CN105829535A - 用于阻止脱靶效应而变形的rna干扰诱导核酸及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及RNA干扰诱导核酸及其用途，更具体地说，涉及RNA干扰诱导核酸，在RNA干扰诱导核酸的双链的至少一个单链中，被变成为将5ˊ末端和3ˊ末端区域取代为没有碱基(base)的形式。本发明的RNA干扰诱导核酸，可提供新型变形形状的核酸及使用其的目标基因的选择性表达抑制方法，用来防止用RNA干扰现象来抑制目标基因的表达时发生的脱靶效应。此外，根据本发明的RNA干扰诱导核酸，提供一种新型变形形状的RNA干扰诱导核酸，在抑制目标基因的表达的同时可以防止脱靶效应，具有目标选择性及特异性，从而来解决现有RNA干扰诱导核酸的问题，即可以放心作为抑制基因表达的方法来进行研究和基因治疗，缓解因脱靶效应引起的不准确性及副作用。

Description

用于阻止脱靶效应而变形的RNA干扰诱导核酸及其用途
技术领域
本发明涉及RNA干扰诱导核酸及其用途，更具体地说，涉及RNA干扰诱导核酸，在RNA干扰诱导核酸的双链的至少一个单链中，包含在5'末端和3'末端区域中以间隔物取代的变形。
背景技术
siRNA(小干扰RNA)已被广泛地用作通过干扰来抑制预期目标基因的表达的技术，但是，作为其不可避免的缺点，别的基因也会被非特异地抑制，脱靶效应的产生会带来错误研究结果和治疗副作用，这是令人非常担忧的。这种脱靶效应，是因为在RNA干扰中起到核心作用的AGO(Argonaute)蛋白被人工导入的siRNA，会被当作跟细胞内存在的微RNA一样对待，从而产生的。因此其被称为微RNA类似脱靶效应(miRNA-likeoff-targeteffect)。微RNA，通过种子区域(seedregion；5'端的第二个到第七个)的碱基配对(basepairing)来识别主要目标基因并抑制其表达，而siRNA也依赖相同的位置即种子区域位置的序列，因此产生脱靶效应。这种siRNA的微RNA类似脱靶现象已在很多研究中被报告出(Jackson，A.L.，etal.，Nat.Biotechnol.，21(6)：635，2003；Jackson，A.L.，etal.，Rna，12(7)：1179，2006；Birminghametal.，Nat.Methods，3(3)：199，2006；Linetal.，NucleicAcidsRes.，33(14)：4527，2005；Andersonetal.，RNA，14(5)：853，2008)，根据种子部分的序列，影响少则几百多则约1500个左右的基因的表达，在使用siRNA的表达型扫描检查过程中，阳性命中中有多达30％的表达型呈现出了这种脱靶，其副作用是很严重的。此外，微RNA的情况，种子部分和靶之间的配对很弱时，已经有报告表明通过3'端部分中的补偿配对(3'-compensatorypairing)来抑制基因的表达的现象，因此，据认为，微RNA类似脱靶现象也会被由这样的机制来呈现。
另外，观察通过siRNA介导的广泛的脱靶表达抑制效应，为了在维持预期的目标的表达抑制效率的同时只减少脱靶表达抑制，siRNA中尝试了几种任意的化学或结构变更。Dharmacon研究(拉斐特，CO)中研究使用的变形，向siRNA上的核苷酸的中核糖基环的2'位置上添加甲基(2'OMe)来减少脱靶效应，尤其是，5'端第二位置的2'OMe变形，对预期的目标的表达抑制的影响多少会变弱，但是首次被发现，对减少脱靶效应的次数和程度都有效果。此后作为其他形状的变形，LNA变形或(Purietal.，NucleicAcidsSymp.Ser.2008)，UNA变形(Bramsenetal.，NucleicAcidsRes.2010；38，5761-73)，还开发了导入单一核苷酸凸起(bulge)的结构。但是，此类所有化学变形，并不是对产生脱靶的最重要的碱基配对本身加以变形，而是加到核苷酸骨架(backbone)上，并不对根本的碱基配对产生影响。因为这个原因，它尽管可以减少脱靶效应，但是并不能完全阻止其发生，此外，其还呈现出了还会减少命中目标抑制效率的问题。
发明内容
要解决的技术问题
因此，本发明人为了解决现有技术的问题，开发了一种目标基因抑制效率高并且可以完全阻断脱靶效应的变形RNA干扰诱导核酸，从而完成了本发明。
因此，本发明的目的在于提供一种RNA干扰诱导核酸，其特征在于，在RNA干扰(RNAinterference)诱导核酸的双链的至少一个单链中，包括至少一个从5'末端起第六个核苷酸或从3'末端起第一个和第二个核苷酸被取代为间隔物的变形。
本发明的另一目的，是提供一种用于抑制基因的表达的化合物，其含所述RNA干扰诱导核酸。
本发明的另一目的是提供一种用于抑制基因的表达的试剂盒，其含有所述RNA干扰诱导核酸。
本发明的另一目的是提供一种用于抑制细胞内目标基因的表达的方法，其包括将所述RNA干扰诱导核酸导入细胞内，或使其在细胞内表达的步骤。
本发明的另一目的是提供一种用于抑制RNA干扰诱导基因的引导链(guidestrand)或过客链(passengerstrand)引起的脱靶效应的方法，其包括将所述的RNA干扰诱导核酸导入细胞内或使其在细胞内表达的步骤。
但是，通过本发明来实现的技术课题，并不限于上述课题，其中没有提及的其他课题，本领域技术人员可通过下面的详细描述来清楚理解。
技术方案
为了达到本发明的上述目的，本发明提供一种RNA干扰诱导核苷酸，其特征在于，在RNA干扰(RNAinterference)诱导核酸的双链的至少一个单链中，包括至少一个从5'末端起第六个核苷酸被取代为间隔物，或从3'末端起第一个和第二个核苷酸被取代为间隔物的变形。
在本发明的实施例中，所述RNA干扰诱导核酸的双链中，成为变形对象的单链，只存在为单链，如引起RNA干扰现象的ss-siRNA(singlestrandsiRNA)一样，具有可与AGO(argonaute)蛋白结合的能力。
