CN105853439A - 吩噻嗪二胺鎓盐和其用途 - Google Patents

吩噻嗪二胺鎓盐和其用途 Download PDF

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詹姆斯·彼得·辛克莱尔
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约翰·默文·大卫·斯托里
托马斯·克雷文·巴德雷
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巴里·艾伦·伍德
克雷格·威廉姆森
斯科特·克鲁纳斯
查尔斯·罗伯特·哈林顿
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Abstract

本发明涉及通式(I)的化合物和其医药上可接受的盐：其中：R1和R9中的每一个独立地选自：‑H、C1‑4烷基、C2‑4烯基和卤代C1‑4烷基；R3NA和R3NB中的每一个独立地选自：‑H、C1‑4烷基、C2‑4烯基和卤代C1‑4烷基；R7NA和R7NB中的每一个独立地选自：‑H、C1‑4烷基、C2‑4烯基和卤代C1‑4烷基；且其中：RA和RB中的每一个独立地选自：C1‑4烷基、卤代C1‑4烷基和C6‑10芳基；或RA与RB连接以形成选自以下的组：C1‑6亚烷基和C6‑10亚芳基；它们可用于治疗例如阿尔茨海默氏病。在其它方面，本发明还涉及3,7‑二氨基‑10H‑吩噻嗪鎓盐的新颖调配物。

Description

吩噻嗪二胺鎓盐和其用途
技术领域
本发明大体上涉及吩噻嗪(phenothiazine)化合物、特别是某些吩噻嗪二胺鎓盐领域，包括其用途和调配物。在一些实施例中，本发明涉及诸如N,N,N’,N’-四甲基-10H-吩噻嗪-3,7-二胺等二氨基吩噻嗪化合物的双(磺酸)盐。本发明化合物例如可用于治疗τ蛋白病变，例如阿尔茨海默氏病(AD)。
背景技术
本文引用了许多专利和出版物，以便更全面地描述和公开本发明和本发明所涉及的技术的最新水平。这些参考文献中的每一个的全部内容均以引用方式并入本发明内，并入程度就如同特别地且个别地指示每一个别参考文献均以引用方式并入一般。
在包括随附的权利要求书在内的整个本说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含”和变化形式例如“包含”应理解为暗指包括所述的整体、或整体的步骤或组、或步骤，但并不排除任何其它的整体、或整体的步骤或组、或步骤。
必须注意的是，除非上下文另有明确规定，否则如说明书和所附权利要求书中所用的单数形式“一”及“所述”包括复数个提及物。如此一来，例如所提及的“一医药载体”包括两种或两种以上所述载体的混合物，诸如此类。
在本文中范围经常表示为从“约”一个特定值和/或到“约”另一特定值。当表示这样的范围时，另一实施例包括从所述一个特定值和/或到所述另一特定值。类似地，当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，应理解，所述特定值形成另一实施例。
本文中的任何小标题只是出于方便的目的包括在内，且不应当将其视为以任何方式限制本发明。
痴呆病况的特征通常在于受影响患者的脑中细胞内和/或细胞外的蛋白质结构沉积物的逐步积聚，例如β-淀粉样斑块和神经元纤维缠结(NFT)。这些病灶的出现主要与病理性神经元纤维变性和脑萎缩症以及认知损害相关(参见例如木卡托瓦-拉丁斯卡·E·B(Mukaetova-Ladinska,E.B.)等，2000，美国病理学杂志(Am.J.Pathol.)，第157卷，第2期，第623-636页)。
在阿尔茨海默氏病中，神经炎斑块和NFT二者都含有成对螺旋细丝(PHF)，其主要组分是微管相关蛋白τ(参见例如威兹奇克(Wischik)等，1988，美国国家科学院院刊(PNASUSA)，第85卷，第4506-4510页)。斑块还含有衍生自淀粉样前体蛋白(APP)异常处理的细胞外β-淀粉样原纤维(参见例如康(Kang)等，1987，自然(Nature)，第325卷，第733页)。威兹奇克等的文章(‘阿尔茨海默氏病神经生物学’，第2版，2000，道伯恩·D(Dawbarn,D.)和艾伦·S·J(Allen,S.J.)编辑，分子与细胞神经生物学系列，生物科学出版社，牛津)详细地论述了τ蛋白质在神经变性痴呆的发病机理中的推定作用。中额叶皮质中正常形式的τ的损失、病理性PHF的积聚和突触的损失全部与相关认知损害相关。此外，突触的损失和锥体细胞的损失二者都与τ-反应性神经元纤维病理的形态测定的测量结果相关联，所述τ-反应性神经元纤维病理在分子水平上平行于阿尔茨海默氏病中从可溶性形式到多聚化形式(即，PHF)的τ蛋白质池的几乎完全的再分布。
τ以选择性剪接亚型存在，所述亚型含有对应于微管结合域的重复序列的3个或4个拷贝(参见例如格德特·M(Goedert,M.)等，1989，欧洲分子生物学组织杂志(EMBO J.)，第8卷，第393-399页；格德特·M等，1989，神经元(Neuron)，第3卷，第519-526页)。PHF中的τ经蛋白质水解处理成核心域(参见例如威兹奇克·C·M等，1988，美国国家科学院院刊，第85卷，第4884-4888页；威兹奇克等，1988，美国国家科学院院刊，第85卷，第4506-4510页；诺瓦克·M(Novak,M.)等，1993，欧洲分子生物学组织杂志，第12卷，第365-370页)，所述核心域是由重复域的移相形式构成；只有三个重复参与稳定的τ-τ相互作用(参见例如杰克斯·R(Jakes,R.)等，1991，欧洲分子生物学组织杂志，第10卷，第2725-2729页)。一旦形成，PHF样τ聚集物便充当进一步捕获用种子并且提供用于蛋白质水解加工全长τ蛋白质的模板(参见例如威兹奇克等，1996，美国国家科学院院刊，第93卷，第11213-11218页)。
在并入PHF中的τ的重复域中观察到的相移表明，重复域在并入细丝期间经历了诱导的构象变化。在AD期间，设想此构象变化可能通过τ结合到病理性基质(例如受损或突变膜蛋白)来开始(参见例如威兹奇克·C·M等，1997，“微管相关蛋白：在疾病中的修饰”，阿维拉·J(Avila,J.)、勃兰特·R(Brandt,R.)和科西卡·K·S(Kosik,K.S.)编辑(哈伍德(Harwood)学术出版社，阿姆斯特丹)第185-241页)。
在PHF的形成和积聚过程中，它们首先可能由早期的τ低聚物在细胞质内组装而形成非晶形聚集物，所述早期的τ低聚物在PHF组装之前或在PHF组装过程中被截短(参见例如米娜·R(Mena,R.)等，1995，神经病理学报(Acta Neuropathol.)，第89卷，第50-56页；米娜·R等，1996，神经病理学报，第91卷，第633-641页)。然后这些细丝继续形成经典的细胞内NFT。在此状态下，PHF由截短的τ的核心和含有全长τ的绒毛状外被组成(参见例如威兹奇克等，1996，美国国家科学院院刊，第93卷，第11213-11218页)。组装过程以指数进行，消耗正常功能τ的细胞池并且诱导新τ合成以弥补亏损(参见例如赖·R·Y·K(Lai,R.Y.K.)等，1995，衰老神经生物学(Neurobiology of Ageing)，第16卷，第3期，第433-445页)。最后，神经元的功能损害进行到细胞死亡的程度，留下细胞外NFT。细胞死亡与细胞外NFT的数量高度关联(参见例如威兹奇克等，‘阿尔茨海默氏病神经生物学’，第2版，2000，道伯恩·D和艾伦·S·J编辑，分子与细胞神经生物学系列，生物科学出版社，牛津)。当缠结被挤出到细胞外空间时，发生神经元的绒毛状外被的进行性损失，同时相应地损失N端τ免疫反应性，但保留与PHF核心相关的τ免疫反应性(参见例如邦达尔夫·W(Bondareff,W.)等，1994，神经病理与实验神经科学杂志(J.Neuropath.Exper.Neurol.)，第53卷，第2期，第158-164页)。
二氨基吩噻嗪化合物
氯化甲基息奥咛(Methylthioninium Chloride)(MTC)(还称为亚甲基蓝(MB)；氯化甲基硫堇(thionine)；氯化四甲基硫堇；3,7-双(二甲基氨基)吩噻嗪-5-鎓氯化物；C.I.碱性蓝9；氯化四甲基硫堇；3,7-双(二甲基氨基)吩噻咛(phenazathionium)氯化物；瑞士蓝(Swiss blue)；C.I.52015；C.I.溶剂蓝8；苯胺紫；和)是低分子量(319.86)、水溶性、具有下式的三环有机化合物：
氯化甲基息奥咛(MTC)是众所周知的吩噻嗪染料和氧化还原指示剂，并且也已经被用作生物物理***的光学探针，用作纳米多孔材料中的插层剂，用作氧化还原介体和用于光电变色成像。
氯化甲基息奥咛(MTC)和其它二氨基吩噻嗪已经被描述为蛋白质病理性聚集的疾病中的蛋白质聚集抑制剂。
特定来说，已显示，包括MTC在内的二氨基吩噻嗪抑制τ蛋白质聚集并破坏PHF的结构，并且逆转PHF核心的蛋白质水解稳定性(参见例如WO 96/30766，霍夫曼罗氏公司(Hofmann-La Roche))。所述化合物被公开用于治疗或预防各种疾病，包括阿尔茨海默氏病。
WO2007/110630(维斯塔实验室有限公司)也公开了与MTC有关的某些特定的二氨基吩噻嗪化合物，包括ETC、DEMTC、DMETC、DEETC、MTZ、ETZ、MTI、MTILHI、ETI、ETLHI、MTN和ETN，这些化合物可用作例如用于治疗阿尔茨海默氏病的药物。
另外，WO 2005/030676(阿伯丁大学的大学评议会(Court))论述了放射性标记的吩噻嗪和其在诊断和治疗例如τ蛋白病变中的用途。
还公开了氯化甲基息奥咛(MTC)用于其它医疗用途。例如，目前已将其用于治疗高铁血红蛋白症(一种病况，其发生在血液不能将氧递送到体内需要它的地方时)。MTC还被用作医疗染料(例如，用以在手术前或在手术期间将机体的某些部分染色)；诊断剂(例如，作为指示剂染料以检测存在于尿液中的某些化合物)；温和的尿道杀菌剂；黏液表面的刺激剂；用于治疗和预防肾结石；和用于诊断和治疗黑色素瘤。
MTC已被单独地使用(参见例如古特曼·P(Guttmann,P.)和埃尔利希·P(Ehrlich,P.)，1891，“关于亚甲基蓝对疟疾的效果”，柏林临床周刊(Berl.Klin.Woschenr.)，第28卷，第953-956页)或与氯喹(参见例如希尔默·H(Schirmer,H.)等，2003，“作为抗疟疾剂的亚甲基蓝”，氧化还原作用报道(Redox Report)，第8卷，第272-275页；仁朔森·J(Rengelshausen,J.)等，2004，“氯喹和亚甲基蓝组合对抗疟疾的药代动力学相互作用”，欧洲临床药理学杂志，第60卷，第709-715页)组合用于治疗疟疾。
MTC(以名称购自生化构想公司(Bioenvision Inc.)，纽约)还显示出体外强效杀病毒活性。具体来说，在实验室测试中，可有效对抗诸如HIV和西尼罗病毒(West Nile Virus)等病毒。目前还在临床试验中被用于治疗慢性C型肝炎，一种肝脏病毒性感染。病毒HCV是急性肝炎和慢性肝病(包括肝硬化和肝癌)的主要病因。
MTC在与光组合时，还可以阻止核酸(DNA或RNA)复制。血浆、血小板和红血细胞不含有核DNA或RNA。当将MTC引入血液成分中时，其穿过细菌细胞壁或病毒膜，然后移入核酸结构内部。当被光活化时，所述化合物于是结合到病毒或细菌病原体的核酸，从而阻止DNA或RNA复制。因为MTC可以使病原体失活，因此其具有降低原本通过测试检测不到的病原体传播风险的潜力。
MTC的口服和非经肠调配物已经可以在美国商购得到，通常名称为Urolene
还原(‘无色’)形式
可以将MTC(吩噻嗪-5-鎓盐)视为涉及对应10H-吩噻嗪化合物N,N,N’,N’-四甲基-10H-吩噻嗪-3,7-二胺(其可被视为“还原形式”)的“氧化形式”：
已知“还原形式”(或“无色形式”)是不稳定的，并且可以被容易地且快速地氧化，得到对应的“氧化”形式。
查德威克(Chadwick)等(美国生理学杂志细胞生理学(Am J Physiol CellPhysiol)，2004，第286卷，第C1390-C1398页)已显示：人类红细胞依序地还原并摄取MTC；MTC本身不被细胞摄取；而是MTC的还原形式穿过细胞膜；摄取速率具有酶依赖性；并且MTC与还原的MTC二者都集中于细胞内(还原的MTC一旦进入细胞内部即会重新平衡，以形成MTC，)。
MTC和类似的药物在肠道内被摄取并进入血流。未被吸收的药物沿消化道向下渗透到远端肠道。一个重要的不期望的副作用是未被吸收的药物在远端肠道中的作用(例如，远端肠道的敏化作用)和/或未被吸收的药物对远端肠道中的菌群的抗微生物效应，二者都会导致腹泻。因此，期望将渗透到远端肠道的药物量降到最低。通过增加药物在肠道中的摄取(即，通过增加药物的生物利用性)，可以降低剂量并且可以改善不期望的副作用，例如腹泻。
由于是MTC的还原形式被细胞摄取，因此可能期望向患者给予还原形式。这还可以降低对酶促还原的限速步骤的依赖性。
WO 02/055720(阿伯丁大学的大学评议会)公开了某些二氨基吩噻嗪的还原形式用于治疗蛋白质聚集性疾病(主要为τ蛋白病变)的用途。
WO2007/110627(维斯塔实验室有限公司)公开了某些3,7-二氨基-10H-吩噻嗪鎓盐，其可有效作为治疗包括阿尔茨海默氏病在内的疾病的药物或前药。当参照MTC考虑时，这些化合物也呈“还原”或“无色”形式。这些化合物包括以下盐：
尽管相对于MTC的使用提供了某些优点，但在某些条件下合成LMT.2HCl可能导致CH3Cl被捕获于该晶体内。由于CH3Cl有毒并且需要使含量保持在安全水平以下，因此之后需要去除CH3Cl。
此外，LMT.2HBr含有溴离子。原则上，这是不太合意的，因为溴离子在高水平下或在慢性给予时均有毒，而在较低水平下，可以在患者中引起副作用，例如意识模糊。
因此，可以看出，提供相对于已经了解的性质具有一种或多种合意性质的甲基息奥咛化合物的其它盐将是对现有技术的贡献。
此外，提供增强稳定性、增强吸收和\或以其它方式改进它们作为治疗法的有效性的甲基息奥咛化合物的新颖调配物将是对现有技术的贡献。
发明内容
本发明人现已鉴别出一种新类别的稳定的吩噻嗪二胺鎓化合物，所述化合物与先前所公开的二氨基吩噻嗪化合物和盐相比具有改进的性质。
所述化合物的性质在下文中进行描述，由此可以看出，在优选实施例中，本发明可以提供一种或多种具有改进的物理、药代动力学、生物化学或其它有益性质的化合物。
在其它方面，本发明人还提供3,7-二氨基-10H-吩噻嗪鎓盐的新颖调配物。
在一个方面，本发明提供某些化合物，具体来说，提供某些吩噻嗪二胺鎓化合物，如本文所述。
所述化合物可选自通式(I)的化合物和其医药上可接受的盐：
其中：
R1和R9中的每一个独立地选自：-H、C1-4烷基、C2-4烯基和卤代C1-4烷基；
R3NA和R3NB中的每一个独立地选自：-H、C1-4烷基、C2-4烯基和卤代C1-4烷基；
R7NA和R7NB中的每一个独立地选自：-H、C1-4烷基、C2-4烯基和卤代C1-4烷基；
且其中：
RA和RB中的每一个独立地选自：
C1-4烷基、卤代C1-4烷基和C6-10芳基；
或
RA与RB连接以形成基团RAB，其中，RAB选自：
C1-6亚烷基和C6-10亚芳基。
本发明的另一方面涉及合成如上文所述化合物的方法。
本发明的另一方面涉及包含如本文所述化合物和医药上可接受的载体或稀释剂的医药组合物。
本发明的另一方面涉及制备医药组合物的方法，包含混合如本文所述化合物与医药上可接受的载体或稀释剂。
本发明的另一方面涉及呈固体剂型的医药组合物，包含如本文所述的化合物并且进一步包含至少一种适于干式压缩的稀释剂和任选地一种或多种其它赋形剂。
本发明的另一方面涉及通过干式压缩方法制造医药组合物的工艺，所述组合物是固体剂型，包含如本文所述的化合物、至少一种适于干式压缩的稀释剂和任选地一种或多种其它赋形剂。
本发明的另一方面涉及自由流动的粘着粉末，包含如本文所述的化合物和至少一种适于干式压缩的稀释剂和任选地一种或多种其它赋形剂，所述粉末能够压缩成固体剂型。
本发明的另一方面涉及逆转和/或抑制蛋白质(例如，τ蛋白质、突触核蛋白等)聚集的方法(例如，与神经变性疾病和/或临床痴呆相关的蛋白质的聚集)，包含使所述蛋白质与有效量的如本文所述的化合物或组合物接触。所述方法可在体外或体内实施。
本发明的另一方面涉及治疗或预防受试者的疾病状况的方法，包含向所述受试者给予预防或治疗有效量的如本文所述的化合物，所述化合物优选地呈医药组合物形式，优选地呈固体剂型的医药组合物形式，如本文所进一步描述。
本发明的另一方面涉及如本文所述的化合物或组合物，用于通过疗法来治疗或预防人类或动物体(例如疾病状况)的方法中。
本发明的另一方面涉及如本文所述的化合物或组合物用以制造用于治疗或预防疾病病况的药剂的用途。
在一些实施例中，疾病状况是蛋白质聚集疾病。
在一些实施例中，疾病状况是τ蛋白病变，例如，神经变性τ蛋白病变，例如，阿尔茨海默氏病或下文所述的其他疾病。
在一些实施例中，疾病状况是皮肤癌，例如，黑色素瘤。
在一些实施例中，疾病状况是病毒性、细菌性或原生动物性疾病状况，例如，C型肝炎、HIV、西尼罗病毒(WNV)或疟疾。
本发明的另一方面涉及使试样(例如血液或血浆试样)中的病原体失活的方法，包含将如本文所述的化合物或组合物引入所述试样中然后使所述试样暴露于光的步骤。
本发明的另一方面涉及试剂盒，包含(a)如本文所述的化合物，优选地提供为医药组合物，并且存于适宜容器中和/或具有适宜包装；和(b)使用说明，例如，关于如何给予化合物或组合物的书面说明。
如所属领域的技术人员所应了解，本发明一个方面的特征和优选实施例还应涉及本发明的其它方面。
附图说明
图1显示存于氘化甲醇(CD3OD)中的本发明的实例性化合物(LMT.2MsOH)在600MHz下的1H NMR波谱。
图2显示存于CD3OD中的LMT.2MsOH在100.56MHz的频率下的13C NMR波谱。
图3显示存于CD3OD中的LMT.2MsOH在100.56MHz的频率下的DEPT-135波谱。
图4显示存于CD3OD中的LMT.2MsOH在100.56MHz的频率下的HSQC波谱。
图5显示存于CD3OD中的LMT.2MsOH在100.56MHz的频率下的HSQC波谱的放大部分。
图6显示LMT.2MsOH(KBr)的红外(FT-IR)波谱。
图7显示LMT.2MsOH的电子碰撞(EI)质谱。
图8显示LMT.2MsOH的电喷射电离(ESI)质谱。
图9显示存于去离子水中的LMT.2MsOH的UV/Vis波谱。
图10显示LMT.2MsOH的HPLC迹线。
图11显示利用Cu Kα辐射测量的LMT.2MsOH的粉末X射线衍射图。
图12显示结晶LMT.2MsOH的FT-拉曼(Raman)波谱。最强信号发现于1615cm-1、1588cm-1、1258cm-1和1042cm-1处。
图13显示结晶LMT.2MsOH的热重量曲线。通过TG和TG-FTIR检测到恒定重量，直到在240-270℃开始分解。
图14显示结晶LMT.2MsOH的示差扫描量热法分析。在271℃(ΔH＝87J/g)的明确熔点后，立即分解。
图15a和15b显示在25℃以5％/h的扫描速率测量的结晶LMT.2MsOH的动态蒸气吸附(DVS)曲线。水平虚线指示一当量水摄取的步骤。在介于0％与70％之间的相对湿度(r.h.)范围内观察到试样的稳定重量(小于0.5％重量变化)。高于此r.h.时，水摄取快速增加并且试样最终液化。干燥后，在50％r.h下，水含量再次降低到约4当量。结晶二盐酸盐(LMT.2HCl)的DVS曲线显示为虚线、二氢溴酸盐(LMT.2HBr)的DVS曲线显示为点线，用于比较。
图15c显示作为时间的函数的结晶LMT.2MsOH的动态蒸气吸附(DVS)曲线。还指示了相对湿度(右轴)。水平虚线指示一当量水摄取的步骤。
图16显示LMT.2MsOH(左)和再结晶的LMT.2MsOH(右)的偏振显微镜图片。通过从2-PrOH/水中再结晶获得大小高至100μm的晶体。晶体具有不规则形状。
图17a-c显示LMTEsOH、LMT.EDSA.和LMT.2MsOH的X射线晶体结构。
图18显示在给予LMT.2HBr、LMT.2HCl和LMT.2MsOH后，MT部分随时间在猪中的血浆浓度的比较。
图19是用于溶解研究(参见调配物实例12)中的装置的图解。
具体实施方式
