CN105838619B - 两对可以成功侵染茭白植株并使其孕茭的菰黑粉菌及其人工接种方法 - Google Patents
两对可以成功侵染茭白植株并使其孕茭的菰黑粉菌及其人工接种方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105838619B CN105838619B CN201610058052.3A CN201610058052A CN105838619B CN 105838619 B CN105838619 B CN 105838619B CN 201610058052 A CN201610058052 A CN 201610058052A CN 105838619 B CN105838619 B CN 105838619B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- wild rice
- smut
- haploid strains
- rice smut
- uet2
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/145—Fungal isolates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
- A01G22/00—Cultivation of specific crops or plants not otherwise provided for
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
- A01G7/00—Botany in general
- A01G7/06—Treatment of growing trees or plants, e.g. for preventing decay of wood, for tingeing flowers or wood, for prolonging the life of plants
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Botany (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Forests & Forestry (AREA)
- Ecology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
两对可以成功侵染茭白植株并使其孕茭的菰黑粉菌及其人工接种方法，属于茭白人工接种技术领域。该两对菰黑粉菌分别为菰黑粉菌单倍体菌株UET1和菰黑粉菌单倍体菌株UET2以及菰黑粉菌单倍体菌株UET2和菰黑粉菌单倍体菌株UEMT3。本发明利用菰黑粉菌中筛选得到的菰黑粉菌单倍体菌株UET1和菰黑粉菌单倍体菌株UET2以及菰黑粉菌单倍体菌株UET2和菰黑粉菌单倍体菌株UEMT3两对组合的菰黑粉菌接种于野茭中，使其成功孕茭。该方法操作简单、有效，为茭白育种提供了一个新的方向。
Description
技术领域
本发明属于茭白人工接种技术领域，具体涉及两对可以成功侵染茭白植株并使其孕茭的菰黑粉菌及其人工接种方法。
背景技术
菰黑粉菌属于担子菌亚门黑粉菌属，是一种典型的二型态真菌，与玉米瘤黑粉菌近源。目前为止，茭白是其所知的唯一寄主，而茭白孕茭是茭白植株与该专一性地寄生在体内的菰黑粉菌共同作用的结果。至今，茭白的种植及保种育种还是采用茭墩分离筛选的方式，人力物力投入较大。因此采用人工接种方式是茭白育种的发展方向。但是迄今为止没有成功进行人工接种的报道。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供两对可以成功侵染茭白植株并使其孕茭的菰黑粉菌及其人工接种方法的技术方案。
所述的两对可以成功侵染茭白植株并使其孕茭的菰黑粉菌，其特征在于该两对菰黑粉菌分别为菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET1和菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET2以及菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET2和菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UEMT3，所述的菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET1保藏号为：CGMCC No.11843，菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET2保藏号为：CGMCC No.11844，所述的菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UEMT3保藏号为：CGMCC No.11842。
所述的利用两对菰黑粉菌使茭白植株孕茭的人工接种方法，其特征在于包括以下步骤：
1）将菰黑粉菌单倍体菌株UET1，UET2和UEMT3分别在YEPS液体培养基中25-30℃摇菌至OD600为0.8-1.0，离心收集菌体，用0.5×YEPS液体培养基稀释成终浓度为OD600为2.0-3.0的菌液，将UET1和UET2或UET2和UEMT3的菌液俩俩混合用于接菌；
2）将带有3个以上完整节间的野茭管状根进行育苗，温室培养15-20天，以萌发有3个以上小苗期植株的管状根为接种对象，并对苗基部进行扎孔处理；
