CN105861541A - 一种双表达盒高抗草甘膦载体及其在水稻上的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因工程领域。本发明公开了一种载体，该载体可在水稻的生长发育期全程表达，并且在幼穗分化期花器官组织特异性地增强表达。可用于培育抗草甘膦作物。该载体由双表达盒组成，其中一个表达盒由水稻幼穗分化期特异表达基因Rfl启动子、水稻叶绿体转运肽、抗草甘膦基因和终止子组成；另一个表达盒由组成型启动子Ubiquitin、叶绿体转运肽、抗草甘膦基因以及终止子组成。利用该载体获得的转基因水稻，其在生长发育的所有组织器官对草甘膦有较高抗性外，在水稻幼穗分化期提高花器官组织对草甘膦的抗性，解除草甘膦对水稻花器官的损害，保证水稻的产量。

Description

一种双表达盒高抗草甘膦载体及其在水稻上的应用
技术领域
本发明涉及植物基因工程领域，尤其是涉及一种载体可在水稻营养生长期所有组织中表达，同时特异性地在幼穗分化期花器官组织中增强表达及其在培育抗草甘膦水稻中的应用。
背景技术
草甘膦是目前使用最为广泛的除草剂品种。由于草甘膦是传导性广谱除草剂，可以有效防除大多数一年生、多年生杂草以及一些与粮食作物亲缘关系近的难治杂草，如：野生稻、赤稻、李氏禾稻、匍匐剪股颖等，被广泛应用于水稻等重要粮食作物的杂草防治；而且草甘膦具有价格低廉、在人和哺乳动物植物体内不代谢、对环境友好，无残留活性、植物不易产生抗性等特点，自1974年在美国注册登记以来，已使用30多年，现在仍然是世界销量最大的农药。
草甘膦是一种非选择性除草剂，它通过竞争性抑制莽草酸途径中的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSP合酶)干扰芳香族氨基酸的生物合成而发挥毒性作用。其作用机理是草甘膦与EPSPS和三磷酸莽草酸 S3P 结合形成非常稳定的EPSPS - S3P - 草甘膦复合体， 此复合体抑制EPSPS的活性导致分支酸合成受阻，阻断芳香族氨基酸和一些芳香化合物的生物合成，最终导致一些激素和关键性代谢物如类黄酮、木质素和酚类化合物代谢失调，从而扰乱了生物体正常的氮代谢而使植物死亡。
草甘膦作为一种非选择性除草剂，它所影响的植物生理生长过程是杂草和作物都具有的，因而具有无法有效区分作物和杂草的缺点，这很大程度上的限制了草甘膦的应用。从上世纪八十年代起，抗草甘膦作物基因工程一直备受关注，众多EPSPS抗性突变体被分离后均被转化到植物中进行草甘膦抗性检测，以期获得草甘膦抗性作物。以孟山都研发的转CP4EPSPS转基因大豆为主的抗草甘膦大豆在全世界广泛种植，至2015年全球种植转基因大豆近22200万公顷，其中绝大部分为抗除草剂性状或是兼具抗除草剂及其他性状的复合性状转基因大豆。
水稻幼穗分化与水稻产量密切相关，幼穗分化期对环境非常敏感，不良的环境条件极易影响水稻幼穗的正常分化，进而影响产量。在水稻幼穗分化期前后，如果草甘膦施用不当，就会造成水稻减产。因此培育兼具营养生长期高效表达和幼穗分化期花器官特异表达的抗除草剂水稻，不仅在营养生长期能够解除草甘膦对水稻的毒害，在水稻幼穗分化关键期也能有效缓解草甘膦对水稻幼穗分化的影响，这对于保证转基因抗草甘膦水稻的产量具有积极意义。
发明内容
本发明提供了一种能在水稻营养生长期所有组织中高效表达并且在水稻幼穗发育期花器官组织特异表达的植物表达载体，该载体包含2个表达盒。所述载体由2个表达盒组成，表达盒1由Rfl启动子、转运肽、抗草甘膦基因和终止子组成；表达盒2由Ubiquitin 启动子、转运肽、抗草甘膦基因以及终止子组成。
所述载体包含的表达盒之一由水稻幼穗发育特异表达基因Rfl启动子、水稻转运肽OsCTP、水稻抗草甘膦突变基因epspM和T-nos组成，该表达盒具有使水稻茎端及幼穗分化期高效表达抗草甘膦基因epspM的作用。
所述水稻幼穗发育特异表达基因Rfl启动子的碱基如SEQ ID NO：1所示。该序列是启动5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS）基因在茎端以及幼穗分化期超高表达的序列。
所述水稻转运肽OsCTP的碱基如SEQ ID NO：2所示。该序列所表达的蛋白的作用是将5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS）蛋白转运到叶绿体中。