本发明人已鉴别出一种新类别的吩噻嗪二胺鎓化合物，所述化合物与先前所公开的二氨基吩噻嗪化合物和盐相比具有合意的物理性质或其它性质和\或令人吃惊地改善的活性。
在其它方面，他们已经另外提供吩噻嗪二胺鎓化合物的新颖调配物，包括(但不限于)上文的类别。
化合物
在一般术语中，除非上下文另有要求，否则可以将本发明化合物描述为3,7-二氨基-10H-吩噻嗪化合物的双(磺酸)盐或双(磺酸)的盐。换句话说，所述化合物是对应的3,7-二氨基-10H-吩噻嗪化合物与有机磺酸的盐。
更具体来说，本发明化合物是以下通式的化合物的双(磺酸)盐：
其中，R1、R9、R3NA、R3NB、R7NA和R7NB如上文所定义。
在一些实施例中，盐是双(烷基磺酸)盐或双(芳基磺酸)盐。
在一些实施例中，盐选自双(甲磺酸)盐、双(乙磺酸)盐、双(对甲苯磺酸)盐、双(苯磺酸)盐、乙二磺酸盐、丙二磺酸盐或萘二磺酸盐。
在一些实施例中，盐是双(甲磺酸)盐(bis(methanesulfonate)salt)(其还可以称为双(甲磺酸)盐(bis(mesylate)salt))。
在一些实施例中，盐是双(乙磺酸)盐(bis(ethanesulfonate)salt)(其还可以称为双(乙磺酸)盐(bis(esylate)salt))。
在一些实施例中，盐是双(对甲苯磺酸)盐(bis(p-toluenesulfonate)salt)(其还可以称为双(甲苯磺酸)盐(bis(tosylate)salt))。
在一些实施例中，盐是双(苯磺酸)盐。
在一些实施例中，盐是乙二磺酸盐。
在一些实施例中，盐是丙二磺酸盐。
在一些实施例中，盐是萘二磺酸盐，优选萘-1,5-二磺酸盐。
换句话说，可以将本发明化合物视为可以从例如如上文所陈述的3,7-二氨基-10H-吩噻嗪化合物与两个有机磺酸部分(RASO3H和RBSO3H)反应获得的产物。所述两个有机磺酸部分可以可选地存在于同一分子上，即其中RA与RB连接。
在一些实施例中，本发明化合物选自通式(I)的化合物和其医药上可接受的盐、溶剂化物和水合物：
其中：
R1和R9中的每一个独立地选自：-H、C1-4烷基、C2-4烯基和卤代C1-4烷基；
R3NA和R3NB中的每一个独立地选自：-H、C1-4烷基、C2-4烯基和卤代C1-4烷基；
R7NA和R7NB中的每一个独立地选自：-H、C1-4烷基、C2-4烯基和卤代C1-4烷基；
且其中：
RA和RB中的每一个独立地选自：
C1-4烷基、卤代C1-4烷基和C6-10芳基；
或
RA与RB连接以形成基团RAB，其中，RAB选自：
C1-6亚烷基和C6-10亚芳基。
本发明化合物在本文中通过通式来表示，该通式显示3,7-二氨基-10H-吩噻嗪化合物的结构，其中，3,7-二氨基呈质子化形式。
所得带双正电的粒种与两个磺酸根抗衡离子部分(其可以可选地存在于同一分子上，即其中，RA与RB连接)缔合：
然而，如所属领域的技术人员所应理解，可以其它方式同等地表示该同一盐，例如：
等。
其它定义和优先选择
如本文所用，术语“C1-4烷基”涉及通过从具有1到4个碳原子的烃化合物去除氢原子获得的单价部分，其可以为脂肪族或脂环族或其组合。
类似地，术语“C2-4烯基”涉及通过从C2-4烯烃化合物(即含有至少一个双键和2到4个碳原子的烃化合物)去除氢原子获得的单价部分。
如本文所用，术语“C1-6亚烷基”涉及通过去除具有1到6个碳原子的脂肪族直链烃化合物的两个氢原子获得的二齿部分，所述两个氢原子要么都来自相同碳原子，要么一个是来自两个不同碳原子中的每一个。
在一些实施例中，C1-4烷基可以选自：直链C1-4烷基，例如-Me、-Et、-nPr、-iPr和-nBu；具支链C3-4烷基，例如-iPr、-iBu、-sBu和-tBu；和环状C3-4烷基，例如-cPr和-cBu。
在一些实施例中，C2-4烯基可以选自直链C1-4烯基，例如-CH＝CH2(乙烯基)和-CH2-CH＝CH2(烯丙基)。
在一些实施例中，卤代C1-4烷基可以选自：-CF3、-CH2CF3和-CF2CF3。
如本文所用，术语“C6-10芳基”涉及通过从C6-10芳族化合物的芳环原子去除一个氢原子获得的单价部分，所述化合物具有一个环或两个或两个以上的环(例如，稠合)并且具有6到10个环原子，且其中，所述环中的至少一个是芳环。
如本文所用，术语“C6-10亚芳基”涉及通过从具有6到10个碳原子的芳族化合物去除两个氢原子获得的二齿部分。
在一些实施例中，C6-10芳基可以选自C6-10碳芳基(carboaryl)，例如苯基和萘基。
在一些实施例中，C6-10亚芳基可以选自亚苯基和亚萘基。
所述C1-4烷基和C1-6亚烷基可以是未经取代的或可以任选地例如经一个或多个选自以下的基团取代：卤素(例如F、Cl、Br、或I)、氨基(例如-NH2、-NHR或-NR2，其中，每一R独立地为C1-4烷基)、羟基(-OH)、烷氧基(-OR，其中，R独立地为C1-4烷基)、硝基(-NO2)等。
所述C6-10芳基和C6-10亚芳基可以是未经取代的或可以任选地例如经一个或多个选自以下的基团取代：C1-4烷基(例如-Me)、卤代C1-4烷基(例如-CF3)、卤素(例如F、Cl、Br或I)、氨基(例如-NH2、-NHR或-NR2，其中，每一R独立地为C1-4烷基)、羟基(-OH)、烷氧基(-OR，其中，R独立地为C1-4烷基)、硝基(-NO2)等。
基团RA和RB
RA和RB中的每一个独立地选自：
C1-4烷基、卤代C1-4烷基和C6-10芳基；
或
RA与RB连接以形成基团RAB，其中，RAB选自：
C1-6亚烷基和C6-10亚芳基；
在一些实施例中，RA和RB中的每一个独立地选自：
C1-4烷基、卤代C1-4烷基和C6-10芳基。
在一些实施例中，RA和RB中的每一个独立地为C1-4烷基。
在一些实施例中，RA和RB中的每一个独立地选自Me、Et、nPr、iPr、nBu、iBu、tBu。
在一些实施例中，RA和RB中的每一个独立地选自Me和Et。
在一些实施例中，RA和RB中的每一个独立地为C6-10芳基。
在一些实施例中，RA和RB中的每一个独立地选自苯、1-萘、2-萘和对甲苯。
在一些实施例中，RA和RB中的每一个独立地选自Me、Et、苯和对甲苯。
在一些实施例中，RA和RB相同。
在一些实施例中，RA和RB不同。
在一些实施例中，RA和RB相同并且独立地为Me。然后可以将所述化合物称作二氨基吩噻嗪双(甲磺酸)盐，其具有通式(Ia)：
在一些实施例中，RA和RB连接以形成基团RAB。
在这些实施例中，本发明化合物可替代地表示为通式Ib：
其中，RAB选自C1-6亚烷基和C6-10亚芳基。
在一些实施例中，RAB是C1-6亚烷基。
在一些实施例中，RAB是选自以下的C1-6亚烷基：-CH2-、-CH2CH2-、-CH2CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH2CH2-和-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-。
在一些实施例中，RAB是选自以下的C1-6亚烷基：亚甲基(-CH2-)、亚乙基(-CH2CH2-)和亚丙基(-CH2CH2CH2-)。
在某些实施例中，R4是乙基。
在一些实施例中，RAB是C6-10亚芳基。
在一些实施例中，RAB是选自亚苯基和亚萘基的C6-10亚芳基。
在一些实施例中，RAB是亚苯基。
在一些实施例中，RAB选自1,2-亚苯基、1,3-亚苯基和1,4-亚苯基。
在一些实施例中，RAB是任选地经一个或多个例如选自C1-4烷基、卤代C1-4烷基和卤素的取代基取代的亚苯基。
在一些实施例中，RAB是亚萘基。
在一些实施例中，RAB选自1,2-亚萘基、1,3-亚萘基、1,4-亚萘基、1,5-亚萘基、1,6-亚萘基、1,7-亚萘基和1,8-亚萘基。
在一些实施例中，RAB选自：
1,5-亚萘基，即
和1,8-亚萘基，即
在一些实施例中，RAB是任选地经一个或多个例如选自C1-4烷基、卤代C1-4烷基和卤素的取代基取代的亚萘基。
基团R1和R9
在一些实施例中，R1和R9中的每一个独立地为-H、-Me、-Et或-CF3。
在一些实施例中，R1和R9中的每一个独立地-H、-Me或-Et。
在一些实施例中，R1和R9相同。
在一些实施例中，R1和R9不同。
在一些实施例中，R1和R9中的每一个独立地为-H。
在一些实施例中，R1和R9中的每一个独立地为-Me。
在一些实施例中，R1和R9中的每一个独立地为-Et。
基团R3NA和R3NB
R3NA和R3NB中的每一个独立地选自：-H、C1-4烷基、C2-4烯基和卤代C1-4烷基。
在一些实施例中，R3NA和R3NB中的每一个独立地选自：C1-4烷基、C2-4烯基和卤代C1-4烷基。
在一些实施例中，R3NA和R3NB中的每一个独立地为-Me、-Et、-nPr、-nBu、-CH2-CH＝CH2或-CF3。
在一些实施例中，R3NA和R3NB中的每一个独立地为-Me、-nPr、-nBu、-CH2-CH＝CH2或-CF3。
在一些实施例中，R3NA和R3NB中的每一个独立地为-Me或-Et。
在一些实施例中，R3NA和R3NB相同。
在一些实施例中，R3NA和R3NB不同。
在一些实施例中，R3NA和R3NB中的每一个独立地为-Me。
基团R7NA和R7NB
R7NA和R7NB中的每一个独立地选自：-H、C1-4烷基、C2-4烯基和卤代C1-4烷基。
在一些实施例中，R7NA和R7NB中的每一个独立地选自：C1-4烷基、C2-4烯基和卤代C1-4烷基。
在一些实施例中，R7NA和R7NB中的每一个独立地为-Me、-Et、-nPr、-nBu、-CH2-CH＝CH2或-CF3。
在一些实施例中，R7NA和R7NB中的每一个独立地为-Me、-nPr、-nBu、-CH2-CH＝CH2或-CF3。
在一些实施例中，R7NA和R7NB中的每一个独立地为-Me或-Et。
在一些实施例中，R7NA和R7NB相同。
在一些实施例中，R7NA和R7NB不同。
在一些实施例中，R7NA和R7NB中的每一个独立地为-Me。
基团R3NA、R3NB、R7NA和R7NB
在一些实施例中：
R3NA和R3NB中的每一个独立地为C1-4烷基、C2-4烯基或卤代C1-4烷基；
R7NA和R7NB中的每一个独立地为C1-4烷基、C2-4烯基或卤代C1-4烷基。
在一些实施例中：
R3NA和R3NB中的每一个独立地为-Me、-Et、-nPr、-nBu、-CH2-CH＝CH2或-CF3；
R7NA和R7NB中的每一个独立地为-Me、-Et、-nPr、-nBu、-CH2-CH＝CH2或-CF3。
在一些实施例中：
R3NA和R3NB中的每一个独立地为-Me或-Et；
R7NA和R7NB中的每一个独立地为-Me或-Et。
在一些实施例中，R3NA和R3NB和R7NA和R7NB全部相同。
在一些实施例中，R3NA和R3NB和R7NA和R7NB相同并且全部为-Me或全部为-Et。
在一些实施例中，R3NA和R3NB和R7NA和R7NB相同并且全部为-Me。
盐和溶剂化物
尽管本文所述的化合物本身为盐，但它们还可以以混合盐(即，本发明化合物与另一盐的组合)的形式提供。所述混合盐意图由术语“和其医药上可接受的盐”涵盖。除非另有规定，否则所提及的特定化合物还包括它的盐。
本发明化合物还可以以溶剂化物或水合物的形式提供。本文所用术语“溶剂化物”为常规含义，是指溶质(例如，化合物、化合物的盐)与溶剂的复合物。如果溶剂是水，则可以将溶剂化物方便地称作水合物，例如，一水合物、二水合物、三水合物等。除非另有规定，否则任何对化合物的提及还包括其溶剂化物和水合物形式。
自然地，本发明还涵盖化合物的盐的溶剂化物或水合物。
同位素变化形式
在一些实施例中，化合物的一个或多个碳原子是11C、13C或14C。
在一些实施例中，化合物的一个或多个碳原子是11C。
在一些实施例中，化合物的一个或多个碳原子是13C。
在一些实施例中，化合物的一个或多个碳原子是14C。
在一些实施例中，化合物的一个或多个氮原子是15N。
在一些实施例中，基团R3NA、R3NB、R7NA、R7NB、R1、R9、RA和RB中的一个或多个或全部中的一个或多个或全部碳原子是11C、13C或14C。
在一些实施例中，基团R3NA、R3NB、R7NA和R7NB中的一个或多个或全部中的一个或多个或全部碳原子是11C、13C或14C。
组合
本文明确地公开上文所述实施例的所有兼容组合，就如同具体地且个别地叙述每一组合一般。
特定来说，在本发明化合物中，基团R3NA、R3NB、R7NA、R7NB、R1、R9、RA和RB(和RAB)定义为独立的变量，并且那些所属领域的技术人员应当认识到，可以在本发明的化合物和方法中利用这些基团和取代基的任何相容组合。
因此，本发明具体地涵盖这种定义的变量和其它定义的变量的所有兼容组合，并且其在本文中公开，就如同个别地且明确地叙述每一个组合一般。
一些优选实施例
在一些实施例中，本发明化合物可以选自以下化合物和其医药上可接受的盐、溶剂化物和水合物：
本发明的一个特定化合物是化合物1：
N,N,N’,N’-四甲基-10H-吩噻嗪-3,7-二胺鎓双(甲磺酸盐)。
此化合物还可以称作：
N,N,N’,N’-四甲基-10H-吩噻嗪-3,7-二胺双(羟基甲磺酸盐)
无色甲基息奥咛双(羟基甲磺酸盐)
无色甲基息奥咛双(甲磺酸盐)
LMTM
LMT.2MsOH。
纯度
可以将本发明化合物方便地描述为呈“稳定的还原形式”。所述化合物氧化(例如，自动氧化)，得到对应氧化形式。因此，如果并非不可避免，则包含本发明化合物的组合物可能会含有至少一些对应的氧化化合物作为杂质。
因此，本发明的另一方面涉及呈大体上纯的形式和/或呈大体上不含污染物(例如，对应的氧化化合物、其它污染物)的形式的如本文所述的化合物。
在一些实施例中，大体上纯的形式是至少50重量％纯，例如，至少60重量％纯，例如，至少70重量％纯，例如，至少80重量％纯，例如，至少90重量％纯，例如，至少95重量％纯，例如，至少97重量％纯，例如，至少98重量％纯，例如，至少99重量％纯。
在一些实施例中，污染物占不超过50重量％，例如，不超过40重量％，例如，不超过30重量％，例如，不超过20重量％，例如，不超过10重量％，例如，不超过5重量％，例如，不超过3重量％，例如，不超过2重量％，例如，不超过1重量％。
通过方法获得产物
在一些实施例中，化合物是通过如本文所述的方法获得，或能够通过如本文所述的方法获得。
化学合成
化学合成本发明化合物的方法在本文中进行了描述。这些和/或其它众所周知的方法可以已知方式进行修改和/或派生，以便于合成在本发明的范围内的额外化合物。
式(I)化合物：
可以由式(II)化合物制备：
其中，R1、R9、R3NA、R3NB、R7NA和R7NB如前文所定义。
式(II)化合物可以例如由式(III)化合物制备：
其中，RProt是氨保护基团并且R1、R9、R3NA、R3NB、R7NA、R7NB、RA和RB如前文所定义。
作为非限制性实例，RProt可以为酰基，例如乙酰基(-C(＝O)Me)或苯甲酰基(-C(＝O)Ph)。
式(II)化合物可以例如通过式(III)化合物的脱保护或通过其它已知方法来制备。相反地，式(II)化合物可以通过对式(III)化合物的保护来产生。
式(II)和(III)的化合物是已知的，并且可以使用已知方法由已知和/或商购的起始材料(例如由对应的吩噻嗪化合物)制备。
例如，将式(II)和(III)的中间体用于在WO2007/110627中公开的合成3,7-二氨基-10H-吩噻嗪盐酸盐、氢溴酸盐和氢碘酸盐的方法中。
如所述文献中所公开，可以例如使用亚硝酸钠与乙酸和氯仿一起将适宜的吩噻嗪转化成对应的3,7-二硝基-吩噻嗪。
然后可以例如使用乙酸酐和吡啶将环氨基保护为例如乙酸盐。
然后可以例如使用氯化锡(II)与乙醇将硝基还原成氨基。
然后可以例如使用碘甲烷、氢氧化钠、DMSO和四正丁基溴化铵对氨基实施取代，例如双取代、例如甲基双取代，以提供N-乙酰基保护的3,7-二烷基氨基-10H-吩噻嗪。
所述方法的实例阐释于方案1a和1b中。本发明当然涵盖所述方法中使用的任一种或多种本文所述试剂：
方案1a
方案1b
然后可以例如使用酸的水溶液将此N-乙酰基中间体的氨基脱保护，即，可以去除N-乙酰基。
式(II)和(III)的化合物还可以使用在WO2008/007074中公开的方法制得。此文献公开了式(III)化合物和式(II)化合物，其中，RProt是酰基，例如乙酰基。
在一种方法中，首先可以例如在适宜碱(例如，吡啶(C5H5N)或霍尼希氏碱(Hünig’sbase)(二异丙基乙基胺，C8H19N))存在下，例如在适宜溶剂(例如，乙醇或乙腈)中例如通过与肼(NH2NH2)、甲基肼(MeNHNH2)或硼氢化钠(NaBH4)和乙酸酐((H3CCO)2O)反应，将合适的息奥咛氯化物(例如，甲基息奥咛氯化物、乙基息奥咛氯化物等)还原并乙酰化，得到对应的1-(3,7-双-二甲基氨基-吩噻嗪-10-基)-乙酮。然后可以例如通过与适宜酸反应将还原并乙酰化的化合物(式(III))脱保护(通过去除乙酰基)，得到式(II)化合物，或可以直接使用式(III)化合物。有利地，此反应可以产生具有高纯度的产物。
一实例示于以下方案中。
方案2
在另一方法中，合适的息奥咛盐(例如，乙基息奥咛半氯化锌)可以例如通过与还原剂苯肼、乙醇、乙酸酐和吡啶反应而同时被还原并且对环氨基进行保护。
一实例示于以下方案中：
方案3
在一个方面，本发明因此提供由式(II)化合物制备式(I)化合物3,7-二氨基-10H-吩噻嗪的方法：
其中，RA、RB、R1、R9、R3NA、R3NB、R7NA和R7NB如前文所定义。
在一些实施例中，所述方法包含以下步骤：
盐形成(SF)。
在一些实施例中，盐形成(SF)包含用合适的磺酸处理式(II)化合物。
在一些实施例中，盐形成包含在有机溶剂中用合适的磺酸处理式(II)化合物的溶液。
在又一方面，本发明提供由式(III)化合物制备式(I)化合物3,7-二氨基-10H-吩噻嗪的方法：
其中，RA、RB、R1、R9、R3NA、R3NB、R7NA和R7NB如前文所定义，且其中，RProt是氨保护基团。
众多种氨保护基团在有机合成中被广泛地使用并且众所周知。参见例如有机合成中的保护基团(格林·T(T.Green)和伍兹·P(P.Wuts)；第4版；约翰威利父子出版公司(John Wiley and Sons)，2006)。
在一些实施例中，氨保护基团是酸可裂解保护基团。
在一些实施例中，氨保护基团是酰基，例如乙酰基。
在一些实施例中，所述方法包含以下步骤：
环氨基脱保护(DP)；和
盐形成(SF)。
环氨基脱保护(DP)包含去除保护基团以将N-被保护的的环氨基(-NRProt-)转化成自由环氨基(-NH-)。式(III)化合物的脱保护产生对应的式(II)化合物。
去除氨保护基团的方法为所属领域内已知。参见例如有机合成中的保护基团(格林·T和伍兹·P；第4版；约翰威利父子出版公司，2006)。
在一些实施例中，环氨基脱保护(DP)的步骤和盐形成(SF)的步骤是同时实施的(即，作为一个步骤)。例如：
在一些实施例中，同时的环氨基脱保护(DP)和盐形成(SF)包含用合适的磺酸处理式(III)化合物，以产生式(I)的双(磺酸)盐。
在一些实施例中，同时的环氨脱保护和盐形成可以包含在有机溶剂中用磺酸和水处理式(III)化合物溶液。
在某些实施例中，所述有机碱为甲苯。
在本发明的方法中，磺酸可以选自烷基磺酸和芳基磺酸。它可以为式RASO3H或RBSO3H的磺酸，其中，RA和RB如本文所定义。
在一些实施例中，磺酸可以为二磺酸，即每个分子含有两个磺酸部分的化合物。这些磺酸部分可以通过例如亚烷基或亚芳基连接。
在一些实施例中，磺酸可以选自：甲磺酸(MsOH)、乙磺酸(EsOH)、苯磺酸(BSA)、萘磺酸(NSA)、对甲苯磺酸(TsOH)、乙二磺酸(EDSA)、丙二磺酸(PDSA)和萘-1,5-二磺酸(NDSA)。
在一些实施例中，首先加热所述有机溶剂中的吩噻嗪起始材料(即式(III)化合物)直到完全溶解并且将所得溶液过滤，然后添加试剂(即磺酸和水)。
在一些实施例中，在所述有机溶剂中在约60-80℃的温度(例如在约70℃的温度)加热所述化合物。
在一些实施例中，相对于吩噻嗪起始材料以至少2摩尔当量(例如约2.2摩尔当量)的量添加磺酸。如果使用二磺酸，则应当理解，所述酸的摩尔量应当为至少1摩尔当量，例如约1.1摩尔当量，以便对于每分子吩噻嗪起始材料达成相同数量的磺酸部分。