3）将步骤1）得到的混合菌液用注射器注射管状根，直到有菌液溢出为止；
4）将处理后的接种苗进行修剪，防止过多的蒸腾作用导致植物萎焉，然后浸置于剩余的混合菌液中，22-25℃温室黑暗放置12-24 h；
5）将浸菌后的野茭苗转移至带营养土的小盆中进行过渡接种，待土充分湿润后将混合菌液倒入土中，22-25℃温室黑暗培养7 d，完成接种；
6）将接种后的苗移植室外或培养箱中进行露天栽培，接种栽培时间控制在3月份，施肥参考正常茭白种植标准。
所述的方法，其特征在于所述的步骤1）中YEPS液体培养基中含有以下组分：蛋白胨2%、蔗糖2%、酵母粉1%和水余量。
所述的方法，其特征在于所述的步骤2）中温室培养条件温度控制在22-25℃，光照时间为8-12 h。
所述的方法，其特征在于所述的步骤4）中浸没茎基部扎孔处为准。
所述的方法，其特征在于所述的步骤5）中小盆体积为3-5 L。
本发明利用菰黑粉菌中筛选得到的菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET1和菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET2以及菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET2和菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UEMT3两对组合的菰黑粉菌接种于野茭中，使其成功孕茭。该方法操作简单、有效，为茭白育种提供了一个新的方向。
附图说明
图1为菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET1和菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET2获得途径示意图；
图2为菌种及交配型基因的PCR鉴定结果图；
图3为茭白组织切片图。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步说明本发明。
实施例1：菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET1和菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET2的筛选，如图1所示；
1.收集冬孢子：从龙茭2号灰茭中（图1A）直接挑取冬孢子。
2.冬孢子悬液：将挑取的冬孢子堆置于5 mL无菌水中，经4层灭菌纱布过滤，获得较纯的冬孢子悬液，最后再用无菌水将冬孢子悬液稀释成终浓度为103个孢子/mL。冬孢子形态如图1B所示。
3.冬孢子培养：取100 µL冬孢子悬液涂布于担孢子分离培养基上，28℃培养约60h，以肉眼可见细小分散的单菌落（图1C）为标准。担孢子分离培养基（1 L）配方为：K2HPO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01g，KCl 0.5 g，葡萄糖18 g，(NH4)2SO4 5.28 g，琼脂10 g。
4.单孢分离培养：挑取单个肉眼可见的菌落至清水中，稀释成103个孢子/mL，每次取1 µL置于显微操作仪下用毛细吸管吸取单个担孢子（图1D），将分离出的担孢子在YEPS（2%蛋白胨，2%蔗糖，1%酵母粉，1.5%琼脂粉）固体培养基上，28℃培养4 d。一个单菌落分离5个担孢子，取3个以上单菌落。担孢子培养后的菌落形态如图1E所示。
5.显微观察：对担孢子形成的菌落形态用光学显微镜进行显微观察，若菌落边缘光滑（图1F）则可初步鉴定为单倍体菌株，若边缘产生了菌丝（图1G），则舍弃。
6.性亲和菌株筛选：将初步鉴定的单倍体菌株编号（图1E），并用YEPS液体培养基分别稀释成浓度为OD600为2.0的菌液。通过融合反应实验对性亲和菌株进行初步鉴定。融合反应实验如图1H，具体过程为：将1号菌液先在YEPS固体培养基上进行点样，每个点1 µL，总点样数为分离得到的单倍体菌株数。之后将剩余的各菌液各取1 µL分别覆盖于1号菌株菌点上方，标记菌株号，于28℃培养箱中培养4 d。培养后对菌落形态进行肉眼观察，若可见白色气生菌丝，则混合培养的两个菌株可能为性亲和单倍体菌株。如图1H中所示，1号菌株与2、3、4、8或11号菌株可能为性亲和单倍体菌株。
7. PCR鉴定：通过对其交配型位点的克隆分析，发现菰黑粉菌中存在3个信息素受体pra基因，分别为pra1，pra2和pra3，pra1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，pra2的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，pra3的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。众所周知，一个单倍体菌株中只可能存在一个pra基因，而两个性亲和的单倍体菌株中pra基因不一样。因此设计特异性引物用于进一步对筛选得到的单倍体进行PCR验证，并进一步确认彼此间的性亲和性。
