CN105850709B - 甜叶菊新品种817096谱星5号及高rd含量甜菊糖苷的制备 - Google Patents

甜叶菊新品种817096谱星5号及高rd含量甜菊糖苷的制备 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种甜叶菊变种植物，所述变种植物为817096谱星5号，其愈伤组织由中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏号为CGMCC No.9703。本发明同时提供了一种高RD含量的甜菊糖苷产品，其中RD/TSG大于0.28。

Description

甜叶菊新品种817096谱星5号及高RD含量甜菊糖苷的制备
技术领域
本发明涉及一种甜叶菊新品种，所述甜叶菊品种含有高含量的RD，并可由保藏的愈伤组织连续培育产生；涉及从该品种的甜叶菊干叶制备高RD含量甜菊糖苷的方法。
背景技术
甜叶菊(Stevia)，学名为Stevia Rebaudiana Bertoni，是一种多年生菊科草本植物，原产于南美巴拉圭，其叶片中含有甜菊糖苷，其甜度为蔗糖的150～300倍，是一种高甜度、低热能、味质好、安全无毒的新型天然甜味剂，可广泛应用于食品、饮料、医药、日化工业等行业。
甜菊糖苷是多组分糖苷混合物，糖苷组分及含量决定混合物的甜度和口感。甜叶菊中的甜菊糖苷含有13种组分，即甜叶菊苷A(Rebaudioside A，简称RebA或RA)，甜叶菊苷B(Rebaudioside B，简称RebB或RB)，甜叶菊苷C(Rebaudioside C，简称RebC或RC)，甜叶菊苷D(Rebaudioside D，简称RebD或RD)，甜叶菊苷E(Rebaudioside E，简称RebE或RE)，甜叶菊苷F(Rebaudioside F，简称RebF或RF)，甜叶菊苷M(Rebaudioside M，简称RebM或RM)，甜叶菊苷N(Rebaudioside N，简称RebN或RN)，甜叶菊苷O(Rebaudioside O，简称RebO或RO)，甜苷A(Dulcoside A，简称DulA或DA)，甜茶苷(Rubusoside，简称Rub或RU)；甜菊双糖苷(Steviolbioside，简称Sbio或SB)，甜菊糖(Stevioside，简称Stev或ST)；这十三种甜菊糖苷的总和成为总甜菊糖苷(Total Steviol glycosides，TSG)；其中RD相对含量较少，约占总甜菊糖苷的0.15％-0.2％。但是RD的甜度最高约为蔗糖的450倍；而且RD味质最好，接近于蔗糖的口感，不含任何不良余味，售价也是其他糖苷的3～5倍，是一种最为理想的天然甜味剂。因此，制取RD含量高的甜菊糖苷产品具有广阔的市场前景。
由于RD在甜叶菊中含量低，过去，获得高纯度RD的唯一方法是反复重结晶，反复重结晶的劣势在于产品得率低，不利于成本控制；另外由于在甜叶菊中含量低，无法大规模生产，不能满足客户的需求。因此有必要开发一种高RD含量的甜叶菊新品种，以便降低高RD含量甜菊糖苷产品生产成本并保持其稳定的得率。
发明内容
本发明提供了一种甜叶菊变种植物。在一个实施例中，变种植物为817096谱星5号，其817096谱星5号的愈伤组织由中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏号为CGMCC No.9703，其所述817096谱星5号的植物及干叶中RD/TSG大于0.28。在另一个实施例中，变种植物通过以AKH L1为父本，AKH/G.8.D为母本进行杂交，得到F1代，并从所述F1代优选出性状优良且稳定的单株YF002，然后以YF002为父本，AKH/G.8.D为母本进行杂交，得到F2代，其中所述F2代表达由权利要求1所描述的817096谱星5号的所有生理和形态特征，其817096谱星5号的愈伤组织由中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏号为CGMCC No.9703。在另一个实施例中，变种植物或其一部分表达由权利要求1所描述的817096谱星5号所有的生理和形态特征，其817096谱星5号的愈伤组织由中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏号为CGMCC No.9703。