可能期望缓慢地添加磺酸以防止温度升高(放热)。因此，在一些实施例中，逐渐添加磺酸。
在一些实施例中，在约15-25℃的温度添加磺酸。
在一些实施例中，在添加磺酸和水后，将反应物加热到约80-90℃的温度。
在一些实施例中，将反应维持在此温度直到通过例如色谱分析判断完成。
在一些实施例中，在反应后，用反萃溶剂处理溶液以使产物沉淀。在一些实施例中，反萃溶剂是醇，例如乙醇。
可能期望用少量(例如，约1mg/克起始材料(式(II)化合物))的期望双(磺酸盐)产物‘接种’反应混合物。不希望受限于理论，认为添加晶种可以确保期望产物较早地并且有效地沉淀，减少可能形成副反应和副产物的机会。还认为晶种可用于控制沉淀产物的粒径。
因此，在一些实施例中，在反应后，用少量的期望双(磺酸)盐接种所得混合物。
在一些实施例中，所述晶种包含已经研磨的期望双(磺酸)盐粒子。
在一些实施例中，所述晶种包含已经研磨到大小小于约100μm的期望双(磺酸)盐粒子。
在一些实施例中，通过过滤分离沉淀产物。
在一些实施例中，在过滤后，用有机溶剂(例如乙醇或乙腈)洗涤产物。
盐形成(SF)由式(II)化合物产生式(I)的双(磺酸)盐：
如上文所解释，双(磺酸)盐还可以直接由对应的的氨基被保护(例如N-乙酰基)的式(III)化合物制备。
在此情况下，盐形成可以与脱保护同时实施，例如通过使用用于脱保护步骤的合适的磺酸(例如甲磺酸)实施。一实例阐释于以下方案中：
方案4
在又一方面，本发明提供制备式(I)化合物的方法：
其中，RA、RB、R1、R9、R3NA、R3NB、R7NA和R7NB如前文所定义
所述方法包含：
制备如本文所定义的式(II)或(III)化合物，
随后进行
盐形成(SF)和/或
环氨脱保护(DP)。
盐形成(SF)和环氨脱保护(DP)的步骤如上文所述。
在一些实施例中，制备所述式(II)或(III)化合物包含如WO2007/110627中所公开的方法。
在一些实施例中，制备所述式(II)或(III)化合物包含如WO2008/007074中所公开的方法。
在一些实施例中，制备式(II)化合物包含式(III)化合物的环氨脱保护(DP)，如上文所陈述。
在一些实施例中，制备式(III)化合物包含一个或多个选自以下的步骤：
硝化(NO)，
环氨基保护(AP)，
硝基还原(NR)，
氨取代(AS)。
在一些实施例中，制备式(III)化合物包含以下步骤：
还原(RED)和
环氨基保护(AP)。
所述步骤可以按照任何逻辑顺序实施。在一些实施例中，所述步骤是按照所列示的顺序实施(即，列表中的任一步骤是在与列表中的前一步骤同时或在所述前一步骤之后实施)。
在一些实施例中，硝化(NO)包含：
硝化(NO)，其中，将10H-吩噻嗪转化成3,7-二硝基-10H-吩噻嗪，例如：
在一些实施例中，硝化是使用亚硝酸盐(例如，亚硝酸钠，例如，与乙酸一起的亚硝酸钠)溶剂(例如二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、乙腈、四氢呋喃、二甲氧基乙烷、丙酮、二氯甲烷或氯仿)实施。
在一些实施例中，环氨基保护(AP)包含：
环氨基保护(AP)，其中，将3,7-二硝基-10H-吩噻嗪的环氨基(-NH-)转化成受保护的环氨基(-NRprot)，例如：
在一些实施例中，环氨基保护是作为乙酸盐完成，例如，使用乙酸酐，例如，使用乙酸酐和碱(例如氨碱，例如三乙胺或吡啶)完成。
在一些实施例中，硝基还原(NR)步骤包含：
硝基还原(NR)，其中，将受保护的3,7-二硝基-10H-吩噻嗪的每一个硝基(-NO2)转化成氨基(-NH2)，例如：
在一些实施例中，硝基还原可以使用例如氯化锡(II)，例如，氯化锡(II)与乙醇一起。
在一些实施例中，硝基还原可以使用例如碳载钯(Pd/C)和氢在例如2-甲基-四氢呋喃中实施。
在一些实施例中，硝基还原可以使用例如锌和氯化铵水溶液在甲醇和THF中实施。
在一些实施例中，氨取代(AS)步骤包含：
氨取代(AS)，其中，将受保护的3,7-二氨基-10H-吩噻嗪的每个氨基(-NH2)转化成双取代的氨基，例如：
在一些实施例中，使用烷基卤化物，例如，烷基碘化物，例如，碘甲烷，例如，碘甲烷与氢氧化钠、DMSO、甲苯和四正丁基溴化铵实施氨取代。
在一些实施例中，氨取代包含在还原条件下用甲醛(例如低聚甲醛、***)处理。例如，在Pd/C催化剂存在下用***和氢气处理；或在诸如氰基硼氢化钠和乙酸等还原剂存在下用低聚甲醛处理。
在一些实施例中，还原(RED)步骤为：
还原(RED)，其中，例如通过用还原剂(例如肼(NH2NH2)、甲基肼(MeNHNH2)或硼氢化钠)和碱(例如吡啶、三乙胺或霍尼希氏碱(二异丙基乙基胺))处理，将3,7-二(双取代氨基)-息奥咛盐还原，得到对应的3,7-二(双取代氨基)-10H-吩噻嗪。
在一些实施例中，环氨基保护(AP)步骤为：
环氨基保护(AP)，其中，例如通过用乙酸酐处理来保护3,7-二(双取代氨基)-10H-吩噻嗪，得到对应的受保护的3,7-二(双取代氨基)-10H-吩噻嗪，例如对应的N-乙酰基3,7-二(双取代氨基)-10H-吩噻嗪。
在一些实施例中，所述步骤是按照所列示的顺序实施(即，列表中的任一步骤实施是在与列表中的前一步骤同时或在所述前一步骤之后实施)。
在一些实施例中，还原(RED)的步骤和环氨基保护(AP)的步骤是同时实施(即，作为一个步骤)。
例如，在一些实施例中，组合的还原(RED)步骤和环氨基保护(AP)步骤为：
还原(RED)和环氨基保护(AP)，其中，将3,7-二(双取代氨基)-息奥咛盐还原，得到对应的3,7-二(双取代氨基)-10H-吩噻嗪，并且将3,7-二(双取代氨基)-10H-吩噻嗪的环氨基(-NH-)转化成受保护的环氨基(-Rprot)，得到对应的受保护的3,7-二(双取代氨基)-10H-吩噻嗪，例如：
其中，Y是抗衡离子。在一些实施例中，Y表示Cl-。
在一些实施例中，3,7-二(双取代氨基)-息奥咛盐是甲基息奥咛氯化物(MTC)。
在一些实施例中，组合的还原(RED)步骤和环氨基保护(AP)步骤使用肼(例如苯肼、MeNHNH2或NH2NH2.H2O)和乙酸酐完成。
在一些实施例中，所述步骤是在氮气氛下实施。
在一些实施例中，组合的还原(RED)步骤和环氨基保护(AP)步骤使用例如苯肼、乙醇、乙酸酐和吡啶实施。
在一些实施例中，组合的还原(RED)步骤和环氨基保护(AP)步骤使用例如肼水合物、乙腈、乙酸酐和三乙胺在氮气氛下实施。
在一些实施例中，受保护的3,7-二(双取代氨基)-10H-吩噻嗪(例如N-乙酰基3,7-二(双取代氨基)-10H-吩噻嗪)经受纯化步骤。
在一些实施例中，纯化包含添加有机溶剂(例如甲苯)和酸(例如乙酸)，以溶解所述化合物，随后进行洗涤步骤。
在一些实施例中，洗涤包含将水和/或乙酸水溶液添加到所述化合物的溶液；搅动和/或加热；和有机层的分离。
在一些实施例中，重复洗涤，例如多达三次。
在一些实施例中，洗涤，然后分离纯化产物。
在一些实施例中，纯化产物的分离包含产物的冷却、沉淀和过滤。
结晶形式
在一些实施例中，本发明化合物是以结晶形式提供。
在一些实施例中，结晶形式是‘形式A’，如本文所述。
在一些实施例中，结晶形式具有图17中所绘示的结构，和\或特征在于附表1中所示的晶体数据，和\或附表2中所示的原子坐标和\或附表3中所示的键长和键角，和\或附表4中所示的各向异性位移参数，和\或附表5中所示的氢坐标和各向同性位移参数。
逆转和/或抑制蛋白质聚集
本发明的一个方面是如本文所述的化合物或组合物的用途，其用以调节(例如，逆转和/或抑制)蛋白质聚集，例如，与神经变性疾病和/或临床痴呆相关的蛋白质的聚集。聚集可能在体外或体内，并且可能与如下文所论述的疾病状态相关。
因此，本发明的一个方面涉及调节(例如，逆转和/或抑制)蛋白质聚集(例如，与神经变性疾病和/或临床痴呆相关的蛋白质的聚集)的方法，包含使所述蛋白质与有效量的如本文所述的化合物或组合物接触。所述方法可以在体外或体内实施。
类似地，本发明的一个方面涉及调节(例如，逆转和/或抑制)哺乳动物脑中的蛋白质聚集的方法，所述聚集与如本文所述的疾病状态相关，所述治疗包含向需要所述治疗的所述哺乳动物给予预防或治疗有效量的如本文所述的化合物或组合物的步骤，所述化合物或组合物是所述聚集的抑制剂。
治疗方法
本发明的另一方面涉及治疗方法，包含向需要治疗的患者给予预防或治疗有效量的如本文所述的化合物，优选呈医药组合物的形式。
在治疗方法中的用途
本发明的另一方面涉及如本文所述的化合物或组合物，用于通过治疗来治疗(例如，疾病状况)人类或动物体的方法中。
在制造药剂中的用途
本发明的另一方面涉及如本文所述的化合物或组合物的用途，其用以制造用于治疗(例如疾病状况)的药剂。
在一些实施例中，药剂包含本发明化合物。
在一些实施例中，药剂是如下文所述的组合物。
所治疗的疾病状况-蛋白质聚集疾病
本发明的化合物和组合物可用于治疗或预防蛋白质聚集疾病。
因此，在一些实施例中，所述疾病状况是蛋白质聚集疾病，并且，例如，所述治疗是利用足以抑制与所述疾病状况相关的蛋白质的聚集的量的如本文所述的化合物或组合物。
一般来说，蛋白质聚集是由诱导的构象聚合相互作用而产生，即，其中，蛋白质或其片段的构象变化以自传布方式产生其它(前体)蛋白质分子的模板化结合和聚集。一旦开始成核，聚集级联即可确保哪个涉及其它蛋白质分子的诱导的构象聚合，从而导致聚集物中形成大体上抗进一步蛋白质水解的毒性产物片段。认为由此形成的蛋白质聚集物为表现为神经变性、临床痴呆和其它病理性症状的疾病状态的最接近原因。
下表列示各种疾病相关的聚集性蛋白质和对应的蛋白质聚集疾病。本发明涵盖本发明的化合物和组合物针对这些蛋白质或疾病的用途。
如WO 02/055720、WO2007/110630和WO2007/110627中所述，二氨基吩噻嗪可用于抑制所述蛋白质聚集性疾病。
因此，应当了解，除非上下文另有要求，否则关于τ蛋白质或τ-样蛋白质(例如，MAP2；参见下文)的实施例的描述应当视为同样适用于本文所论述的其它蛋白质(例如，β-淀粉样蛋白、突触核蛋白、朊蛋白等)或可能因域的构象变化而开始或经受类似的病理性聚集的其它蛋白质，所述域的构象变化对于聚集的传布至关重要，或赋予由此形成的聚集物以蛋白质水解稳定性(参见例如威兹奇克等的文章，“阿尔茨海默氏病神经生物学”，第2版，2000，道伯恩·D和艾伦·S·J编辑，分子与细胞神经生物学系列，生物科学出版社，牛津)。所有所述蛋白质在本文中都可以称作“聚集性疾病蛋白质”。
同样，在本文中提及“τ-τ聚集”等等时，也可以将这视为可适用于其它“聚集性蛋白质聚集”，例如β-淀粉样蛋白聚集、朊蛋白聚集、突触核蛋白聚集等。这同样适用于“τ蛋白质水解降解”等。
优选聚集性疾病蛋白质
本发明的优选实施例是基于τ蛋白质。如本文所用，术语“τ蛋白质”一般是指τ蛋白质家族的任何蛋白质。将τ蛋白质描述为在重复的组装和拆分循环期间与微管共同纯化的更大数量的蛋白质家族中的一员(参见例如舍兰斯基(Shelanski)等，1973，美国国家科学院院刊，第70卷，第765-768页)并且称为微管相关蛋白质(MAP)。τ家族成员共享以下部分的公共特征：特征性N端区段、***N端区段中的约50个氨基酸的序列(其在脑中受到发育调节)、由31-32个氨基酸的3或4个串联重复组成的特征性串联重复区，和C端尾。
MAP2是体树突状隔室中主要的微管相关蛋白(参见例如马特斯·A(Matus,A.)，“微管”[海姆斯(Hyams)和洛伊德(Lloyd)编辑]，第155-166页，约翰威利父子出版公司，美国纽约)。MAP2亚型与τ蛋白质在串联重复区几乎相同，但在N端域的序列和范围二者上都显著不同(参见例如金德勒(Kindler)和加纳(Garner)，1994，分子水平脑研究(Mol.BrainRes.)，第26卷，第218-224页)。然而，串联重复区中的聚集并不对τ重复域具有选择性。因此，应当了解，本文中的任何与τ蛋白质或τ-τ聚集有关的论述都应当视为也涉及τ-MAP2聚集、MAP2-MAP2聚集，等等。
在一些实施例中，所述蛋白质是τ蛋白质。
在一些实施例中，所述蛋白质是突触核蛋白，例如，α-或β-突触核蛋白。
在一些实施例中，所述蛋白质是TDP-43。
TAR DNA-结合蛋白质43(TDP-43)是由染色体1p36.2上的TARDBP编码的414个氨基酸蛋白质。所述蛋白质高度保守、广泛地表达并且主要局限于细胞核，但可以在细胞核与细胞质之间穿梭(麦肯锡等2010)。它参与转录和剪接调节并且可能在诸如以下的其它过程中具有作用：微小RNA加工、细胞凋亡、细胞***、信使RNA的稳定、神经元可塑性的调节和树突完整性的维持。此外，自2006年以来，已经积累了大量证据来支持肌萎缩侧索硬化(ALS)中TDP-43毒性功能获得假设。TDP-43是固有的具有聚集倾向的蛋白质，且体外形成的聚集物的超微结构类似于在ALS患者中的变性神经元中见到的TDP-43沉积物(约翰逊(Johnson)等2009)。约翰逊等(2008)展示，当TDP-43在酵母菌模型中过表达时，只有聚集形式有毒。若干体外研究已经显示，TDP-43的C端片段比全长TDP-43更有可能形成变得泛素化且对细胞有毒的、不溶性细胞质的聚集物(荒井(Arai)等2010；伊高兹(Igaz)等2009；野中(Nonaka)等2009；张(Zhang)等2009)。尽管野中等(2009)提出这些细胞质的聚集物结合内源性全长蛋白质，使其从细胞核耗尽，但张等(2009)发现正常核表达的保留，表明所述聚集物的单纯毒性效应。杨(Yang)等(2010)已经描述了全长TDP-43在培养中的NSC34运动神经元的TDP-43的C-和N端片段的聚集物内的捕获。因所述截短的片段的存在而受到损害的轴突生长物(Neurite outgrowth)可以通过全长蛋白质的过表达来补救。尽管还没有确定轴突生长物体内的作用，但此模型将支持野中和同事关于TDP-43聚集在ALS致病机理中的作用的提议。
已经再三地报道了，细胞培养物中的突变体TDP-43表达导致C端片段的生成增加，细胞质的聚集和毒性效应甚至大于野生型蛋白质(卡巴什(Kabashi)等2008；斯瑞德哈兰(Sreedharan)等2008；约翰逊等2009；野中等2009；荒井等2010；巴马达(Barmarda)等2010；卡巴什等2010)。
当蛋白质是τ蛋白质时，在本发明的一些实施例中，提供抑制哺乳动物脑中产生蛋白质聚集物(例如呈成对螺旋细丝(PHF)形式，任选地呈神经原纤维缠结(NFT)形式)的方法，所述治疗如上文所述。
优选适应症-蛋白质聚集疾病
值得注意的是，这种疾病不只有τ蛋白质(和异常功能或其加工)可以在其中起作用的阿尔茨海默氏病(AD)。诸如皮克氏病和进行性核上性麻痹(PSP)等的神经变性疾病的发病机理似乎也分别与病理性截短的τ聚集物在新皮质的齿状回和星形锥体细胞中的积聚相关联。其它痴呆包括额颞痴呆(FTD)；连锁于17号染色体的伴帕金森症的FTD(FTDP-17)；脱抑制-痴呆-帕金森症-肌萎缩复合症(DDPAC)；苍白球-脑桥-黑质变性(PPND)；关岛-ALS综合征；苍白球-黑质-吕伊斯体(luysian)变性(PNLD)；皮质-基底节变性(CBD)和其它(参见例如威兹奇克等的文章，“阿尔茨海默氏病神经生物学”，第2版，2000，道伯恩·D和艾伦·S·J编辑，分子与细胞神经生物学系列，生物科学出版社，牛津；尤其是表5.1)。所有这些特征主要或部分在于异常τ聚集的疾病，其在本文中称作“τ蛋白病变”。
因此，在一些实施例中，疾病状况是τ蛋白病变。
在一些实施例中，疾病状况是神经变性τ蛋白病变。
在一些实施例中，疾病状况选自阿尔茨海默氏病(AD)、皮克氏病、进行性核上性麻痹(PSP)、额颞痴呆(FTD)、连锁于17号染色体的伴帕金森症的FTD(FTDP 17)、额颞叶变性(FTLD)综合征；脱抑制-痴呆-帕金森症-肌萎缩复合症(DDPAC)、苍白球-脑桥-黑质变性(PPND)、关岛-ALS综合征、苍白球黑质吕伊斯体变性(PNLD)、皮质-基底节变性(CBD)、嗜银颗粒性痴呆(AgD)、拳击员痴呆(DP)或慢性创伤性脑病变(CTE)、唐氏综合征(DS)、路易体痴呆(DLB)、亚急性硬化性全脑炎(SSPE)、MCI、C型尼曼-皮克病(Niemann-Pick disease,typeC)(NPC)、B型圣菲利波综合征(Sanfilippo syndrome type B)(粘多糖累积病III B)、或肌强直性营养不良(DM)、DM1或DM2、或慢性创伤性脑病变(CTE)。
在一些实施例中，疾病状况是具有τ病理的溶酶体贮积症。NPC是由影响胆固醇代谢的基因NPC1突变引起(拉乌(Love)等1995)，并且B型圣菲利波综合征是由存在硫酸肝素的溶酶体积聚的基因NAGLU突变引起(奥米(Ohmi)等2009)。在这些溶酶体贮积症中，观察到τ病状且对它的治疗可以减慢所述疾病的进展。其它溶酶体贮积症的特征也可以在于τ的积聚。
吩噻嗪二胺鎓盐在治疗帕金森氏病和MCI中的用途在PCT/GB2007/001105和PCT/GB2008/002066中进行了更详细地描述。
在一些实施例中，疾病状况是帕金森氏病、MCI或阿尔茨海默氏病。
在一些实施例中，疾病状况是亨廷顿氏病或其它多聚谷氨酰胺疾病，例如脊髓延髓肌肉萎缩症(或肯尼迪病(Kennedy disease))和齿状核红核苍白球丘脑下核萎缩症和各种脊髓小脑共济失调。
在一些实施例中，疾病状况是FTLD综合征(其可以例如为τ蛋白病变或TDP-43蛋白质病变，参见下文)。
在一些实施例中，疾病状况是PSP或ALS。
在一些实施例中，治疗(例如，神经变性τ蛋白病变(例如，阿尔茨海默氏病)的治疗)可以任选地与一种或多种其它药剂组合，例如，一种或多种胆碱酯酶抑制剂(例如多奈哌齐(Donepezil)(还称为AriceptTM)、卡巴拉汀(Rivastigmine)(还称为ExelonTM)、加兰他敏(Galantamine)(还称为ReminylTM)、NMDA受体拮抗剂(例如美金刚(Memantine)(还称为EbixaTM、NamendaTM)、毒蕈碱受体激动剂和/或导致β-淀粉样蛋白生成增多的淀粉样前体蛋白质加工的抑制剂。
TDP-43蛋白质病变包括肌萎缩侧索硬化(ALS；ALS-TDP)和额颞叶变性(FTLD-TDP)。
TDP-43在ALS神经变性和其它神经变性疾病中的作用已经在若干最近的出版物中进行了综述(陈-普洛特金(Chen-Plotkin)等2010；让德隆(Gendron)等2010；格斯尔(Geser)等2010；麦肯锡等人2010)。
ALS是一种神经变性疾病，特征在于进行性麻痹和肌萎缩、随后发生的在初级运动皮层、脑干和脊髓中的上和下运动神经元两者的变性。有时将它称作运动神经元疾病(MND)，但存在除ALS以外的影响或者上运动神经元或者下运动神经元的疾病。明确的诊断需要具有不能通过任何其它疾病过程解释的明显临床进展证据的、在延髓、胳膊和腿部肌肉组织中的上和下运动神经元征候(维吉塞凯拉(Wijesekera)和利(Leigh)2009)。
尽管大多数情况是ALS-TDP，但仍然存在病理性蛋白质不同于TDP-43的其它情况。错误折叠的SOD1是具有SOD1突变的ALS中的泛素阳性包涵体中的病理性蛋白质(斯珊拉曼(Seetharaman)等2009)，并且在家族性ALS的极小亚组(约3-4％)中，由于FUS中的突变(在肉瘤蛋白质中融合)，因此泛素化病理性蛋白质是FUS(万斯(Vance)等2009；布莱尔(Blair)等2010)。与TDP-43一样，FUS似乎在细胞核-细胞质的穿梭中非常重要，尽管对于受损核输入FUS的方式仍不清楚。从麦肯锡等(2010)派生的一种新的ALS分子分类反映了不同亚型中的独特的潜在病理性机理(参见下表)。
ALS的新的分子分类(自麦肯锡等2010修改)。在大多数情况下，TDP-43是在ALS中发现的病理性泛素化蛋白质。
肌萎缩侧索硬化被视为疾病分类实体已经有几乎一个半世纪，并且其被视为ICD10，并被分类为ICD 10(G12.2)中的MND的亚型。可以获得对ALS有用的、与沙可(Charcot)的原始描述几乎没有差异的可靠临床诊断，并且反映潜在分子病理学的神经病理性准则也已经被承认。
