CN105842379A - 一种衍生化测定酚类***的方法 - Google Patents

一种衍生化测定酚类***的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种衍生化测定酚类***的方法。该方法包括同时衍生化6种酚类***，并利用超高效液相色谱‑质谱检测器快速测定。与现有技术相比，本发明提高6种***的灵敏度，重现性好，回收率符合测定要求，变异系数小、检测成本低。

Description

一种衍生化测定酚类***的方法
技术领域
本发明属于兽药残留分析检测技术领域，通过柱前衍生化反应，超高效液相色谱-质谱检测器同时测定雌醇和雌酚。本发明可以同时对动物组织中雌醇和雌酚类***的多残留分析测定，也可对其他多酚类有机物进行分析测定。
背景技术
***是一类具有广泛生物活性的类固醇化合物，能够促进和维持女性相关的生理作用，也会对内分泌***、心血管***、肌体新陈代谢、骨骼发育和皮肤等各方面发挥特殊的作用。天然类固醇激素主要由动物的雌性或雄性性器官，肾上腺素等器官产生，是动物生长发育的重要物质之一，如***、雌三醇、雌酮等。人工合成很多类似结构的类固醇激素，如己烯雌酚、己烷雌酚和双烯雌酚等，这些激素在动物体内很难分解，通过食物链进入人体后，可扰乱人体内分泌***，导致男性女性化、男性生育能力下降、女性乳腺癌和卵巢癌、女性性早熟等。欧盟已经禁止其在动物饲养中的使用，我国农业部235号公告中也规定，己烯雌酚等***在动物源性食品中不得检出。因此快速准确检测动物组织中这些***残留对于保障食品安全是很重要的。
衍生化是为了弥补直接测定存在的目标化合物不稳定、离子化效率低等缺点，如硅烷甲基化或者乙酰化反应把***转化为挥发性成分才能进行GC-MS测定。LC-MS/MS是***药物残留检测的常用技术之一，其检测成本高，对部分难电离化合物如***、雌三醇，需要衍生化反应提高离子化效率，国内外文献均有报道(1、M.Reza Anari,Ray Bakhtiar,Bing Zhu et al，Anal.Chem.2002,74,4136-4144，2、Hiroyuki Yamada,Yasuhiro Kuwahara,2Yasuo Takamatsu et al，Biomed.Chromatogr.2000，14:333–337，3、Robert E.Nelson,Stefan K.Grebe,Dennis J.O’Kane et al.,ClinicalChemistry 2004，50(2),373–384，4、赵怀鑫，孙学军，孙志伟等，分析化学，2009，37(2)，187-193)。这些方法均针对***、雌三醇目标化合物，未见关于雌酚类***衍生化反应的报道,而且国家没有同时测定雌醇和雌酚的标准。
超高效液相色谱(UPLC)作为一种新的色谱仪，涵盖了小颗粒填料、低***体积及快速数据收集等全新技术，具有柱效高、分离时间短、溶剂消耗少等优点。目前UPLC***带有一款便携式质谱检测器(QDa)，灵敏度和准确度优于紫外检测器(PDA)，摆脱了常规质谱仪的条件优化，操作简便，开机抽真空时间短(只要5min)，即开即用，适合日常大批量样品的检测，但对于雌醇、雌酚类化合物也存在离子化效率低、灵敏度低等缺点，直接测定只能达到mg/kg残留水平，不能满足痕量检测分析要求。
发明内容
本发明的目的是提供一种通过柱前衍生化后用超高效液相色谱-质谱检测器，能快速、低成本、灵敏度高地同时测定雌醇和雌酚类***多残留的一种衍生化测定酚类***的方法。
本发明的技术方案如下：
1.一种衍生化测定酚类***的方法,其特征在于包括以下步骤：
(1)***标准品的制备和测定
①标准储备液的制备：将17β-***，雌三醇，雌酮，己烯雌酚，己烷雌酚，双烯雌酚6种***固体标准品分别用甲醇溶解后，分别用甲醇配成浓度为1mg/mL的6种标准储备液，置于-20℃冰箱储存；