本发明同时提供了产生甜叶菊变种植物或其一部分的愈伤组织，甜叶菊变种植物的再生细胞及其再生细胞的组织培养。
本发明同时提供了产生甜叶菊变种植物的方法。在一个实施例中，所述方法包括：以AKH L1为父本，AKH/G.8.D为母本进行杂交，得到F1代，并从所述F1代优选出性状优良且稳定的单株YF002，然后以YF002为父本，AKH/G.8.D为母本进行杂交，得到F2代，其中所述F2代表达由权利要求1所描述的817096谱星5号的所有生理和形态特征，其817096谱星5号的愈伤组织由中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏号为CGMCCNo.9703。
本发明同时提供了一种高RD含量甜菊糖苷的制备方法。在一个实施例中，所述制备方法包括：提供用于制备高RD含量甜菊糖苷的原料，其原料为由权利要求1-3所描述的甜叶菊植物或干叶，其植物及干叶中RD/TSG大于0.28；粉碎所述原料；用水或水溶剂提取所述粉碎原料，获得甜菊糖苷产品，其中RD/TSG大于0.28。在另一个实施例中，所述制备方法包括：提供用于制备高RD含量甜菊糖苷的甜叶菊植物或干叶，其植物及干叶中RD/TSG大于0.28；所述甜叶菊植物或干叶通过愈伤组织再生或扦插由权利要求1-3所描述的甜叶菊植物而得到；粉碎所述甜叶菊植物或干叶；用水或水溶剂提取所述粉碎甜叶菊植物或干叶，获得甜菊糖苷产品，其中RD/TSG大于0.28。
本发明同时提供了一种高RM含量的甜菊糖苷产品，其中RD/TSG大于0.28。
本发明同时提供了一种甜叶菊变种植物或其一部分,源自817096谱星5号的任何一代的后代，其所述817096谱星5号的愈伤组织由中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏号为CGMCC No.9703。
通过如下结合附图对优选实施例的详细描述，本发明的目的和优点是显而易见的。
附图说明
本发明的优选实施方式现在将参考附图进行说明，其中类似的附图标记表示相同的元件。
图1、杂交选育甜叶菊植物的示意图。
具体实施方式
1、高RD含量甜叶菊品种育种方法
技术路线如图1所示。
采用回交育苗方法，选择AKH/G.8.D为母本，先以AKH L1为父本进行一次杂交，再以优选单株YF002为父本进行一次回交，采收种子，育苗，移栽大田种植。以单株选择育种方式选择优良单株，经过种植观察其农艺性状和分析检测糖苷含量，性状稳定后，再用组织培养法和无性扦插繁殖方式固定其优良性状，经示范性种植后，成为新品种。
A、选育YF002
通过杂交育种的方法进行选育。首先，将母本AKH/G.8.D和父本AKH L1种植于同一大棚中，通过蜜蜂封闭式授粉的方法进行杂交，收其亲本的种子进行播种、育苗、种植，根据农艺性状及色谱分析，从F1代中选出性状优良且稳定的单株，经无性扦插繁殖固定后的新品系，即YF002号单株。通过父本AKH L1与母本AKH/G.8.D杂交得到的YF002，相对于父本其RA含量明显下降，相对于母本其St含量也明显下降，而RD的含量明显增加。
B、选育817096谱星5号(817096PC Star 5)
以AKH/G.8.D为母本，YF002为父本，同样通过蜜蜂封闭式授粉进行回交选育，收其亲本的种子进行播种、育苗、种植，根据农艺性状及色谱分析，从F2代中选出性状优良且稳定的单株817096，经组织培养及无性扦插繁殖固定其优良性状，获得高RD糖苷含量的无性繁育新品种，并命名为：谱星5号，英文名PCstar5。通过父本YF002和母本AKH/G.8.D杂交得到的817096，其RD含量有明显的增加。
对杂交种进行检测确认的方法为薄层色谱分析和高效液相分析，分析采自所述植株817096谱星5号(817096PC Star 5)的干燥叶，证实其中RD/TSG大于0.28。然后对选育出的优良品种817096谱星5号(817096PC Star 5)进行扩繁。扩繁主要采用两种方法：愈伤组织培养和扦插，其中又以愈伤组织培养为主。