尽管ALS在病理学上被分类为三个亚群：ALS-TDP、ALS-SOD1和ALS-FUS，但后两种情况非常罕见。迄今为止最大型的研究显示，所有散发性ALS情况都具有TDP-43病理(麦肯锡等2007)。只有约5％的ALS是家族性的(伯恩(Byrne)等2010)，并且SOD1的突变(FALS中发现的最常见突变)占12-23％的情况(安德森(Andersen)等2006)。SOD1还可能牵涉到2-7％的SALS。FUS的突变似乎非常少见，只占FALS的约3-4％(布莱尔等2010)。因此，能够可靠地预测，SALS的临床情况将具有基于TDP-43的病理。类似地，由于占约4％的情况的TDP-43突变，能够在FALS中被可靠地预测该病理(麦肯锡等2010)。也已经报道，具有以下突变的ALS与TDP-43阳性病理相关：占FALS1-2％的VCP(约翰逊等2010)、ANG(萨亨(Seilhean)等2009)和CHMP2B(考克斯(Cox)等2010)。尽管尚未发现SOD1、FUS和ATXN2突变与TDP-43阳性聚集物相关，但已经报道，TDP-43与推定起因于这些突变的病理过程有关(东(Higashi)等2010；令(Ling)等2010；埃尔登(Elden)等2010)。
因此确定，TDP-43在绝大多数SALS情况的发病机理中具有重要且可能核心的作用，并且可能与相当大比例的FALS的发病机理有关。现在广泛地将ALS视为TDP-43蛋白质病变(诺伊曼(Neumann)等2009)，并且许多体外和体内研究为以下假设提供支持：毒性功能获得因TDP-43聚集而导致所述疾病的至少部分神经毒性。
FTLD综合征是徐发性、不可阻挡的进行性、神经变性病况，在中年晚期出现发作高峰。在一级亲属中经常有类似病症的阳性家族史。
行为变异性FTD的特征在于早期社会和人际功能的显著变化，经常伴有重复性行为和饮食模式变化。在语义性痴呆中，虽然言语流畅，但存在显著的找词问题，并且在认知评估上，目标知识退化并且对单个词的理解力受损。进行性非流利性失语表现为运动性言语问题和语法欠缺的组合。这三种FTLD综合征的核心临床诊断特征示于下表和内亚里(Neary)等(1998)中的完全准则中。
FTLD综合征的临床特点和核心诊断特征
在发现TDP-43阳性包涵体表征ALS和FTLD-TDP(诺伊曼等2006)后，很快鉴别出ALS的家族性和散发性情况中TARDBP基因的错义突变(吉特科(Gitcho)等2008；斯瑞德哈兰等，2008)。到目前为止，已经在全世界79个家谱无关的家族中报道了38个不同的TARDBP突变(麦肯锡等2010)。TARDBP突变占所有家族性ALS情况的约4％和散发性ALS情况的约1.5％。
截至2010年12月，已经鉴别出13个与家族性和散发性ALS相关的基因突变。已经证实ALS与5个其它染色体基因座的连锁，但目前为止，尚未鉴别出具体的突变。
用于TDP-43蛋白质病变的甲基息奥咛(MT)
MT具有靶向细胞中的TDP-43蛋白质聚集并可减少所述聚集的作用模式，所述蛋白质聚集是绝大多数家族性和散发性ALS的病理性特征并且也是FTLD-P所特有的。
另外，实验室数据显示，甲基息奥咛抑制SH-SY5Y细胞中形成TDP-43聚集物。在用0.05μM MT治疗后，TDP-43聚集物的数量减少了50％。这些发现通过免疫印迹分析得到了确认(山下(Yamashita)等2009)。
因此，本发明的化合物和组合物可以用于治疗肌萎缩侧索硬化(ALS)和额颞叶变性(FTLD)。
用于亨廷顿氏病和多聚谷氨酰胺疾病的甲基息奥咛(MT)
MT能够减少细胞中的多聚谷氨酰胺蛋白质聚集，所述聚集是亨廷顿氏病的病理性特征。亨廷顿氏病是定位于亨廷顿蛋白N端的经翻译的CAG重复的扩增引起的。野生型染色体含有6-34个重复，而在亨廷顿氏病中，染色体含有36-121个重复。疾病的发作年龄与编码所述蛋白质内聚谷氨酰胺重复的CAG段的长度反向相关联。
实验室数据显示，甲基息奥咛抑制斑马鱼中形成含有102个残基的多聚谷氨酰胺延伸的亨廷顿蛋白衍生物的聚集物(凡比博(van Bebber)等2010)。当在0μM、10μM和100μM下测试时，MT以剂量依赖性方式防止斑马鱼中形成所述聚集物。
因此，本发明的化合物和组合物可以用于治疗亨廷顿氏病和其它多聚谷氨酰胺疾病，例如脊髓延髓肌肉萎缩症(或肯尼迪病)和齿状核红核苍白球丘脑下核萎缩症和各种脊髓小脑共济失调(奥尔(Orr)和左格比(Zoghbi)，2007)。
线粒体性疾病和拉福拉病(Lafora Disease)
除了骨骼肌以外，线粒体病症、特别是呼吸链疾病(RCD)中最频繁地受到影响的器官是中枢神经***(CNS)。RCD的CNS表现包含中风样发作、癫痫、偏头痛、共济失调、痉挛状态、运动障碍、精神异常、认识能力减退或甚至痴呆(线粒体性痴呆)。到目前为止，已经在MELAS、MERRF、LHON、CPEO、KSS、MNGIE、NARP、利氏综合征和阿尔佩斯－胡滕洛赫尔病(Alpers-Huttenlocher disease)中报道了线粒体性痴呆(芬斯特雷尔(Finsterer)，2009)。涉及一系列电子转移的线粒体呼吸链中有4种复合物。这些复合物中任一个的功能异常都可能导致继发于异常的电子传送链和随后的异常线粒体呼吸的线粒体性疾病。线粒体呼吸链的复合物III用于将电子转移到细胞色素C。
本发明的化合物和组合物还可以用于治疗与呼吸链的复合物III的功能缺失和/或受损相关的的线粒体性疾病。所述化合物具有用作有效电子载体和/或电子转移体的能力，因为息奥咛部分具有在氧化形式与还原形式之间进行转化的低氧化还原电势。倘若复合物III的功能受损和/或缺乏导致线粒体性疾病，则本发明化合物还能够执行复合物III的电子传送和转移作用，这是因为息奥咛部分能够在氧化形式与还原形式之间穿梭，由此用作电子载体代替次优功能复合物III，将电子转移到细胞色素C。
本发明的化合物和组合物还具有生成活性息奥咛部分的能力，所述活性息奥咛部分能够使错误折叠的蛋白质/氨基酸单体/低聚物转移以远离Hsp70ADP相关蛋白质积聚和/或重折叠途径，并且反而使这些异常折叠的蛋白质单体/低聚物改道到直接导向Hsp70ATP依赖性泛素-蛋白酶体***(UPS)的途径，所述途径经由直接路径去除这些错误折叠的蛋白质/氨基酸单体/低聚物(金瓦尔(Jinwal)等2009)。
拉福拉病(LD)是与许多组织中不充分分支且不溶的糖原(称为葡聚糖)的逐渐积聚相关的青少年发作型常染色体隐性致命性癫痫。在脑中，葡聚糖体或拉福拉体形成于神经元中。MT对Hsp70ATPase的抑制(金瓦尔等2009)可能上调对错误折叠的蛋白质的去除。拉福拉病主要归因于由于痫蛋白(Laforin)或马林(Malin)基因(这两个基因都位于6号染色体上)突变所致的溶酶体泛素-蛋白酶体***(UPS)缺陷，这产生可能加速错误折叠的τ蛋白质聚集的包涵体。源于受损UPS的继发性性线粒体损伤可能进一步抑制线粒体活性并且损害电子传送链，从而进一步产生脂褐素并引发拉福拉病所特有的痉挛。
MT部分可以通过抑制Hsp70ATP酶来分解现有的τ聚集物，减少更多的τ积聚并提高溶酶体效率。MT可以通过其对Hsp70ATP酶的抑制作用增强泛素蛋白酶体***对τ单体/低聚物的去除，从而减少τ缠结。
因此，本发明的化合物和组合物对治疗拉福拉病可具有实用性。
所治疗的疾病状况-其它疾病状况
在一些实施例中，疾病状况是皮肤癌。
在一些实施例中，疾病状况是黑色素瘤。
在一些实施例中，疾病状况是病毒性、细菌性或原生动物性疾病状况。
在一些实施例中，(原生动物性)疾病状况是疟疾。治疗可以与一种或多种抗微生物剂(例如，氯喹和/或阿托伐醌(atovaquone))组合。
在一些实施例中，(病毒性)疾病状况是由C型肝炎、HIV或西尼罗病毒(WNV)引起的。
其它用途
本发明的另一方面涉及如本文所述的化合物在使试样(例如血液或血浆试样)中的病原体失活的方法中的用途，包含将所述化合物引入所述试样中和使所述试样暴露于光的步骤。
例如，在一些实施例中，所述方法包含将所述化合物引入所述试样中和随后使所述试样暴露于光的步骤。
用作配体
能够抑制τ蛋白质聚集的本文所述的化合物还能够用作τ蛋白质(或聚集的τ蛋白质)的配体或标记。因此，在一些实施例中，本发明化合物是τ蛋白质(或聚集的τ蛋白质)的配体。
所述化合物(配体)可以包含、偶联至、螯合至、或以其它方式联合至其他化学基团，例如稳定和不稳定的可检测同位素、放射性同位素、发射正电子的原子、磁共振标记、染料、荧光标记物、抗原组、治疗性部分或任何其他可以辅助预测、诊断或治疗应用的部分。
例如，在一些实施例中，所述化合物如本文所定义，但具有以下额外限制：所述化合物包含、偶联至、或以其他方式联合至一种或多种(例如，1种、2种、3种、4种等)可检测标记，例如同位素、放射性同位素、发射正电子的原子、磁共振标记、染料、荧光标记物、抗原组或治疗性部分。
在一些实施例中，所述化合物是配体以及标记，例如，τ蛋白质(或聚集的τ蛋白质)的标记，所述化合物包含、偶联至、螯合至、或以其他方式联合至一种或多种(例如，1种、2种、3种、4种等)可检测标记，。
例如，在一些实施例中，所述化合物如上文所定义，但具有以下额外限制：所述化合物包含、偶联至、或以其他方式联合至一种或多种(例如，1种、2种、3种、4种等)可检测标记。
标记的化合物(例如，当接合到τ蛋白质或聚集的τ蛋白质时)可以通过任何适宜的手段显现或检测，并且所属领域的技术人员应当了解，可以使用如所属领域内已知的任何适宜的检测手段。
例如，所述化合物(配体-标记)可以通过包含发射正电子的原子(例如，11C)(例如，作为一个或多个烷基取代基(例如，甲基取代基)的碳原子)并使用如所属领域内已知的正电子发射断层摄影术(PET)检测所述化合物，来适宜地检测。
所述11C标记的化合物可以通过以已知方式改编本文所述的方法来制备，所述已知方式例如与WO 02/075318(参见其中的图11a、11b、12)和WO2005/030676中所描述的方法类似。
因此，本发明的另一方面涉及标记τ蛋白质(或聚集的τ蛋白质)的方法，包含以下步骤：(i)使所述τ蛋白质(或聚集的τ蛋白质)与化合物接触，所述化合物包含、偶联至、螯合至、或以其他方式联合至一种或多种(例如，1种、2种、3种、4种等)可检测标记。所述化合物可以提供为如本文所述的组合物。
本发明的另一方面涉及检测τ蛋白质(或聚集的τ蛋白质)的方法，包含以下步骤：(i)使τ蛋白质(或聚集的τ蛋白质)与化合物接触，所述化合物包含、偶联至、螯合至、或以其他方式联合至一种或多种(例如，1种、2种、3种、4种等)可检测标记；和(ii)检测结合到τ蛋白质(或聚集的τ蛋白质)的所述化合物的存在和/或量。所述化合物可以提供为如本文所述的组合物。
本发明的另一方面涉及在相信罹患τ蛋白质病变的受试者中诊断或预测所述疾病的方法，包含以下步骤：(i)向所述受试者中引入能够标记τ蛋白质或聚集的τ蛋白质、特别是τ蛋白质的化合物(例如，包含、偶联至、螯合至、或以其他方式联合至一种或多种(例如，1种、2种、3种、4种等)可检测标记的化合物)；(ii)测定结合到τ蛋白质或聚集的τ蛋白质的所述化合物在所述受试者的脑中的存在和/或量；和(iii)使(ii)中得出的测定结果与所述受试者的疾病状态相关联。所述化合物可以提供为如本文所述的组合物。
本发明的另一方面涉及能够标记τ蛋白质或聚集的τ蛋白质的化合物(例如，包含、偶联至、螯合至、或以其他方式联合至一种或多种(例如，1种、2种、3种、4种等)可检测标记的化合物)，用于诊断或预测τ蛋白质病变的方法。所述化合物可以提供为如本文所述的组合物。
本发明的另一方面涉及能够标记τ蛋白质或聚集的τ蛋白质、特别是τ蛋白质的本发明化合物(例如，包含、偶联至、螯合至、或以其他方式联合至一种或多种(例如，1种、2种、3种、4种等)可检测标记的化合物)在用以制造用于诊断或预测τ蛋白质病变的诊断或预测试剂的方法中的用途。所述化合物可以提供为如本文所述的组合物。
那些所属领域的技术人员应当了解，作为直接给予配体/标记的替代，它们能够以前体形式给予，以供通过存在于相同受试者中或给予所述相同受试者的活化剂转化成活性形式(例如，接合形式、标记形式)。
本文所公开的配体可以作为诊断或预测方法的一部分使用。它可以用来选择供治疗的患者，或用来评价给予受试者的治疗或治疗剂(例如，τ蛋白质聚集抑制剂)的有效性。
治疗
如本文所用，术语“治疗”在治疗病况的背景下，大体涉及无论是人类还是动物(例如，在兽医应用中)的治疗和疗法，其中，达成某一期望的治疗效果，例如，对病况进程的抑制，并且包括进展速率的降低、进展速率的停止、病况的消退、病况的改善和病况的治愈。还包括作为预防措施(即，预防、防止)的治疗。
如本文所用，术语“治疗有效量”涉及当依照期望的治疗方案给予时可以有效地产生某一期望的治疗效果、与合理的效益/风险比相称的本发明化合物或包含所述化合物的材料、组合物或剂量的量。
类似地，术语“预防有效量”涉及当依照期望的治疗方案给予时可以有效地产生某一期望的预防效果、与合理的效益/风险比相称的本发明化合物或包含所述化合物的材料、组合物或剂量的量。
在本说明书的背景下“预防”不应理解为限定在完全成功，即完全保护或完全防止。而是，在本发明的背景下，预防是指在检测出症状性病况前执行的措施，旨在通过帮助延迟、缓解或避免所述特定病况来保持健康。
术语“治疗”包括例如依序或同时组合两次或更多次治疗或疗法的组合治疗和疗法。治疗和疗法的实例包括但不限于化学疗法(给予有效药剂，包括例如药物、抗体(例如，如在免疫疗法中)、前药(例如，如在光动力疗法、GDEPT、ADEPT等中)；手术；辐射疗法；和基因疗法。
例如，将利用如本文所述的化合物的治疗与一种或多种其它(例如，1种、2种、3种、4种)药剂或疗法组合，可能有益。
特定组合应由选择剂量的医师利用他/她的一般常识和所属领域的技术人员已知的给药方案决定。
药剂(即，如本文所述的化合物加上一种或多种其它药剂)可以同时或依序给予，并且可以以单独不同的给药方案并经由不同路径给予。例如，当依序给予时，药剂能够以紧密隔开的间隔(例如，经5-10分钟时段)或以更长时间间隔(例如，相隔1小时、2小时、3小时、4小时或更多小时，或倘若需要，相隔甚至更长时段)给予，准确剂量方案与治疗剂的性质相称。
药剂(即，如本文所述的化合物加上一种或多种其它药剂)可以单一剂型调配在一起，或可替代的，单独的药剂可以分别地调配并且以试剂盒的形式呈现在一起，所述试剂盒可选地具有使用说明书。
给药路径
本发明化合物或包含它的医药组合物可以通过任何方便的给药路径给予受试者/患者，无论是全身/周围还是局部(即，在期望的作用部位)。
给予路径包括但不限于经口(例如，通过摄入)；颊；舌下；经皮(包括例如通过贴片，膏药(plaster)等)；透粘膜(包括例如通过贴片，膏药等)；鼻内(例如，通过鼻喷雾)；眼(例如，通过滴眼剂)；肺(例如，通过吸入或吸入疗法，使用例如经由喷雾器例如，经由嘴或鼻)；直肠(例如，通过栓剂或灌肠剂)；***(例如，通过***栓)；非经肠，例如，通过注射，包括皮下、皮内、肌内、静脉内、动脉内、心脏内、鞘内、脊柱内、囊内、囊下、眼眶内、腹膜内、气管内、表皮下、关节内、蛛网膜下和胸骨内(包括，例如，导管内注射到脑中)；通过例如经皮下或经肌内植入储积物(depot)或储存物(reservoir)。
优选组合物是如下文所更详细描述而调配的口服组合物。
受试者/患者
受试者/患者可以为动物、哺乳动物、有胎盘哺乳动物、啮齿动物(例如，豚鼠、仓鼠、大鼠、小鼠)、鼠科动物(例如，小鼠)、兔类动物(例如，兔)、鸟类(例如，鸟)、犬科动物(例如，狗)、猫科动物(例如，猫)、马科动物(例如，马)、猪科动物(例如，猪)、羊类(例如，绵羊)、牛科动物(例如，奶牛)、灵长类动物、类人猿(例如，猴或猿)、猴(例如，绒猴、狒狒)、单孔类动物(例如鸭嘴兽)、猿(例如，大猩猩、黑猩猩、猩猩、长臂猿)或人类。
此外，受试者/患者可以为其发育形式中的任一种，例如，胎儿。
在一些实施例中，受试者/患者是人类。
组合物/调配物
尽管本发明化合物可以单独使用(例如，给予)，但经常优选将它作为组合物或调配物呈现。
因此，本发明的另一方面提供组合物，包含如本文所述的化合物和医药上可接受的载体或稀释剂。
在一些实施例中，所述组合物是包含如本文所述的化合物和医药上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的医药组合物(例如，调配物、制剂、药剂)。
在一些实施例中，所述组合物是包含至少一种如本文所述的化合物连同一种或多种那些所属领域的技术人员所熟知的其它医药上可接受的成分的医药组合物，所述其它医药上可接受的成分包括但不限于医药上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、佐剂、填充剂、缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂、润滑剂、稳定剂、增溶剂、表面活性剂(例如，润湿剂)、掩蔽剂、着色剂、调味剂和甜味剂。
在一些实施例中，所述组合物进一步包含其它活性剂，例如，其它治疗或预防剂。
适宜的载体、稀释剂、赋形剂等能够在标准医药教材中找到。参见例如医药添加剂 手册(Handbook of Pharmaceutical Additives)，第2版(阿什·M(M.Ash)和阿什·I编辑)，2001(声纳普斯信息资源公司(Synapse Information Resources,Inc.)，恩迪科特(Endicott)，美国纽约)；雷明顿的医药科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)，第20版，利平科特、威廉斯&威尔金斯出版公司(pub.Lippincott,Williams&Wilkins)，2000；和医药赋形剂手册(Handbook of Pharmaceutical Excipients)，第2版，1994。
本发明的另一方面涉及制备医药组合物的方法，包含将至少一种如本文所定义的[11C]-放射性标记的化合物连同一种或多种那些所属领域的技术人员所熟知的其它医药上可接受的成分(例如载体、稀释剂、赋形剂等)混合在一起。如果调配呈离散单元(例如，片剂等)，则每一单元都含有预定量(剂量)的所述化合物。
如本文所用，术语“医药上可接受”涉及那些在合理地医学判断范围内适用于与所述受试者(例如，人类)的组织接触而无过度毒性、刺激性、过敏反应或其它问题或并发症、并与合理的效益/风险比相称的化合物、成分、材料、组合物、剂型等。在与调配物的其它成分相容的意义上，每种载体、稀释剂、赋形剂等也都必须是“可接受的”。
所述调配物可以通过药学领域内众所周知的任何方法来制备。所述方法包括使所述化合物与构成一种或多种辅助成分的载体联合的步骤。一般来说，所述调配物是通过使所述化合物与载体(例如，液体载体、微细固体载体等)均匀且紧密地联合并且然后(如果需要)使产物成形来制备。
所述调配物可以经制备以提供快速或缓慢释放；立即、延迟、定时或持续释放；或其组合。
适于非经肠给予(例如，通过注射)的调配物包括水性或非水性、等张、无热原、无菌液体(例如，溶液、悬浮液)，其中，将述化合物溶解、悬浮或以其它方式提供(例如，以脂质体或其它微粒)。所述液体另外可以含有其它医药上可接受的成分，例如抗氧化剂、缓冲剂、防腐剂、稳定剂、抑菌剂、悬浮剂、增稠剂和使调配物与预期受体的血液(或另一相关体液)等张的溶质。赋形剂的实例包括例如水、醇、多元醇、甘油、植物油等等。用于所述调配物的适宜等张载体的实例包括氯化钠注射液、林格氏溶液或乳酸林格氏注射液。通常，液体中的化合物的浓度是约1ng/ml到约10μg/ml，例如约10ng/ml到约1μg/ml。所述调配物可以存在于单位剂量或多剂量的密封容器(例如，安瓿和小瓶)中，并且可以储存在冷冻干燥(冻干)的条件下，只需要在使用前立即添加无菌液体载体，例如注射用水。临时注射溶液和悬浮液可以由无菌粉末、颗粒剂和片剂制备。
一些优选调配物的实例
本发明的一个方面涉及剂量单元(例如，医药片剂或胶囊)，包含20mg到300mg的如本文所述的化合物(例如，通过如本文所述的方法获得，或能够通过如本文所述的方法获得；具有如本文所述的纯度；等)和医药上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在一些实施例中，剂量单元是片剂。
在一些实施例中，剂量单元是胶囊。
在一些实施例中，所述胶囊是明胶胶囊。
在一些实施例中，所述胶囊是HPMC(羟丙基甲基纤维素)胶囊。
在一些实施例中，量是30mg到200mg。
在一些实施例中，量是约30mg。
在一些实施例中，量是约60mg。
在一些实施例中，量是约100mg。
在一些实施例中，量是约150mg。
在一些实施例中，量是约200mg。