②五个系列浓度混合标准液的制备：量取步骤(1)①制备的浓度为1mg/mL的17β-***标准储备液、浓度为1mg/mL的雌三醇标准储备液、浓度为1mg/mL的雌酮标准储备液、浓度为1mg/mL的己烯雌酚标准储备液、浓度为1mg/mL的己烷雌酚标准储备液、浓度为1mg/mL的双烯雌酚标准储备液各取0.5mL混合到50mL容量瓶，用甲醇定容至50mL得混合工作液，然后分取混合工作液用甲醇分别稀释为混合标准液A、混合标准液B、混合标准液C、混合标准液D、混合标准液E五个系列浓度混合标准液，其中：
混合标准液A中含有的17β-***、雌三醇、雌酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚6个组分的浓度均为5ng/mL；
混合标准液B中含有的17β-***、雌三醇、雌酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚6个组分的浓度均为50ng/mL；
混合标准液C中含有的17β-***、雌三醇、雌酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚6个组分的浓度均为100ng/mL；
混合标准液D中含有的17β-***、雌三醇、雌酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚6个组分的浓度均为500ng/mL；
混合标准液E中含有的17β-***、雌三醇、雌酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚6个组分的浓度均为1000ng/mL；
③内标的制备：将氘代17β-***(d3)用甲醇溶解后，用甲醇配成浓度为1mg/mL的内标标准储备液，量取内标标准储备液，加入甲醇配制成浓度为500ng/mL的内标；
④丹磺酰氯衍生试剂的制备：将固体丹磺酰氯溶解于有机溶剂，用该有机溶剂配制成浓度为1mg/mL丹磺酰氯衍生试剂，装入棕色瓶，置于-20℃冰箱储存；
⑤分别取1mL步骤(1)②配制的五个系列浓度的混合标准液，在每一个混合标准液中加入步骤(1)③所制备的浓度为500ng/mL的内标100μL，每一个混合标准液加入内标混合均匀后用氮气吹干，分别得到对应的五个混合标样；混合标准液A对应的混合标样记为混合标样A＇，混合标准液B对应的混合标样记为混合标样B＇、混合标准液C对应的混合标样记为混合标样C＇、混合标准液D对应的混合标样记为混合标样D＇、混合标准液E对应的混合标样记为混合标样E'；
⑥衍生化反应和超高效液相色谱-质谱检测器测定
步骤(1)⑤所述的五个混合标样均按如下方法进行衍生化反应：每个混合标样中加入步骤(1)④制备的1mg/mL丹磺酰氯衍生试剂10～1000μL，用碳酸氢钠或氢氧化钠调pH为8.0～11.0，旋涡混合30s，在温度45℃～70℃，衍生化反应10～30min；
每个衍生化反应后的溶液自然冷至室温后，氮气吹干，再加入混合液溶解，所述混合液由0.65mL甲醇溶液和1mmol/L乙酸铵溶液0.35mL混合而成；溶解后的溶液中有机相用滤膜过滤得滤液，所得滤液进超高效液相色谱-质谱检测器测定，超高效液相色谱-质谱检测器测定条件如下：
色谱柱：waters BEH C18 2.1×50mm。色谱柱温度：35℃。进样体积：10μL；
流动相为甲醇:1mmol/L乙酸铵,设置梯度洗脱，梯度洗脱条件按表1：
表1梯度洗脱条件
设置质谱检测器扫描方式：选择离子模式，按表2所示质谱检测器测定衍生产物的条件，正负离子同时扫描，扫描质量数范围为m/z＝40～600，锥孔电压15V，采样速率8点/秒,毛细管电压0.8kv；
表2质谱检测器测定衍生产物的条件
⑦经超高效液相色谱-质谱检测器测定得到17β-***，雌三醇，雌酮，己烯雌酚，己烷雌酚，双烯雌酚6种***的峰面积和内标的峰面积，分别以6种***的峰面积与内标峰面积之比值为纵坐标，步骤(1)②中的五个混合标准液的浓度值为横坐标，绘制对应的六个标准工作曲线；
(2)待检样品检测
①准确称取5g动物组织待检样品，加入100μL步骤(1)③所制备的浓度为500ng/mL的内标，用25mL乙腈提取，5000rpm，离心5min，收集上清液，氮气吹干；