在本发明的另一实施例中，所述间隔物，是可以维持核苷酸位置的空间的化合物，优选有机化合物，最优选为含有磷酰基或磺酰基的羟基碳链，所述羟基碳链可以是至少一个碳原子数为3的烷基链(C3间隔物)。
在本发明的另一实施例中，所述间隔物，可以是与生体碱基结合无法进行碱基配对的，可以是作为非碱基形状以脱氧核糖核苷酸(Deoxyribonucleotide)为骨架的dSpacer或核糖核苷酸(Ribonucleotide)为骨架的rSpacer分子。
在本发明的另一实施例中，所述RNA干扰诱导核酸，可进一步包括：由于取代引起的与目标基因的RNA的不一致碱基配对(mismatchbasepairing)或由于***引起的凸起生成。
在本发明的另一实施例中，所述核酸，可以是siRNA、miRNA、shRNA、DsiRNA、lsiRNA、ss-siRNA、asiRNA、piRNA或endo-siRNA等引起干扰表达的所有核酸。
在本发明的又一实施例中，所述核酸，可像miRNA(微RNA)一样，当与全部序列相辅的目标基因不存在于生体中时，其可丧失功能，在这种情况下，可提供与RNA干扰相关联的对照群。
在本发明的又一实施例中，所述核酸想要通过RNA干扰来抑制的目标基因，可以上在最广义中表示的基因，在包含病毒在内的所有生物体中被转录(transcription)，可以是以RNA介导的所有编码(coding)或非编码(non-coding)基因。
在本发明的又一实施例中，所述RNA干扰诱导核酸，可以是抑制目标基因的表达的用途，上述双链，可以在人为组成的形状或生体中再次变形。
本发明提供用于抑制基因表达的化合物和试剂盒，其含有所述RNA干扰诱导核酸。
另外，本发明提供用于抑制细胞内目标基因的表达的方法，其包括将所述RNA干扰诱导核酸导入细胞内的或使其在细胞内表达的步骤。
此外，本发明提供用于抑制RNA干扰诱导核酸的引导链(guidestrand)或过客链(passengerstrand)引起的脱靶效应的方法，其包括将所述的RNA干扰诱导核酸导入细胞内的步骤。
进一步，本发明提供用于抑制RNA干扰诱导核酸的引导链(guidestrand)或过客链(passengerstrand)引起的脱靶效应的方法，其包括使所述RNA干扰诱导核酸在细胞内表达的步骤。
有益效果
本发明的RNA干扰诱导核酸，可提供新型变形形状的核酸及使用其的目标基因的选择性表达抑制方法，用来防止用RNA干扰现象来抑制目标基因的表达时发生的脱靶效应。
根据本发明的RNA干扰诱导核酸，具有以下特征，其提供新型变形形状的RNA干扰诱导核酸，在抑制目标基因的表达的同时可以防止脱靶效应，具有目标选择性及特异性，从而来解决现有RNA干扰诱导基因的问题，即可以放心作为抑制基因表达的方法来进行研究和基因治疗，缓解因脱靶效应引起的不准确性及副作用。
附图简述
图1以图表示出了被变形为脱氧核糖核苷酸间隔物(dSpacer)的核酸的基因表达命中目标抑制效果和微RNA类似脱靶效应抑制的图表。
图2示出了被脱氧核糖核苷酸间隔物(dSpacer)取代变形的siRNA分子的基因表达抑制效果和微RNA类似脱靶效应。
图3示出了被核糖核苷酸间隔物(rSpacer)取代变形的siRNA分子的基因表达抑制效果和微RNA类似类似脱靶效应。
图4示出了被***脱氧核糖核苷酸间隔物(dSpacer)的变形的siRNA分子的基因表达抑制效果和微RNA类似脱靶效应。
图5示出了被***核糖核苷酸间隔物(rSpacer)的变形的siRNA分子的基因表达抑制效果和微RNA类似脱靶效应。
图6通过比较示出了以5'末端为基准第六个核苷酸被取代变形为脱氧核糖核苷酸间隔物(dSpacer)的形状(6pi)的siRNA分子对miRNA分子的目标基因调整功能的影响，及现有的5'末端第二个部分的2'OMe变形的siRNA分子与效果。
图7示出了在细胞内siRNA(PCSK9)的脱靶效应及根据本发明被变更为6pi后评价其脱靶效应的结果。
图8示出了在生体内siRNA(PCSK9)的脱靶效应及根据本发明被变更为6pi后评价其脱靶效应的结果。
图9示出了现有的不一致碱基配对(mismatch)及2'OMe变形被应用到5'末端的第六部分的siRNA形状，与5'末端第二部分的2'OMe变形，第六部分的UNA变形，siRNA双链体第二位置导入凸起的形状的siRNA分子的相关基因表达抑制效果，与将微RNA类似脱靶效应与本发明比较的结果。
图10用图表示出了在RNA干扰诱导核酸的单链中，5'端的第六个，被变形为碳原子数至少为3的烷基链的羟基碳链构成的间隔物时，基因表达命中目标抑制效果和微RNA类似脱靶效应抑制。
图11示出了将5'末端的第六位置被由烷基链构成的间隔物(C3spacer)取代的siRNA分子的基因表达抑制效果，与微RNA类似脱靶效果进行评价的结果。
图12示出了对3'末端的第一个和第二个核苷酸被取代变形为间隔物的siRNA分子的基因表达抑制效果，和微RNA类似脱靶中3'末端补偿结合的相关效果进行评价的结果。
具体实施方式
本发明的特征在于，提供一种RNA干扰诱导核酸，其特征在于，在RNA干扰(RNAinterference)诱导核酸的双链的至少一个单链中，包括至少一个从5'末端起第六个核苷酸或从3'末端起第一个和第二个核苷酸被取代为间隔物的变形。
本发明人，为找到使用由名为RNA干扰的短RNA诱导的基因抑制现象，来在序列特异地有效抑制关注目标基因的表达的同时，完全防止脱靶效应的方法进行研究的结果，完成了本发明，将RNA干扰诱导核酸的双链中的任何一个单链，变形为在5'末端区域中包含不含碱基的共价结合如间隔物形状的非碱基单一核苷酸，由此可以确认到，其具有在可在阻止微RNA类似脱靶效应的同时有效抑制目标基因的特异性，此外，还可以确认到，在3'端领域中包含无碱基的共价结合变形，如间隔物形状的非碱基单一核苷酸，由此可以确认到，在阻止因3'末端补偿结合造成的微RNA类似脱靶效应的同时，有效抑制目标基因的特点。