在本说明书通篇内，例如如上文所陈述的，剂量的量可以指化合物本身的量也可以指含于剂量单元中的游离碱当量的量(即LMT部分的量)。本发明明确地公开了这些替代形式。
在一些实施例中，医药上可接受的载体、稀释剂或赋形剂是或包含甘油酯(例如，Gelucire 44/14月桂酰基聚乙二醇-32甘油酯，欧洲药典(PhEur),美国药典(USP))和胶体二氧化硅(例如，2％Aerosil 200胶体二氧化硅PhEur,USP)中的一种或两种。
新颖调配物-固体剂型
一般用于片剂调配和膜包衣的工艺在干燥过程期间需要使用伴随低湿度的加热。
LMTM和其它无色-甲基噻咛(thionium)盐可能易于氧化成甲基息奥咛部分(MT)和降解成例如L天蓝(Azure)B(LAB)(参见以下方案):
对于易于氧化(如上文所解释)的诸如LMTM等材料来说，常规调配工艺可能因此导致降解且因此可能导致产物性能的不稳定性。
因此，本发明的调配物背后的原理是提供一种通过直接的片剂压缩技术或通过其它独特的压片技术并且通过囊封制造含有作为活性物质的无色-甲基噻咛盐(例如双(甲磺酸盐))(LMTM)的压缩的医药调配物和胶囊的方法，其中，所述活性物质大体上以稳定形式存在。
用于制备固体剂型的最常用方法是湿法造粒(还称为湿式造粒)。这涉及将造粒流体添加到粉末。造粒流体可以为水或挥发性足以在随后通过干燥去除的某一其它溶剂。造粒流体还可能包括粘合剂。在去除溶剂后，研磨所得团块。
湿法造粒通常优于直接压缩，因为湿法造粒更有可能克服任何与调配物中各种成分的物理特性相关的问题。湿法造粒提供具有获得可接受的固体剂型必需的所需流动和粘着性质的材料。利用湿法造粒通常可以改进固体剂型的含量均匀度，因为所有颗粒一般都含有相同量的药物。还避免了药物与赋形剂的分离。
在直接压缩中，不预先造粒，而将待压缩组合物的单独组分混合，并随后直接压缩。虽然这似乎是简洁且简单的工艺，但通过这种工艺可能难以获得在商业上可用的、具有足够强度并且还在给予后足够快速地崩解的片剂。此外，许多活性物质不能通过直接压缩来处理，这是因为它们在没有造粒步骤的情况下不能被压缩。
现在已经吃惊地发现，在制造和储存期间，本发明化合物在干式压缩的固体剂型(例如片剂)中稳定，并且所形成的降解产物(例如L天蓝B(LAB)和甲基息奥咛(MT))的量能够控制在规格内(例如，LAB小于2％和MT小于12％)。
这与例如当通过常规湿法造粒工艺处理时的LMTM的性质形成对比。不希望受限于理论，在常规湿法造粒工艺中，LMTM例如可能极不稳定，并且可能形成大量LAB和MT。
因此，本发明的一个方面提供一种呈固体剂型的包含本发明化合物的医药组合物。所述组合物优选进一步包含至少一种适于干式压缩的稀释剂。所述医药组合物的特征在于所述化合物以大体上稳定的形式存在。
本发明的另一方面提供一种自由流动的粘着粉末，包含本发明化合物和至少一种适于干式压缩的稀释剂和任选的一种或多种其它赋形剂，所述粉末能够压缩成固体剂型。
本文中的这些组合物和调配物最初是关于本发明的双(磺酸)盐、特定来说LMTM来描述的。然而，本发明调配方法的优点同样适用于无色-甲基噻咛家族的盐的其它成员。
例如，本文所述的调配物也适用于WO2007/110627(维斯塔实验室有限公司)中公开的3,7-二氨基-10H-吩噻嗪鎓盐，这些盐在上文中进行了简要论述。它们包括无色-甲基噻咛双(氢溴酸盐)(LMT.2HBr,LMTB)和无色-甲基噻咛双(盐酸盐)(LMT.2HCl,LMTC)。
因此，在更广泛的方面，本发明提供如本文所述的固体剂型的、包含下式I化合物的医药组合物或其医药上可接受的盐、溶剂化物或水合物：
其中：
R1、R9、R3NA、R3NB、R7NA和R7NB如前文所定义；
且其中，HX1和HX2中的每一个独立地为质子酸。
为了完整，应当注意，如所属领域的技术人员可以理解的，能够将上式等同写成：
其中，X1和X2是相应的抗衡离子。
优选地，X1和X2独立地为磺酸根(例如烷基磺酸根或芳基磺酸根，例如如上文所定义的RASO3 -或RBSO3 -)或卤离子(Cl-、Br-、I-)。换句话说，HX1和HX2优选独立地为磺酸(RASO3H、RBSO3H)或氢卤化物(HCl、HBr、HI)。
如下文所用，术语‘活性成分’是指相关的无色(甲基息奥咛)盐。换句话说，它是指式(I)的化合物，例如本发明化合物，例如LMTM。
本发明的另一方面提供一种通过干式压缩方法制造所述医药组合物的方
法。所述方法优选包含将活性化合物与至少一种适于干式压缩的稀释剂和任选地一种或多种其它赋形剂的紧密粉末混合物干式压缩。
在一些实施例中，所述方法包含直接压缩。
在一些实施例中，所述方法包含简单直接压缩。
在一些实施例中，所述方法包含干式造粒。
在一些实施例中，所述方法包含对赋形剂的湿式造粒、随后在颗粒外添加活性成分。
根据本发明的固体剂型有利地展现活性成分(本发明化合物-例如LMTM)的长期的化学和物理稳定性。根据本发明的医药组合物甚至在长期储存后仍具有快速溶解速率。
在本上下文中，活性成分的“大体上稳定”的形态意指在调配过程期间或在受调配产物储存时不会反应而以任何显著程度形成诸如氧化杂质或其它降解产物等的杂质的形态。
因此，在本上下文中，它可以指含有例如小于20％w/w、小于15％w/w或小于10％w/w的氧化杂质或其它降解产物的材料。换句话说，所述材料含有至少80％w/w、至少85％w/w或至少90％w/w的呈其最初(未反应)形式的纯活性成分。
在一些实施例中，含有活性成分的材料可以含有例如小于20％w/w、小于15％w/w、小于12％w/w或小于10％w/w的MT。在一些实施例中，材料可能含有例如小于5％w/w、小于3％w/w或小于2％w/w的LAB。
在本发明上下文中，“稳定”片剂是在温度和湿度的受控条件下延长储存后保持大体上稳定的片剂。稳定性测试可以利用直接暴露于所选环境条件的固体剂型或利用容纳于包装内的固体剂型实施。
活性成分的含量
未经包衣的组合物中活性成分的量通常超过约10％w/w，但可以超过20％或超过30％w/w。片剂调配物中活性成分的量通常小于约70％w/w并且一般小于60％或小于50％w/w。因此，通常，未经包衣的片剂核心组合物中活性成分的量为约10％w/w(或20％或30％)到约70％w/w(或60％或50％)。倘若如下文所述将包衣施加到组合物上，则会增加组合物的总重量并因此稍微降低活性成分在总体组合物中的百分比。
稀释剂
活性成分可能并非固有地可压缩并且因此可能需要添加适宜稀释剂以辅助压缩。
因此，本发明的医药组合物通常包含至少15％w/w、更通常至少20％w/w、至少30％w/w、至少40％w/w或至少50％w/w的稀释剂。
可使用的稀释剂包括以下的一种或多种：微晶纤维素、乳糖、甘露醇、钙盐(例如磷酸氢钙、硫酸钙和碳酸钙)和糖(例如乳糖、蔗糖、右旋糖和麦芽糖糊精)。
优选稀释剂是微晶纤维素、乳糖和甘露醇。乳糖和甘露醇的喷雾干燥形式是那些用于直接压缩或干式造粒技术的化合物特别适宜的形式。
已经意外地发现，当用干式压缩稀释剂(例如微晶纤维素、喷雾干燥的乳糖、无水乳糖和甘露醇中的一种或多种)调配如本文所述的活性成分(例如本发明的化合物，例如LMTM)时，在活性成分保持化学稳定甚至在延长储存后仍保持化学稳定的意义上，所得固体剂型是稳定的。
因此，本发明提供制备低、中或高剂量片剂(例如低、中或高剂量LMTM片剂)的方法，所述片剂是稳定的且具有良好的溶解曲线、可接受的硬度和抗剥蚀性、以及短的崩解时间。
本发明组合物的溶解
本发明人还已经吃惊地发现，本文所述的独特的固体剂型提供极快速的溶解速率。
如上文所解释并且不希望受限于理论，认为活性甲基息奥咛(MT)部分可以优选从胃和/或上胃肠道(GI tract)中吸收。因此，无色(甲基息奥咛)盐的快速崩解和快速溶解调配物将是有利的，因为这可以释放最大可能量的药物至预期吸收点。
本文所述固体剂型的快速溶解速率意指，它们能够在胃和/或下GI道中快速地溶解并且因此在彼处有效地呈现活性成分，以供快速吸收。
在一些实施例中，当使用标准药典法评估时，本发明调配物提供在30分钟内至少溶解80％，优选在15分钟内至少溶解80％，更优选在10分钟内至少溶解80％。
在一些实施例中，当使用标准药典法评估时，本发明调配物提供在30分钟内至少溶解90％，优选在15分钟内至少溶解90％，更优选在10分钟内至少溶解90％。
在一些实施例中，当使用标准药典法评估时，本发明调配物提供在30分钟内至少溶解95％，优选在15分钟内至少溶解95％，更优选在10分钟内至少溶解95％。
溶解速率可以通过如美国药典(USP)总章<711>中所述的标准药典法测量。现行USP是USP 34(2011)。例如，本发明调配物的溶解速率可以使用根据USP溶解装置2(桨)的装置测量。
在一些实施例中，上述溶解速率是在0.1M盐酸中以～5μg/ml LMT的工作浓度在50rpm的桨速下搅拌来评估。在一些实施例中，溶解速率通过分光光度分析来评估。在一些实施例中，分析包含UV/vis分光光度法(λmax LMT＝255nm)。
由于它们令人吃惊地高溶解速率，因此本文所述的调配方法能够提供具有高的生物利用度的活性化合物。
在延长储存后维持快速溶解速率，即使在‘应激’条件(即增加的温度和湿度)下储存也是如此。根据本发明方法调配的组合物的快速溶解速率和由此良好的生物利用性也高度耐受调配本身的变化形式。
其它成分
医药组合物通常还将包括滑润剂。滑润剂的实例包括硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂富马酸钠、硬脂酸、山萮酸甘油酯(glycerylbehaptate)、聚乙二醇、环氧乙烷聚合物(例如，那些以注册商标卡波蜡(Carbowax)从联合碳化物公司(Union Carbide,Inc.)、丹伯里(Danbury)、CT购得的聚合物)、月桂基硫酸钠、月桂基硬脂酸镁、硬脂酸镁与月桂基硫酸钠的混合物和氢化植物油。优选滑润剂包括硬脂酸钙、硬脂酸镁和硬脂富马酸钠。最优选的滑润剂是硬脂酸镁。滑润剂通常占总(未经包衣)片剂重量的约0.5％到约5.0％。所用滑润剂的量通常为约1.0％w/w到约2.0％w/w，优选为0.5％w/w到2.0％w/w。
除稀释剂和滑润剂外，本发明的医药组合物中还可以存在其它常规赋形剂。所述额外赋形剂包括崩解剂、粘合剂、调味剂、着色剂和助流剂。一些赋形剂可以发挥多种功能，例如作为粘合剂与片剂崩解剂二者。
片剂崩解剂可以以实现快速溶解所必需的量存在。崩解剂是当将片剂或胶囊置于水性环境中时对抗所述剂型中的粒子结合物理力的赋形剂。崩解剂的实例包括交联的聚乙烯吡咯烷酮(交聚维酮)、羟乙酸淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠(可斯卡麦勒斯钠(sodiumcroscarmellose))和预胶凝淀粉。通常，崩解剂的量可为组合物的0到约25％w/w、更通常约1％w/w到约15％w/w且一般小于10％w/w或小于5％w/w。
粘合剂是促成固体调配物中粒子粘附的赋形剂。粘合剂的实例包括纤维素衍生物(羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素)和糖，例如乳糖、蔗糖、右旋糖、葡萄糖、麦芽糖糊精和甘露醇、木糖醇、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯基吡咯烷酮、山梨醇、预胶凝淀粉、海藻酸和其盐(例如海藻酸钠)、硅酸镁铝、聚乙二醇、角叉菜胶(carrageenan)等等。通常，粘合剂的量可广泛地变化，例如为组合物的0％到95％w/w。如上文所述，赋形剂可以发挥多种功能。例如，压片稀释剂也可以用作粘合剂。
助流剂是添加到粉末中以改进其流动性的物质。助流剂的实例包括硬脂酸镁、胶体二氧化硅(例如以Aerosil等级出售的)、淀粉和滑石粉。助流剂可以以0到约5％w/w的水平存在于医药组合物中。然而，再次应当注意，所述赋形剂可以发挥多种功能。诸如硬脂酸镁等的滑润剂也可以起到助流剂的功能。
可并入本发明医药组合物中的着色剂的实例包括二氧化钛和/或适于食物的染料，例如称为FD&C染料和天然着色剂的那些。着色剂不大可能用于上文所论述的根据本发明方面的压缩的粉末混合物中，但可以构成施加到组合物上的包衣的一部分，如下文所述，在此情况下，着色剂可以高至约2.0％w/w的量存在于膜衣中。
片剂合意地是用赋予最终产品韧性、易吞咽性和雅致外观的常用膜包衣来包衣。许多聚合物膜包衣材料为本领域内已知。优选膜包衣材料是羟丙基甲基纤维素(HPMC)或部分水解的聚乙烯醇(PVA)。HPMC和PVA可以例如从卡乐康(Colorcon)以注册商标欧巴代(Opadry)以含有用作包衣助剂的赋形剂的包衣调配物商购获得。欧巴代调配物还可以含有滑石粉、聚右旋糖、三醋汀(triacetin)、聚乙二醇、聚山梨醇酯80、二氧化钛和一种或多种染料或色淀。也可使用其它适宜的成膜聚合物，包括羟丙基纤维素、乙烯基共聚物(例如聚乙烯基吡咯烷酮和聚乙酸乙烯基酯)和丙烯酸酯-甲基丙烯酸酯共聚物。使用膜包衣有益于易处理性且因为未经包衣的蓝色核心可在吞咽期间将嘴内部染色。包衣还可改进剂型的光稳定性。
对片剂的包衣可以方便地使用常用包衣锅实施。在所述工艺的优选实施例中，使用加热的入口空气将包衣锅预加热直到排气温度达到35-55℃、更优选40-50℃。这通常可能需要应用在45-75℃、优选50-65℃的入口温度下以10-15分钟加热的入口空气。然后将含有活性成分(例如LMTM)的片剂核心添加到包衣锅并且施加水性膜衣。控制喷雾速率以使床温维持在38-48℃、更优选42-44℃，直到完成所需增重(包衣重量)。
干式压缩方法
如本文所用，‘干式压缩’是指不涉及使用热或水分的压缩技术。干式压缩可以包含将活性成分与适宜稀释剂一起直接压缩，或其可以包含干式造粒(例如击压(slugging)/双压缩法或辊压)。
直接压缩可以包含将活性成分与适于直接压缩的稀释剂一起进行简单直接压缩。另替代的，其可以包含对赋形剂造粒(例如湿式造粒)以产生干燥颗粒赋形剂混合物，然后所述混合物可以与干燥活性成分(和任选地其它干燥赋形剂)一起直接压缩。可以将这称作活性成分的‘颗粒外并入’。
因此，在一些实施例中，本发明的固体剂型可以在包含简单直接压缩的制造工艺中产生。在此实施例中，将片剂成分(即活性成分(例如LMTM)、稀释剂和其它任选赋形剂)例如在翻转掺合机中以固体微粒形式掺和在一起以产生紧密的混合物，然后使用压片机压缩。
在其它实施例中，所述组合物通过干式造粒工艺制备。干法造粒是指不使用造粒流体的造粒工艺。为了对材料进行干法造粒，其组分中的至少一者(活性成分或稀释剂)必须具有粘着性质。干法造粒可通过称为“击压”的工艺实施。在“击压”中，首先通常使用具有大的平面工具的压片机(线性压机的一个实例阐释于US4,880,373中)将待造粒的材料制成大的压缩团块或“击压块”。可通过留出足够时间使空气从待压实材料逸出来而形成相当致密的击压块。然后例如通过研磨机的方式经由所需网筛手动或自动地研磨压缩的块体。通过“击压”形成颗粒也称为预先压缩。当从被造粒的击压块材料制备片剂时，将所述工艺称作“双压缩法”。
干法造粒还可使用“辊压机”来实施。在辊压机中，材料粒子是通过使所述材料在两个高压辊之间通过来固结和变得致密。然后通过研磨将来自辊压机的致密材料降低到均匀的颗粒大小。然后可将均匀颗粒与例如滑润剂的其它物质混合，以将材料制成片剂(例如，经由旋转压片机)。除医药用途外，辊压还用在其它工业中，例如食品工业、动物饲料工业和肥料工业。
干法造粒在当前通常应当理解为意指辊压或击压，且为那些所属领域的技术人员所熟知(参见例如，医药剂型:片剂(利伯曼(Lieberman)、拉奇曼(Lachman)和施瓦兹(Schwartz)(编辑)；马塞尔·德克尔公司(Marcel Dekker,Inc)，第2版，1989)和雷明顿的医药科学(杰纳罗·A·R(A.R.Gennaro)(编辑)；马克出版公司(Mack Publishing Co)，伊斯顿(Easton)，PA，第18版，1990))。
在本发明的其它实施例中，片剂是通过对赋形剂湿式造粒并且在颗粒外并入活性成分(例如LMTM)来制备。通常，所述工艺涉及用水将诸如乳糖和/或微晶纤维素等的稀释剂制成湿团块，任选地添加粘合剂，例如聚乙烯基吡咯烷酮。使湿团块干燥，然后通过丝网，以形成颗粒。然后将活性成分和诸如滑润剂等的任何剩余的赋形剂与干颗粒掺和在一起并压缩以形成片剂。
酸在本发明组合物中的用途
在一些实施例中，可以通过在调配前将合适量的某些酸添加到散装物质来稳定含有无色(甲基息奥咛)化合物的组合物(包括本发明化合物，例如LMTM)。这些酸可以在调配期间和产品的整个生命周期中用来防止进一步MT形成，由此提供稳定的医药组合物，用于这样的目的：获得相关包装成本节省的规章性批准。
因此，根据本发明，还提供一种包含如本文所述的活性成分和医药上可接受的载体的医药组合物，特征在于，所述调配物另外包含足以防止MT形成的量的酸。不希望受限于理论，认为优选pK1大于1.5的酸。在一些实施例中，所述酸是以5％w/w到25％w/w的量存在。
优选地，所述组合物是通过如上文所述的干式压缩方法制备。
用于本发明目的的优选酸是马来酸(pK1 1.9)、磷酸(pK1 2.12)、抗坏血酸(pK14.17)、山梨酸(pK1 4.76)、天冬氨酸和唾液酸。所添加酸的稳定效应可以通过选择合适的载体得到增强。载体优选为甘露醇、纤维质材料或淀粉或其混合物。载体通常以占调配物至少40％w/w的量存在。
粒径
也已经发现，MT形成的显著减少还可以通过选择干燥粉末掺合物的合适粒径范围来实现，通常其中，超过10％的粒子具有大于10微米的大小。因此，根据本发明的另一方面，提供一种包含如本文所述的活性成分和医药上可接受的载体的医药组合物，特征另外在于，所述组合物包含超过10％、具有大于10微米的大小的粒子。
载体
已经发现，MT形成的显著减少还可以通过选择合适的载体、特别是抵制水进入的粒子形状的载体来实现。例如，具有非多孔表面且具有形状光滑并且平坦的长层状粒子的Elcema TM似乎通过限制水的进入来减少MT形成。乙基纤维素、甘露醇和淀粉1500TM和微晶纤维素也特别适于此目的。
因此，根据本发明的另一方面，提供一种包含无色(甲基息奥咛)化合物(例如本发明化合物，例如LMTM)和医药上可接受的载体的医药组合物，特征在于，所述载体是ElcemaTM、乙基纤维素、甘露醇或淀粉1500TM。
囊封
根据本发明的稳定干燥粉末掺合物可以例如通过压缩成片剂或填充到胶囊(通过例如调配物实例1到4中所述的手段预先转化成造粒粉末或不进行此预先转化)中进行调配，以得到具有极佳贮存期的医药组合物。
根据本发明的胶囊通常为明胶或优选HPMC。优选赋形剂包括乳糖、淀粉、纤维素、乳糖和高MW聚乙二醇。
结论
刚完成制造后的根据上文所述方法制备的医药组合物和调配物比使用常规水性造粒生产的调配物更稳定。此外，它们可以表现出增强的储存稳定性。
例如，由此制备的医药调配物(LMTM的含量为10重量％到50重量％、优选15重量％到40重量％)使以下成为可能：在标准的稳定性测试中，例如在长期加速的稳定性测试中，在25℃的温度和60±5％的相对湿度下，在24个月时期内，相对于LMTM峰面积，L天蓝B的含量不会增加超过2％。
在处理期间和储存时，无色(甲基息奥咛)化合物(例如LMTM)还可以氧化而产生少量MT(参见上文方案)。
在本发明无色调配物中存在相对较小浓度(例如小于12％)的MT虽然不合意，但认为这本身并不具有不利的临床意义，因为即使机体存在有来自LMTM和各种其它无色盐的带电或氧化形式的MT，其仍然能够在被吸收前还原成为不带电(还原)的MT形式。除了在诸如掺和和压片等的处理期间形成少量MT以外，本发明的无色-甲基息奥咛盐还可与吸收于赋形剂上和存在于片剂内的氧反应，得到更多的MT，特别是在水分存在下。
本发明调配物的一个优点是将片剂中形成的MT量降到最低，例如当在25℃和60％的相对湿度下储存2年时降到小于12％。这是指在片剂的处理和储存期间形成的MT的累积量：通常，本发明的调配方法使处理期间形成的MT小于5％；然后在完成的包装的储存期间形成最大约5-7％的MT。这提供至少24个月的贮存期。
这在下文调配物实例中得到了证实。
剂量
所属领域的技术人员应当了解，所述化合物和包含所述化合物的组合物的合适剂量可以随患者不同而变化。最佳剂量的确定通常会涉及将治疗益处的水平针对任何风险或有害副作用进行平衡。所选剂量水平将取决于多种因素，包括但不限于特定化合物的活性、给药路径、给药时间、所述化合物的***速率、治疗持续时间、组合使用的其它药物、化合物和/或材料、病况的严重程度和患者的物种、性别、年龄、重量、状况、总体健康状况和先前医疗史。化合物的量和给药路径最终应由医师、兽医或临床医师决定，但通常所述剂量应当经过选择以在作用部位达到实现期望效果而不会造成实质性伤害或有害副作用的局部浓度。