以上述筛选到的12个单倍体菌株为例，提取各菌株的DNA，先通过引物ITS1和ITS4扩增ITS序列并测序进行菌种鉴定，PCR结果如图2D所示，测序结果经NCBI比对后表明均属于Ustilago esculenta。接下来我们对各个菌株基因组DNA中的pra1，pra2和pra3进行PCR扩增，结果如图2A,B,C所示，表明2、4号菌株的信息素受体基因为pra3,3、8、11号菌株的信息素受体基因为pra1，其余菌株的信息素受体基因为pra2。PCR扩增反应体系为：10×PCR缓冲液5 μL，dNTP 4 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，DNA模板1 μL，Taq酶0.5 μL，加ddH2O至50 μL。PCR扩增程序为94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃ 终止，扩增片段长度均在600 bp上下，引物序列如下：
ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’（ 核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示），
ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ （ 核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示），
pra1-F：5’-ATCGGCATCCTCGCTCATTATG-3’ （ 核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示），
pra1-R：5’-TGCATGCTTGATCTCCGTTGCG-3’ （ 核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示），
pra2-F：5’-ACAGCACGCTTCCCACCTTTTC-3’ （ 核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示），
pra2-R：5’-GACAAAGCAGCAGTGAACTGCC-3’ （ 核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示），
pra3-F：5’-CACAATTCCCATCACGGTGCTC-3’ （ 核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示），
pra3-R：5’-GAGCGAGAGCACTGATGGAAAG-3’ （ 核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示）。
8.确定单倍体菌株：当采用引物pra1-F和pra1-R扩增后得到长度在600 bp上下扩增片段的菌株确定为单倍体菌株UET1，当采用引物pra2-F和pra2-R扩增后得到长度在600bp上下扩增片段的菌株确定为单倍体菌株UET2。单倍体菌株UET1和UET2，在YEPS培养基上进行融合反应，结果，UET1和UET2可以融合形成白色气生菌丝，对菌丝基因组进行PCR鉴定后表明菌丝中同时含有pra1和pra2基因。
菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET1和UET2具有以下性质：形态特征：短杆状，成熟的孢子在15-20微米左右，单核无隔膜，进行芽殖，似酵母菌，但比酵母菌大。培养特性：固体培养菌落呈乳黄色，表面光滑，较湿润，比细菌菌落更大更厚，挑取时比细菌粘稠，类似酵母菌落。液体培养液如细菌菌液。 生理代谢特性：该菌株偏好还原性糖和有机氮源作为其生长的碳氮源。培养方法：可体外培养，适于在PDA或YEPS固体培养基上进行单菌落划线培养，在液体培养中培养容易降低该菌活性。另外该菌不适宜继代三次以上，不适宜7天以上的连续培养或低温放置，否则造成活性降低或菌体降解，适宜在-80度20%甘油保藏。
UET1菌株于2015年12 月07日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC) 保藏，保藏号为CGMCC No.11843，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1 号院3 号。UET2菌株于2015年12 月07日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC) 保藏，保藏号为CGMCC No.11844，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1 号院3 号。
同样的，采用上述的方法从龙茭2号正常茭白中也分离得到了两个单倍体菌株，分别命名为UEMT2和UEMT3，经PCR验证后表明UEMT2只含有pra2基因，UEMT3只含有pra3基因，证明它们是性亲和的单倍体菌株。在YEPS培养基上进行融合反应，UEMT2和UEMT3可以融合形成白色气生菌丝，对菌丝基因组进行PCR鉴定后表明菌丝中同时含有pra2和pra3基因。UEMT2菌株于2015年12 月07日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏号为CGMCC No.11841。保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1 号院3 号。UEMT3菌株于2015年12 月07日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏号为CGMCC No.11842。保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1 号院3 号。
菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UEMT2和UEMT3具有以下性质：形态特征：短杆状，成熟的孢子在20-25微米左右，单核无隔膜，进行芽殖，似酵母菌，但比酵母菌大。培养特性：固体培养（YEPS固体培养基：2%蛋白胨，2%蔗糖，1%酵母粉，1.5%琼脂糖）菌落呈乳黄色，表面光滑，较湿润，比细菌菌落更大更厚，挑取时比细菌粘稠，类似酵母菌落。液体培养（YEPS液体培养基：2%蛋白胨，2%蔗糖，1%酵母粉）后菌液均一，如细菌菌液。生理代谢特性：该菌株偏好复合碳源和复合氮源作为其生长的碳氮源，对有机碳源的喜好大于无机碳源，对乳糖和半乳糖的耐受性较差，对氨基酸的喜好程度大于无机氮源。培养方法：可体外培养，适于在PDA或YEPS固体培养基上进行单菌落划线培养，在液体培养中培养容易降低该菌活性。另外该菌不适宜继代三次以上，不适宜7天以上的连续培养或低温放置，否则易造成活性降低或菌体降解，适宜在-80度20%甘油保藏。繁殖方法：芽殖。
实施例2：使茭白植株孕茭的人工接种方法
1）将菰黑粉菌单倍体菌株分别在YEPS液体培养基（蛋白胨2%、蔗糖2%、酵母粉1%和水余量）中25-30℃摇菌至OD600为0.8-1.0，离心收集菌体，用0.5×YEPS液体培养基稀释成终浓度为OD600为2.0-3.0的菌液，将菰黑粉菌单倍体菌株的菌液俩俩混合用于接菌；
2）将带有3个以上完整节间的野茭管状根进行育苗，温室培养15-20天，温室培养条件温度控制在22-25℃，光照时间为8-12 h，以萌发有3个以上小苗期植株的管状根为接种对象，并对苗基部进行扎孔处理；
3）将步骤1）得到的混合菌液用注射器注射管状根，直到有菌液溢出为止；
4）将处理后的接种苗进行修剪，防止过多的蒸腾作用导致植物萎焉，然后浸置于剩余的混合菌液中，浸没茎基部扎孔处为准，22-25℃温室黑暗放置12-24 h；
5）将浸菌后的野茭苗转移至带营养土的3-5 L小盆中进行过渡接种，待土充分湿润后将混合菌液倒入土中，22-25℃温室黑暗培养7 d，完成接种；
6）将接种后的苗移植室外或培养箱中进行露天栽培，接种栽培时间控制在3月份，施肥参考正常茭白种植标准。
实施例3：能够成功侵染茭白植株并使其孕茭的菰黑粉菌的菌株筛选
采用实验室前期分离得到的UET1、UET2、UEMT2、UEMT3四个单倍体菌株，形成16种不同的菌株及不同形态的菌的组合（表1），采用实施例2的步骤接种野生茭白植株，结果发现只有组合（五）和组合（八）可以使植株茎基部膨大，其余组合接种后与对照没有明显区别。
表1 不同菌株及不同形态的菌的组合列表
验证试验：
为了进一步确认致使茭白孕茭的是人工接种的菰黑粉菌，我们采用过表达EGFP的菌株UET1-EGFP和UET2-EGFP、UET2-EGFP和UEMT3-EGFP混合侵染方式，按所述接种流程侵染小苗期的野茭，成功使茭白孕茭，同时对茭白进行组织切片后在荧光显微镜下观察到冬孢子和菌丝中具有EGFP过表达产生的绿色荧光信号，表明该茭白中的菌为我们人工接种的过表达EGFP的菰黑粉菌。
如图3所述的茭白组织切片，过表达EGFP菰黑粉菌人工接种茭白植株使其孕茭后，将茭白进行组织切片并在荧光显微镜下观察。A，田间茭白的组织切片（对照）；B，UET1-EGFP和UET2-EGFP混合后人工接种野茭孕茭后冬孢子富集区组织切片；C，UET1-EGFP和UET2-EGFP混合后人工接种野茭孕茭后肉眼未见冬孢子区组织切片；D，UET2-EGFP和UEMT3-EGFP混合后人工接种野茭孕茭后冬孢子富集区组织切片；E，UET2-EGFP和UEMT3-EGFP混合后人工接种野茭孕茭后肉眼未见冬孢子区组织切片。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国计量学院
<120> 两对可以成功侵染茭白植株并使其孕茭的菰黑粉菌及其人工接种方法
<130> 1
<160> 11
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1316
<212> DNA
<213> 菰黑粉菌
<400> 1
atgcttgatc acgtttcgcc tttcctttca ttgctcgcca gtgttctagt ctttatgcca 60
cttgcttggc acgtcaagag tagaaacgtt ggtacgatag tcctttcgat ctggctcatc 120
cttggcaatc ttgataactt cattaattca atggtatggt ggaacaccac ggcgaataag 180
gctccaggct tttgcgaaat aagtaagctc acaatttatg aatcactcct catcggcatc 240
ctcgctcatt atgatttact ttgcgttgct attttacagg catccgattg cggcatgcgt 300
tgtttgtcgc catccctgcc tccaaccttg tcatcgcacg aaaattagag agcatagcat 360
cgaccagaca agttcgagcc agcgcagcag accgaaagaa gtcggtcatc atcgatctac 420
tcatatcggt tggcgtgcca gtcatttatg tctcgcttat gattgtaaat caatctaatc 480