即，在本发明的实施例中，确认到，在从5'端第6位置上的间隔物变形，在没有脱靶的同时还呈现出了最有效的目标基因抑制效果。这与本研究者之前的研究，也就是微RNA识别机制的相关新模型，即过渡成核模型(transitionalnucleationmodel，纳特结构体分子生物学杂志2012年02月12；19(3)：321-7)一致，因此，被称为“枢轴(pivot)”的5'端第6位置上的碱基配对，可以展示微RNA类似脱靶识别的核心要素。
另外，确认到，从所述非碱基核苷酸变形扩张，用间隔物取代从5'端起第六个位置上的核苷酸，当第五个核苷酸和第七个核苷酸与所述间隔物是共价结合形状时，可以既不出现脱靶，也可最有效地抑制目标基因。
即，在本发明的一个实施例中，从5'端起第六位置上的间隔物u变形，其所有种类可将脱靶效应消除，但是，在上靶效应中，与间隔物变形中大小最大的核糖核苷酸间隔物(rSpacer)相比，由于2'位置没有氧原子，所以大小相对较小的脱氧核糖核苷酸间隔物(dSpacer)更好，作为一个极端的情况，在最小的间隔物形状的烷基链间隔物(C3Spacer)中，呈现出了与没有施加变形的形状的上靶抑制效果类似的情况。这种在5'端第六个上较小的间隔物呈现出优秀的上靶效应的现象，与先前报告的AGO蛋白质与微RNA的结构(Schirleetal，Science2012，336，1037-40)以及过渡成核模式对照的话，与微RNA在5’端第六个碱基配对之后为抑制目标而进行的结构及功能的变化这一点上一致。
在本发明的另一实施例中，确认到，向实际上以种子部位识别目标显示功能的微RNA中的一个，即向miR-124施加本发明的变形的结果，呈现出了阻止微RNA目标妨碍，其功能呈现出神经细胞分化诱导功能丧失，与此相反，施加先前在Dharmacon公司中开发出的脱靶抑制变形，即2'OMe变形时，未能阻止miR-124的功能即神经分化诱导，在染色体水平的转录表达调查中，与本发明的变形方法相比，其抑制效果非常不足。
在本发明的其他实施例中，确认到，作为目标基因，将根据本发明的siRNA变形应用到海肾荧光素酶(Renillaluciferase)或PCSK9基因妨碍用siRNA上，对其中靶效果和脱靶效果进行调查的结果，可以以优秀的效率阻止介导链造成的脱靶效应，显示出对目标的选择能力得到提高的效果。尤其是，确认到，用于降低血浆胆固醇水平的PCSK9的siRNA的情况，以动物模型小鼠为对象治疗效果，即减少胆固醇水平，其效果与非变形形状的siRNA效果相当。
在本发明的另一实施例中，作为由PCSK9siRNA引起的脱靶现象，人类肝细胞HepG2出现了停止细胞周期，在小鼠肝组织中，发现了由于铜离子代谢异常造成细胞死亡的副作用，为了改善这一点，施加根据本发明的siRNA变形，确认上述副作用及脱靶效应的结果，确认到，副作用和脱靶现象消失，本来的目标及PCSK9妨碍表达得到了有效的维持。
在本发明的另一实施例中，确认到，将作为现有的微RNA类似脱靶抑制方法而提出的种子部分的不匹配，向微RNA中的一个，向从miR-124的5’端起第六个中导入时，miR-124的目标识别形状的种子匹配(seedmatch)造成的目标基因妨碍，虽然可以抑制，但是对由于不匹配导入造成的变形的序列的相关新种子匹配，依然存在可将其识别为目标从而出现抑制的副作用，将用于抑制现有脱靶的变形方法，即2'OMe变形导入至5'端第六时，同样也确认到了上述副作用的存在。
在本发明的另一实施例中，确认到，作为抑制以往的脱靶的变形方法而提出的从5'末端起的第2个进行2'OMe变形，从5'末端起的第7个进行UNA变形，在siRNA双链结构中在介导链的5'末端起第二个上形成单一核苷酸凸起的变形被施加时，虽然不能在所有情况下完美地抑制脱靶，但是本发明的情况，可以确认到脱靶被完美地抑制。
在本发明的另一实施例中，确认到将从5'末端第六个位置上的核苷酸以间隔物取代，且第五个核苷酸和第七个核苷酸与间隔物共价结合的形状时，既可以抑制目标基因的表达，又可以完全地阻止脱靶效应。
在本发明的另一实施例中，确认到，当将从siRNA的3'端起第一和第二核苷酸用没有碱基的形状的间隔物取代时，基因表达抑制效果优秀，且可以完美地阻止微RNA类似脱靶中3'末端补偿结合造成的脱靶效应。
如上所述，本发明，可提供抑制目标基因的表达的RNA干扰诱导核苷酸，其特征在于，在RNA干扰诱导核苷酸的双链中的至少一个单链中，用间隔物取代从5'端起第六个位置上的核苷酸，当第五个核苷酸和第七个核苷酸与所述间隔物共价结合形状，或用非碱基核苷酸或间隔物取代从3'端起第一和第二位置上的核苷酸。
在上面，RNA干扰诱导核苷酸优选形成双链，其包括由18-23个构成的核苷酸的介导链(guidestrand)及与所述介导链相辅的过客链(passengerstrand)，最优选是由21个核苷酸构成，但不限于此。此时，所述双链，可以是具有茎-环(stem-loop)的发夹(hairpin)结构的核酸的茎部分被迪塞尔(Dicer)蛋白质加工从而变形成为双链形状，即，shRNA被加工形成siRNA形状，但是其根据核酸形状会有所不同，因此其不限于此。此外，为了发挥最好的脱靶抑制效果，所述核酸，在3’末端具有两个核苷酸突起部(overhang)，或者可进一步包括由于取代造成的目标基因的RNA的不一致碱基配对(mismatchbasepairing)或由于***造成的凸起(bulge)的生成。术语凸起(bulge)指的是双链的核酸中，由于导入了一个以上核苷酸，而造成无法配对因此分开的部分，不一致碱基配对，一般指的是碱基对之间的沃森-克里克碱基配对(Watson-Crickbasepairing)没有形成的情况。
在本发明中，术语“介导链(guidestrand；antisensestrand)”，指的是，作为所述双链中用于抑制目标的用途而规定序列的单链部分，实际上主要结合至AGO蛋白质，作用在于介导使得AGO复合体可以识别目标基因，作为感兴趣的目标基因mRNA中基本上或者100％具有互补核酸序列的多聚核苷酸，因此其也被叫做“反义链”，例如，与siRNA、miRNA、shRNA、DsiRNA、lsiRNA、ss-siRNA、piRNA、endo-siRNA或asiRNA等核酸序列全部或一部分互补，术语“过客链(passengerstrand；sensestrand)”，指的是，所述双链中，和介导链形成双链结构，作用在于帮助使介导链与AGO蛋白质结合的过客角色，作为与目标核酸具有基本上或者100％相同的核酸序列的多聚核苷酸，因此被叫做“有义链(sensestrand)”，例如siRNA、miRNA、shRNA、DsiRNA、lsiRNA、ss-siRNA、piRNA、endo-siRNA或asiRNA等核酸序列的全部或一部分相同的多聚核苷酸。