在整个治疗进程中可以以单剂量连续地或间歇地(例如，合适的间隔下分次剂量)影响给药。最有效的给药手段和剂量的确定为那些所属领域的技术人员所熟知，并且应当随用于治疗的调配物、治疗目的、所处理靶细胞和所治疗的受试者而变化。可以根据治疗医师、兽医或临床医师所选择的剂量水平和模式实施单次或多次给药。
一般来说，所述化合物的适宜剂量是在约100ng到约25mg(更通常约1μg到约10mg)/千克受试者体重/天的范围内。
在一些实施例中，所述化合物是根据以下剂量方案给予人类患者：约100mg，每天3次。
在一些实施例中，所述化合物是根据以下剂量方案给予人类患者：约150mg，每天2次。
在一些实施例中，所述化合物是根据以下剂量方案给予人类患者：约200mg，每天2次。
实例
提供以下实例仅仅用于阐释本发明，而并不打算限制其范围。
实例1-合成和表征
10-乙酰基-N,N,N’,N’-四甲基吩噻嗪-3,7-二胺的实验室合成
3,7-二硝基-10H-吩噻嗪(2)的合成
向装配有温度计、滴液漏斗和冷凝器的1升的3颈圆底烧瓶(RBF)中添加吩噻嗪(MW199.28g/mol,25.00g,125.5mmol)和二甲基亚砜(250ml)，将所述混合物搅拌2分钟或直到吩噻嗪溶解。然后将冷凝器连接到一半填充有水的德雷克塞尔瓶(Dreschel bottle)。然后将亚硝酸钠(MW 69.00g/mol,51.94g,752.7mmol)添加到RBF，并且将乙酸(150ml)添加到滴液漏斗。然后经20分钟期间以逐滴方式将乙酸添加到RBF。淡黄色浆液变成红色，并且从溶液中沉淀出固体。在完成乙酸添加后，将混合物在环境温度下(36-20℃)搅拌2小时，然后将温度增加到95℃并且搅拌17小时。此后，将混合物冷却到50℃并添加甲醇(100ml)并且将混合物进一步冷却到22℃。然后将冷却的混合物过滤，并且用甲醇(3×25ml)洗涤滤饼。将洗涤的滤饼置于过滤器上，施加真空30分钟，然后在50℃干燥15小时，得到棕色固体产物(MW289.27g/mol,29.45g,81％)。
注释
1.乙酸的添加产生NOx气体，通过使所述气体鼓泡到一半填充有水的德雷克塞尔瓶中将所述气体转化成硝酸。
2.乙酸的添加是放热的并且混合物从22℃上升到36℃。
3.添加甲醇以帮助溶解任何乙酸钠并且作为抗溶剂以使产物产量最大。
4.使用二甲基甲酰胺(DMF)、乙腈(MeCN)、四氢呋喃(THF)、丙酮或二甲氧基乙烷(DME)作为反应溶剂也能进行成功的合成。
NMR：将产物(5mg)溶解于DMSO-d6(1.5ml)中并且可能需要将其加热以完全溶解固体。
δH(400MHz；DMSO-d6)：6.72(2H,d,J 8.8,ArH),7.77(2H,d,J 2.8,ArH),7.87(2H,dd,J 2.8,8.8,ArH)
3,7-二硝基-10-乙酰基吩噻嗪(3)的合成
向装配有温度计和冷凝器的500ml的3颈圆底烧瓶中添加3,7-二硝基-10H-吩噻嗪(MW 289.27g/mol,29.00g,100mmol)、二甲基甲酰胺(58ml)、乙酸酐(MW 102.09g/mol,102.09g,1000mmol)和三乙胺(MW 101.19g/mol,40.88g,401mmol)。将混合物加热到105℃并且在此温度下搅拌3小时。将混合物冷却到环境温度(21℃)，然后冷却到5℃，在此温度下将它搅拌1小时。通过过滤分离产物并且用甲醇(3×30ml)洗涤，得到淡黄色结晶固体，将所述固体在50℃干燥15小时(MW 331.31g/mol,26.94g,81％)。
注释
1.在反应期间，在105℃约1小时后形成产物晶体。
2.在冷却时，大部分产物在约70℃沉淀。
3.在用甲醇洗涤前，产物为橙色。
NMR：将产物(10mg)溶解于DMSO-d6(1.5ml)中。
δH(400MHz；DMSO-d6)：2.25(3H,s,CH3),7.92(2H,d,J 8.8,ArH),8.28(2H,dd,J8.8,2,ArH),8.47(2H,d,J 2,ArH)
10-乙酰基-N,N,N’N’-四甲基吩噻嗪-3,7-二胺(5)的合成
向装配有温度计和冷凝器的100ml的3颈圆底烧瓶中添加3,7-二硝基-10-乙酰基吩噻嗪(MW 331.31g/mol,5g,15.09mmol)、碳载钯(10％，干燥，0.5g)和2-甲基四氢呋喃(25ml)。将烧瓶抽真空并用氢吹扫5次，然后将混合物加热到56℃。17小时后，判断还原已经达到完成(参见薄层色谱法(tlc)条件)，得到化合物4，并且添加***(MW 30.03g/mol,14.7g,181.1mmol)。再次将烧瓶抽真空并且用氢吹扫5次。从在56℃添加***开始71小时(总时间为88小时)后，通过tlc判断四甲基化完成。在50℃将混合物过滤，用2-甲基四氢呋喃(3×5ml)洗涤灰色催化剂并且合并滤液和洗涤液。向此溶液中添加甲醇(5ml)以使混合物均匀。冷却到5℃使无色固体从溶液中沉淀出来。进一步添加两体积的甲醇(10ml)并且将浆液在5℃搅拌50分钟。通过过滤分离粗制产物，获得无色固体，用甲醇(3×5ml)洗涤所述无色固体并且在50℃干燥16小时(MW 327.45g/mol,2.26g,46％)。向来自分离过程的滤液中添加水(50ml)，进一步产生固体。将悬浮液在5℃搅拌2小时，然后通过过滤收集，用甲醇(3×5ml)洗涤然后在50℃干燥13小时(MW 327.45g/mol,0.83g,17％)。产物的总产量是(3.09g,63％)。
注释
1.正相tlc条件，洗脱液75％乙酸乙酯，25％石油精(40-60℃)和UV灯，254nm。
2.二硝基起始材料的保留因子是0.68，为黄色斑点；氢化产物的保留因子是0.25，为蓝色斑点；并且甲基化产物的保留因子是0.67，为淡蓝色斑点。
3.氢化步骤的tlc分析方法是直接点样，而甲基化产物的分析是将水等分添加到反应，用乙酸乙酯萃取所述试样然后点样。
4.17小时后，tlc显示两个斑点，主斑点是还原产物，次斑点未知。
5.88小时后，tlc主要显示四甲基化产物，为主斑点。
6.通常，还原和甲基化会在72小时内完成。
7.两个试样的1H NMR波谱分析得到相同的波谱，检测到2-甲基四氢呋喃的迹线以及5ppm处的未知信号。
NMR：将产物(10mg)溶解于CDCl3(1.5ml)中。
δH(400MHz；CDCl3):2.09(3H,s,CH3),2.86(12H,s,NCH3),6.54(2H,d,J 8,ArH),6.64(2H,s,ArH),7.19(2H,brd s,ArH)
10-乙酰基-N,N,N’N’-四甲基吩噻嗪-3,7-二胺(5)的替代合成
向50ml圆底烧瓶中添加3,7-二硝基-10-乙酰基吩噻嗪(MW 331.31g/mol,1g,3.02mmol)、锌粉(MW 65.39g/mol,1.38g,21.13mmol)、甲醇(6ml)和四氢呋喃(2ml)。将混合物加热到50℃，此后缓慢添加氯化铵水溶液(MW 53.49g/mol,2.26g,42.26mmol，溶解于6ml水中)的温热溶液(45-50℃)以维持温和回流。然后将混合物加热到70℃并且在此温度下搅拌2小时，此后将它冷却到环境温度(23℃)。将冷却的混合物过滤以去除锌盐并且用低聚甲醛(MW 30.03g/mol,1.09g,36.22mmol)、氰基硼氢化钠(MW 62.84g/mol,1.14g,18.11mmol)和乙酸(2ml)处理含有化合物4的滤液。将混合物加热到50℃并且在此温度下搅拌3小时。在冷却到环境温度(23℃)后，添加水(2×10ml)并且将无色浆液搅拌16小时。然后通过过滤收集固体，并且用甲醇(3×2ml)洗涤，得到呈灰白色(off-white)固体的标题化合物(MW327.45g/mol,0.91g,92％)。
注释
1.使用锌和氯化铵水溶液的还原反应快速并且彻底，达到完成只用了2小时，通过tlc分析没有其它斑点记录。
2.使用氰基硼氢化钠、低聚甲醛和乙酸的还原性甲基化快速并且彻底，达到完成只用了3小时。
NMR：将产物(10mg)溶解于CDCl3(1.5ml)中。
δH(400MHz；CDCl3):2.17(3H,s,CH3),2.94(12H,s,NCH3),6.61(2H,d,J 8,ArH),6.71(2H,s,ArH),7.26(2H,brd s,ArH)
合成1：N,N,N’,N’-四甲基-10H-吩噻嗪-3,7-二胺鎓双(甲磺酸盐)(LMT.2MsOH)的 合成
将10-乙酰基-N,N,N’N’-四甲基-10H-吩噻嗪-3,7-二胺(AcMT)(150g)添加到3颈圆底烧瓶。添加甲苯(1.8l)并且将混合物加热到回流并保持30min。将溶液冷却到70℃，然后通过在线5μ过滤器到达装配有蒸馏装置的夹套式器皿。1将甲苯(150ml)添加到圆底烧瓶。这用来冲洗输送管线和过滤器。在减压下蒸馏掉约1.4l甲苯。2将温度降到18℃，然后添加水(42ml)。3此后经5min期间添加甲磺酸(MSA)(65.5ml,99％,2.2当量)。4添加第二部分的水(18ml)。将混合物加热到85℃并保持3h，此时通过tlc分析判断反应完成。将两相溶液冷却到50℃，然后经20min添加无水EtOH(150ml)。5使用150mg N,N,N’,N’-四甲基-10H-吩噻嗪-3,7-二胺鎓双(甲磺酸盐)接种混合物。6-8经90min添加第二部分的EtOH(600ml)9并且经1h将反应冷却到20℃。10在此温度下将它搅拌1h，然后通过过滤收集固体。用3×300ml MeCN洗涤滤饼11，经5min吸干，并置于真空下过夜，得到黄色结晶固体产物(85-90％产率)。
νmax(KBr)/cm-1；3430(NH),3014(＝CH),2649(C-H),1614(C＝C),1487(C-C),1318(S＝O),1199(SO2-O),1059(S＝O),823(ArC＝-H)
δH(600MHz；CD3OD)；2.71(6H,s,SCH3),3.21(12H,s,NCH3),6.75(2H,d,J 8.8Hz,ArH),7.22(4H,d J 2.9Hz,ArH),7.24(4H,dd J 2.9,8.8Hz,ArH),
δC(100MHz；CD3OD)；38.2(SCH3),45.9(NCH3),115.0(CH),118.2(CH),118.7(QC),119.9(QH),137.1(CH),142.8(QC)
MP：271℃
m/z计算值285.129970；观察值285.131292(100％,[M-2MSA]+)。
m/z(ES-)：计算值95；观察值95(100％,[M-LMT]-)。
元素分析％(C18H27N3O6S3)：计算值C(45.26),N(8.80),S(20.14),H(5.70)；观察值C(45.19),N(8.76),S(19.84),H(5.53)
注释
1.加热到回流以确保AcMT完全溶解以供输送经过5μ过滤器。甲苯是良好的溶剂，并且70℃的目标是确保材料保持在溶液中与将对塑料输送软管和过滤器的潜在损害降到最低之间的折衷。
2.500ml的剩余甲苯确保反应体积满足反应器的最小搅拌深度。
3.控制水的体积以确保产物作为自由流动的沉淀物结晶出来。接种(Seeding)反应物以减小水体积微小变化的影响。
4.使用2.2当量MSA来实现水解并且形成盐，同时留下足量的过量酸(0.2当量)以确保溶液中产物的稳定性。添加MSA引起轻微放热，因此添加时间为5分钟。
5.使用EtOH作为反萃溶剂来使产物沉淀。在接种前添加一部分以确保晶种不会溶解。延长添加时间确保产物受控结晶(参见注释7和8)。
6.可以不使用晶种实施反应，但并入晶种可确保LMT.2MsOH较早沉淀，进而防止形成副产物(例如醇酯EMS，一种潜在的具遗传毒性的副产物-在该合成过程中未检测到)和囊封EtOH。
7.晶种还可以用作控制产物的粒径的手段。当使用在研钵和研杵中研磨到<100μm的晶种材料时，观察到产物的平均粒径显著减小。当使用<100μm的未经研磨的晶种时，没有观察到所述效应。因此，不希望受限于理论，晶种控制粒径的能力似乎并不是晶种粒径的函数，它与破碎晶种暴露的内部或‘新’晶面的比例关联。
8.最后，当晶种材料相对较大并且未经破碎时，在添加EtOH期间，大量产物(皮)可能粘附到反应器器皿的侧面。这可以通过在添加EtOH后将加热/冷却循环引入到所述过程来减少。然而，利用破碎的晶种的一个预料不到的好处是将添加EtOH后出现的结皮材料的水平减少约90％。因此，不再必须实施加热/冷却循环。这似乎与小的晶种大小而非新面关联，因为当使用未经破碎的<100μm的晶种实施反应时，观察到结皮的相同减少。
9.EtOH的添加速率对粒径和EtOH的并入具有作用。快速添加(<1h)减小粒径，但EtOH的并入增加。缓慢添加(2h)具有相反的作用，因此必须达成平衡。
10.冷却速率具有类似但减小的作用。快速冷却(<1h)使粒径减小，伴随EtOH水平的增加。缓慢冷却具有相反的作用。
11.在去除相关物质方面，EtOH与MeCN一样有效，但使用它会伴有所保留的EtOH的水平的微小增加。
N,N,N’,N’-四甲基-10H-吩噻嗪-3,7-二胺鎓双(甲磺酸盐)(LMT.2MsOH)的表征
元素分析(微量分析)
所述分析在碳、氮、氢和硫的理论值与分析值之间具有良好的相关性。
元素分析结果：
1H-核磁共振(NMR)波谱分析
在瓦里安(Varian)600MHz仪器上在氘化甲醇CD3OD中获得1H NMR波谱并且示于图1中。
1H NMR波谱的赋值如下：
13C-核磁共振(NMR)波谱分析
在瓦里安400MHz NMR仪器上以100.56MHz的频率在氘化甲醇CD3OD中获得13C NMR波谱并且示于图2中。
13C-NMR波谱的初始赋值是基于与已知化学位移图表的相关性(文献参考：有机化合物的结构测定：波谱数据表，普雷士·E(Pretsch E.)等，施普林格(Springer)，伦敦，第122页)。
其它赋值利用DEPT-135、HSQC和HMBC实验来明确地确认赋值。在瓦里安400MHzNMR仪器上以100.56MHz的频率获得DEPT-135(不失真极化转移增强)、HSQC(异核单量子相干)和HMBC(异核多重键相关)波谱(参见图3-5)。
红外波谱分析(IR)
将试样与200mg无水KBr在研钵和研杵中彻底地混合并研磨。然后使用模具以1500psi的压力将此混合物压制成盘状物。然后在尼高力阿凡达(Nicolet Avatar)320FT-IR波谱仪上获得IR波谱。波谱示于图6中。
红外波谱的赋值：
质谱分析(MS)
使用沃特世(Waters)LCT普瑞美(Premier)XE质谱仪实施质谱分析。采用1ml/hr的流速。用于活性组分分析的源是呈阳性模式的电子碰撞电离。用于甲磺酸根抗衡离子分析的源是呈阳性模式的电喷射电离。
使用电子碰撞电离时，在285下观察到主峰(参见图7)。此对应于分子离子C16H19N3S。测量的准确质量和理论值的比较提供如下：
理论值 峰m/z 丰度(％) 赋值
285.129970 285.131292 100 C16H19N3S
测量的精确质量与C16H19N3S的计算质量非常一致。
使用电喷射电离时，在95下观察到主峰(参见图8)。此对应于抗衡离子CH3O3S的分子离子：
峰m/z 丰度(％) 赋值
95 100 CH3O3S
紫外-可见波谱分析(UV-Vis)
将5mg试样溶解于去离子水中并且在容量瓶中补足到100ml。使用石英比色杯在铂金埃尔默拉姆达(Perkin Elmer Lambda)25UV/Vis波谱仪中实施分析。UV-Vis波谱示于图9中。
UV-Vis波谱的赋值：
λmax在255nm下的消光系数ε是34254.64。这是根据比尔-朗伯定律计算得到：
&epsiv; = A C &times; l
其中，A＝吸光度Log(I0/I)3.5860；C＝浓度Mol/L；l＝路径长度1cm。
高效液相色谱法(HPLC)
提交100mg试样用于HPLC分析。在具有用于同一性的VWD检测器或PDA的安捷伦(Agilent)1200系列上根据下表中汇总的方法实施分析。
HPLC方法：
HPLC迹线示于图10中。发现有机纯度为99.45％w/w。
结晶形式
在上述方法中，以结晶形式产生LMT.2MsOH。LMT.2MsOH的结晶形式由图11示出的X射线粉末衍射谱图解说明。XRPD展现尖锐信号，表明高的结晶有序度。可以观察到相对峰强度的变化，这些变化归因于与粒径差异组合的取向效应。只观察到作为试样厚度的函数(0.1mm对1.0mm)，的相对峰强度微小变化(小于50％)。
通过FT-拉曼、热重量(TG)、示差扫描量热法(DSC)、动态蒸气吸附(DVS)分析和显微镜检查进一步表征晶体形态(图12-16)。可以将此形式方便地称作‘形态A’。
从乙醇、甲磺酸和水中获得用于单晶X射线分析的晶体。参见图17c。
仪器细节
X射线粉末衍射：布鲁克08阿得旺斯((Bruker 08 Advance)，Cu Ka辐射40kV/40mA，联凯(LynxEye)检测器，0.02°2θ步长，37s/步，2.5°-50°2θ扫描范围。在具有0.1mm或1.0mm深度的硅单晶体试样架上准备试样，除了施加微小压力以获得平坦表面外，没有进行任何特殊处理。在测量期间使所有试样旋转。
示差扫描量热法：铂金埃尔默(Perkin Elmer)DSC 7金坩埚，封闭在N2中，加热速率为20℃/min，扫描从-50℃到280℃。
动态蒸气吸附：普罗杰克美斯塔克(Projekt Messtechnik)SPS 11-100n水蒸气吸附分析仪。将试样置于微量天平顶部上的铝坩埚中并且在25℃和50％r.h.下平衡，然后开始25℃下的预界定湿度程序(50-0-95-50％r.h.，以Δr.h.＝5％h-1和极值下的'等湿(isohumid)'平衡期进行扫描)。
FT-拉曼波谱分析：布鲁克RFS100。Nd:YAG 1064nm激发，50mW激光功率，Ge-检测器，128次扫描，范围50-3500cm-1，2cm-1分辨率。铝试样架。
偏振光显微镜检查：带有莱卡(Leica)OFC280CCO照相机的莱茨奥索普兰(LeitzOrthoplan)显微镜。
TG：TA仪器TGA Q5000。开口铝坩埚，N2气氛，加热速率为
10℃min-1，范围25-300℃。
TG-FTlR：带有布鲁克FT-IR波谱仪维克塔(Vector)22的耐驰热-微量天平(Netzsch Thermo-Microbalance)TG 209。带有微孔的铝坩埚，N2气氛，加热速率为10℃min-1，范围为25-250℃。
不希望受限于理论，提议此形式代表LMT.2MsOH唯一稳定的多晶形式。多晶现象研究已经显示，形式A在几乎所有的结晶***中再现(使用脱气溶剂在惰性气氛中实施研究)。
非晶形LMT.2MsOH可以通过蒸发LMT.2MsOH水溶液来制备，然而，非晶形材料在进一步干燥是会再结晶成形式A。
AcMT和LMT.2MsOH的工业规模合成
10-乙酰基-N,N,N’N’-四甲基-10H-吩噻嗪-3,7-二胺(AcMT)的大规模合成
将乙腈(MeCN)(300l)添加到反应器1(R1)并且冷却到-5-0℃。添加氯化甲基息奥咛三水合物(MTC.3H2O)(150kg)并且使温度升到15-25℃。添加三乙胺(Et3N)(100l)，随后进行MeCN冲洗(20l)。经30min添加肼水合物(N2H4.H2O)(12l)。经1h使反应温度升到60-70℃并且随后在此温度下维持1h，然后降到40-50℃。经1h添加乙酸酐(Ac2O)(240l)，随后进行MeCN(20l)冲洗。使批料温度升到90-100℃并保持2h。使温度降到55-65℃并且经2h添加水(340l)，同时维持所述温度。然后经2h使批料温度降到-5-5℃并且在此温度保持6h。通过过滤收集固体。将滤饼完全脱水，然后将水(400l)添加到R1。使R1中的温度升到15-25℃，然后将水逐份用于洗涤滤饼。将产物在氮气流中干燥6h，然后卸载(产量：90-110kg)。
10-乙酰基-N,N,N’N’-四甲基-10H-吩噻嗪-3,7-二胺(AcMT)的大规模纯化