甜叶菊新品种817096谱星5号(817096PC Star 5)愈伤组织由中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏号为CGMCC No.9703。本发明的所涉及的植物可由817096谱星5号(817096PC Star 5)品种的保藏愈伤组织再生得到。
2、高RD含量甜菊糖苷产品的制备
(a)预处理：将粉碎的817096谱星5号(817096PC Star 5)甜叶菊干叶于热水中萃取，制成甜菊糖苷萃取液，萃取液经过絮凝沉淀和板框压滤两道工序后，进入下一道工序；
(b)一次吸附及解吸：采用树脂吸附上述萃取液中甜菊糖苷有效成分，到树脂出甜时止；用氢氧化钠稀溶液、盐酸稀溶液、纯水洗树脂、至流出液pH值达到7时止；用乙醇溶液对树脂进行分柱解吸，得含RD为22～25％、含糖苷量为78～86％的解吸液，解吸液进入下一道工序；
(c)一次离子交换：解析液依次通过一次离子交换除杂后，蒸发浓缩，得含RD为23～26％、含苷量在82～88％的浓缩液，浓缩液进入下一道工序；
(d)二次离子交换：将流出液再通过二次离子交换树脂进行深度除杂，浓缩得到含RD为24～26％、含苷量85～88％的浓缩液，再除菌过滤，浓缩液进入下一道工序；
(e)喷雾干燥：将除菌过滤后的浓缩液喷雾干燥，得到RD/TSG大于0.28、TSG≥85％的甜菊糖苷产品。
如需要制备更高纯度的产品，则在步骤(C)后按以下步骤进行：
(d)二次吸附提纯：用二次吸附树脂三柱串联过饱和吸附上述浓缩液除杂，得到含苷量≥95％的甜菊糖苷提纯液，提纯液进入下一道工序；
(e)二次离子交换：将提纯液通过二次离子交换树脂进行深度除杂，浓缩得到含苷量≥95％的浓缩液，再经过除菌滤膜除菌过滤，浓缩液进入下一道工序；
(f)喷雾干燥：将除菌过滤后的浓缩液喷雾干燥，得到RD/TSG大于0.28、TSG≥95％的甜菊糖苷产品。
下面结合实施例对本发明做做进一步详细描述。
实施例1
用于杂交育种的父母本性状：
母本一AKH/G.8.D：2010年从巴拉圭引进的高Stev含量甜菊新品种。株高50～55cm，叶子成椭圆状，叶子边缘无明显锯齿，颜色为深绿色。干叶中RebA含量为0.00％，St含量为18.00％。
父本一AKH L1：2010年从巴拉圭引进的高Reb A含量甜菊新品种。该品种为晚熟品种，株高51～70cm，大田种植前期生长慢，中后期生长旺盛，一茬大田生长期为135～150天。叶子颜色为淡绿色/黄绿色。干叶中Reb A含量为11.5％，St含量为1.30％,亩产干叶200公斤以上。
母本二AKH/G.8.D：2010年从巴拉圭引进的高Stev含量(以下简称St)甜菊新品种。株高50～55cm，叶子成椭圆状，叶子边缘无明显锯齿，颜色为深绿色。干叶中RebA含量为0.00％，St含量为18.00％。
父本二YF002：第一次杂交后代中性状优良且稳定的优良单株，经无性扦插繁殖固定后的新品系。其RA含量低，且RD含量高，分枝能力一般，叶片大且厚实，干叶产量高。
杂交育种过程：
2011年8月中旬开始，将所选St含量高的AKH/G.8.D(母本)和RebA糖苷含量高的AKH L1(父本)移入育种大棚内，进行杂交育种，10月初，亲本现蕾之前放入蜂箱，利用蜜蜂进行封闭式授粉杂交；11月中旬开始采收杂交种子，一直采收至12月中旬。2012年初将所得种子播种于育苗大棚内，待其长到3叶1心(约10厘米)时，将种苗移植至6*8cm的育苗袋中，并放于大棚内培养，3月初浇施一次可溶性复合肥500倍液及尿素1000倍液，3月中旬气温回暖后，将种苗移栽至试验田，并对其进行田间管理等措施。
2012年7月份采收植株鲜叶，并进行干燥，采用TLC及高效液相色谱法分析干叶糖苷含量，选择RA糖苷含量低且RD糖苷含量高的单株，即YF002。
YF002及其亲本以及亲本含苷量检测结果见表1：
表1：YF002及其亲本检测结果
ND–Not Detected(未检出)。