本发明的术语“间隔物(spacer)”是指可以代替单一核苷酸来维持其空间的取代体，可以维持空间的形状，并不限于哪一个，优选是有机化合物，更优选是包含或连接磷酰基(-H2PO4)或者磺酰基(-H2PSO4)的羟基碳链，最优选是碳原子数至少为3的烷基链。此外，所述间隔物，包含非碱基形状的核苷酸，此类非碱基核苷酸形状的间隔物，一般来说作为完全没有碱基的形状的单一核苷酸类似体，可以表示包含dSpacer、rSpacer的概括地无法与以RNA为代表的所有其他生物体碱基相结合的形状的所有变形。
在上面，双链中成为对象的单链，可具有与引起RNA干扰现象的AGO(argonaute)蛋白质结合的能力。
在上面，RNA干扰诱导核苷酸，可以是从5'端第六个核苷酸被间隔物取代，从3'端第1个和第2个核苷酸被间隔物取代的变形一起被应用的。
此外，本发明可以提供含有所述RNA干扰诱导核苷酸的基因表达抑制用化合物和/或试剂盒。
在本发明中，所述“化合物”，可以指在抑制目标基因的表达的同时，还可以起到减少脱靶效果的作用的用途的化合物。
所述“试剂盒”，具有包括用于抑制目标基因的表达的含有RNA干扰诱导核苷酸或盛放着含有所述RNA干扰诱导核酸的化合物的容器的结构，所述容器可以采取瓶、桶、香囊、信封、管、安瓶(ampoule)等类似形状，其可部分或全部由塑料、玻璃、纸、箔、蜡等来形成。容器最初可以装备有一个完全或部分可拆卸的盖子，其可以是容器的一部分或者可以通过机械、粘合或其他方式被固定到容器上，或者还可以安装有可通过注射器针头来存取内容物的止动件。所述试剂盒可包括外部包，外部包可包含构成元件的使用说明书。
在此之上，确认到，根据本发明的RNA干扰诱导核酸可以从本发明的一个实施例有效抑制目标基因的表达，因此，可提供一种抑制细胞内目标基因的表达的方法，其包含将所述RNA干扰诱导核酸导入细胞内部的步骤，并提供一种抑制细胞内目标基因的表达的方法，其包含使所述RNA干扰诱导核酸在细胞内表达的步骤。
在本发明中，所述目标基因可以是内源性(endogeneous)基因或转基因(transgene)，但不限于此。
更进一步，通过实施例我们确认到，根据本发明的RNA干扰诱导核酸，可以有效抑制目标基因的表达，并且同时阻止脱靶效应，因此，本发明作为用于抑制由所述RNA干扰诱导核酸的介导链(guidestrand)或过客链(passengerstrand)造成的脱靶效应的方法，可提供包括将RNA干扰诱导核酸导入细胞内的步骤的方法。此外，本发明作为用于抑制由所述RNA干扰诱导核酸的介导链(guidestrand)或过客链(passengerstrand)造成的脱靶效应的方法，可提供包括使RNA干扰诱导核酸在细胞内表达的步骤的方法。
本发明的术语“脱靶效应(Off-targeteffect)”，是为了获得siRNA诱导与介导链具有相辅序列的mRNA的分解从而抑制相关mRNA的基因表达的效果而使用的，不仅如此，还包括因siRNA的过客链造成的其他mRNA的分解发生时因过客链造成的这种没有预料到的其他mRNA的分解乃至相关基因的表达抑制效果，及siRNA的介导链与错误的目标配对，使得其他mRNA的分解发生的介导链造成其他mRNA分解以及相关基因的表达抑制效果。
下面将展示一些优选实施例来帮助本发明的理解。但是，下面的实施例不过是为了帮助容易理解本发明而提供，本发明的内容并不限于下面的实施例。
【实施例1】
用脱氧核糖核苷酸间隔物(dSpacer)取代的siRNA分子的目标基因表达抑制效果及脱靶效应对比
如图1图表所示实施例，本发明人推测，将无法碱基配对的间隔物变形应用于与AGO蛋白质结合的所有RNA干扰诱导核酸的5'种子区域，可完全阻止脱靶效应，同时提高目标基因的抑制作用(中靶效果)，本发明人基于微RNA识别机制的模型，即过渡核模型(NatStructMolBiol.2012Feb12；19(3):321-7)，侧重于5'种子区域，尤其是被称之为“枢轴(pivot)”的从5'末端起的第6个核苷酸位置的碱基配对，从而发明了本RNA干扰诱导核酸。
首先，为将根据本发明的变形后的siRNA分子和以往的未施加变形的siRNA分子所媒介的中靶与脱靶效果进行对比，进行了下列实验。首先，合成包含介导链(guidestrand)RNA上的种子区域(seedregion)的5'末端区域(1号至11号)上被无法进行碱基配对的脱氧核糖核苷酸间隔物(dSpacer)取代(pi)的RNA，合成为过客链(passengerstrand)未施加任何变形，以往的结构，即与19个完美反向互补(perfectreversecomplement)一起，3‘末端上具有两个dT(DeoxyThymineNucleotide)的突起的双链被产生制造出。此类RNA分子由STPharma,TrilinkTechnologies或Bioneer公司化学合成，通过HPLC分离，然后根据这些公司提供的方法，作为在介导链和过客链的双体(duplex)，被制作成如图1的左边面板一样(在5'末端起第6个上被非碱基核苷酸取代的例子，6pi)。同时，作为对照群(NT；非靶向)，只在漂亮小线虫(c.elegans)中表达的微RNA(miRNA)，即cel-miR-67的序列，使用以siRNA的形状合成的。
上述变形，被应用于设计的siRNA(siRL)，目的在于抑制海肾荧光素酶(海肾荧光素酶产生于Promega公司psi-check2矢量中)。具体来说，75nMsiRNAs的产生是由于上述的双链体按照生产商的方案采用脂质体2000转染剂(Invitrogen)共转染HeLa细胞(ATCCCCL-2)同时带有psi-check2载体，该载体就是表达海肾荧光素酶的，然后检测效果。在测量siRL介导的靶向效应时，psi-check2载体被完整使用，而测量脱靶效应时，psi-check2载体中的海肾荧光素酶基因被不能对靶向效应起反应的pRL-TK(promega)的海肾荧光素酶所取代，之后构建RL-Seed和RL-Nuc,该载体包含与siRL(种子位点；种子)种子区域(5'末端起1-8位)完美互补的2组序列，以及成核凸起位点，其可通过在位点5和6之间形成凸起与miRNA结合，化合为DNA并重复植入3'UTR(3'untranslatedregion)。如此，HeLa细胞在DMEM培养基(Invitrogen)中被培育了出来，补充以10％FBS(胎牛血清)，100U/ml盘尼西林，以及100μg/ml链霉素，而没有抗生素在完全培养基中会发生转染。在转染24小时后，通过使用Promega公司的双荧光素酶报告基因检测***，按照生产商的方案对荧光素酶活性进行测量，可检测出siRNA的效果。这里的海肾荧光素酶的活性预测至少是副本的三倍，采用Promega公司的Glomax发光检测仪进行测量，然后按照萤火虫(firefly)荧光素酶活性进行标准化。
结果，如图2a所示，在5'末端区域起的第1与11位点之间拥有一个dSpacer替代物的siRNA表现出小于或等于60％的活性(相对于萤火虫荧光素酶标计的标准化数值而言)，此时靶向效应测量为75nM。尤其是，虽然位点2,4,5或6的替代降至小于或等于活性的30％，其表现不如未变形过的，但是其效果仍然非常显著。但是，当使用萤光素酶报告基因，***之前已知位点，例如种子位点(RL-种子)或成核凸起位点，以便估算微RNA类似脱靶效应，该脱靶抑制作用仅在位点2和7之间的dSpacer替代的情况下被消除，如图2b所示。
如上所述，5'末端起2-7位点之间的dSpacer替代被证明可消除微RNA类似脱靶效应，同时显示靶向活性，此时非碱基脱氧核苷酸是一个不能作碱基配对的变形物。
此外，为了进一步调查siRNA中2-7位点之间的dSpacer替代所显示出来的优秀的上靶效果，靶向抑制活性在各浓度中进行估算以便测量IC50(抑菌浓度50)，从而确认位点5或6上的替代是最有效的，如图2c和2d所示，此时位点6上的替代在所有消除脱靶效应的变形中表现出了最佳的最大抑菌率(Imax)。
上述结果非常符合过渡成核模型，这是一种新的miRNA目标识别模式，如图2e和2f所示，此结果也符合前面5'末端6位上的碱基配对研究报告，尤其是被称为“支点”的，对识别miRNA目标(NatStructMolBiol.2012Feb12；19(3):321-7)至关重要。
此外，如图2g所示，在5'末端起3至6位上拥有单一非碱基脱氧核苷酸替代的介导链，使得由对面的过客链介导的微RNA类似脱靶效应降低，通过在过客链上的相同的变形实现完全的防止，替代了5'末端区域起的2-7位上的一个核苷酸。
基于上述描述，我们可知siRNA分子的介导链应被适当地使用，通过替代5'末端区域起的2-7位为在碱基配对方面拥有缺陷的脱氧核苷酸间隔物(dSpacer)，考虑到对目标基因抑制的作用和避免脱靶效应，这里最合适的使用方法是替代位点6为dSpacer(6pi)。
【实施例2】
目标基因抑制和由siRNA分子核糖核苷酸间隔物(rSpacer)替代所导致的脱靶效应的对比
要看上面例1中的结果是否能被相似的含有核糖核苷酸骨架的间隔物所复制，siRL的2-7位上的核苷酸被替代为核糖核酸间隔物(rSpacer)(pi-r)，该位置之前表明可消除脱靶效应，这里siRL的靶向活性按照例1中的相同方法通过计算IC50来进行检测。
结果，如图3a和3c所示，每个5'末端起2-7位上的rSpacer替代都显示大于或等于54％的最大抑菌率(Imax)，相对于未变形(WT)而言。其中，除了2pi-r(应用于位点2)之外的每个变形物的靶向抑制活性都比6pi小。特别是2pi-r显示出了比6pi优秀的靶向抑制作用，但仍然如图3d所示抑制脱靶，此处按照例1中的方法用RL-seed测量脱靶效应进行了确认。此外，当每个变形物的脱靶效应都测量为75nMsiRNA时，可以确定除了2pi-r和7pir外每个变形物都可阻隔脱靶效应。
基于上面所述，我们发现siRNA分子的介导链应通过替换5'末端起位点3或6为核糖核苷酸间隔物(rSpacer)被适当使用，考虑到对目标基因抑制的作用和避免脱靶效应，最合适的使用方法是如例1所示替换位点6为dSpacer(6pi)。
【实施例3】
目标基因抑制和由siRNA分子脱氧核苷酸间隔物(dSpacer)植入所引起的脱靶效应的对比
在种子区域序列配置包含脱氧核苷酸间隔物(dSpacer)，当与目标基因RNA互相作用时，不一致配对应发生在siRNA中的一个非碱基部分里，该非碱基通过例1和例2中的替代制成。所以，当一个dSpacer被植入siRNA的种子区域时，该非碱基可形成一个凸起，如图4a所示。因此，针对此类dSpacer植入的情况，调查靶向和脱靶效应中的变化。最初，通过按照例1中的方法测量IC50可检测siRL的靶向效应，该siRL包含5’末端起2-7位点之间的dSpacer植入，这里的位点2至7在上述实施例中被报告可消除脱靶。
因此，如图4b所示，从5’末端起位点2-7之间的每次dSpacer植入都显示至少为最大抑菌率的19％，相对于未变形的(WT)而言。此外，如图4c和4d所示，除了2pi-I和3pi-I外，所有一切都显示出不如6pi那么有效力的靶向活性。异常的是，2pi-I和3pi-I显示出了比6pi更好的靶向活性，但是它们仍然抑制脱靶效应，这可由使用例1中的RL-seed对脱靶效应进行测量所得的结果得到证实。此外，如图4f所示，所有的变形物(4pi-I,5pi-I,6pi-I)，除了2pi-I,3pi-I和7pi-I之外，都消除脱靶效应，通过测量各变形物的脱靶效应观察到siRNA浓度为75nM。
基于上面所述，我们发现siRNA分子的介导链应通过植入脱氧核苷酸间隔物(dSpacer)于5'末端起位点4或6为被适当使用，考虑到对目标基因抑制的作用和避免脱靶效应，最合适的使用方法是如例1所示替换位点6为dSpacer(6pi)。
【实施例4】
目标基因抑制和由siRNA分子核糖核苷酸间隔物(rSpacer)植入所引起的脱靶效应的对比
为研究核糖核苷酸间隔物(rSpacer)植入种子区域(pi-rI)对脱靶效应的作用，采用例3中的方法对IC50进行测量。
结果，如图5a和5c所示，种子区域每个变形物都显示出了优秀的靶向活性，大于最大抑菌率的20％。特别是2pi-rI和3pi-rI显示出的有效靶向活性要优于6pi，但是它们仍可如图5d所报告的那样抑制脱靶，这里可用与例1相同的方法对脱靶进行测量。此外，每个变形物(4pi-rI,5pi-rI和6pi-rI)，除2pi-rI,3pi-rI和7pi-rI之外，都被观测到如图5e所示那样可消除脱靶效应，各变形物siRNA浓度为75nM此脱靶效可估算。
基于上面所述，我们发现siRNA分子的介导链应通过植入核糖核苷酸间隔物(rSpacer)于5'末端起位点4或6为被适当使用，考虑到对目标基因抑制的作用和避免脱靶效应，最合适的使用方法是替换位点6为dSpacer(6pi)。
【实施例5】
由含有替代变形5’末端起第6核苷酸为脱氧核苷酸间隔物(dSpacer)的微RNA分子导致的目标基因调整功能的损失与2’OMe变形的对比
如例1所证，本发明带有非碱基替代物的siRNA分子可消除由常规的siRNA结构所导致的微RNA类似脱靶效应，因此为进一步通过应用于微RNA使变形生效，miR-124被变形为在5’末端起位点6上含有脱氧核苷酸替代物，之后通过下列实验进行检测。最初，合成了与人类miR-124-3p相同的序列和含有6pi的序列，位点6的dSpacer替换物，之后转染带psi-check2载体的HeLa细胞，其含有2个miR-124种子位点(5’末端区域起1-8位点的完美补偿序列)。之后使用例1中的方法测量各RNA浓度下的荧光素酶活性。
其结果，如图6a所示，我们确定含有6pi的微RNA,本发明的变形物(miR-124-6pi),不能在之前它们被识别的地方抑制种子位点。除了种子位点之外，我们也确认6pi变形不能影响成核凸起位置(Nuc),该位置已知由微RNA识别。
此外，实施进行全组基因验证以确认miR-124-6pi是否真的可避免各种基因的抑制，这些基因通常受未变形的miR-124影响，该miR-124,miR-124-6pi,和对照被转染miR-124无法表达的HeLa细胞，这里的同RNA通过使用RNAeasykit(Qiagen)试剂盒在转染24小时之后进行提取，从而进行RNA-Seq分析，一种基于序列分析的基因表达实验(由Otogenetics公司提供)。上述实验的结果，生成FASTAQ文件并进一步使用TopHat,Cufflink和Cuffdiff程序进行连续地分析，通过采用原始HeLa细胞的结果将这些数值最终标准化为log2比率。为了选出做分析，由Cuffdiff提供的统计分析该数值应被报告为非常重要。
因此如图6b所示，我们观察到对照显示了基因表达在相同的程度上的上下调整，但是miR-124增加了下调基因的重要部分，这里，在6pi变形的情况下，此类下调基因在数目上被大大减少了。此外，如图6c所示，热图表现明显显示大量miR-124相关下调基因不能被mir-124-6pi抑制，由miR-124介导的抑制程度被分类为检查miR-124和miR-124-6pi总基因，最后如热图所示抑制。
另外，要看6pi变形是否消除微RNA和目标mRNA之间的相互作用，上面观察的潜在原因，进行AgoHITS-CLIP分析miR-124转染HeLa细胞，分析该AgoHITS-CLIP得出的序列来生成一个mRNA所有位点结合的地图，然后进一步与原始HeLa细胞表达对照进行对比，从而精确辨别由miR-124在全组基因范围上的表达所产生的Argonaute结合位点。此miR-124结合位点被命名为denovoAgo-miR-124群，根据抑制程度对比分析其累计分数，关注于包含目标miR-124种子位点的mRNA，抑制程度可由miR-124或miR-124-6pi表达HeLa细胞的mRNA分析结果进行估算。
其结果，如图6d所示，由miR-124所联结的目标mRNA相对于总mRNA表达(KStest,P<0.01)已经明显被抑制了，但是miR-124-6pi的情况统计并不显著。在此基础上，我们确认miR-124-6pi在全组基因范围上不能抑制miR-124常规的目标mRNA，在此，就miR-124-6pi而言，miR-124的5’末端起位点6可被变形为被替换成非碱基单一脱氧核苷酸。
2’OMe变形，由Dharmacom公司开发，已被广泛使用于防止siRNA脱靶。这是一个实证方法，该方法将2’OMe变形应用于介导链的5’端起的第2位点以便防止相应的微RNA类似脱靶效应。本发明人将本发明中的6pi变形应用于siRNA以抑制海肾荧光素酶并且还应用了2'OMe，在此，他们根据IC50对靶向效应的效率进行评估，IC50源于使用与例1相同的方法对各种浓度的抑制作用进行测量。
结果如图6e所示，6pi变形不仅显示出了比2’OMe优秀的抑制效率，还显示了优秀的最大抑菌率。此外，全组基因脱靶效应由相同的RNA-seq方法和热图分析进行评估，确认2’OMe变形不能像6pi一样在siRNA消除脱靶抑制。
此外，6pi或2'OMe变形被应用于miR-124,其功能就是诱导神经元分化，以便看看是否微RNA类似定向的变形介导消除对抑制其生物功能足够有效，带这些变形物的miRNA转染N2a细胞(Neuro-2a,ATCCCCL-131),然后自转染72小时后通过显微镜观察它们是否可生成末端神经元结构。
其结果，如图6g所示，miR-124-2me仍拥有诱导末端神经元结构的能力，但是miR-124-6pi则完全失去这种能力，这里的miR-124-2me是在应用2’OMe变形的情况下。
因此，在上面所述的基础上，对于抑制脱靶效应的作用来说，我们确定6pi变形体现出了优秀的避免结合和微RNA类似脱靶效应抑制作用，因此该6pi变形可完全阻止miRNA中的生物功能，这里的6pi变形是替换5'端位点6为脱氧核苷酸间隔物(dSpacer)的，而传统的2’OMe变形的靶向效率不如6pi,这里的2’OMe变形仅能略微降低脱靶效应，体现了不能完全阻止脱靶的局限性。
【实施例6】
为了减少血液中的胆固醇而开发的siRNA的脱靶效应及间隔物变形应用时的改善效果比较
以实验用为目的，可以扩张到以治疗用为目的，将根据本发明的变形应用至siRNA序列并评判其效果，在Alnylam公司，为降低血液中胆固醇的数值，用RNA干涉现象妨碍肝细胞的PCSK9基因而开发的siRNA，即PCS-A1(A1),PCS-A2(A2)(ProcNatlAcadSciUSA.2008Aug19；105(33):11915-20)，以这种siRNA为对象完成了实验。A1的情况，以和实施例1同样的方法，通过对荧光酶活性度的测定，比较了在多个位置上的非碱基变形的命中目标效果的时候，如图7a所示，A1-6pi有着最优秀的目标基因抑制效率，如图7b所示，种子序列造成的脱靶效应也完全被抑制了。A2的情况，为改善拥有与A1相同的序列或引起免疫反应的问题以及RNA的稳定化，对多个位置施加了2’OMe变形，在这样的A2siRNA分子中，用和实施例1相同的方法测定的荧光酶素报告活性测定中，也如图7c所示，显示出6pi变形抑制了脱靶。而且，如图7所示，A2的情况，即使施加6pi变形，在使用荧光素酶报告的IC50测定中，呈现出和未变形形状的A2几乎类似的水准的命中目标抑制效率。
将关于PCSK9基因siRNA全部呈现微RNA类似脱靶的现象，以荧光素酶报告实验进行观察后，为了确认实际上在肝细胞中也会出现这样的脱靶效应，使用了人类肝癌细胞主人HepG2(ATCCHB-8065)实施了追加实验。首先，为了确认对于PCSK9基因，通过siRNA、A2能否有效的减少PCSK9mRNA的量，对HepG2细胞将A2、A2-6pisiRNA分子使用LipofectamineRNAiMAX(Invitrogen公司)试剂，根据相关协议转染，24小时后将总RNA用RNeasy试剂盒(Qiagen公司)提取，根据有关协议逆转写至SuperscriptIIIRT(Invitrogen)，用GreenPCRMasterMix(AppliedBiosystems公司)执行qPCR，测定PCSK9的mRNA，用GAPDHmRNA值将其标准化。
其结果，如图7d右边的图表所示，确认到，A2，A2-6pi两个都能有效抑制PCSK9的上靶效果。
以后，从总RNA使用NSRRNA-Seq(NatMethods.2009sep；6(9):647-9)方法制作库，用illumina公司的HiSeq2000序列分析机器分析上述库，调查所有mRNA的表达之后，通过和上述实施例2相同的方法，以热度图的方式，在基因体水平上进行了分析。
结果是，如图7e所示，被A2抑制的脱靶基因的mRNA的量，因为6pi变形得到了恢复。
而且，将显示出这这种差异的脱靶基因的功能，使用DAVID程序(NatureProtoc.2009；4(1):44-57)进行GO(geneontology)分析的结果表明，具有和细胞周期关联的功能的很多基因，因脱靶效应被致命性的抑制了。为了确定这种被发现的脱靶效应，向HepG2转染相关siRNA之后，去除放入了培养基24小时的10％血清(FBS)，在细胞周期被统一之后，48小时之后用FACS装备实施使用PropodiumIodide的细胞周期分析。
结果是，如图7f所示，A2siRNA分子被表达的情况，跟预期的一致，细胞周期出现了异常，尤其是观察到G1/G2细胞周期停止的现象增加，还确认到，这种现象在导入6pi变形时消失。
如上所述，确认到，对于PCSK9，siRNA因没有预想到的脱靶效应出现了在肝细胞里细胞周期停止的副作用，这种脱靶副作用，通过导入根据本发明的6pi变形，可以在对PCSK9维持中靶抑制效率的同时阻止脱靶副作用的发生。
【实施例7】
通过从小鼠中的PCSK9siRNA的生体转达进行的脱靶效应和间隔物变形应用时的改善效果评价
为在生体内确认在上述实施例6中分析的对PCSK9的siRNA的脱靶效果，使用出生7周的实验用小鼠(C57/BL6)，在肝组织转达siRNA后，执行了评价。siRNA的肝组织转达，使用一种叫做invivo-jetPEI的转达物质，根据提供的协议，在5只小鼠的尾巴血管里各注入(tail-veininjection)5mg/kgsiRNA转达，48小时后牺牲小鼠，提取其血液和肝组织进行了实验。首先，在摘除的一部分肝组织内，使用miRNeasy试剂盒(Qiagen公司)分离出包含小的RNA(smallRNAs)的总RNA，在这里，通过qPCR来测定各个被转达的siRNA和目标即PCSK9mRNA的量。关于siRNA的测定，根据协议(Biotechniques.2005Oct；39(4):519-25)使用Poly(A)TailingKit(Ambion公司)来执行，首先，在RNA的3‘末端上连接多个腺苷，使用包含特定序列的oligo-dT向SuperscriptIIIRT(invitrogen公司)实施逆转录之后，将识别oligo-dT上附着的特定sequence的序列，和与想要测定的siRNA具有相同序列的DNA引物作为一对，用GreenPCRMasterMix(AppliedBiosystems公司)实施了qPCR。PCSK9mRNA测定，使用与上述实施例6相同的方法实行。血液中胆固醇的总含量，使用Wako公司的试剂盒，通过ELISA方法根据提供协议进行了测定。
结果是，如图8a所示，以A2siRNA为代表，施加间隔物变形的A2-6pi也在肝组织内被转达，而且PCSK9mRNA也得到了抑制，因此血液中的胆固醇总含量表达出得到降低的效果。
而且，各siRNAden转达，使用从被确认的肝组织中获取的总RNA，使用和上述实施例5相同的方法执行了RNA-Seq分析。
此外，以热度图表示和分析的结果，如图8b所示，确认到，使用6pi变形时的脱靶在遗传体上减少。