将水(300l)添加到R1，随后添加10-乙酰基-N,N,N’N’-四甲基-10H-吩噻嗪-3,7-二胺(AcMT)(100kg)。添加甲苯(400l)和80％乙酸水溶液(40l)，随后进行水洗(50l)。使批料温度升到75-85℃并保持1h。停止搅拌器并且使各层沉降30min。去除下部水层并且然后添加新鲜水(300l)、80％乙酸水溶液(40l)，随后进行水洗(50l)。将混合物在75-85℃搅拌1h，然后停止搅拌器，并且使各层沉降30min。去除下部水层并且然后添加新鲜水(300l)、80％乙酸水溶液(40l)，随后进行水冲洗(50l)。将混合物在75-85℃搅拌1h，然后停止搅拌器。使各层沉降30min，然后去除下部层并添加水(390l)，并且将混合物搅拌1h。停止搅拌动器并且使各层沉降30min。去除下部水层并且使温度降到-5-5℃。使夹套温度升到80℃并且然后在它达到60℃时，经2h使温度降到-10-0℃。将混合物搅拌4h，然后将它转移到过滤器。将滤饼完全脱水，然后将甲苯(150l)添加到R1。将甲苯在R1中搅拌30min，然后将它逐份用于洗涤滤饼。将产物在过滤器上在氮气流中干燥48h直到干燥损失<1％，然后卸载(产量：75-90kg)。
N,N,N’,N’-四甲基-10H-吩噻嗪-3,7-二胺鎓双(甲磺酸盐)(LMT.2MsOH)的大规模合成
将AcMT(18-22kg)添加到R1。添加甲苯(体积(l)＝16×AcMT重量)并且将混合物加热到90-100℃并保持30min。将溶液冷却到60-80℃，然后通过在线5μ过滤器到达反应器2(R2)的。将甲苯(50l)添加到反应器1(仍在约70℃)并且搅拌30min。将此用于冲洗输送管线和过滤器。上述过程再重复一次。然后开始通过减压蒸馏而从R2中去除过量甲苯的过程。R2的容量允许，依照上述方法将额外两份AcMT(各18-22kg)从R1转移到R2。当R2中的批料体积降到～340l时，蒸馏完成。使温度升到95-105℃并保持15-30min，然后冷却到15-25℃。将水(20l)添加到R2。此后添加甲磺酸(MSA)(33l,99％,2.2当量)，同时将批料温度保持在15-30℃。添加第二部分水(10l)并且在此温度将混合物搅拌2h。将混合物加热到80-90℃并保持3-4h。将双相溶液冷却到48-58℃，然后经15-30min添加无水EtOH(75l)。停止搅拌器并且使用150g破碎的(<100μ)N,N,N’,N’-四甲基-10H-吩噻嗪-3,7-二胺鎓双(甲磺酸盐)接种混合物。经80-110min添加第二部分EtOH(300l)。将夹套温度设定为10℃并且当温度达到25℃时，将夹套温度重新设定为20℃。将它在15-25℃搅拌2h，然后通过过滤收集固体。将滤饼彻底地脱水。将MeCN(300l)添加到R2并且搅拌15min，然后逐份用于洗涤滤饼。将第二个300l的MeCN添加到R2并且重复洗涤过程。将产物在过滤器上干燥直到干燥损失<0.2％，然后卸载(80-90％产率)。
合成2：N,N,N’,N’-四甲基-10H-吩噻嗪-3,7-二胺鎓双(乙磺酸盐)的合成和分析 (LMT.2EsOH)
LMT.2EsOH的合成方法
LMT.2EsOH的合成是通过对10-乙酰基-N,N,N’,N’-四甲基-10H-吩噻嗪-3,7-二胺的酸水解来实施的。所用酸是乙磺酸并且溶剂组合是甲醇水溶液。
实验细节
向100ml圆底烧瓶中添加10-乙酰基-N,N,N’,N’-四甲基-10H-吩噻嗪-3,7-二胺(5g,15.27mmol,MW 327.45g/mol)、(70％水溶液)乙磺酸(7.21g,45.81mmol,MW 110.13g/mol)和甲醇(25ml)。将混合物加热到75℃并且在此温度搅拌4小时，然后将混合物经冰水冷却。没有固体形成并在真空中去除甲醇，得到粘性绿色油状物。向此油状物中添加异丙醇(25ml)并且将混合物加热到回流以确保均质溶液。冷却后立即添加丙酮直到形成沉淀物。将悬浮液经冰水冷却1小时，然后过滤，得到呈黄色固体的粗制产物，所述产物在暴露于空气后变为绿色。将粗制物用丙酮(3×5ml)洗涤并且风干3天，得到呈淡绿色固体的粗制产物(3.35g,43％,MW 505.68g/mol)。
νmax(KBr)/cm-1；3448(NH),3263(＝CH),3030(＝CH),2987(CH),2938(CH),2582(SO3H),2452(SO3H),1487(C-C),1211(O＝S＝O),1188(O＝S＝O),1145(O＝S＝O),1026。
δH(400MHz；D2O):1.07(6H,t,J 7.6,CH3),2.72(4H,q,J 7.6,SCH2),3.02(12H,s,NCH3),6.54(2H,d,J 9.2,ArH),7.02(4H,brd s,ArH)；
δC(100MHz；D2O):142.3(QC),136.6(QC),119.9(CH),118.4(QC),118.2(CH),115.2(CH),46.2(NCH3),45.3(SCH2),8.3(CH3)。
MP:208-210℃(IPA/丙酮)
m/z(EI+)：计算质量285.129970；观察值285.129761(100％,[M-2EsOH]+)。
m/z(ES-)：计算质量109；观察值109(100％,[M-LMT]-)。
晶体学
将1g LMT.2EsOH试样溶解于乙酸(～0.1g)中并且将乙酸乙酯层放于顶部并使其在黑暗中缓慢扩散3天。晶体生长并被收集，并通过X射线衍射进行分析，并且确认产物为双(乙磺酸盐)。参见图17a。
合成3：N,N,N’,N’-四甲基-10H-吩噻嗪-3,7-二胺鎓双(对甲苯磺酸盐) (LMT.2TsOH)的合成和分析
LMT.2TsOH的合成方法
LMT.2TsOH的合成是通过用碳酸钠中和N,N,N’,N’-四甲基-10H-吩噻嗪-3,7-二胺鎓二氯化物并将中性物质萃取到有机溶剂中来实施。用对甲苯磺酸处理萃取物并且将混合物浓缩到干燥。
实验细节
向50ml烧杯中添加碳酸钠(0.59g,5.58mmol,MW 105.99g/mol)和水(10ml)，搅拌混合物直到固体已经溶解。向100ml分液漏斗中添加N,N,N’,N’-四甲基-10H-吩噻嗪-3,7-二胺鎓二氯化物(1g,2.79mmol,MW 358.33g/mol)、四氢呋喃(35ml)和二***(5ml)，然后添加碳酸钠水溶液。将中性物质萃取到有机溶剂层中并与水层分离。向有机萃取物中添加预先溶解在四氢呋喃(5ml)中的对甲苯磺酸一水合物(1.06g,5.58mmol,MW 190.20g/mol)并且将所述混合物浓缩到干燥，得到呈易碎的绿色非晶形泡沫的产物(MW 629.8216g/mol)。
νmax(KBr)/cm-1；3440(NH),3270(＝CH),3032(＝CH),2628(SO3H),1484(C-C),1194(O＝S＝O),1122(O＝S＝O),1032。
δH(400MHz；D2O)；2.24(6H,s,CH3),3.09(12H,s,NCH3),6.62(2H,d,J 8.4,ArH),7.10(4H,s,ArH),7.13(4H,d,J 8.4,Ts-H),7.61(4H,d,J 8.4,Ts-H)
δC(100MHz；D2O)；19.9(CH3),45.9(NCH3),115.0(CH),118.2(CH),118.6(QC),119.9(CH),125.5(CH),128.5(CH),137.0(QC),140.5(QC),141.9(QC),142.8(QC)。
Mp:108℃(THF/Et2O)
m/z(EI+)：计算质量285.129970；观察值285.129398(100％,[M-2TsOH]+)。
m/z(ES-)：计算质量171.0116；观察值171.0121(100％,[M-LMT]-)。
合成4：N,N,N’,N’-四甲基-10H-吩噻嗪-3,7-二胺鎓乙二磺酸盐(LMT.EDSA)的合 成和分析
LMT.EDSA的合成是通过对10-乙酰基-N,N,N’,N’-四甲基-10H-吩噻嗪-3,7-二胺的酸水解来实施的。所用酸是1,2-乙二磺酸并且溶剂组合是乙醇水溶液。
实验细节
向25ml圆底烧瓶中添加10-乙酰基-N,N,N’,N’-四甲基-10H-吩噻嗪-3,7-二胺(1g,3.05mmol,MW 327.45g/mol)、1,2-乙二磺酸一水合物(0.95g,4.58mmol,MW 208.21g/mol)、水(1ml)和乙醇(5ml)。将混合物加热到85℃并且在此温度搅拌2.5小时，其中，黄绿色固体从溶液中沉淀出来。将浆液经冰水冷却30min，然后过滤，得到呈绿黄色固体的粗制产物。用乙醇(3×3ml)洗涤粗制物并且风干15min，然后在70℃通过烘干3.5小时，得到呈黄色固体的粗制产物(1.33g,91％,MW 475.61g/mol)。
LMT.EDSA的纯化
向50ml锥形瓶中添加粗制LMT.EDSA(1g,2.10mmol,MW 475.61g/mol)和水(10ml)。将浆液加热到95℃并且在此温度搅拌直到固体溶解。然后将溶液冷却到25℃，其中，形成淡绿色结晶固体。然后将浆液经冰水冷却30min，随后过滤。用甲醇(3×3ml)洗涤所收集的固体并且风干18小时，得到呈结晶状淡绿色固体的纯化产物(0.88g,88％,MW 475.61g/mol)。
νmax(KBr)/cm-1；3408(NH),3280(＝CH),3221(C-H),3036(＝CH),2574(SO3H),2480(SO3H),1484(C-C),1226(O＝S＝O)
δH(400MHz；D2O)；2.98(12H,s,NCH3),3.06(4H,s,SCH2),6.45(2H,d,J 6,ArH),6.95(4H,d J 4,ArH)
δC(100MHz；D2O)；46.2(NCH3),46.4(SCH2),115.1(CH),118.1(CH),118.4(QC),119.8(CH),136.5(QC),142.1(QC)
MP:在268℃分解(H2O)
m/z(EI+):计算值285.129970；观察值285.130948(100％,[M-EDSA]+)。
m/z(ES-)：计算值188.9528；观察值188.9535(100％,[M-LMT]-)。
晶体学
将40mg LMT.EDSA试样溶解于热的氘化水(～1ml)中并且在黑暗中缓慢地冷却。晶体生长并被收集，并通过X射线衍射进行分析，并且确认产物为1:1LMT与EDSA加合物的一水合物。参见图17b。
合成5：N,N,N’,N’-四甲基-10H-吩噻嗪-3,7-二胺鎓萘二磺酸盐(LMT.NDSA)的合 成和分析
LMT.NDSA的合成方法
LMT.NDSA的合成是通过对10-乙酰基-N,N,N’,N’-四甲基-10H-吩噻嗪-3,7-二胺的酸水解来实施的。所用酸是1.5-萘二磺酸并且溶剂组合是乙醇水溶液。
实验细节
向25ml圆底烧瓶中添加10-乙酰基-N,N,N’,N’-四甲基-10H-吩噻嗪-3,7-二胺(1g,3.05mmol,MW 327.45g/mol)、1.5-萘二磺酸四水合物(1.65g,4.58mmol,MW 360.36g/mol)、水(1ml)和乙醇(5ml)。将混合物加热到85℃并且在此温度搅拌30分钟，其中，所述混合物仍不可溶。向热混合物中添加水(4ml)并将反应加热到95℃并且在此温度搅拌8小时。将悬浮液经冰水冷却10分钟，然后过滤，得到呈淡绿色固体的粗制产物。将粗制物用乙醇(3×5ml)洗涤并且风干3天，得到呈淡绿蓝色固体的粗制产物(1.75g,100％,MW 573.71g/mol)。
νmax(KBr)/cm-1；3382(NH),3302(＝CH),3040(＝CH),2525(SO3H),1478(C-C),1238(O＝S＝O),1219(O＝S＝O),1179,1158,1030。
δH(400MHz；D2O)；3.06(12H,s,NCH3),6.70(2H,brd,ArH),7.14(4H,brd,ArH),7.43(2H,t,J 8.0,7.6,萘-H),7.94(2H,d,J 7.2,萘-H),8.87(2H,d,J 78.4,萘-H),9.10(1H,s,NH)
δC(100MHz；D2O)；46.0(NCH3),115.3(CH),117.5(QC),118.7(CH),120.4(CH),124.6(CH),124.7(CH),129.6(CH),129.9(QC),138.3(QC),141.7(QC),143.8(QC)。
MP；在256℃分解(MeCN)
m/z(EI+):计算质量285.129970；观察值285.130367(100％,[M-NDSA]+)。
m/z(ES-)：计算质量286.9684；观察值286.9697(100％,[M-LMT]-)。
实例2–溶解度研究
i)N,N,N’,N’-四甲基-10H-吩噻嗪-3,7-二胺鎓二溴化物、二氯化物和双(甲磺酸盐)(LMT.2HBr、LMT.2HCl和LMT.2MsOH)盐的溶解度
通过将HCl(5M)小心地添加到去离子水来制备两种水溶液(pH 2.00和3.01，在21.4℃)。
在每一实验中，将上述溶液中的一种的5ml的小分加热到37℃。添加一部分合适盐(LMT.2MsOH、LMT.2HCl或LMT.2HBr)并且将混合物搅拌片刻以使固体完全溶解。重复此步骤直到不发生进一步溶解。
结果示于下表中：
盐 pH(21.4℃) g/5ml*(37℃)
LMT.2HBr 3.01 4.726-5.236
LMT.2HBr 2.00 4.822-5.096
LMT.2HCl 3.01 4.978-6.029
LMT.2HCl 2.00 4.404-4.961
LMT.2MsOH 2.00 8.825-9.943
*范围下限对应于观察到完全溶解时的总重量。上限是在达到饱和前添加的总重量。
可以看出，LMT.2MsOH具有良好的水溶性。
ii)LMT.2MsOH盐的pH依赖性
在相关实验中，如下制备三种缓冲储备溶液(pH 2、pH 3和pH 7)：
pH 2缓冲水溶液
首先制备(0.2M)氯化钾(KCl)(0.745g，存于50mL去离子水中)溶液。从此溶液中取50mL并且用约80mL去离子水稀释。然后利用(0.2M)盐酸(HCl)溶液将pH调节到2，随后用去离子水进一步稀释，以补足到200mL。记录21.6℃下的最终pH 2.00。
pH 3缓冲水溶液
首先制备(0.1M)邻苯二甲酸氢钾(2.042g，存于100mL去离子水中)溶液。从此溶液中取100mL并且用约50mL去离子水稀释。然后利用0.2M HCl溶液将pH调节到3，随后用去离子水进一步稀释，以补足到200mL。记录21.7℃下的最终pH 2.99。
pH 7缓冲水溶液
首先制备(0.1M)磷酸二氢钾(KH2PO4)(1.370g，存于100mL去离子水中)溶液。从此溶液中取100mL并且用约80mL去离子水稀释。然后利用0.5M氢化钠(NaOH)溶液将pH调节到7，随后用去离子水进一步稀释，以补足到200mL。记录22℃下的最终pH 7.07。
方法
将缓冲水溶液的5mL小分添加到含有微型搅拌子(micro-flea)的小瓶中。将此小瓶置于设定在25℃的水浴中。向溶液中添加1-1.5g份的LMT.2MsOH。在每次添加后，允许10分钟搅拌时间以确保最大可能的溶解。通过肉眼判断混合物的均匀性。如果在搅拌时间后，如通过目测检查所判断的，固体仍然存在，则判断已经达到饱和点。
结果
所得混合物的粘性阻止过量固体的充分分离，因此不可能确定准确的溶解度值。因此，将所述结果中的每一个报告为以下范围：在饱和点前添加的LMT.2MsOH的总质量构成下限，并且在饱和点后添加的LMT.2MsOH的总质量提供上限。
三个实验中每一个的结果显示如下：
pH 溶解度(g/mL)
2.00 1.600-1.773
2.99 1.981-2.092
7.07 2.033-2.114
可以看出，当pH降低时，溶解度稍有减小，但是LMT.2MsOH在三个水性***中的每一个中都表现得很好。
总之，LMT.2MsOH比MTC(未显示)具有更佳的水溶性并且溶解度相对于相应的氯化物盐和溴化物盐有所提高。这表明，关于本文所述的治疗和用途的实用性增加。
实例3-对聚集和毒性的抑制
方法：对于τ聚集的固相分析
τ-τ聚集分析在固相免疫分析中利用纯化的重组τ片段。方法在例如WO96/30766中进行了详细地描述。简单地说，所述分析测量溶液中的截短的τ(氨基酸297-391)与固相结合的截短的τ(残基297-390)的结合。前者的结合是利用抗体mAb 423来检测，所述抗体mAb423特异性地识别含有C端Glu-391残基的肽。体外形成的Τ复合物类似于在阿尔茨海默氏病中由于通过94/95-氨基酸重复域(残基297-390)的病理性τ-τ结合相互作用的稳定性而形成的聚集的复合物，所述重复域是在成对螺旋细丝的蛋白质水解稳定的核心中发现的。
将B50值(表示为平均值±SE)测定为τ-τ结合减少50％时化合物的浓度。
方法：基于细胞的τ聚集分析
分析是基于3T6小鼠细胞，所述细胞已经设计为在诱导型启动子(pOPRSVI)控制下表达全长的人类τ蛋白质(hτ40)和在组成型启动子(pcDNA3.1)控制下表达低水平的截短的τ(295-390,dGA)。大量hτ40的表达是通过添加IPTG(10-50μM)来诱导的，这进而会导致通过以下过程产生额外的截短的τ：在用作模板的dGAτ的存在下发生全长-τ的聚集和加工。将τ-τ聚集抑制剂添加到所述分析阻断此过程。方法在WO 02/055720中进行了更详细地描述。
结果表示为将12kD片段的生成抑制50％时的浓度。此称作EC50值。
使细胞(4A和其克隆)在10-cm的盘中生长到～80％铺满(confluency)，然后分配到两个24孔板并且使其生长24hr。添加不同浓度的测试物品并且在24hr后，添加IPTG。在过夜培育后，去除培养基，用PBS洗涤各孔并且通过添加拉姆利(Laemmli)缓冲液收集细胞。将试样储存于-20℃以供随后进行凝胶电泳、蛋白质印迹(Western blotting)和抗体标记。通过SDS PAGE分离试样，将其转移到PVDF膜，并且柯达成像站(Kodak Image Station)上的ECL检测到由7/51抗体标记的τ。通常在一定的浓度范围内在4个浓度下一式三份测试化合物，在一个凝胶上运行所有试样。以dGA与hτ40带的强度比率(归一化为已经没有药物的对照试样)对药物浓度绘图，并且以图解方式由所述比例降到0.5时的浓度确定EC50值。
所述方法汇总于下表1中。MTC(TRx0014.047)在所有实验中作为对照运行，并且将EC50值归一化为具有EC50＝0.59μM的MTC。
表1：用于测量EC50的分析程序的汇总
方法：细胞毒性分析
使细胞(3T6小鼠纤维原细胞)在10-cm盘中生长到约80％铺满，然后分配到96孔板，10％10-cm盘/每96孔板，50μl/孔。一列8个孔保持空置(将作为分析中的试剂空白)。允许细胞生长过夜，然后以开始浓度(对于MTC或LMT.2HBr来说，通常为200μM)将药物添加到4个孔，并且在后续孔中使用1:2稀释***，其中最后4孔细胞用作没有药物的对照。此使得每个96孔板可测试两种药物。使细胞在药物存在下保持48hr，此后去除培养基并且用PBS洗涤细胞。使用基于乳酸脱氢酶(LDH)分析的塞托托克(Cytotox)96孔试剂盒(普洛麦格(Promega))来测定细胞数。所述分析定量地测量稳定的细胞裂解后释放的胞质酶LDH。利用可将四唑盐转化成红色甲瓒(formazan)产物的酶促分析来测量所释放的LDH。所形成颜色的量与所裂解细胞的数量成比例。
简单地说，将细胞用50μl/孔1×裂解缓冲液裂解45-60分钟，随后用50μl/孔LDH分析试剂处理30分钟并且用50μl/孔终止缓冲液终止反应。在490nm下读取吸光度。以相对于未处理的孔的吸光度(未处理的细胞＝1.0)对药物浓度绘图。以图解方式从吸光度降低50％时的浓度测定LD50。当测试LMT.2HBr时，MTC(TRx0014.047)在所有实验中均作为对照运行，并且将LD50值校正为LD50＝65μM的MTC。
结果：
测试根据本发明的各种双(磺酸)盐并且与双(卤化物)盐N,N,N’,N’-四甲基-10H-吩噻嗪-3,7-二胺鎓二氯化物(LMTC,LMT.2HCl)和N,N,N’,N’-四甲基-10H-吩噻嗪-3,7-二胺鎓二(溴化物)LMT.2HBr且与甲基息奥咛氯化物(MTC)进行比较。
不同甲基息奥咛盐形式的体外数据汇总于下表2中：
表2：体外数据之汇总.
THx，治疗指数(THx＝LD50/EC50)
值表示为平均值±SE。NE＝无效(在最大测试剂量下)
*MSA＝甲磺酸；EDSA＝乙二磺酸
评论
LMT.2MsOH和LMT.2HCl的EC50值(平均值±SE)分别是0.19±0.04μM和0.63±0.10μM，相应的治疗指数为179和102。
化合物在基于细胞的τ-τ聚集模型中的相对效能是
LMT.2MsOH>MTC、LMT.2HBr、LMT.2HCl。LMT.2MsOH的治疗指数比MTC大63％。
在基于细胞的分析中的效能顺序是MTC、LMT.2MsOH>LMT.2HCl>LMT.2HBr。LMT.2MsOH和LMT.2HCl的B50值分别是238.2±74.2μM和360.8±38.2μM。在无细胞分析中的相对效能顺序是LMT.2MsOH>MTC、LMT.2HCl、LMT.2HBr。
实例4-毒理学、杂质和对造血***的影响
每天向雌性威斯塔(Wistar)大鼠给予LMT.2HBr、LMT.2HCl、LMT.2MsOH或MTC，持续14天；从第1天到第10天的剂量为95mg MT/kg/天，从第11天到第14天的剂量为60mg MT/kg/天。在所有治疗组中都看到机体姿势抬高、行为减弱(subdued behaviour)和全身无力的临床体征。在LMT.2HBr和MTC治疗组中发生治疗相关性死亡。
在所有治疗组的血液和骨髓中都看到指示再生性贫血的红血细胞参数变化。这些变化包括：血液中的红血细胞数量减小、低血红蛋白浓度和网织红细胞数量增加以及骨髓中的红细胞前体数量增加。这是通过脾中红细胞生成水平的增加以组织学方式来证实。
在所有治疗动物的骨髓中都看到嗜中性粒细胞数量的减小，但LMT.2HBr治疗组中这种效应的程度显著大于其它组。在所制备的血液涂片中观察到的嗜中性粒细胞减少症(neutropaenia)的严重程度上也注意到这种差异，其中LMT.2HBr治疗的动物中的成熟嗜中性粒细胞显著消耗，MTC组有中度减少，LMT.2HCl或LMT.2MsOH组没有减少。此研究的结果表明，至少在大鼠中，LMT.2HBr引起嗜中性粒细胞消耗的倾向性高于LMT.2HCl、LMT.2MsOH或MTC。在大鼠中进行的6个月高剂量(45mg MT/kg/天)LMT·2HBr研究中，也观察成熟嗜中性粒细胞和粒细胞的数目减小。在给予LMT.2HBr后观察到的嗜中性粒细胞的减少或嗜中性粒细胞减少症虽然可逆，但会使患者更易受到细菌感染，因为它们的主要作用是破坏细菌。
因此，在大鼠中，LMT.2MsOH与LMT.2HBr相比在耐受性(剂量相关性死亡)与嗜中性粒细胞反应两个方面都显示改进的性质。
表：在经14天口服给予LMT的不同盐形式后在大鼠中的嗜中性粒细胞反应。将总嗜中性粒细胞记录为总白细胞(约100)的百分比；从每个玻片检查白血细胞(范围100到107)；记录每个动物组在不成熟嗜中性粒细胞存在下的频率；剂量相关性死亡记录为每组8只大鼠的动物数量。
*P<0.001，与对照相比
尽管在上述分析中LMT.2HCl和LMT.2MsOH相当，但在这两种盐形式中发现的杂质存在明显不同。对于LMT.2HCl来说，在合成期间检测到氯甲烷的存在并且以难以将它完全去除的方式被捕获在产物内。相比之下，在LMT.2MsOH合成过程中，可以将诸如甲磺酸乙酯和甲磺酸甲酯(EMS、MMS)等杂质控制在低得多的水平。
在大鼠、猴和小型猪中实施对造血***的研究。
观察到高铁血红蛋白血症的最低剂量是在大鼠中的15mg MT/kg/天(MTC和LMT.2HBr)或在灵长类动物中的30mg MT/kg/天(LMT.2MsOH)、5.3mg MT/kg/天(MTC)和在小型猪中的10mg MT/kg/天(LMT.2MsOH和LMT.2HBr)。
在小型猪中进行的9个月LMT.2MsOH研究中，在前28天给予后，在3mg MT/kg/天下没有高铁血红蛋白血症的指征。
然而，如所预测的，随着MTC、LMT.2HBr或LMT.2MsOH的剂量水平增加，对RBC的氧化应激的体征以剂量相关方式出现，这是通过高铁血红蛋白水平的增加以及在最终无法耐受的剂量下海因茨小体(变性、沉淀的血红蛋白在红细胞内的聚集物)的形成来证明。
实例5-药代动力学
图18显示在(以2mg/kg和15mg/kg的两次经口剂量)给予LMT.2HBr、LMT.2HCl和LMT.2MsOH后，MT部分随时间在猪中的血浆浓度的比较。
可以看出，LMT.2MsOH的Cmax(Tmax为1小时)是LMT.2HCl或LMT.2HBr的Cmax的2倍以上。因此，LMT.2MsOH可以比LMT.2HCl或LMT.2HBr更有效地暴露于MT。
实例6-胃刺激研究
研究(使用MTC或LMT.2HBr的28天大鼠)：来自终末动物(terminal animal)的胃中的所选的显微镜发现的发生率和严重程度
表解：“-“＝不存在发现，1＝最低，2＝轻度，3＝中度，4＝中度严重，5＝严重
从上文利用10个/组可以预测下文内容
研究(使用LMT.2MsOH的28天大鼠研究):来自终末动物的胸骨、肝、脾和胃中的所选的显微镜发现的发生率和严重程度
*表解：“-“＝不存在发现，1＝最低，2＝轻度，3＝中度，4＝中度严重，5＝严重
这些结果显示，LMT.2MsOH引起的胃刺激小于LMT.2HBr。
实例7-调配物
调配物实例1:使用直接压缩制备LMTM片剂
通过直接压缩法来制备具有以下组成的片剂：
在翻转掺合机中掺和LMTM、喷雾干燥的甘露醇、微晶纤维素、交聚维酮和硬脂酸镁，并且然后使用压片机压缩。
然后可用欧巴代*蓝(*卡乐康的注册商标，用于一系列的膜包衣材料)的水性悬浮液对片剂核心实施膜包衣。
调配物实例2：使用干式造粒(辊压)制备LMTM片剂
通过干式造粒法来制备具有以下组成的片剂：
在翻转掺合机中掺和LMTM、喷雾干燥的甘露醇、微晶纤维素、交聚维酮和硬脂酸镁。然后使用辊压机对混合物实施干式造粒并且随后利用摇摆式造粒机(oscillationgranulator)使用适宜筛研磨。在此情况下，在辊压前使用一半硬脂酸镁且可在常用压片机上压缩之前将另一半硬脂酸镁添加到颗粒中并掺和。
然后可用欧巴代*蓝(*卡乐康的注册商标，用于一系列的膜包衣材料)的水性悬浮液对片剂核心实施膜包衣。
调配物实例3:通过干法造粒(击压)制备LMTM片剂
通过另一种干式造粒法来制备具有以下组成的片剂：
在翻转掺合机中掺和LMTM和赋形剂，然后使用压片机压缩以产生击压块(普通平面片剂)。
然后使用装配有20目筛的摇摆式造粒机研磨击压块。
在此实例中，在击压前使用一半硬脂酸镁且可在常用压片机上压缩之前将另一半硬脂酸镁添加到颗粒中并掺和。
然后可用欧巴代*蓝(*卡乐康的注册商标，用于一系列的膜包衣材料)的水性悬浮液对片剂核心实施膜包衣。
调配物实例4:通过对赋形剂实施湿式造粒并在颗粒外并入LMTM来制备LMTM片剂
通过湿式造粒法来制备具有以下组成的片剂：
在翻转掺合机中掺和甘露醇、交聚维酮(总量的1/3)和微晶纤维素。然后使用溶于水中的PVP溶液对掺和材料实施造粒。在流化床干燥器中干燥湿团块，然后使用装配有适宜筛的摇摆式造粒机研磨。
然后将研磨的材料与剩余的交聚维酮和硬脂酸镁以及LMTM掺和在一起，随后在常规压片机上压缩。然后可用欧巴代*蓝(*卡乐康的注册商标，用于一系列的膜包衣材料)的水性悬浮液对片剂核心实施膜包衣。
调配物实例5:LMTM胶囊的制备
制备具有以下组成的胶囊。
在翻转掺合机中掺和LMTM和赋形剂。使用胶囊填充机将所得药物掺合物填充到胶囊(将50mg、75mg、100mg、125mg和150mg调配物填充到1号胶囊中并且将200mg调配物填充到0号胶囊中)中。制备明胶胶囊和HPMC胶囊二者。
调配物实例6:LMTM 75mg膜包衣片剂的稳定性测试结果
调配物实例7:LMTM 100mg膜包衣片剂的稳定性测试结果
调配物实例8:LMTM 75mg膜包衣片剂的稳定性测试结果
调配物实例9:LMTM 100mg膜包衣片剂的稳定性测试结果
调配物实例10：LMTB 100mg膜包衣片剂
通过如上文所述的直接压缩法制备具有上述配方的片剂并且然后实施膜包衣(参见调配物实例1)。
调配物实例11：LMTM 75mg膜包衣片剂
通过如上文所述的直接压缩法制备具有上述配方的片剂并且然后实施膜包衣(参见调配物实例1)。
调配物实例12-溶解研究
以50rpm的桨速搅拌(参见图19)如调配物实例10和11中所制备的LMTB膜包衣片剂(3×100mg)和LMTM片剂(4×75mg)，并且使用标准药典法(USP34)和下文所规定的条件评价溶解速率。
仪器条件
(45min时，Q＝75％。对于S1来说，45分钟时，6个片剂中的6个不小于80％溶解)。
结果示于下表中。
LMTM(4×75mg；批号：A04827)
溶解(％溶解)：
LMTB(3×100mg；批号：A02581)
溶解(溶解％)：
还使用相同方法测试了已经在正常(25℃/60％RH)或‘应激’条件(40℃/75％RH)下储存不同时段的片剂。
结果示于下表中。
LMTM(4×75mg；批号：A04827)-储存在25℃/60％RH溶解(溶解％)：
LMTM(4×75mg；批号：A04827)-储存在40℃/75％RH溶解(溶解％)：
LMTB(3×100mg；批号：A02581)-储存在25℃/60％RH溶解(溶解％)：
LMTB(3×100mg；批号：A02581)-储存在40℃/75％RH溶解(溶解％)：
附录-晶体学数据
LMT.EDSA的晶体学数据(图17a)：
表1.LMT.EDSA的晶体数据和结构精修。
表2.LMT.EDSA的原子坐标(×104)和等效各向同性位移参数U(eq)定义为正交的Uij张量的迹线的1/3。
表3.LMT.EDSA的键长和键角[°]。
用于产生等效原子的对称转变：
#1-x+2,y,-z+5/2 #2-x+1,-y,-z+2
表4.LMT.EDSA的各向异性位移参数
各向异性位移因子指数呈以下形式：-2p2[h2a*2U11+...+2h k a*b*U12]
表5.LMT.EDSA的氢坐标(×104)和各向同性位移参数
LMT.2EsOH的晶体学数据(图17b)
表1.LMT.2EsOH的晶体数据和结构精修.
表2.LMT.2EsOH的原子坐标(×104)和等效各向同性位移参数U(eq)定义为正交的Uij张量的迹线的1/3。
表3.LMT.2EsOH的键长和键角[°]。
用于产生等效原子的对称转变：
表4.LMT.2EsOH的各向异性位移参数
各向异性位移因子指数呈以下形式：-22[h2a*2U11+...+2h k a*b*U12]
表5.LMT.2EsOH的氢坐标(×104)和各向同性位移参数
LMT.2MsOH的晶体学数据(图17c)
表1.LMT.2MsOH的晶体数据和结构精修.
表2.eul1_0m的原子坐标(×104)和等效各向同性位移参数U(eq)定义为正交的Uij张量的迹线的1/3。
表3.eul1_0m的键长和键角[°]。
用于产生等效原子的对称转变：
表4.eul1_0m的各向异性位移参数
各向异性位移因子指数呈以下形式：-2π2[h2a*2U11+...+2h k a*b*a*b*U12]
表5.eul1_0m的氢坐标(×104)和各向同性位移参数
参考文献
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Claims (21)

1.具有下式的化合物或者为其医药上可接受的盐、溶剂化物或水合物在制备用于治疗或预防原生动物性疾病、皮肤癌或黑素瘤的疾病；或病毒性或细菌性疾病状况的药物中应用。
2.根据权利要求1所述的化合物的用途，其中，所述化合物呈结晶形式。
3.根据权利要求1或2所述的化合物的用途，其中所述化合物呈纯化的形式。
4.根据权利要求1或2所述的化合物的用途，其中，所述药物为组合物，所述组合物包含所述化合物和医药上可接受的载体或稀释剂。
5.根据权利要求4所述的化合物的用途，其中所述组合物为医药组合物，所述医药组合物为固体剂型，包含所述化合物和至少一种适于干式压缩的稀释剂。
6.根据权利要求5所述的化合物的用途，其中，所述固体剂型通过直接压缩产生。
7.根据权利要求5所述的化合物的用途，其中，所述固体剂型通过干式造粒产生。
8.根据权利要求5所述的化合物的用途，其中，所述固体剂型以在30分钟内至少80％的程度溶解，这由美国药典(USP)总章<711>中所定义的标准药典法所评估。
9.根据权利要求5所述的化合物的用途，其中，所述至少一种稀释剂选自：微晶纤维素；乳糖；甘露醇；钙盐，例如磷酸氢钙、硫酸钙、碳酸钙；和糖，例如乳糖、蔗糖、右旋糖和麦芽糖糊精。
10.根据权利要求5所述的化合物的用途，所述组合物进一步包含至少一种崩解剂。
11.根据权利要求10所述的化合物的用途，其中，所述崩解剂选自交联的聚乙烯基吡咯烷酮(交聚维酮)、羟乙酸淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠(可斯卡麦勒斯钠)或预胶凝淀粉。
12.根据权利要求5所述的化合物的用途，其中，所述固体剂型是经膜包衣的。
13.根据权利要求5所述的化合物的用途，所述组合物进一步包含pK1大于1.5的酸。
14.根据权利要求13所述的化合物的用途，其中，所述酸选自马来酸、磷酸、抗坏血酸、山梨酸、天冬氨酸和唾液酸。
15.根据权利要求13或14所述的化合物的用途，所述组合物进一步包含选自甘露醇、纤维质材料、淀粉或其混合物的载体。
16.根据权利要求5所述的化合物的用途，其特征在于，所述组合物包含粒子，超过10％的所述粒子具有大于10微米的大小。
17.一种根据权利要求1-2，5-14和16中任一项所述的化合物的用途，其中所述疾病为皮肤癌或黑色素瘤。
18.根据权利要求1-2，5-14和16中任一项所述的化合物的用途，其中，所述疾病为病毒性、细菌性或原生动物性疾病。
19.根据权利要求1-2，5-14和16中任一项所述的化合物的用途，其中所述病毒性疾病选自C型肝炎、HIV和西尼罗病毒。
20.根据权利要求1-2，5-14和16中任一项所述的化合物的用途，其中所述疾病为疟疾。
21.一种由N-被保护的3,7-二氨基-10H-吩噻嗪制备通式(I)的化合物的方法，
其中，
R1和R9中的每一个独立地选自：-H、C1-4烷基、C2-4烯基和卤代C1-4烷基；
R3NA和R3NB中的每一个独立地选自：-H、C1-4烷基、C2-4烯基和卤代C1-4烷基；
R7NA和R7NB中的每一个独立地选自：-H、C1-4烷基、C2-4烯基和卤代C1-4烷基；
且其中：
RA和RB中的每一个独立地选自：
C1-4烷基、卤代C1-4烷基和C6-10芳基；
或
RA与RB连接以形成选自以下的组：
C1-6亚烷基和C6-10亚芳基。
所述方法包括步骤：
环氨基脱保护(DP)；和
盐形成(SF)。
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