gttacggtat cgtcgaggag gctggatgct ggcccattct tgtaccttct tgggtctggg 540
tcttgcttgt cgcggtacca gttgtcctca tatccctttg ctcggccgta tacagtggta 600
agtgcagctg atcgccccat cccctgggct ttgaaccttg caactctaaa ctgactggtt 660
cggtcaatca cagtcgtagc gttccgatgg ttttggattc gaaggcgtca atttcaagca 720
gtgctggcaa gcagcgcatc gacgatcaac aaatctcgtt atgtcaggct tctcatgctg 780
actgctatcg acatgttgct attcttcccg gtttatgtcg gagccatcgc aacggagatc 840
aagcatgcaa tcaccacacc gtatggctca tggtctagcg ttcattctgg cttcagtcag 900
gttctctcgt tcccggctgc ggccatagag atgcaaagta gtttcagaag aaaccttatc 960
ctgtctcgac tcgtctgccc tctatccgcc tacatcttct tcgcaatgtt cgggcttggc 1020
ctggaggcac gtcaaggtta caagaatgcc ttcggcaggc ttctggtctt ttttaagttg 1080
cgaaaggagt ccaagccagc agtacctgag taagtacaca gcaattgcaa aaacatctac 1140
cccgcattga ggtgctcggt tcactaactt ttgccctctt cccgtacaga cccatcgttg 1200
cagatattga ggttgttacc ttccagtctc atgatcctta tgccgttgct gagactagtc 1260
cgtactcgga gaagtccggt gccgacactc caaagtacga agactcttgg aagtaa 1316
<210> 2
<211> 1218
<212> DNA
<213> 菰黑粉菌
<400> 2
atggtgtttt cagcagctga aaacgcctgt tacggcacac tctgtatatt gacagcatgt 60
cttcccacct tttcttttcc cgttcatttt cgggctggaa acactggggt cttgctcatg 120
atattttggt gcttcctcgg ccccttcaac aagggagtaa atgctcttgc atttaatcac 180
aatcttcaag ttcattggac ctttggttgc gacatcagcg ctgtcatcga acgaatctgg 240
caaataggct tgtgctgtag ttcgctttgt attttgcaga agctggagag cattgcttcc 300
ctcaggcaag cgcattcaag caatgcggat aggagacgca gactatgcat cgacttatct 360
gtgggacttg gagtccccat ccttcaaatt ccgttattct tcgtcgttca accatacaga 420
ctcgatgtga tcgaaaatat cggatgcagt gctccgctct acaactctgt acccgcgctg 480
ttcgtctact atttgtggag gctcctcatc agcgtcctgt gctccgtctt tgcaggtatg 540
tccattcctt ggcttggaat cttcgacgct acttcatgct gaccttgtct ttgactcaac 600
agtgctgatt ctcagatggt ttgtgctcag gcgaaggcag ttcactgctg ctttgtcttc 660
tcaacattca ggcctgtctc aaaaaaaata cttccgctta ttcgccctgg cagtctgcga 720
agcgactctc gtctcggttg cacaatttta tctcatcata gactcactgc gactaactgg 780
tctgctccct tattcgaact gggcacaagt acacatcaac ttcgatacga ttgcgtacgt 840
tccgatgatc agagaaggag gcacatctca tgcctcagtc tcccttacaa ttttcaggtg 900
gttgtccttg tctccagctc tcgctctgtt cttctttttt ggtctcacgg aagatgcgaa 960
ggcgacctac cagagcttct ggcaggcaat caagaaaatg ggccaagcat ttcagtaagt 1020
atggcgaaat ttttattatt tggtcaatcc tttgagtgct catcgaattt gacgacgttg 1080
tcttgtagac caaggatgag aaacaggggc tctggaaagc acatcaaccc agagaatcac 1140
tccctcgacc tcgaacactt tcaggatcaa aacagcaaag tttcgattgt gctgcacaaa 1200