②加入步骤(1)④所述的1mg/mL丹磺酰氯衍生试剂10-1000μL后，用碳酸氢钠或氢氧化钠调pH为8.0～11.0，旋涡混合30s，在温度45℃～70℃，衍生化反应10～30min；
③衍生化反应后的溶液自然冷至室温后，氮气吹干，再加入混合液溶解，所述混合液由0.65mL甲醇溶液和1mmol/L乙酸铵溶液0.35mL混合而成；溶解后的溶液中有机相用滤膜过滤得滤液，所得滤液进超高效液相色谱-质谱检测器测定，按步骤(1)⑥所述的超高效液相色谱-质谱检测器测定条件测定；
④经超高效液相色谱-质谱检测器测定，得到待检样品峰的保留时间和峰面积，与步骤(1)⑥所得的6种***标样的保留时间进行比较，确定待检样品中所含***的种类，与步骤(1)⑦中所对应的***的标准工作曲线比较，得到所含***的含量。
2.根据技术方案1所述的衍生化测定酚类***的方法,其特征在于：步骤(1)④中所述的有机溶剂为丙酮或者苯。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、通过本发明的柱前衍生化反应方法，提高了17β-***、雌三醇、雌酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚以及内标氘代17β-***(d3)的离子化效率，灵敏度得到了提高。
2、目前还没有采用超高效液相色谱-质谱检测器同时对17β-***、雌三醇、雌酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚6种***多残留的检测，本发明采用超高效液相色谱-质谱检测器及其参数设定进行定性和定量分析，定量限可达到1～2μg/kg，结果重现性良好，3个添加浓度回收率为65％～121％，6次重复实验的变异系数小于13％。
3、本发明方法检测成本低。现有串联质谱仪器价格高达250万元，而超高效液相色谱-质谱检测器的价格70万元，相比串联质谱仪器，本发明方法检测成本低。
附图说明
图1是17β-***标样衍生物的色谱图，图中纵坐标是强度，横坐标是时间。
图2是雌三醇标样衍生物的色谱图，图中纵坐标是强度，横坐标是时间。
图3是雌酮标样衍生物和己烯雌酚标样衍生物的色谱图，图中纵坐标是强度，横坐标是时间。
图4是己烷雌酚标样衍生物的色谱图，图中纵坐标是强度，横坐标是时间。
图5是双烯雌酚标样衍生物的色谱图，图中纵坐标是强度，横坐标是时间。
图6是内标标样衍生物的色谱图，图中纵坐标是强度，横坐标是时间。
图7是牛奶加标样本的17β-***衍生物的色谱图，图中纵坐标是强度，横坐标是时间。
图8是牛奶加标样本的雌三醇衍生物的色谱图，图中纵坐标是强度，横坐标是时间。
图9是牛奶加标样本的雌酮衍生物和己烯雌酚衍生物的色谱图，图中纵坐标是强度，横坐标是时间。
图10是牛奶加标样本的己烷雌酚衍生物的色谱图，图中纵坐标是强度，横坐标是时间。
图11是牛奶加标样本的双烯雌酚衍生物的色谱图，图中纵坐标是强度，横坐标是时间。
图12是牛奶加标样本的内标衍生物的色谱图，图中纵坐标是强度，横坐标是时间。
具体实施方式
以下实施例所用的所有原料、试剂等均为市售。各实施例中无特殊说明的为常规方法。
实施例1衍生化反应条件
①丹磺酰氯衍生试剂的制备：将固体丹磺酰氯溶解于丙酮溶剂，配制浓度1mg/mL丹磺酰氯衍生试剂，装入棕色瓶，置于-20℃冰箱储存。
②衍生化反应条件1：加入步骤(1)①制备的1mg/mL丹磺酰氯衍生试剂10μL，用碳酸氢钠调节混合混合的pH为8.0，旋涡混合30s，在温度45℃，衍生化反应10min。
③衍生化反应条件2：加入步骤(1)①制备的1mg/mL丹磺酰氯衍生试剂100μL，用碳酸氢钠调节混合混合的pH为9.0，旋涡混合30s，在温度55℃，衍生化反应10min。
④衍生化反应条件3：加入步骤(1)①制备的1mg/mL丹磺酰氯衍生试剂200μL，用碳酸氢钠调节混合溶液的pH为10.0，旋涡混合30s，在温度55℃，衍生化反应30min。
⑤衍生化反应条件4：加入步骤(1)①制备的1mg/mL丹磺酰氯衍生试剂500μL，用碳酸氢钠调节混合溶液的pH为11.0，旋涡混合30s，在温度65℃，衍生化反应20min。