然后在2012年8月中旬移入大棚内进行杂交育种。2013年1月初将所得种子播种在谱赛科公司塑料大棚内进行育种，种子萌发后，秧苗长至3叶1心时，移植至6×8cm的育苗袋中，并放于大棚内培养，3月初浇施一次可溶性复合肥500倍液及尿素1000倍液，3月中旬气温回暖后，将种苗移栽至试验田，并对其进行田间管理等措施。
2013年7月份采收植株鲜叶，并进行干燥，采用薄层色谱及高效液相色谱法分析干叶糖苷含量，选育出所含RD占总甜菊糖苷量比例超过28％，所含RA占总甜菊糖苷量比例超过20％的单株，即817096谱星5号(817096PC Star 5)。
817096谱星5号及其亲本含苷量检测结果见表2：
表2：817096谱星5号(817096PC Star 5)及其亲本含苷量检测结果
ND–未检出。
新品系817096谱星5号(817096PC Star 5)的扩繁及栽培管理：
2013年10月至2014年2月，采用组织培养法将817096单株扩繁到50000株。2014年2月下旬将组培苗移植至育苗穴盘中进行炼苗；2014年3月中下旬，将练好的种苗移栽到大田，并进行相应的田间管理。2014年4月初(移栽后10天左右)进行查苗补缺工作，2014年4月中下旬(苗高15cm左右)开始进行打顶摘心，2014年4月中下旬开始进行第一次追肥，追施的肥料为可溶性复合肥和尿素，用量为可溶性复合肥500倍液，尿素1000倍液，2014年5月份开始进行第二次追肥管理，追施的肥料为可溶性复合肥和尿素，用量为可溶性复合肥500倍液，尿素1000倍液，后期(6月份)补施磷酸二氢钾叶面肥。2014年7月初开始进行收获，收割采用人工采收，打谷机脱叶方式，然后进行晒干，并装袋保存。
分析采自所述植株的干燥叶，通过高效液相色谱测定其成分。
817096PC Star 5与相似品种(PC Star)中甜菊糖苷含量、各组分占总甜菊糖苷比例以及性状的比较见表3、表4以及表5。
表3：817096PC Star 5与相似品种(PC Star)中甜菊糖苷含量比较(％wt/wt,干基)
ND–未检出。
表4：817096PC Star 5与相似品种(PC Star)中各组分占总甜菊糖苷比例比较(％)
ND–未检出。
表5：817096PC Star 5与相似品种(PC Star)性状比较
实施例2
高RD含量甜菊糖苷产品的制备
(a)预处理：将甜叶菊叶子与50℃软水按重量比1:15混合，制成甜菊糖苷提取液，经过絮凝沉淀和板框压滤两道工序，板框过滤后的滤液进入下一道工序；
(b)一次吸附及解吸：用一次吸附树脂吸附上述萃取液中甜菊糖苷有效成分，用氢氧化钠溶液、盐酸溶液处理吸附了甜菊糖苷有效成分的树脂，纯水淋洗树脂，至流出液PH值达7时止，再用乙醇溶液进行解吸，得到含RD为22.69％、含苷量79.5％的解吸液，解吸液去醇进入下一道工序；
(c)一次离子交换：去醇解吸液依次通过一次离子交换除杂，蒸发浓缩得到含RD为24.24％、含苷量为84.91％的一次浓缩液，浓缩液进入下一道工序；
(d)二次离子交换：将浓缩液通过二次离子交换树脂进行深度除杂，经过浓缩得到含苷量为85.12％的二次离子交换液，再进行除菌滤芯除菌过滤，无菌液进入下一道工序；
(e)喷雾干燥：将无菌液进行喷雾干燥，得到甜菊糖苷产品，其中RD/TSG为0.2855、TSG为85.12％。经高效液相色谱分析测定其成分：
表6：产品高效液相检测结果
ND–未检出。
实施例3
(a)预处理：将甜叶菊叶子与70℃软水按重量比1:20混合，制成甜菊糖苷提取液，经过絮凝沉淀和板框压滤两道工序，板框过滤后的滤液进入下一道工序；
(b)一次吸附及解吸：用一次吸附树脂吸附上述脱盐滤液中甜菊糖苷有效成分，用氢氧化钠溶液、盐酸溶液处理吸附了甜菊糖苷有效成分的树脂，再用乙醇溶液进行解吸，得到含RD为23.41％、含苷量82.0％的解吸液，解吸液去醇进入下一道工序；
(c)一次离子交换：去醇解吸液依次通过一次离子交换除杂，蒸发浓缩得到RD为25.02％、含苷量为87.65％的一次浓缩液，浓缩液进入下一道工序；
(d)二次吸附提纯：用二次大孔吸附树脂三柱串联吸附上述离子交换液除杂，得到RD为27.11％、含苷量为94.97％甜菊糖苷提纯液，提纯液进入下一道工序；
(e)二次离子交换：通过二次离子交换树脂进行深度除杂，经过浓缩得到RD为27.14％、含苷量为95.06％的二次离子交换液，再进行除菌滤芯除菌过滤，无菌液进入下一道工序；
(f)喷雾干燥：将无菌液进行喷雾干燥，得到甜菊糖苷产品。经高效液相色谱分析，产品RD含量为27.14％，TSG为95.56％,RD/TSG为0.2840。
表7：产品高效液相检测结果
ND–未检出。
本发明中所有样品，在下列条件下，通过高效液相色谱测定其成分。
高效液相色谱检测：
一种新的高效液相色谱方法检测甜菊糖苷。每个样品需用2种方法综合检测。
方法1是用于分析RebE、RebD、RebM、RebN、RebO；方法2是用于分析RebA、Stev、RebF、RebC、DulA、Rub、RebB、Sbio。
所有糖苷的标准品,包括RebE、RebD、RebM、RebN、RebO均购于美国ChromaDex公司。
检测仪器：配备二元泵、自动进样器的安捷伦1200高效液相色谱仪，DAD检测器配合化学工作站软件使用。
方法1仪器条件：
色谱柱：安捷伦Poroshell 120SB-C182.7μm,4.6x 150mm
柱温：40℃
流动相A：10mM磷酸二氢钠pH2.6:乙腈，75％:25％(v/v)
流动相B：水：乙腈，50％:50％(v/v)
流量：0.5mL/min
进样量：5μL
检测：UV 210nm
运行时间：25分钟
过度时间：10分钟
进样器温度：常温
梯度程序，(％，v/v:)
时间(min) A(％) B(％)
0.0 100 0
14.0 100 0
14.5 0 100
25.0 0 100
方法2仪器条件：
色谱柱：安捷伦Poroshell 120SB-C182.7μm,4.6x 150mm
柱温：40℃
流动相：10mM磷酸二氢钠pH2.6:乙腈，68％:32％(v/v)
流量：1.0mL/min
进样量：5μL
检测：UV 210nm
运行时间：20分钟
进样器温度：常温

Claims (4)

1.再生细胞的组织培养，其特征在于，所述再生细胞来自甜叶菊变种植物817096谱星5号，其愈伤组织由中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏号为CGMCC No.9703，所述817096谱星5号的植物及干叶中RD/TSG大于0.28。
2.产生甜叶菊变种植物的方法，其特征在于，所述甜叶菊变种植物通过甜叶菊变种植物817096谱星5号的愈伤组织再生而获得，所述甜叶菊变种植物817096谱星5号的愈伤组织由中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏号为CGMCC No.9703。
3.一种高RD含量甜菊糖苷的制备方法，其特征在于,所述制备方法包括：提供用于制备高RD含量甜菊糖苷的原料，其中所述原料为由权利要求2所描述的产生甜叶菊变种植物的方法获得的甜叶菊变种植物或干叶，其植物及干叶中RD/TSG大于0.28；
粉碎所述原料；
用水或水溶剂提取所述粉碎原料，获得甜菊糖苷产品，其中RD/TSG大于0.28。
4.一种高RD含量甜菊糖苷的制备方法，其特征在于,所述制备方法包括：提供用于制备高RD含量甜菊糖苷的甜叶菊植物或干叶，其植物及干叶中RD/TSG大于0.28；所述甜叶菊植物或干叶通过甜叶菊变种植物817096谱星5号的愈伤组织再生或扦插由权利要求2所描述的产生甜叶菊变种植物的方法获得的甜叶菊植物而得到，其中所述甜叶菊变种植物817096谱星5号的愈伤组织由中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏号为CGMCC No.9703；
粉碎所述甜叶菊植物或干叶；
用水或水溶剂提取所述粉碎甜叶菊植物或干叶，获得甜菊糖苷产品，其中RD/TSG大于0.28。
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