gacatcgtga ttacttga 1218
<210> 3
<211> 1479
<212> DNA
<213> 菰黑粉菌
<400> 3
atgttcacca caattcccat cacggtgctc tcatttgcgg gagcacttgt cgtaatcatc 60
ctgattccct cgtactatcg ggttaggaac actccagtgc tcctttctat tttttggctt 120
tgttcaacta gccttttcat cgcaatcaac actgctggat ggcaacacaa tgtttcagat 180
aagtggcagg tgtattgcga aatttgtaag tgaccaagtc cgataaaaaa ctgtttaaga 240
tcaccagcta actcgcccca aatcctttga ttttcacttt tattatgatt attacgtttc 300
ctattattat tttctctttc ttcatagccg ttcgaatcgt gtacgcctcc cctttcgccc 360
ttcaatgctg ctcagtgctt ctactcagtc gcctcgaagc aatcgctgcg actcgatacg 420
tatctctgac agactcggca aagaagcggc gaatggtcat agagctcgtt gtaggcttca 480
ttctcccaat cctttacata gctctggcag tcatcaacca agggcatcgg tacgacatca 540
tcgagggact cggaccaacc atatccatct ttccatcagt gctctcgctc atattttcga 600
cagcaccgac cctagtcgct tcagtcatcg caactgtata cgcacgtgag tctcttcccc 660
tgccatcgag aaacttgcgc tcaatgactg attttctgat atttgcttca ttctaatgac 720
ctagtgctct gtgcttattg gctattcctg cgcaggaggc aattaagtgc agtactttcc 780
tcgtctggct caggcataaa catttcgcag tatgttcgac tgtttggtct gagctgcatg 840
gagctcttat ggaccgtacc aatcaattgg agcgtccaga tgcagaacct tcttaataga 900
ggcgacaacg gccaagttct gtacccatac aagtcttggg cgtacgtaca tcaaggatac 960
tggtctattt cacaggttac catcgaggac cttcgacaga cctctgtggg aagaaagaac 1020
atccccatca tgtatcttgg agccctgtca atctctgtgt cttgttttat tttcttcatc 1080
ttcctcggta caagcaccga aatctcgaga gacctcacag ctaggctcgg tgcattttgt 1140
ccagtctcta agtgggcctc aaagatttca ggacgtcaag ggtgagtcga cttacaatat 1200
ttgcggttaa aagcgctgta atcttgtgct tgtgtgacca gccgtttaac ccttttctat 1260
tccattttcc aggctcttta acgtccattc tgtacgcagg caaccggcat tgtcggaaag 1320
tcggtcacag cctcctttaa cccccaacga agagctgaag atgaaagact tcgacgaatc 1380
tagagccgac gagatgcaaa ttgaggtcct tgtagagcgg acacggtacg aagattcatt 1440
ggaaagttcg agagccatgt aaatgctgca gctaaataa 1479
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
tccgtaggtg aacctgcgg 19
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
tcctccgctt attgatatgc 20
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
atcggcatcc tcgctcatta tg 22
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
tgcatgcttg atctccgttg cg 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
acagcacgct tcccaccttt tc 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
gacaaagcag cagtgaactg cc 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
cacaattccc atcacggtgc tc 22
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 11
