-L¹-R³，其中R³是微粒子。例如，在一些实施方案中，所述微粒子是聚合珠或非聚合珠。

在甚至更多实施方案中，所述光学响应是荧光响应。

在其他实施方案中，所述样品包含细胞，并且一些实施方案进一步包括通过流式细胞术观察所述细胞。

在还有更多实施方案中，所述方法进一步包括将所述荧光响应与具有可检测不同的光学特性的第二荧光团的荧光响应区分开来。

在其他实施方案中，本公开提供一种用于目视检测生物分子的方法，其包括：

(a)提供结构(I)的化合物，其中R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ、R^2j、R^2k、R^2l、R^2m、R²ⁿ、R^2o、R^2p、R^2q、R^2r或R^2s之一是-L¹-R³，其中R³是生物分子；和

(b)通过其可视特性检测化合物。

例如，在一些实施方案中，所述生物分子是核酸、氨基酸或其聚合物(例如，多核苷酸或多肽)。在还有更多实施方案中，所述生物分子是酶、受体、受体配体、抗体、糖蛋白、适配体或朊病毒。

在其他实施方案中，提供一种用于目视检测生物分子的方法，所述包括：

(a)将任何前述化合物与一种或多种生物分子混合；和

(b)通过其可视特性检测化合物。

如上所示，结构(I)的化合物的某些实施方案包含分析物分子(例如，生物分子)或与之附接(缀合)的配体。附接可以是，例如，通过共价键合、离子键合、注有日期的键合(dated bonding)、氢键合和其他形式的分子键合。

几种类型的分析物分子适合于缀合至结构(I)的化合物。例如，有用的本发明的缀合的底物包括，但不限于，包含与之附接的分析物分子的结构(I)的化合物(本文也称为“缀合的底物”)，所述分析物分子选自抗原、小分子、类固醇、维生素、药物、半抗原、代谢物、毒素、环境污染物、氨基酸、肽、蛋白质、光敏剂、核苷酸、寡核苷酸、核酸、碳水化合物、脂质、离子-络合部分和非生物聚合物。在一个示例性实施方案中，缀合的底物是天然或合成的氨基酸，天然或合成的肽或蛋白质，或离子-络合部分。示例性肽包括，但不限于蛋白酶底物、蛋白激酶底物、磷酸酶底物、神经肽、细胞因子和毒素。示例性蛋白缀合物包括酶、抗体、凝集素、糖蛋白、组蛋白、白蛋白、脂蛋白、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、蛋白A、蛋白G、酪蛋白、藻胆蛋白、其他荧光蛋白、激素、毒素、生长因子等。

分析物分子与结构(I)的化合物的剩余部分的连接点可以且将根据实施方案而变化。此外，一些实施方案包括分析物分子和结构(I)的化合物的剩余部分之间的接头(L¹)，尽管使用的接头是任选的，并且不是所有实施方案中都是必需的。还预想结构(I)的化合物可以包含多于一个分析物分子。例如，两个、三个或多于三个分析物分子可以缀合至化合物(I)的萘基和/或蒽环。

将染料连接至各种类型的分析物分子的几种方法是本领域中熟知的。例如，用于将染料缀合至分析物分子的方法描述于R.Haugland,The Handbook：A Guide toFluorescent Probes and Labeling Technologies,第9版,2002,Molecular Probes,Inc.和其中引用的文献；和Brindley,1992,Bioconjugate Chem.3:2，其通过引用全部并入本文。通过实例的方式，本公开的化合物可以包括经由一个或多个嘌呤或嘧啶碱基通过酰胺、酯、醚或硫醚键至DNA或RNA的共价键；或通过作为酯、硫酯、酰胺、醚或硫醚的键附接至磷酸酯或碳水化合物。或者，结构(I)的化合物可以通过化学后修饰(如用铂试剂)或使用光可激活的分子(如缀合的补骨脂素)结合至核酸。

本发明的化合物可用于许多应用，包括美国专利号7,172,907；5,268,486；和美国专利申请号20040014981；和20070042398(其中所有都以其整体通过引用并入本文)中对于其他染料描述的那些。例如，荧光染料，如本文所述的那些，可用于用技术成像，所述技术如基于荧光检测(包括但不限于荧光寿命、各向异性、光诱导的电子转移、光漂白恢复和非放射性转移)的那些。因此，结构(I)的化合物，可用于所有基于荧光的成像，显微镜和光谱技术，包括其变型。此外，它们也可用于光动力疗法和多模式成像中。示例性荧光检测技术包括涉及在***内检测产生的荧光的那些。这类技术包括，但不限于，荧光显微镜，荧光激活的细胞分选(FACS)，荧光流式细胞术，荧光关联光谱(FCS)，荧光原位杂交(FISH)，多光子成像，扩散光学断层成像，细胞和组织中的分子成像，具有一纳米精度的荧光成像(FIONA)，自由基引发的肽测序(FRIP)，和膜电位的二次谐波视网膜成像(SHRIMP)，以及本领域中已知的其他方法。

或者，结构(I)的化合物可以用作追踪活细胞中的动态行为的标记物或标签。在这方面，光漂白后的荧光恢复(FRAP)可以与本化合物组合使用以便用高强度激光选择性破坏感兴趣的区域内的荧光分子，随后用低强度激光经一段时间监测新荧光分子至漂白区域内的恢复。FRAP的变体包括，但不限于，偏振FRAP(pFRAP)，光漂白中的荧光损失(FLIP)，和光漂白后的荧光定位(FLAP)。从FRAP和FRAP的变体得到的信息可以用于确定荧光标记的分子的动力学特性，包括扩散系数、移动分数和转运速率。基于这类光漂白技术的方法描述于Braeckmans,K.等人,Biophysical Journal 85:2240-2252,2003；Braga,J.等人,Molecular Biology of the Cell 15:4749-4760,2004；Haraguchi,T.,Cell Structureand Function 27:333-334,2002；Gordon,G.W.等人,Biophysical Journal 68:766-778,1995，其都以其整体通过引用并入本文。

其他荧光成像技术基于非放射性能量转移反应，其为供体和受体之间的能量转移的均匀发光测定法。可以采用本荧光染料的使用的这类技术包括，但不限于，FRET、FET、FP、HTRF、BRET、FLIM、FLI、TR-FRET、FLIE、smFRET和SHREK。这些技术都是FRET的变型。

本化合物可以用作生物传感剂，如Ca²⁺离子指示剂；pH指示剂；磷酸化指示剂，或其他离子(例如，镁、钠、钾、氯和卤化物)的指示剂。例如，生化过程经常涉及生物分子的质子化和去质子化，伴随环境pH的变化。用不同pH敏感的基团在中位位置处的取代产生各种具有不同pKa的NIR荧光pH传感剂。为了有效，在间位的取代将与荧光团核心处于扩展的π缀合，以实现响应于不同pH环境的显著的光谱变化。

公开的化合物的使用决不限于分析方法。在各个实施方案中，所述化合物用作各种应用中的着色剂或染料。在这方面，核心蒽和/或萘基部分上的取代基没有特别限制，只要所述化合物维持其期望的颜色和/或吸光度和/或发射特性。用于该目的的适当取代基的选择在本领域普通技术人员的技术内。因此，在一些实施方案中，提供具有以下结构(I")的可用作染料或着色剂的化合物：

或其盐，其中R^1a、R^1b、R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ、R^2j、R^2k、R²¹、R^2m、R²ⁿ、R^2o、R^2p、R^2q、R^2r和R^2s各自独立地是H或取代基，所述取代基基于该化合物的期望的颜色和或发射/吸光度特性进行选择。

在结构(I")的化合物的某些实施方案中，R^1a和R^1b各自独立地是羟基或烷氧基；且R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ、R^2j、R^2k、R²¹、R^2m、R²ⁿ、R^2o、R^2p、R^2q、R^2r和R^2s各自独立地是H、卤素或烷基。

在一些实施方案中，本文公开的化合物(例如，(I)、(I’)和/或(I"))可用作纺织品、塑料、油漆和/或安全装置(例如，反光材料、应急灯、荧光棒等)中的染料或着色剂。本领域普通技术人员将容易地认识到所公开的化合物的其他用途。

提供以下实施例用于说明目的而非限制。

实施例

一般方法

在JEOL 400MHz分光光度计上获得¹H NMR谱。¹H谱针对TMS进行参考。使用具有保持在45℃的2.1mm x 50mm Acquity BEH-C18柱的Waters Acquity UHPLC***进行反相HPLC染料分析。使用MassLynx 4.1采集软件，在Waters/Micromass Quattro micro MS/MS(仅以MS模式)***上进行质谱分析。用于LC/MS染料上的流动相是100mM 1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(HFIP)，8.6mM三乙胺(TEA)，pH 8。使用具有二极管阵列探测器的Agilent Infinity1260 UHPLC***和高效自动采样器使用 Spirit^TM肽C18柱(4.6mmx100mm，5μm粒度)分析，磷酰亚胺和前体分子。使用阳离子输注增强电离获得单体中间体的分子量。在Cary Eclipse光谱光度计上记录激发曲线和发射曲线。

除非另外声明，否则全部反应均在烘箱干燥的玻璃器具中氮气氛下实施。市售DNA合成试剂购自Glen Research(Sterling,VA)。无水吡啶、甲苯、二氯甲烷、二异丙基胺、三乙胺、乙酸、吡啶和THF购自Aldrich。全部其他化学品均购自Aldrich或TCI并且原样使用，不作额外纯化。

实施例1

2-溴-9,10-双((6-甲氧基萘-1-基乙炔基)蒽(1)的合成

干净、干燥的200mL圆底烧瓶用氮气和无水THF(40mL)冲洗。添加l-乙炔基-6-甲氧基萘(2.0g,10.9mmol)，然后将烧瓶在丙酮干冰浴中在氮气氛下冷却30分钟。冷却后，逐滴添加nBuLi 2.5M的己烷溶液(4.4mL,10.9mmol)，并使反应物搅拌1小时。添加2-溴蒽醌(1.05g,3.6mmol)和***(30mL)，其后使反应物温热至室温并搅拌过夜。然后以一份添加0.1M SnC12于1M HC1(44mL)中的溶液。2小时之后，将反应混合物倒入甲醇(200mL)，并将所得浆料搅拌一小时。红色固体通过过滤分离并在真空下干燥(1.15g,51％)。

化合物1的¹H NMR谱描绘于图1中。化合物的215-500nm处的RP总二极管阵列色谱图描绘于图2中。化合物1的质谱描绘于图3中。

实施例2

3-(9,10-双((6-甲氧基萘-1-基)乙炔基)蒽-2-基)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)丙-1-醇(2)的合成

装备有冷凝器的250mL圆底烧瓶用氮气和无水THF(50mL)冲洗，随后添加2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)丙-2-烯-l-醇(2.2g,5.6mmol)。经由注射器添加9-BBN 0.5M的THF溶液(30.7mL,14.0mmol)，并且将反应物加热至回流12小时。使反应冷却至室温之后，添加3M K₂CO₃(2.4ml)和无水THF(150mL)。添加化合物1(1.74g,2.8mmol)和PdCl₂(dppf)(0.41g,0.56mmol)，并将溶液回流6小时，并使其经两小时冷却至室温。将反应混合物倒入CH₂Cl₂(300mL)并用H₂O(300mL)洗涤。将水层用额外的CH₂Cl₂(100mL)回萃取。将合并的有机层用饱和NaCl(300mL)洗涤，经Na₂SO₄干燥，并在真空中浓缩至粘稠胶状物。然后将分离的粗产物洗涤，通过硅胶柱色谱纯化，用CH₂Cl₂:己烷(100:0v/v)-(0:100v/v)的梯度洗脱，得到作为红色固体的3(1.0g,35％)。化合物2的⁴H NMR谱描绘于图4中。化合物的215-500nm处的总二极管阵列色谱图描绘于图5中。化合物2的质谱描绘于图6中。

实施例3

3-(9,10-双((6-甲氧基萘-1-基)乙炔基)蒽-2-基)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)丙基2-氰基乙基二异丙基磷酰亚胺(3)的合成

干燥100mL圆底烧瓶用氮气冲洗，随后添加CH₂Cl₂(20mL)和化合物3(0.20g,0.21mmol)。经由注射器添加N,N-二异丙基乙胺(0.18mL,10.7mmol)和2-氰基乙基二异丙基氯磷酰亚胺(0.15mL,0.6mmol)。在室温搅拌1小时之后，通过TLC分析确定反应完成。然后将粗反应混合物在真空中浓缩为黑色胶状物。将残余物溶解于乙腈中并浓缩至干燥，并且不经进一步纯化即用于染料组装。

实施例4

寡核苷酸染料的合成

化合物3用于在Applied Biosystems 394 DNA/RNA合成仪上以1μmol规模合成其他染料化合物。所述化合物包含3'-磷酸酯基团。染料直接在CPG珠上或在聚苯乙烯固相支持物上合成。染料以3’至5’方向通过标准固相DNA方法合成。偶联方法使用标准β-氰基乙基磷酰亚胺化学条件。全部磷酰亚胺单体均溶解于乙腈/二氯甲烷(0.1M溶液)中，并且使用以下合成循环，连续添加：1)用甲苯中的二氯乙酸移除5’-二甲氧基三苯甲基保护基，2)用乙腈中的激活试剂偶联下一个磷酰亚胺，3)用碘/吡啶/水氧化，和4)用乙酸酐/1-甲基咪唑/乙腈封端。重复合成循环直至5’寡聚氟苷(Oligofloroside)装配。在链装配结束时，用二氯甲烷中的二氯乙酸或甲苯中的二氯乙酸移除单乙氧基三苯甲基(MMT)基团或二甲氧基三苯甲基(DMT)基团。在室温使用浓氨水2-4小时，从固相支持物切下染料。在真空中浓缩产物且使用Sephadex G-25柱以分离主要产物，所述主要产物给出RP-HPLC痕迹，如图7(化合物5)中所示。图8显示根据上述程序(化合物5)制备的染料质谱数据。根据上述一般程序通过将化合物3偶联至支持物、随后标准切割和脱保护而制备化合物4。

示例性化合物的结构、光谱特性和通过电喷雾质谱测定的分子量(MW)呈现于表1中。

表1.代表性中间体和寡核苷酸染料序列及其观察到的质量和光学特性。

本说明书中所参考的全部美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利公开，包括2014年1月16日提交的美国临时专利申请序列号61/928,147，通过引用方式完整并入本文到并非与本说明书不一致的程度。

从前文，可以理解尽管已经出于说明目的在此描述了本发明的具体实施方案，但是可以在不偏离发明精神和范围的情况下做出多种修改。因此，本发明不受除所附权利要求书之外的限制。

Claims (15)

1.具有以下结构(I)的化合物：

或其盐、立体异构体或互变异构体，其中：

R^1a和R^1b各自独立地是羟基或烷氧基；且

R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ、R^2j、R^2k、R^2l、R^2m、R²ⁿ、R^2o、R^2p、R^2q、R^2r和R^2s各自独立地是H、卤素或-L¹-R³；

R^2t是H；

R³，在每次出现时，独立地是分析物分子或烷基，其中所述分析物分子或烷基被以下中的一种或多种取代：羟基、受保护的羟基、氨基、烷基氨基、烷氧基、聚烷基醚、羟基烷氧基、氨基烷氧基、羟基聚烷基醚、氨基聚烷基醚、磷酸酯、硫代磷酸酯、二氧磷基、硫代二氧磷基、二氧磷基烷基醚、氧二氧磷基烷基醚、硫代二氧磷基烷基醚、氧硫代二氧磷基烷基醚、亚磷酰胺或激活的磷；或者R³是微粒子；且

L¹是任选的接头部分。

2.权利要求1的化合物，其中所述化合物具有以下结构(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)之一：

3.权利要求2的化合物，其中所述化合物具有结构(If)。

4.权利要求1-3中任一项的化合物，其中

a)R^1a或R^1b是羟基；

b)R^1a或R^1b是烷氧基；

c)R^1a和R^1b是烷氧基；

d)R^1a或R^1b、或两者是烷氧基，并且烷氧基是C₁-C₆烷氧基；

e)R^1a或R^1b、或两者是烷氧基，并且烷氧基是甲氧基。

5.权利要求1-3中任一项的化合物，其中:

a)R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ、R^2j、R^2k、R^2l、R^2m、R²ⁿ、R^2o、R^2p、R^2q、R^2r或R^2s中的至少一者是H；

b)R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ、R^2j、R^2k、R^2l、R^2m、R²ⁿ、R^2o、R^2p、R^2q、R^2r或R^2s中的至少一者是卤素；

c)R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g或R^2h中的至少一者是卤素；

d)R^2b是卤素；或者

e)R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ、R^2j、R^2k、R^2l、R^2m、R²ⁿ、R^2o、R^2p、R^2q、R^2r或R^2s中的至少一者是卤素；R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g或R^2h中的至少一者是卤素；或者R^2b是卤素，并且卤素是溴。

6.权利要求1-3中任一项的化合物，其中：

a)R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ、R^2j、R^2k、R^2l、R^2m、R²ⁿ、R^2o、R^2p、R^2q、R^2r或R^2s中的至少一者是-L¹-R³；

b)R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g或R^2h中的至少一者是-L¹-R³；

c)R^2b是-L¹-R³；或者

d)R^2b是-L¹-R³；并且R^2a、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ、R^2j、R^2k、R^2l、R^2m、R²ⁿ、R^2o、R^2p、R^2q、R^2r和R^2s是H。

7.权利要求6的化合物，其中：

a)R³，在每次出现时，独立地是被以下基团中的一种或多种取代的烷基：羟基、受保护的羟基、氨基、烷基氨基、烷氧基、聚烷基醚、羟基烷氧基、氨基烷氧基、羟基聚烷基醚、氨基聚烷基醚、磷酸酯、硫代磷酸酯、二氧磷基、硫代二氧磷基、二氧磷基烷基醚、氧二氧磷基烷基醚、硫代二氧磷基烷基醚、氧硫代二氧磷基烷基醚、亚磷酰胺或激活的磷；

b)R³，在每次出现时，独立地是被一种或多种选自以下的取代基取代的烷基：羟基、氨基、三苯甲基醚、亚磷酰胺、二氧磷基、二氧磷基烷基醚、氧二氧磷基烷基醚、磷酸酯和聚乙二醇；

c)R³，在每次出现时，独立地是被一个或多个氧二氧磷基烷基醚取代的烷基；或者

d)R³，在每次出现时，独立地是以下结构之一：

其中：

n¹、n²和n³各自独立地是1至6的整数；且

x和y各自独立地是1至10的整数。

8.权利要求6的化合物，其中R³，在每次出现时，独立地是分析物分子。

9.权利要求8的化合物，其中：

a)所述分析物分子是生物分子；

b)所述分析物分子是生物分子，并且所述生物分子是核酸、氨基酸或其聚合物；

c)所述分析物分子是生物分子，并且所述生物分子是核酸、肽、碳水化合物、脂质、酶、受体、受体配体、抗体、糖蛋白、适配体、抗原或朊病毒；或者

d)所述分析物分子是药物、维生素或小分子。

10.权利要求8或9的化合物，其中：

a)L¹存在；

b)L¹包含与所述分析物分子形成的磷酸酯键；或者

c)L¹具有以下结构：

其中n¹、n²和n³各自独立地是1至6的整数。

11.权利要求1的化合物，其中所述化合物具有以下结构之一：

其中R³是分析物分子。

12.分析物分子，其包含与具有以下结构(I')的化合物形成的共价键：

或其盐，其中：

R^1a和R^1b各自独立地是羟基或烷氧基；且

R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ、R^2j、R^2k、R^2l、R^2m、R²ⁿ、R^2o、R^2p、R^2q、R^2r和R^2s各自独立地是H、卤素或-L¹-R³；

R^2t是H；

R³，在每次出现时，是分析物分子；且

L¹是任选的接头部分，

其中R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ、R^2j、R^2k、R^2l、R^2m、R²ⁿ、R²°、R^2p、R^2q、R^2r或R^2s中的至少一者是-L¹-R³。

13.权利要求12的分析物分子在制备用于在对样品进行染色的方法中使用的试剂中的用途，所述方法包括向所述样品以足够在以适宜波长照射所述样品时产生光学响应的量添加权利要求12的分析物分子。

14.权利要求12的化合物在制备用于在用于目视检测分析物分子的方法中使用的试剂中的用途，所述方法包括：

(a)提供权利要求12的化合物；并且

(b)通过其可视特性检测所述化合物。

15.权利要求1-12中任一项的化合物在制备用于在用于目视检测生物分子的方法中使用的试剂中的用途，所述方法包括：

(a)将权利要求1-12中任一项的化合物与一种或多种生物分子混合；并且

(b)通过其可视特性检测所述化合物。