⑥衍生化反应条件5：加入步骤(1)①制备的1mg/mL丹磺酰氯衍生试剂1000μL，用碳酸氢钠调节混合溶液的pH为10.0，旋涡混合30s，在温度70℃，衍生化反应10min。
实施例2***标准样品的制备和***标准曲线绘制
(1)***标准样品的制备
①标准储备液的制备：将如下6种***固体标准品：17β-***，雌三醇，雌酮，己烯雌酚，己烷雌酚，双烯雌酚，分别用甲醇溶解，分别配成浓度为1mg/mL的如下6种标准储备液:
1mg/mL的17β-***标准储备液；
1mg/mL的雌三醇标准储备液；
1mg/mL的雌酮标准储备液；
1mg/mL的己烯雌酚标准储备液；
1mg/mL的己烷雌酚标准储备液；
1mg/mL的双烯雌酚标准储备液；
以上6种标准储备液均置于-20℃冰箱储存。
②五个系列浓度混合标准液的制备：量取步骤(1)①制备的浓度为1mg/mL的17β-***标准储备液、浓度为1mg/mL的雌三醇标准储备液、浓度为1mg/mL的雌酮标准储备液、浓度为1mg/mL的己烯雌酚标准储备液、浓度为1mg/mL的己烷雌酚标准储备液、浓度为1mg/mL的双烯雌酚标准储备液各取0.5mL混合到50mL容量瓶，用甲醇定容至50mL得混合工作液，然后分取混合工作液用甲醇分别稀释为混合标准液A、混合标准液B、混合标准液C、混合标准液D、混合标准液E 5个不同浓度的混合标准液，其中：
混合标准液A中含有的17β-***、雌三醇、雌酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚6个组分的浓度均为5ng/mL；
混合标准液B中含有的17β-***、雌三醇、雌酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚6个组分的浓度均为50ng/mL；
混合标准液C中含有的17β-***、雌三醇、雌酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚6个组分的浓度均为100ng/mL；
混合标准液D中含有的17β-***、雌三醇、雌酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚6个组分的浓度均为500ng/mL；
混合标准液E中含有的17β-***、雌三醇、雌酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚6个组分的浓度均为1000ng/mL。
③内标的制备：将氘代17β-***(d3)用甲醇溶解后，用甲醇配成浓度为1mg/mL的内标标准储备液，量取内标标准储备液，加入甲醇配制成浓度为500ng/mL的内标。
④丹磺酰氯衍生试剂的制备：将固体丹磺酰氯溶解于丙酮中，用丙酮配制成浓度为1mg/mL丹磺酰氯衍生试剂，装入棕色瓶，置于-20℃冰箱储存。
⑤分别取1mL步骤(1)②配制的五个系列浓度的混合标准液，在每一个混合标准液中加入步骤(1)③所制备的浓度为500ng/mL的内标100μL，每一个混合标准液加入内标混合均匀后用氮气吹干，分别得到对应的五个混合标样；混合标准液A对应的混合标样记为混合标样A＇，混合标准液B对应的混合标样记为混合标样B＇、混合标准液C对应的混合标样记为混合标样C＇、混合标准液D对应的混合标样记为混合标样D＇、混合标准液E对应的混合标样记为混合标样E'。
(2)衍生化反应和超高效液相色谱-质谱检测器测定
①步骤(1)⑤所述的五个混合标样均按如下方法进行衍生化反应：每个混合标样中加入步骤(1)④制备的1mg/mL丹磺酰氯衍生试剂200μL，用碳酸氢钠调pH为10.0，旋涡混合30s，在温度60℃，衍生化反应10min；
每个衍生化反应后的溶液自然冷至室温后，氮气吹干，再加入混合液溶解，所述混合液由0.65mL甲醇溶液和1mmol/L乙酸铵溶液0.35mL混合而成；溶解后的溶液中有机相用滤膜过滤得滤液，所得滤液进超高效液相色谱-质谱检测器测定，超高效液相色谱-质谱检测器测定条件如下：
色谱柱：waters BEH C18 2.1×50mm。色谱柱温度：35℃。进样体积：10μL；
流动相为甲醇:1mmol/L乙酸铵,设置梯度洗脱，梯度洗脱条件按表1：