gagcgagagc actgatggaa ag 22
Claims (6)
1.两对可以成功侵染茭白植株并使其孕茭的菰黑粉菌，其特征在于该两对菰黑粉菌分别为菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET1和菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET2以及菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET2和菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UEMT3，所述的菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET1保藏号为：CGMCC No.11843，菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET2保藏号为：CGMCC No.11844，所述的菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UEMT3保藏号为：CGMCC No.11842。
2.利用权利要求1所述的两对菰黑粉菌使茭白植株孕茭的人工接种方法，其特征在于包括以下步骤：
1）将菰黑粉菌单倍体菌株UET1，UET2和UEMT3分别在YEPS液体培养基中25-30℃摇菌至OD600为0.8-1.0，离心收集菌体，用0.5×YEPS液体培养基稀释成终浓度为OD600为2.0-3.0的菌液，将UET1和UET2或UET2和UEMT3的菌液俩俩混合用于接菌；
2）将带有3个以上完整节间的野茭管状根进行育苗，温室培养15-20天，以萌发有3个以上小苗期植株的管状根为接种对象，并对苗基部进行扎孔处理；
3）将步骤1）得到的混合菌液用注射器注射管状根，直到有菌液溢出为止；
4）将处理后的接种苗进行修剪，防止过多的蒸腾作用导致植物萎焉，然后浸置于剩余的混合菌液中，22-25℃温室黑暗放置12-24 h；
5）将浸菌后的野茭苗转移至带营养土的小盆中进行过渡接种，待土充分湿润后将混合菌液倒入土中，22-25℃温室黑暗培养7 d，完成接种；
6）将接种后的苗移植室外或培养箱中进行露天栽培，接种栽培时间控制在3月份，施肥参考正常茭白种植标准。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的步骤1）中YEPS液体培养基中含有以下组分：蛋白胨2%、蔗糖2%、酵母粉1%和水余量。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的步骤2）中温室培养条件温度控制在22-25℃，光照时间为8-12 h。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的步骤4）中浸没茎基部扎孔处为准。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的步骤5）中小盆体积为3-5 L。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610058052.3A CN105838619B (zh) | 2016-01-28 | 2016-01-28 | 两对可以成功侵染茭白植株并使其孕茭的菰黑粉菌及其人工接种方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610058052.3A CN105838619B (zh) | 2016-01-28 | 2016-01-28 | 两对可以成功侵染茭白植株并使其孕茭的菰黑粉菌及其人工接种方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105838619A CN105838619A (zh) | 2016-08-10 |
| CN105838619B true CN105838619B (zh) | 2019-04-26 |
Family
ID=56580603
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610058052.3A Active CN105838619B (zh) | 2016-01-28 | 2016-01-28 | 两对可以成功侵染茭白植株并使其孕茭的菰黑粉菌及其人工接种方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105838619B (zh) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109022290B (zh) * | 2018-07-25 | 2021-06-08 | 中国计量大学 | 一种菰黑粉菌单倍体菌株UeMTSP及其应用 |
| CN109136099B (zh) * | 2018-07-25 | 2021-06-08 | 中国计量大学 | 一种菰黑粉菌单倍体菌株UeTSP及其应用 |
| CN108998464B (zh) * | 2018-07-25 | 2021-05-18 | 中国计量大学 | pSP107质粒及其应用、构建方法 |
| CN109392702B (zh) * | 2018-12-18 | 2022-09-20 | 中国计量大学 | 一种人工选育正常茭白的方法 |