所述水稻抗草甘膦突变基因为epspM（一种水稻EPSP合酶突变体及其编码基因、获得方法与应用，ZL200510002739.7）。
所述终止子为T-nos。
所述载体包含的表达盒之二由Ubiquitin 启动子、水稻转运肽OsCTP、水稻抗草甘膦突变基因epspM和T-nos组成，该载体具有使水稻在营养生长中所有组织高效表达抗草甘膦基因epspM的作用。
本发明的优点在于：水稻幼穗分化与水稻产量密切相关，幼穗分化期对环境极其敏感，不良的环境条件极易影响水稻幼穗的正常分化，进而影响产量。现有的转单基因组成型抗草甘膦水稻，不足以保护幼穗分化期前，草甘膦施用不当，就会造成水稻减产。因此培育兼具营养生长期高效表达和幼穗分化期花器官特异表达的抗除草剂水稻，不仅在营养生长期能够解除草甘膦对水稻的毒害，在水稻幼穗分化关键期也能有效缓解草甘膦对水稻幼穗分化的影响，这对于保证转基因抗草甘膦水稻的产量具有积极意义。
附图说明
图1 双表达盒抗草甘膦植物表达载体pCDMAR-Ubi-Osctp-OsEpspsM-Tnos-Rfl-Osctp-OsEpspsM图谱。
图2 转pCDMAR-Ubi-Osctp-OsEpspsM-Tnos-Rfl-Osctp-OsEpspsM水稻Hyg基因扩增结果；1-10为转基因阳性株；N为非转基因植株阴性对照；12为重组质粒阳性对照；M为DL2000 DNA Marker。
图3 用浓度为0.39g/m2（平均每株纯受药量为0.0216g）的草甘膦药液处理14天后的转基因水稻植株。其中：A为清水处理的非转基因水稻植株对照；B为喷施草甘膦的非转基因植株对照；C是喷施草甘膦后的转双表达盒载体重组质粒pCDMAR-Ubi-Osctp-OsEpspsM-Tnos-Rfl-Osctp-OsEpspsM的转基因植株。
图4 用浓度为0.39g/m2（平均每株纯受药量为0.0216g）的草甘膦药液处理后，转基因水稻颖花分化后期幼穗发育情况。其中A1-D1：为转单表达盒的Ubi-OsEpspsM转基因植株；A2-D2：转双表达盒pCDMAR-Ubi-Osctp-OsEpspsM-Tnos-Rfl-Osctp-OsEpspsM的转基因植株；A3-D3：为不喷药的非转基因材料。A1、A2、A3：喷施草甘膦前的幼穗发育情况；B1、B2、B3：施用草甘膦后的第7天；C1、C2、C3：施用草甘膦后的第14天；D1、D2、D3：施用草甘膦后的第23天幼穗剥查情况。
具体实施方式
以下结合具体实施对本发明的技术路线进一步详细说明。
实施例一 双表达盒抗草甘膦植物表达载体
1．Rfl启动子克隆: 采用CTAB法提取水稻基因组DNA。从NCBI数据库中查找水稻Rfl基因序列，截取Rfl基因起始密码子5'上游2000 bp为启动子区，设计引物：F:5'-TACAAAAATTTCGACTAAACTCG-3'，R:5'-TTTATCGTCATCATGGCCACCGC-3'克隆启动子，获得长度为2001bp的片段。回收并纯化该片段，测序后加polyA尾。
2．双表达盒高效特异植物表达载体构建
⑴将PUEP（pCAMBIA1300-Ubi-epspsM-Tnos）中Ubi启动子切除。
⑵将Rfl启动子片段连接到上述的去除Ubi启动子的PUEP骨架中， 用HindIII+EcoRV双酶部分切5min，得到Rfl-Osctp-epspsM-Tnos表达框片段。
⑶用BamHI酶切pCDMAR-Hyg载体，Klenow酶补平、 CIAP 去磷酸化。
⑷将pCDMAR-Hyg载体骨架与Rfl-Osctp-epspsM-Tnos表达框连接得到pCDMAR-Rfl-Osctp-epspsM-Tnos载体，用HindIII酶切鉴定。
⑸pCDMAR-Rfl-Osctp-epspsM-Tnos用SmaI酶切后，连接另一个表达框Ubi-Osctp-epspsM-Tnos得到双元表达载体，pCDMAR-Rfl-Osctp-epspsM-Tnos-Ubi-Osctp-epspsM-Tnos，用BgLII和HindIII分别单酶切鉴定，经鉴定，两个Rfl-Osctp-epspsM-Tnos和Ubi- Osctp-epspsM-Tnos表达框方向是相对的。
实施例二 转pCDMAR-Ubi-Osctp-OsEpspsM-Tnos-Rfl-Osctp-OsEpspsM水稻材料获得