表1梯度洗脱条件
设置质谱检测器扫描方式：选择离子模式，按表2所示质谱检测器测定衍生产物的条件，正负离子同时扫描，扫描质量数范围为m/z＝40～600，锥孔电压15V，采样速率8点/秒；毛细管电压0.8kv；
表2质谱检测器测定衍生产物的条件
②经超高效液相色谱-质谱检测器测定得到17β-***，雌三醇，雌酮，己烯雌酚，己烷雌酚，双烯雌酚6种***的峰面积和内标的峰面积，每个标准工作曲线按如下方法绘制：
以混合标样A＇至混合标样E＇中的每种***的5个浓度对应的峰面积分别与内标峰面积之比所得到的5个比值为纵坐标，以步骤(1)②中的五个混合标准液的浓度值5ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL为横坐标，绘制对应的标准工作曲线；详见表3。
6个标准曲线的线性范围为5～1000ng/mL，相关系数R2>0.995，6种***衍生产物有很好的线性关系，表明本发明方法和仪器条件合理可行。
17β-***、雌三醇、雌酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚衍生物和内标衍生物的色谱图见图1-图6。
表3 6种***回归方程，相关系数及浓度范围
实施例3牛奶样本检测
(1)牛奶样本的提取
市场随机选择牛奶为实验样本，并对上述6种***残留同时进行检测。共设3个添加浓度，分别为2，10，50μg/kg。分别设一个空白样本，每个浓度重复6次，进行重复性实验，分别计算回收率和变异系数。
(2)衍生化反应
准确称取5g样本,加入实施例2步骤(1)③所制备的浓度为500ng/mL的内标100μL，经提取净化之后收集洗脱液，氮气吹干，加入体积200μL实施例2步骤(1)④制备的1mg/mL丹磺酰氯衍生试剂，用碳酸氢钠调节pH为10，旋涡混合30s，在温度60℃下反应时间为30min，得衍生化产物。取出自然冷至室温后，氮气吹干，再加入混合液溶解，所述混合液由0.65mL甲醇溶液和1mmol/L乙酸铵溶液0.35mL混合而成，溶解后的溶液中有机相用滤膜过滤得滤液，所得滤液进超高效液相色谱-质谱检测器测定，测定条件按照实施例2中步骤(2)①所述的超高效液相色谱-质谱检测器测定条件。
(3)检测结果
检测结果见表4。六种***在2-50μg/kg的添加浓度范围内的定量限为1-2μg/kg，回收率范围为68％-121％，RSD范围为4.3％-13.8％，表明本发明方法对于6种***的检测灵敏度低，稳定性较好。
表4 6种***的回收率，RSD，定量限n＝6

Claims (2)

1.一种衍生化测定酚类***的方法,其特征在于包括以下步骤：
(1)***标准品的制备和测定
①标准储备液的制备：将17β-***，雌三醇，雌酮，己烯雌酚，己烷雌酚，双烯雌酚6种***固体标准品分别用甲醇溶解后，分别用甲醇配成浓度为1mg/mL的6种标准储备液，置于-20℃冰箱储存；
②五个系列浓度混合标准液的制备：量取步骤(1)①制备的浓度为1mg/mL的17β-***标准储备液、浓度为1mg/mL的雌三醇标准储备液、浓度为1mg/mL的雌酮标准储备液、浓度为1mg/mL的己烯雌酚标准储备液、浓度为1mg/mL的己烷雌酚标准储备液、浓度为1mg/mL的双烯雌酚标准储备液各取0.5mL混合到50mL容量瓶，用甲醇定容至50mL得混合工作液，然后分取混合工作液用甲醇分别稀释为混合标准液A、混合标准液B、混合标准液C、混合标准液D、混合标准液E五个系列浓度混合标准液，其中：
混合标准液A中含有的17β-***、雌三醇、雌酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚6个组分的浓度均为5ng/mL；
混合标准液B中含有的17β-***、雌三醇、雌酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚6个组分的浓度均为50ng/mL；
混合标准液C中含有的17β-***、雌三醇、雌酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚6个组分的浓度均为100ng/mL；
混合标准液D中含有的17β-***、雌三醇、雌酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚6个组分的浓度均为500ng/mL；
混合标准液E中含有的17β-***、雌三醇、雌酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚6个组分的浓度均为1000ng/mL；
③内标的制备：将氘代17β-***(d3)用甲醇溶解后，用甲醇配成浓度为1mg/mL的内标标准储备液，量取内标标准储备液，加入甲醇配制成浓度为500ng/mL的内标；
④丹磺酰氯衍生试剂的制备：将固体丹磺酰氯溶解于有机溶剂，用该有机溶剂配制成浓度为1mg/mL丹磺酰氯衍生试剂，装入棕色瓶，置于-20℃冰箱储存；
⑤分别取1mL步骤(1)②配制的五个系列浓度的混合标准液，在每一个混合标准液中加入步骤(1)③所制备的浓度为500ng/mL的内标100μL，每一个混合标准液加入内标混合均匀后用氮气吹干，分别得到对应的五个混合标样；混合标准液A对应的混合标样记为混合标样A＇，混合标准液B对应的混合标样记为混合标样B＇、混合标准液C对应的混合标样记为混合标样C＇、混合标准液D对应的混合标样记为混合标样D＇、混合标准液E对应的混合标样记为混合标样E'；
⑥衍生化反应和超高效液相色谱-质谱检测器测定
步骤(1)⑤所述的五个混合标样均按如下方法进行衍生化反应：每个混合标样中加入步骤(1)④制备的1mg/mL丹磺酰氯衍生试剂10～1000μL，用碳酸氢钠或氢氧化钠调pH为8.0～11.0，旋涡混合30s，在温度45℃～70℃，衍生化反应10～30min；
每个衍生化反应后的溶液自然冷至室温后，氮气吹干，再加入混合液溶解，所述混合液由0.65mL甲醇溶液和1mmol/L乙酸铵溶液0.35mL混合而成；溶解后的溶液中有机相用滤膜过滤得滤液，所得滤液进超高效液相色谱-质谱检测器测定，超高效液相色谱-质谱检测器测定条件如下：
色谱柱：waters BEH C18 2.1×50mm。色谱柱温度：35℃。进样体积：10μL；
流动相为甲醇:1mmol/L乙酸铵,设置梯度洗脱，梯度洗脱条件按表1：
表1 梯度洗脱条件
设置质谱检测器扫描方式：选择离子模式，按表2所示质谱检测器测定衍生产物的条件，正负离子同时扫描，扫描质量数范围为m/z＝40～600，锥孔电压15V，采样速率8点/秒,毛细管电压0.8kv；
表2 质谱检测器测定衍生产物的条件
⑦经超高效液相色谱-质谱检测器测定得到17β-***，雌三醇，雌酮，己烯雌酚，己烷雌酚，双烯雌酚6种***的峰面积和内标的峰面积，分别以6种***的峰面积与内标峰面积之比值为纵坐标，步骤(1)②中的五个混合标准液的浓度值为横坐标，绘制对应的六个标准工作曲线；
(2)待检样品检测
①准确称取5g动物组织待检样品，加入100μL步骤(1)③所制备的浓度为500ng/mL的内标，用25mL乙腈提取，5000rpm，离心5min，收集上清液，氮气吹干；
②加入步骤(1)④所述的1mg/mL丹磺酰氯衍生试剂10-1000μL后，用碳酸氢钠或氢氧化钠调pH为8.0～11.0，旋涡混合30s，在温度45℃～70℃，衍生化反应10～30min；
③衍生化反应后的溶液自然冷至室温后，氮气吹干，再加入混合液溶解，所述混合液由0.65mL甲醇溶液和1mmol/L乙酸铵溶液0.35mL混合而成；溶解后的溶液中有机相用滤膜过滤得滤液，所得滤液进超高效液相色谱-质谱检测器测定，按步骤(1)⑥所述的超高效液相色谱-质谱检测器测定条件测定；
④经超高效液相色谱-质谱检测器测定，得到待检样品峰的保留时间和峰面积，与步骤(1)⑥所得的6种***标样的保留时间进行比较，确定待检样品中所含***的种类，与步骤(1)⑦中所对应的***的标准工作曲线比较，得到所含***的含量。
2.根据技术方案1所述的衍生化测定酚类***的方法,其特征在于：步骤(1)④中所述的有机溶剂为丙酮或者苯。
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