| CN109370922B (zh) * | 2018-12-18 | 2020-10-16 | 中国计量大学 | 一对成功实现茭白正常茭人工选育的菰黑粉菌及其应用 |
| CN109593772B (zh) * | 2018-12-18 | 2020-12-29 | 中国计量大学 | CRISPR/Cas9质粒及其构建方法、使用方法 |
| CN114175979A (zh) * | 2021-11-19 | 2022-03-15 | 扬州大学 | 一种通过人工接种菰黑粉菌使雄茭产生正常茭白的方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104560742A (zh) * | 2015-01-14 | 2015-04-29 | 浙江省林业科学研究院 | 农杆菌介导茭白黑粉菌转化子菌株及其制备方法和应用 |
-
2016
- 2016-01-28 CN CN201610058052.3A patent/CN105838619B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104560742A (zh) * | 2015-01-14 | 2015-04-29 | 浙江省林业科学研究院 | 农杆菌介导茭白黑粉菌转化子菌株及其制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| "the generic position of ustilago maydis,ustilago scitaminea, and ustilago esculenta (ustilaginales)";meike piepenbring 等;《mycological progress》;20020228;第1卷(第1期);第71-80页 * |
| "菰黑粉菌不同菌株比较研究";柯卫东 等;《长江蔬菜》;19961231(第8期);第21-24页 * |
| "菰黑粉菌转录调节因子rbf1的克隆及表达分析";胡鹏 等;《植保研究》;20151231;第198-201页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105838619A (zh) | 2016-08-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105838619B (zh) | 两对可以成功侵染茭白植株并使其孕茭的菰黑粉菌及其人工接种方法 | |
| CN105830760B (zh) | 一种成功使茭白植株孕茭的菰黑粉菌人工接种方法 | |
| CN105838615B (zh) | 一种菰黑粉菌单倍体菌株uet2及其应用 | |
| CN105838616B (zh) | 一种菰黑粉菌单倍体菌株uet1及其应用 | |
| CN107435047A (zh) | 一种植物磷信号网络中耐低磷关键基因GmPHR25及其与应用 | |
| US20220369648A1 (en) | Endophytic falciphora oryzae fo-r20 and its application | |
| CN114456981B (zh) | 一株耐盐碱地固氮大豆根瘤菌及其应用 | |
| CN108293599A (zh) | 一种花脸香蘑及其分离扩繁方法和覆土栽培方法 | |
| CN113025505A (zh) | 一种莱氏绿僵菌及其在草地贪夜蛾蛹期的生物防治方法与应用 | |
| CN108913796A (zh) | 用于检测绿僵菌植物内生性的绿色荧光蛋白标记基因egfp特异性引物、试剂盒及方法 | |
| CN105838782A (zh) | 一种快速稳定分离鉴定菰黑粉菌性亲和单倍体菌株的方法 | |
| CN109392702A (zh) | 一种人工选育正常茭白的方法 | |
| KR101905674B1 (ko) | 탁월한 천마종자 발아활성을 갖는 신규한 애주름버섯 nifos101 균주 및 이의 이용 | |
| CN105441332A (zh) | 一种从柞蚕中分离的白僵菌及其应用 | |
| CN109593769A (zh) | 菰黑粉菌冬孢子形成相关基因Itd1及其应用 | |
| CN107858372A (zh) | 一种农杆菌介导的棉花瞬时转化方法 | |
| CN109370922A (zh) | 一对成功实现茭白正常茭人工选育的菰黑粉菌及其应用 | |
| CN105838618B (zh) | 一种菰黑粉菌单倍体菌株uemt2及其应用 | |
| CN108203695B (zh) | 一株杜鹃花类菌根真菌功能菌株及其应用 | |
| CN114766285B (zh) | 一种白肉灵芝菌株l4495及其栽培方法与应用 | |
| CN105732781B (zh) | 一种促进哈茨木霉根表定殖的蛋白及其应用 | |
| CN105838617B (zh) | 一种菰黑粉菌单倍体菌株uemt3及其应用 | |
| CN104630103A (zh) | 一种微生物菌剂及其制备方法和应用 | |
| CN114874917A (zh) | 深绿木霉t3、由其制备的菌剂、菌剂制备方法和菌剂的应用 | |
| CN110452821B (zh) | 能够促进苗木不定根和次生根发育的根际真菌及用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |