CN105861736B - miRNA在子宫内膜癌诊疗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了miRNA在子宫内膜癌诊疗中的应用，所述miRNA为miRNA‑3926‑1。通过检测miRNA‑3926‑1的表达水平可用于诊断子宫内膜癌。本发明公开了miRNA‑3926‑1在制备子宫内膜癌诊断试工具中的应用，同时公开了miRNA‑3926‑1在制备治疗子宫内膜癌的药物中的应用。

Description

miRNA在子宫内膜癌诊疗中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及miRNA在子宫内膜癌诊疗中的应用，具体地涉及miRNA-3926-1

背景技术

子宫内膜癌是女性中常见的生殖***三大恶性肿瘤之一，在欧美地区发病率和死亡率较高。2010年，仅在美国就增加约43470例新发病例，其中7950例死亡，发病率高居妇科恶性肿瘤之首。子宫内膜癌在我国妇科恶性肿瘤中的发病率仅次于***，居第二位。子宫内膜癌好发于围绝经期妇女，合并肥胖、糖尿病、高血压、未曾生育者以及长期不***者皆是高危险族群，其中超过86％的病人年龄在50岁以上。随着高血压、冠心病、肥胖、糖尿病和代谢综合征等高危因素疾病发病率的提高以及人们饮食结构的渐行改变，该病发病率逐年增高且发病年龄年轻化。

miRNAs是一类长度为18-25个核苷酸的非编码小RNA分子，其序列在物种间高度保守，它们通过结合靶信使RNA的3’非翻译区，引起靶mRNA失活和/或转录后抑制，从而调控靶基因表达。研究发现，miRNAs在许多肿瘤中普遍失调，它们通过影响肿瘤细胞的转化、增殖、迁移及凋亡等生物学行为而广泛参与肿瘤的发生发展过程，在癌症发生发展中发挥着原癌基因或抑癌基因的作用。如较早发现的miR-21已经在多种实体肿瘤中表达升高，如结直肠癌、胆管癌、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、脑胶质瘤、肺癌、肝癌、食管癌、***癌、***、卵巢癌、子宫肌瘤等中均不同程度的发现了miR-21的表达失调，miR-21已经被广泛作为可开发的癌症相关潜在治疗靶点。

子宫内膜癌发生的分子机制尚不清楚，早期发现和治疗是改善预后、提高治愈率的关键。深入研究子宫内膜癌相关基因的异常表达机制将有助于其早期诊断、预防及治疗，具有重要的意义。本发明首次发现miRNA-3926-1的在子宫内膜癌患者中的表达量远远低于对照正常组，miRNA-3926-1的表达异常和子宫内膜癌的发生发展相关，这为子宫内膜癌的miRNA的临床治疗和科学研究提供了基础。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供与子宫内膜癌的诊断和治疗相关的miRNA。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明提供了miRNA在制备诊断子宫内膜癌的产品中的应用，所述miRNA为miRNA-3926-1或其同源物。

进一步，所述产品通过测定miRNA-3926-1或其同源物的水平以诊断子宫内膜癌。

进一步，所述所述产品包括通过使用RT-PCR、印记杂交、原位杂交、阵列杂交、基因芯片或新一代测序来检测miRNA-3926-1或其同源物的水平以诊断子宫内膜癌的产品。

应当知道，本发明的miRNA-3926-1包括组成型核酸分子的功能等同物，即变体，“变体”是指，与对应野生型miRNA基因产物具有少于100％的同一性并且具有对应野生型miRNA基因产物的一个或多个生物活性的miRNA。此类生物活性的实例包括但不限于，与子宫内膜癌发生发展的细胞过程(例如，细胞分化、细胞生长、细胞死亡)的抑制。这些变体包括物种变体和由于miRNA基因的一个或多个突变(例如，置换、缺失、***)而产生的变体。在某些实施方案中，变体与对应野生型miRNA基因产物具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性。

本领域人员熟知，为了保证miRNA的稳定性，可以在miRNA的一端或者两端增加保护性碱基，如TT，也可对miRNA碱基进行修饰，但是不影响miRNA的功能。因此，本领域技术人员熟知，在不影响miRNA-3926-1功能的条件下，对miRNA-3926-1进行碱基修饰或者在两端增加碱基获得的序列同样包含在本发明的保护范围之内。

本发明的miRNA-3926-1核酸分子可以以单链或双链的形式存在。成熟的miRNA-3926-1主要呈单链形式，而miRNA-3926-1前体是部分自互补的，以形成双链结构。本发明的核酸分子可以是RNA、DNA、PNA、LNA的形式。

本发明提供了一种诊断子宫内膜癌的产品，所述产品能够通过检测miRNA-3926-1或其同源物的水平来诊断子宫内膜癌。

进一步，所述产品包括芯片或试剂盒；其中，所述芯片包括固相载体；以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于miRNA-3926-1的部分或全部序列。所述试剂盒包括用于检测miRNA-3926-1的表达水平的试剂，所述检测miRNA-3926-1表达水平的试剂包括针对miRNA-3926-1的引物和/或探针。

根据SEQ ID NO.1所示的核酸序列，可以生成用于给定miRNA基因产物的RNA印记杂交的合适探针，包括但不限于，与目标miRNA基因产物具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或完全互补的探针。标记的DNA和RNA采用常规方法制备，例如核酸探针用下述物质标记，如放射性核素³H、³²P、³³P、¹⁴C或³⁵S，重金属，能起到标记配体的特异性结合对成员功能的配体如生物素、抗生物素蛋白或抗体等，荧光分子，化学发光分子、酶等。

通过切口平移法或随机引物法，可以将探针标记成高比放射性，后者是从单链DNA或从RNA模板合成高比放射性的32P-标记的探针的选择方法。例如，通过根据切口平移法用高效放射性的核苷酸替换现有的核苷酸，可以制备比放射性大大超过108cpm/微克的32P-标记的核酸探针。然后通过使杂交的滤膜曝光于照相胶片，可以进行杂交的放射自显影检测。对杂交的滤膜曝光的照相胶片的光密度扫描，会提供miRNA基因转录产物水平的精确测量。

进一步，上面所述的寡核苷酸探针还可包括针对现有技术中已经报道的可用于诊断子宫内膜癌的miRNA的寡核苷酸探针。将多种miRNA的检测探针放置在同一芯片上通过检测多种miRNA指标联合诊断子宫内膜癌的情况也包含在本发明的保护范围之内。上面所述试剂还包括针对现有技术中已经报道的诊断子宫内膜癌miRNA的引物和/或探针。将多种miRNA的检测引物和/或探针放置在同一试剂盒中通过检测多种miRNA指标联合诊断子宫内膜癌的情况也包含在本发明的保护范围之内。

所述的miRNA芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法，例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的miRNA芯片。如果核酸不含氨基修饰，则其制备方法也可参照：王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.L.erisi，V.R.Iyer，P.O.BROWN.Exploring the metabolic and genetic control of geneexpression on a genomic scale.Science，1997；278：680和马立人，蒋中华主编.生物芯片.北京：化学工业出版社，2000，1-130。

本发明提供了miRNA-3926-1或其同源物在制备治疗子宫内膜癌药物中的应用。

进一步，所述药物包含促进所述miRNA-3926-1表达或增强miRNA-3926-1功能的试剂。所述促进miRNA-3926-1表达或增强miRNA-3926-1功能的试剂的靶标不限于miRNA-3926-1本身，还包括miRNA-3926-1的上下游，例如：编码miRNA-3926-1的基因组序列，miRNA-3926-1靶基因、调控miRNA-3926-1的蛋白或者基因。

进一步，促进miRNA-3926-1表达或增强miRNA-3926-1功能的试剂包括蛋白、寡核苷酸、小分子化合物。

优选地，所述的试剂是miRNA-3926-1的模拟物、miRNA-3926-1的激动剂、前体miRNA-3926-1、携带miRNA-3926-1的载体。

根据miRNA-3926-1序列设计出它的模拟物或激动剂，miRNA-3926-1的模拟物是化学合成的小RNA，miRNA-3926-1的激动剂是经过特殊标记和化学修饰的双链小RNA，将miRNA-3926-1模拟物或者激动剂转移到人体内后，它们能够明显上调miRNA-3926-1的表达。

本发明提供了一种治疗子宫内膜癌的药物，所述药物包括上面所述的促进miRNA-3926-1表达或增强miRNA-3926-1功能的试剂，所述促进miRNA-3926-1表达或增强miRNA-3926-1功能的试剂的靶标不限于miRNA-3926-1本身，还包括miRNA-3926-1的上下游，例如：编码miRNA-3926-1的基因组序列，miRNA-3926-1靶基因、调控miRNA-3926-1的蛋白或者基因。

进一步，所述药物还包括药学上可接受的载体。所述载体包括但不限于：稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂或吸附载体。

所述药物可以制成包括但不限于显微注射剂、适于转染的剂型、注射液、片剂、粉剂、粒剂、胶囊剂。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。对于固体药物，可使用常规的无毒性固体药学上可接受的载体例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。例如，用于口服给药的固体药物可包含上列的任何载体和赋形剂和10-95％，优选25％-75％的至少一种miRNA-3926-1基因产物(或至少一种包含编码它们的序列的核酸)。用于气雾剂(吸入)给药的药物组合物可包含封装在上述脂质体中的按重量计算0.01％-20％、优选按重量计算1％-10％的至miRNA-3926-1基因产物(或至少一种包含编码它们的序列的核酸)和喷射剂。当需要时也可包含载体，如用于鼻内递送的卵磷脂。

本发明的药物组合物可以进一步包含一种或多种抗癌剂。组合物包含至少一种miRNA-3926-1基因产物(或至少一种包含编码它们的序列的核酸)和至少一种化疗剂。适用于本发明的方法的化疗剂，包括但不限于，DNA-烷化剂，抗肿瘤抗生素剂，抗代谢剂，微管蛋白稳定剂，微管蛋白去稳定剂，激素拮抗剂，拓扑异构酶抑制剂，蛋白激酶抑制剂，HMG-COA抑制剂，CDK抑制剂，细胞周期蛋白抑制剂，胱天蛋白酶抑制剂，金属蛋白酶抑制剂，反义核酸，三链螺旋DNA，核酸适体，和分子修饰的病毒、细菌和外毒素试剂。本发明的组合物试剂包括但不限于，阿糖胞苷、甲氨喋呤、长春新碱、依托泊苷、多柔比星、顺铂、***、环磷酰胺、沙可来新、甲基亚硝基脲、氟尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、长春碱、喜树碱、放线菌素-D、丝裂霉素C、过氧化氢、奥沙利铂、伊立替康、托泊替康、亚叶酸、卡莫司汀、链佐星，CPT-11、泰素、他莫昔芬、达卡巴嗪、利妥昔单抗、柔红霉素、1-β-D-阿糖呋喃胞嘧啶、伊马替尼、氟达拉滨、多西他赛。

本发明的miRNA-3926-1可以是天然的或是人工合成的，或者使用可以表达miRNA-3926-1的DNA片段的载体转染细胞获得。所述载体包括病毒载体、真核表达载体。

本发明的可药用载体可包括但不限于：病毒、脂质体、纳米颗粒或聚合物及其任意组合。相关的递送载剂可包括但不限于：脂质体、生物相容性聚合物(包括天然聚合物和合成聚合物)、脂蛋白、多肽、多糖、脂多糖、人工病毒包膜、无机(包括金属)颗粒、以及细菌或病毒(例如杆状病毒、腺病毒和逆转录病毒)、噬菌体、黏粒或质粒载体。

病毒载体可以是能够接受miRNA基因产物的编码序列的任何病毒载体；，包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒)载体、甲病毒载体。可通过用来自其他病毒的包膜蛋白或其他表面抗原假型化载体或通过置换不同的病毒衣壳蛋白(如果合适)来改变病毒载体的趋向性。

真核表达载体可以是任何适当的表达载体，包括但不限于pCMV-Myc表达载体、pcDNA3.0表达载体、pcDNA3.1表达载体、pEGFP表达载体、pEF Bos表达载体、pTet表达载体、pTRE表达载体、或者在公知表达载体的基础上经改造的载体，比如pBin438、pCAMBIA1301等。

可以表达miRNA-3926-1的DNA片段可以通过如下方式获取：从miRNA数据库中(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/)寻找miRNA-3926-1在基因组上的位置及具体序列信息，根据基因组序列确定miRNA-3926-1初始miRNA的位置，在miRNA-3926-1初始miRNA位置的上下游500-800bp区间内设计特异性引物，扩增引物中间的序列即可获得表达miRNA-3926-1的DNA片段。

所述药物可以单独施用或者与其他能够抑制子宫内膜癌的药物进行组合施用。施用有效量的miRNA-3926-1基因产物或其分离的变体或生物活性片段，以便受试者中癌细胞的增殖被抑制。

在本发明中，“阵列”或“微阵列”是杂交阵列原件有序排列在基质上，所述杂交阵列原件诸如聚核苷酸探针(例如寡核苷酸)或结合剂(例如抗体)。所述基质可以是固体基质，例如，玻璃或二氧化硅玻片、珠、纤维光学粘结剂或半固态基质，例如硝酸纤维素膜。核苷酸序列可以是DNA、RNA或其中的任何排列。微阵列可从产生自已知miRNA序列的基因-特异的寡核苷酸探针来制备。阵列可含有每个miRNA的2种不同的寡核苷酸探针，一种含有活性的成熟序列，而另一种特异于miRNA的前体。阵列还可含有对照，诸如与人类直向同源物仅几个碱基不同的一种或多种小鼠序列，其可作为杂交严紧条件的对照。来自两个物种的tRNA也可印在微芯片上，提供了特异杂交的内部、相对稳定的阳性对照。非特异杂交的一个或多个适当的对照也可包括于微芯片上。

在本发明中，miRNA基因产物的“生物活性片段”是指，具有对应野生型miRNA基因产物的一个或多个生物活性的miRNA基因产物的RNA片段。如上文中所述，此类生物活性的实例包括但不限于，子宫内膜癌的细胞增殖过程的抑制。在某些实施方案中，生物活性片段在长度上为至少约5、7、10、12、15或17个核苷酸。在具体的实施方案中，可将分离的miRNA基因产物与一种或多种另外的抗癌治疗组合来给受试者施用。适当的抗癌治疗包括但不限于，化学疗法、放射疗法以及组合(例如，放化疗)。

在本发明中，可将miRNA-3926-1基因产物作为裸RNA与递送试剂一起作为核酸(如重组质粒或病毒载体)给受试者施用，所述核酸包含表达miRNA-3926-1基因产物的序列。递送试剂可以是亲脂试剂、聚阳离子、脂质体等。miRNA-3926-1基因产物的序列的重组质粒和病毒载体以及用于递送此类质粒和载体至癌细胞的技术是本领域众所周知的。

脂质体用于将miRNA-3926-1基因产物(或包含编码它们的序列的核酸)递送至受试者。脂质体可以增加基因产物或核酸的血液半衰期。可从标准的形成小囊泡的脂质(其通常包括中性或带负电荷的磷脂和固醇例如胆固醇)形成用于本发明的合适的脂质体。通常，通过考虑入目的脂质体的大小和血流中直追半衰期等因素，指导脂质的选择。

用于本发明的脂质体可包含将脂质体靶向细胞的配体分子。结合癌细胞中普遍存在的受体的配体例如结合肿瘤细胞抗原的单克隆抗体是优选的。还可对用于脂质体进行修饰，以避免被单核巨噬细胞***和网状内皮***清除。此类修饰的脂质体具有存在于表面上或整合入脂质体结构中的调理作用抑制部分。优选的，脂质体可包含调理作用抑制部分和配体两者。

适用于修饰脂质体的调理作用抑制部分优选是具有500至约40000道尔顿和优选约20000道尔顿的数量平均分子量的水溶性聚合物。此类聚合物包括聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)衍生物如甲氧基PEG或PPG，和PEG或PPG硬脂酸酯；合成聚合物如聚丙烯酰胺或聚N-乙烯基吡咯酮；线性的、分支的或树状聚酰胺-胺；聚丙烯酸；多元醇如羧基或氨基化学连接至其的聚乙烯醇和聚木糖醇，以及神经节苷脂。此外调理作用抑制性聚合物可以是PEG与多聚氨基酸、多糖、聚酰胺-胺、聚乙烯胺或多核苷酸的嵌段共聚物。调理作用抑制性聚合物也可以是包含氨基酸或羧酸如半乳糖醛酸、葡萄醛酸、甘露糖醛酸、透明质酸、果胶酸、神经氨酸、海藻酸、角叉菜胶的天然多糖；氨化多糖或寡糖；羧化多糖或低聚糖如与碳酸的衍生物反应，获得羧基的连接。优选的，调理作用抑制部分是PEG、PPG或其衍生物。

本发明的药物组合物包含对核酸酶的降解具有抗性的至少一种miRNA-3926-1基因产物(或至少一种包含编码它们的序列的核酸)。本领域技术人员可容易地合成对核酸酶具有抗性的核酸，如通过将一个或多个在2’位置被修饰的核糖核苷酸掺入miR基因产物。合适的2’-修饰的核糖核苷酸包括在2’位置用氟、氨基、烷基、烷氧基和O-烯丙基修饰的核糖核苷酸。

所述药物可以体内施用：将miRNA-3926-1模拟物、miRNA-3926-1的激动剂、前体miRNA-3926-1或者miRNA-3926-1的表达载体直接导入体内。这种载体可以是病毒型或非病毒性，甚至是裸DNA或RNA。

在本发明中，术语“治疗”是指改善与疾病或病症例如实体癌相关的症状，包括阻止或延迟疾病症状的发作和/或减少疾病或病症的严重度或频率。术语“受试者”、“患者”或“个体”在本文定义为包括动物如哺乳动物，包括但不限于，灵长类动物、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔子、豚鼠、大鼠、小鼠或其它牛族动物、羊科动物、马科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物或鼠类物种。优选的，动物为人。

术语“抑制癌细胞的增殖”是指杀死细胞或永久性地或临时性地阻止或减缓细胞的生长。如果在施用miR基因产物或抑制miR基因表达的化合物后，受试者中癌细胞的数目保持恒定或减少，那么可推断此类细胞的增殖被抑制。如果癌细胞的绝对数目增加但肿瘤生长速率减小也可推断癌细胞的增殖被抑制。可通过直接测量或通过从原发性或转移肿瘤块的大小估计来确定受试者体内癌细胞的数目。例如，可通过免疫组织学方法、流式细胞计量术或设计用于检测癌细胞的特征性表面标记的其它技术测量受试者中的癌细胞数目。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了miRNA-3926-1表达水平与子宫内膜癌的发生发展相关，通过检测受试者miRNA-3926-1的表达水平，可以判断受试者是否患有子宫内膜癌，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。

附图说明

图1显示利用qRT-PCR检测miRNA-3926-1在子宫内膜癌组织中的表达情况；

图2显示利用qRT-PCR检测miRNA-3926-1对子宫内膜癌细胞中的表达情况；

图3利用CCK-8法检测miRNA-3926-1对子宫内膜癌细胞增殖的影响。

具体实施方式

下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明，并不意味着限制本发明的保护范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1与子宫内膜癌相关的miRNA的筛选

1、样本获取：各收集10例正常子宫内膜组织和子宫内膜癌组织样本。上述所有样本的取得均通过组织伦理委员会的同意。

2、样本总RNA的提取

使用QIAGEN公司的组织RNA提取试剂盒提前总RNA。具体步骤如下：

1)在较少RNase干扰的清洁区，使用含适量液氮的研钵称取组织样本约20mg，用杵棒研磨至粉末状；

2)将样本转移到一个不含RNA酶的2ml的离心管中；

3)加入300μl Lysis solution，置于匀浆器内，充分研磨1-5min；

4)12000g，4℃，离心10min，转移上清至新的1.5ml的离心管中；

5)加入600μl RNase-Free Water，用漩涡器混匀；

6)加入20μl蛋白酶K，在55℃水浴锅中温浴15min，不断涡旋混匀；

7)14000g，室温，离心1min，使细胞碎片沉淀于离心管底部，取上清转移到另外一个不含RNA酶1.5ml的离心管中；

8)加入450μl的95％乙醇，涡旋混匀；

9)取650μl含乙醇的裂解液加到离心柱中，14000g离心1min；弃下层，将柱子重新置于收集管中；

10)依照裂解液的容量，重复步骤9)；

11)加入400μl Wash solution，14000g离心2min；弃下层，将柱置于一新的收集管中；

12)加入100μl Enzyme Incubation Buffer和15μl DNase I，14000g离心1min，将收集管中的溶液重新移入柱中，室温放置15min；

13)加入400μl Wash solution，14000g离心1min，弃下层，将柱子重新置于收集管中；

14)加入400μl Wash solution，14000g离心2min，弃收集管，把柱子放入1.7mlElution管中；

15)加入30μl Elution Buffer，200g离心2min，使溶液充分与柱结合；

16)14000g离心1min，将RNA使用无RNA去离子水溶解，待用。

3、RNA样品的质量分析(NanoDrop1000分光光度计)

NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。

将上述提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，Agilent Technologies2100Bioanalyzer检测RNA样品质量，在凝胶成像仪上观测、拍照，保存图像，一般认为28S:18S≥2可以初步判定总RNA质量较好。

4、miRNA的提取和标记

1)用Ambion公司的miRNAs抽提试剂盒抽提获得miRNA，具体操作按照相应说明书。样品用T4RNA连接酶标记步骤依照Thomson的方法。miRNA标记方法大致如下：1.4μg miRNA和500ng 5’-磷酸盐-胞嘧啶-尿嘧啶cy3-3’(Dharmacon，Chicago，USA)及2单位T4RNAligase(NEB，Ipswich，USA)，于4℃孵育2小时。每份miRNA样品均设等量的相应阴性对照。

2)标记的RNA用0.3M醋酸钠和2.5倍体积的乙醇进行沉淀，再用15μl含3×SSC、0.2％SDS和15％甲酰胺的杂交液重悬，所有的杂交重复两次，杂交用LifterSlipTM(Erie，PA USA)以保证杂交液在芯片和盖片之间均匀流动。

3)将杂交室放在杂交仪BioMixerTMII上(CapitalBio Corp，Beijing，China)于42℃水浴过夜，用洗液洗两遍。

5、miRNA芯片操作：

miRNA芯片，采用博奥生物有限公司的miRNA表达谱芯片(单通道芯片)，按照说明书的指示进行miRNA表达谱的检测。

6、结果：

分析miRNA芯片表达谱的检测结果，可知miRNA-3926-1在子宫内膜癌组织和正常子宫内膜组织中的表达存在显著差异，与正常子宫内膜组织相比，子宫内膜癌组织中miRNA-3926-1的水平显著降低。

实施例2qRT-PCR验证差异表达的miRNA-3926-1

1、根据miRNA芯片的检测结果选择miRNA-3926-1进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择子宫内膜癌组织本和正常子宫内膜组织样本各60例。

2、RNA提取过程同实施例1。

3、逆转录：

1)按照表1配制反应体系

表1反应体系

RNA模板	1μg
		10×缓冲液	2μl
dATP(10mM)	2μl
		polyA多聚酶	0.5μl
RNase抑制剂	0.5μl
		ddH<sub>2</sub>O	补足到20μl

37℃孵育1h。

2)反应管中加入1μl 0.5μg/μl Oligo(dT)特异性RT引物，70℃孵育5min。

3)立即置于冰上孵育2min，打断RNA和引物的二级结构。

4)将上述20μl反应混合物与4μl 5×缓冲液、1μl dNTP(10mM)，0.5μl M-MLV逆转录酶，0.5μl核糖核酸酶(RNase)抑制剂，10μl polyA反应混合液和4μl无核糖核酸酶水(RNase free water)混合，42℃孵育1h。

4、QPCR反应：

1)引物设计

扩增miRNA-3926-1的引物

正向引物：TGGCCAAAAAGCAGGCAGAGA(SEQ ID NO.2)

反向引物：GTGCAGGGTCCGAGGT(SEQ ID NO.3)

扩增U6snRNA的引物

正向引物：CTCGCTTCGGCAGCACA(SEQ ID NO.4)

反向引物：AACGCTTCACGAATTTGCGT(SEQ ID NO.5)

2)按照表2配制PCR反应体系：

其中，SYBR Green聚合酶链式反应体系购自Invitrogen公司。

表2PCR反应体系

	体积
		SYBR Green聚合酶链式反应体系	12.5μl
正向引物	1μl
		反向引物	1μl
cDNA模板	2μl
		ddH<sub>2</sub>O	8.5μl
总体积	25μl

3)PCR反应条件：95℃3min，(95℃3s，60℃32s)×40个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，以U6snRNA作为参照基因，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

5、结果

如图1所示，与正常子宫内膜组织样本相比，子宫内膜癌组织中miRNA-3926-1的表达水平显著降低，与miRNA芯片结果一致。

实施例3QPCR检测子宫内膜癌细胞中miRNA-3926-1的表达

1、miRNA-3926-1质粒的扩增及鉴定

1)根据miRNA-3926-1的序列信息由大连宝生物生物技术有限公司设计合成miRNA-3926-1模拟物质粒和随机对照序列的阴性对照质粒。

2)质粒转化DH5α感受态菌株

①-80℃冰箱取出DH5α感受态细菌100μl于冰上融化；

②将10μl pMKITeno质粒加入100μl DH5α感受态菌液，轻弹、旋转管底混匀，冰浴放置30min；

③置于42℃水浴热休克90s后立即冰浴90s；

④加Amp-LB培养液800μl，轻轻吹打混匀，于37℃恒温摇床，100rpm振荡孵育1h，使细菌复苏；

⑤将复苏后的菌液于4℃，3000rpm离心10min；

⑥吸弃上清，使管中剩余约100μl液体，轻轻吹打混匀后将其涂于Amp-LB琼脂平板；

⑦待平板菌液完全被吸收，倒置平板，于37℃培养箱培养16h。

3)筛选阳性菌落

经16h孵育，固体培养基长出白色菌落。取消毒离心管8支，用消毒牙签小心挑取白色菌落8株，吸管吸取Amp-LB液体培养基，分别将其冲入相应试管，加培养液至5ml。置37℃恒温摇床，以200rpm振荡培养12h，取适量培养物送华大基因进行基因测序。

4)提取阳性菌液质粒(OMEGA公司质粒中量提取试剂盒)，按照试剂盒的说明书进行提取。

5)质粒浓度的测定

将提取的阳性菌液的质粒应用微型全波长分光光度计进行浓度的测定。

2、细胞培养

将Ishikawa细胞常规培养于含10％胎牛血清的RRMI 1640培养基中，于37℃、5％CO₂及饱和湿度条件下培养。

3、细胞转染

将Ishikawa细胞分为四组，实验组即转染miRNA-3926-1模拟物组，阴性对照组即转染随机对照序列组，脂质体对照组即转染Lipofectamine^TM 2000脂质体转染试剂组，空白对照组即不转染组。运用转染试剂Lipofectamine^TM 2000进行转染，转染方法参照说明书。对照组和实验组组的工作浓度均为5μM。转染后48h收集各组细胞用于后续实验。

4、QPCR实验

1)细胞总RNA提取：利用QIAGEN公司的RNA提取试剂盒进行细胞总RNA的提取，按照说明书指示进行。

2)QPCR：步骤同实施例2。

结果如图2所示，与对照组相比，实验组的miRNA-3926-1的表达水平显著上升，表明miRNA-3926-1模拟物能够有效促进miRNA-3926-1的表达。

实施例4CCK-8法检测miRNA-3926-1对细胞增殖的影响

细胞培养和转染按照实施例3

1、转染48h后，收集Ishikawa细胞：细胞计数后，每组细胞配成浓度为2×10⁴个/ml细胞悬液；

2、96孔板每孔0.1ml，每组细胞设6个复孔，重复铺5块96孔板，边缘孔加0.1ml无菌水或PBS；

3、细胞贴壁后，连续测第0h、24h、48h、72h时间点：加CCK-8，每孔10μl，37℃孵育4h，450nm波长测OD值，记录各组OD平均值，根据平均值画出生长曲线。

4、结果

结果如图3所示，与对照组相比，实验组Ishikawa细胞的生长速度明显低于对照组的细胞生长速度，差异具有统计学意义(P<0.05)。上述结果表明miRNA-3926-1的表达不利于子宫内膜癌细胞的增殖，通过增加miRNA-3926-1的表达可以抑制子宫内膜癌细胞的生长。

实施例5FITC/PI双染流式细胞学法检测miRNA-3926-1对子宫内膜癌的影响

1、细胞培养步骤同实施例3。

2、细胞转染步骤同实施例3。

3、步骤

1)收集转染72h后的子宫内膜癌细胞：细胞计数后，每个样品准备0.5-1.0×10⁶个/ml细胞，共4组；

2)Annexin-V-FITC/PI双染进行染色，染色方法如下：

空细胞不染色(校准用)、空细胞单染PI(校准用)、空细胞单染Annexin-V-FITC(校准用)、空细胞双染Annexin-V-FITC、PI

①为保证上机细胞数足够，细胞数目≥5×10⁶处理，1500rpm离心5min；

②预冷的PBS洗涤细胞沉淀，1500rpm离心5min，弃上清；

③加入195μl Annexin-V-FITC结合也重悬沉淀，空细胞和空细胞PI单染用200μl结合液重悬沉淀

④加入5μl Annexin-V-FITC，轻轻吹打混匀，空细胞和空细胞PI单染不加；

⑤室温孵育10min，1000g离心5min，弃上清；

⑥加入190μl Annexin-V-FITC结合也重悬沉淀，空细胞和空细胞PI单染用200μl结合液重悬沉淀；

⑦加入10μl PI，轻轻吹打混匀，空细胞和空细胞PI单染不加冰浴避光放置，将细胞移到流式上机管中，上机检测。记录双染凋亡的实验结果

4、结果

实验组的细胞凋亡率为(29.12±0.024)％，空白对照组的细胞凋亡率为(4.23±0.14)％，转染试剂组的细胞凋亡率为(3.78±0.23)％，阴性对照组的细胞凋亡率为(5.18±0.17)％，上述差异具有统计学意义(P<0.05)，上述结果表明，miRNA-3926-1的表达不利于子宫内膜癌的存活，通过促进miRNA-3926-1的表达可以促进子宫内膜癌细胞的凋亡。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (6)

1.miRNA在制备诊断子宫内膜癌的试剂盒中的应用，其特征在于，所述miRNA为miRNA-3926-1。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒通过测定miRNA-3926-1的水平以诊断子宫内膜癌。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂盒选自通过使用qRT-PCR、印记杂交、原位杂交、阵列杂交、基因芯片或新一代测序来检测miRNA-3926-1的水平以诊断子宫内膜癌的试剂盒。

4.miRNA-3926-1在制备治疗子宫内膜癌药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物包含促进miRNA-3926-1表达或增强miRNA-3926-1功能的试剂。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的试剂包括：miRNA-3926-1的模拟物、miRNA-3926-1的前体、miRNA-3926-1的激动剂、携带miRNA-3926-1的载体。

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