采用农杆菌介导法获得转pCDMAR-Ubi-Osctp-OsEpspsM-Tnos-Rfl-Osctp-OsEpspsM水稻，具体步骤如下：
1．胚性愈伤组织的诱导与继代
取水稻授粉后15-20d的未成熟穗，剥壳后用75%乙醇浸泡1min，再转入25wt.％的次氯酸钠溶液中振荡灭菌25min，于超净工作台中无菌水冲洗3-5次，将消毒后种子的幼胚挑出并接种于诱导培养基中，每皿约30粒，于28℃暗培养7d，切除胚根，继续培养7d，待愈伤长大后进行继代培养。从第三代开始可以选择适当的胚性愈伤用于农杆菌转化。
2．愈伤组织的预培养
选取自然分散、颜色鲜黄、直径约为2-3mm的颗粒状愈伤，转接到预培养培养基中，置于27℃暗培养4天。
3．农杆菌的培养及处理
从低温(-85℃) 冻存管中刮取少量菌液于附加卡那霉素50 mg•L-1和利福平50 mg•L- 1YEB固体培养基划线，然后在28℃暗培养36~72h进行活化；取活化平板上的单菌落转接划菌，28℃培养两天后，用适量添加有100µM•L-1乙酰丁香酮的AAM培养基（配方见附录3）将菌洗脱，悬浮于添加有100µM•L-1乙酰丁香酮20 ml AAM培养基中，剧烈摇动1min后，调整菌液浓度至OD600nm=1.5~2.0，静置1h，以便让农杆菌形成悬浮液。
4．共培养
取经预培养的愈伤于灭菌的培养瓶中，加入上述处理的农杆菌菌液，略微摇动后静置30min，于无菌滤纸上晾干愈伤后接种于共培养基上，25℃暗培养3d。
5．洗除农杆菌
挑取共培养后的愈伤于广口培养瓶中，用无菌水冲洗3-5次，每次摇动数次，直至水中不见丝状菌体。最后一次用含250 mg•L-1羧卞青霉素的无菌水静置1h，然后置于无菌滤纸上晾干。
6．愈伤组织的筛选
将愈伤转移至选择培养基中进行抗性愈伤的筛选，每两周转接1次。
7．转化植株再生
将抗性愈伤转移至分化培养基上，2周后愈伤开始转绿，3周后即可长出幼芽，随后根也长出。将幼苗移至生根培养基上，每培养瓶1个克隆。待幼苗生根长成后，移出培养瓶，洗净根上的培养基后，移至温室盆栽。
实施例三 转pCDMAR-Ubi-Osctp-OsEpspsM-Tnos-Rfl-Osctp-OsEpspsM水稻材料的分子检测
1．提取转基因水稻及费转基因水稻叶片总DNA，根据基因序列设计特异性引物， F:5'-GAAAAAGCCTGAACTCACCGC-3',R:5'-TGCTCCATACAAGCCAACCAC- 3'
进行PCR扩增检测，筛选PCR扩增片段大小与预期大小一致的阳性株进行进一步的分子检测。
2．酶PCR 反应体系
Template 1μg
Primer1 (5μM) 1μL
Primer2 (5μM) 1μL
Golden DNA Polymerase 0.4μL
2×Reaction Mix 12.5μL
ddH2O 9.1μL
3．PCR反应程序：
94℃ 5min；｛94℃ 45s/90s，60℃/65℃/56℃（根据引物设定退火温度） 30s/ 60s，72℃ 45s/90s（根据扩增片段长短确定延伸温度）｝35个循环；72℃，10min。
实施例四 转pCDMAR-Ubi-Osctp-OsEpspsM-Tnos-Rfl-Osctp-OsEpspsM水稻对草甘膦的抗性检测
1．对移栽后35天的转基因植株喷施浓度为高于商业推荐使用浓度3倍的草甘膦即（0.39g/m2，平均每株纯受药量为0.0216g），同时以清水喷施非转基因水稻为阴性对照，以同浓度草甘膦喷施非转基因水稻为阳性对照，以转单表达盒pCDMAR-Ubi-Osctp-OsEpspsM-Tnos的转基因水稻为另一阳性对照。14天后调查结果显示：非转基因对照植株枯死；喷施草甘膦的转单表达盒pCDMAR-Ubi-Osctp-OsEpspsM-Tnos和转双表达盒pCDMAR-Ubi-Osctp-OsEpspsM-Tnos-Rfl-Osctp-OsEpspsM基因水稻均生长良好，没有产生明显可见的药害。
2． 进一步对喷药后的水稻材料茎尖每3天剥查，观察草甘膦对水稻颖花发育的影响。结果显示：喷药后14天转单表达盒pCDMAR-Ubi-Osctp-OsEpspsM-Tnos水稻与未喷药的非转基因植株比较，其颖花分化大大延迟，而转双表达盒pCDMAR-Ubi-Osctp-OsEpspsM-Tnos-Rfl-Osctp-OsEpspsM水稻，其颖花分化几乎与未喷药的非转基因水稻同步，没有被延迟；喷药后23天，转单价载体的转基因植株的颖花分化略有恢复，但是此时转双价载体的转基因水稻和未喷药的对照水稻的幼穗几乎发育完成。研究结果表明转双表达盒pCDMAR-Ubi-Osctp-OsEpspsM-Tnos-Rfl-Osctp-OsEpspsM基因水稻不仅在营养生长期能够解除草甘膦对水稻的毒害，在水稻幼穗分化关键期也能有效缓解草甘膦对水稻幼穗分化的影响，这对于保证转基因抗草甘膦水稻的产量具有积极意义。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建省农业科学院生物技术研究所
<120> 一种双表达盒高抗草甘膦载体及其在水稻上的应用
<130> 4
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 2001
<212> DNA
<213> 水稻Rfl启动子
<400> 1
tacaaaaatt tcgactaaac tcgaaaccct aactcaaaac tcaactcaat tgctctcaaa 60
agcaataccg ggaagcctca cgctccccct ctatttatac atgaggtagg cagcctaaag 120
ccacgaacca aactcatact aagagtccta aacaccttag gaaaccctct agtacaagaa 180
agaaacttta cataaccaat tgtaccaaat ttggactcct tccaaattcg actccgcatc 240
ccatacgcac acaataactc catcgtatgc catatggaat ctccatcaac cacgtgcatc 300
aactctagcc taagtatccc gcatgatctt tgaccaccac ggatgtcgtc ttatccccaa 360
gccgactccc ggtccatcac cgcaaatact ctcccgagac atcgagtcac ctacacatgg 420
aacaaacaaa gaaaccatat tccgagacca agctatctcc aacttgactc atcagcagca 480
aacaatagta ttacatacgt atagtatcca tctagaagtt ataatcatga aataaattcg 540
gacatctaaa taaacaaccc gaaaccgaaa ccgacacaga ccgcgggctg cgccggtctg 600
accgcgcatt acacgccggt ctaaccggct accagagctc ggtctgaccg gtcacataaa 660
atgacgaatc ctgcgatcac gtgtgaaatc caatcatatc caaaaccact tcgtgaataa 720
attccaaata acaaaaccaa taatctccaa tgcccaattg ttcatcacaa aataataata 780
aaaaacacct ttgattttac aaaatattta aatgcaaaaa cgactttcac gtaggttcca 840
tgtgtcagtt taggggactt ggtggtggga gtggcagact caccatatcc accactcttt 900
tttttctttt aaagtagtat agatcttctc tgaaagtcca ctaggagtcg atgttaagct 960
taatataaca tcggctttta tctcatctct tgatccaaaa ggaaatagga gcacatgtga 1020
tttgaaatgt cacagtaaat cccagtgaaa aaagcctaag gaagtgagct atgctcatgc 1080
tgcttttact actactccat ccgtcccata atataaggga ttttgagttt ttgcttgcaa 1140
cgtttgacca ctcgtcttat tcaaaaattt ttgaaattat tatttatttt atttgtgact 1200
tactttatta tctacagtac tttaagcaca acttttcgtt ttttatattt gcaaaaaaaa 1260
tttaaataag acgagtggtc aaacgttgca agcaaaaact taaaatccct tatattgtgg 1320
gacggaggga gtagtactta ctagtgctag gctgctagct agtactagga tttttgatgt 1380
gaaatagtag tggagattct ctcggaacag taattttgga acaatcacga gtaaagcacc 1440
tgttaggatg gaacttttcg taatactaat acgttgtgaa tcgagtgagc atgatctttt 1500
tataatcctc gtcgagcgcg agatctgatt gtccggtaca gtattttatt caaccgaaca 1560
tgacaaagtg ttttaacgtc gaaaagtcac tagtttacct cggggtgagg tgagcagcca 1620
atcgggtggg gtgtcaaaga cagaaaccaa aaggcagcca gtcatcagag cggtcactgc 1680
ggcacacgtc gtggggcgtg gttggaggtt cgctcaagtc gtggtcgtcc tcgtcccggt 1740
tggatggact agggggtgca atgcaaatag cgtatggtta cgggcgggta attgcaaaaa 1800
atgcggcgca cccgtgttgt ggcaccaata atgttgggct tctctccccg agaagagaca 1860
gccaatgggg gggggggggg gggcggaagc ggaaccaact ttttcgccgg atgggaaatt 1920
tcggcctcgc tttccttgtt tgttcggccc ggatgcatta ccacttctgc ccctgggtgc 1980
ggtggccatg atgacgataa a 2001
<210> 2
<211> 213
<212> DNA
<213> epsps转运肽碱基序列OsCTP
<400> 2
atggcggcga ccatggcgtc caacgccgcg gctgcggcgg cggtgtccct ggaccaggcc 60
gtggcggcgt cggcggcgtt ctcgtcgcgg aagcagctgc ggctgcccgc cgcggcgcgc 120
ggggggatgc gggtgcgggt gcgggcgcgg gggcggcggg aggcggtggt ggtggcgtcc 180
gcgtcgtcgt cgtcggtggc agcgccggcg gcg 213
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tacaaaaatt tcgactaaac tcg 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tttatcgtca tcatggccac cgc 23

Claims (6)

1.一种抗草甘膦植物表达载体，其特征在于：所述载体由2个表达盒组成，表达盒1由Rfl启动子、转运肽、抗草甘膦基因和终止子组成；表达盒2由Ubiquitin 启动子、转运肽、抗草甘膦基因以及终止子组成。
2.根据权利要求1所述的一种抗草甘膦植物表达载体，其特征在于：所述Rfl启动子碱基序列如SEQ ID NO：1所示。
3.根据权利要求1所述的一种抗草甘膦植物表达载体，其特征在于：所述转运肽OsCTP碱基序列如SEQ ID NO：2所示。
4.根据权利要求1所述的一种抗草甘膦植物表达载体，其特征在于：所述抗草甘膦基因来源于水稻epsps的突变基因epspsM。
5.根据权利要求1所述的一种抗草甘膦植物表达载体，其特征在于：所述终止子为T-nos。
6.如权利要求1-5中任意所述的抗草甘膦植物表达载体在培育抗草甘膦水稻中的应用。
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