不仅如此，通过GO分析，对通过A2siRNA脱靶被抑制的基因主要具有何种机能进行了分析，发现这种基因是在肝细胞中对铜离子代谢起作用的基因，因此，使用叫做NCTCclone1469(韩国细胞株银行)的小鼠肝细胞，来确认预期的铜离子代谢异常现象。也就是说，在NCTCclone1469上，使用lipofectamine2000，转染对照群、A2、A2-6pisiRNA分子，72小时后，使用QuantiChromCopperAssayKit(biosystems)测定铜电离子的量，结果是，确认到，如图8c所示，在A2中细胞内的铜电离子增加了，A2-6Pi没有增加。众所周知，肝细胞里的铜离子的增加会导致细胞死亡，相同地，将对照群、A2、A2-6pi向NCTCclone1469表达后，72小时后，使用AnnexinV:FITCApoptosisDetectionKitII(BDPharmingen公司)，根据提供的协议使用PI和annexinV染色后，使用FACS测定细胞死亡的结果，如图8d所示，观察到，A2的情况，与处理32nMCuSO4的结果类似导致了细胞死亡，但是A2-6pi的情况，导致细胞死亡的现象消失。
通过上述结果，我们可以知道，关于PCSK9，在siRNA注入小鼠生体内被转达至肝细胞时，由于没有预想到的脱靶效应，出现了铜代谢基因被抑制的现象，因此，因为肝细胞内的铜增加，出现了没有预想到的导致细胞死亡的副作用。但是，即使在生体内，通过导入根据本发明的6pi变形，这种脱靶副作用，可以在维持对PCSK9的上靶抑制效果的同时还可以有效阻止脱靶副作用。
【实施例8】
脱氧核糖核苷酸用隔物取代的取代体和现有的脱靶效应抑制用变形取代体的目标基因表达抑制效果及脱靶效果比较
用与上述实施例1相同的方法，对上述实施例1中确认到了具有目标基因表达抑制效果和阻止脱靶效应的效果的、根据本发明的用脱氧核糖核苷酸间隔物把5’末端起第6个核苷酸取代的取代体，和以往的用于抑制脱靶效应的变形取代体的性能，测定IC50进行了比较。
首先，作为用于减少以往脱靶效应的取代体，运用在5‘末端起第2个到第8个位置上导入不一致碱基配对(mismatch)的方法，向miR-124的5'末端起第6个上导入不一致碱基配对(mismatch)后测定了IC50。结果是，如图9a所示，miR-124-6mm的情况，对于完美的匹配目标(perfectmatchtarget)，其显示出了与没有施加变形的miR-124同样优秀的抑制效果(两个都是IC50＝0.02nM)，但是如图9b所示，对于miR-124的种子结合目标(seedtarget，5’末端起第2个到第8个)，其显示为不能抑制。
但是，没有配对的导入，有可能根据变化的核苷酸碱基，将新的序列识别为种子结合目标，因此对新的不一样的种子配对序列有可能会出现脱靶效应。因此，在miR-124的5‘末端起第6个上导入没有配对之后，对有可能被识别为新的5’末端起第2个到第8个连续碱基对配对的种子结合目标，测定IC50对其抑制效果进行了调查。其结果，如图9c所示，有可能被识别为新的5’末端起第2个到第8个连续碱基对配对的种子结合目标，与没有施加变形的miR-124观察到了同样的抑制。
而且，如图9c所示，IC50的测定结果发现，将以往的2’OMe变形施加在miR-124的5‘末端起第6个位置上时，依然与没有施加变形的miR-124一样，siRNA的情况，被观察到，抑制作用为脱靶的种子结合目标。
通过上述结果，当将以往的不匹配变形施加到5’末端起第6个上时，以往的种子结合目标的相关脱靶效果虽被阻止，但是对于因不匹配导入而新出现的种子结合目标，仍然出现脱靶效应，这就是其局限。而且，可以知道，以往的2‘OMe变形的情况，被施加至5’末端起第6个上时，完全不能减少脱靶效应。
接下来，为了比较在除5’末端起第6个以外的位置上，将以往的阻止微RNA类似脱靶效应有效的变形的效果，与本发明相比较，对miR-124应用5‘末端起第2个2’OMe变形(2me)和5‘末端起第7个UNA(7UNA)变形，使用与上述实施例1相同的方法，测定IC50进行比较调查。结果是，如图9e所示，与2me(IC50＝0.9nM和7UNA(IC50＝7.2nM)都没有施加变形的miR-124相比，虽然(IC50＝0.7nM)脱靶效应多少有些减少，但是，在5’末端第6个上用非碱基脱氧核糖核酸取代的根据本发明的变形(6pi)，观察到了完全去除脱靶效应的现象。
而且，如图9f所示，可以知道，向抑制中靶PCSK9基因的siRNA即A2序列上施加7UNA时，脱靶效应多少有些减少，但是不能完全消失。而且，为阻止脱靶效应，在A2上运用在siRNA双链结构中施加介导链的5‘末端起第2个单一核苷酸形成凸起的变形的以往的方法，观察其结果，同样的，虽然脱靶效应多少被减少，但是不能完全被阻止。
综上所述，可以知道，现有的抑制脱靶效应用途的变形方法，虽然多少可以减少脱靶效应，但是不能被完全消除，但是本发明可以完全阻止脱靶效应。
【实施例9】
将从5’末端起第6个取代为以没有碱基的形状，第5个和第7个核苷酸被取代为C3共价结合的siRNA分子的目标基因表达抑制效果和脱靶效应比较
像上述实施例8观察的那样，用dSpacer取代从5’末端起第6个核苷酸的(6pi)siRNA，彻底地去除了脱靶效应，从这一点上可以推测，其是因为第6个碱基消失因此通过这一部分脱靶效应和碱基配对无法再发生。所以从理论上讲，从5’末端起第6个核苷酸上不存在碱基的话，其骨架即使不是核苷酸的任何变形，只要其变形是可与单一核苷酸取代的相同大小的间隔物变形，就可以呈现出相同的脱靶去除效果。以此，发明人根据图10里出现的被公式化的例子，从图1的5’末端起第6个位置dSpacer取代扩张，设计为，作为以5’末端起第6个位置上没有碱基的形状维持骨骼的最小间隔物(spacer)，第5个和第7个核苷酸共价结合。也就是说，设计为，作为在第6个位置上维持核苷酸占据空间的间隔物的最小大小，达到磷酰基和碳原子为3个(spacer)的变形。将没有核苷酸的C3变形为最小基准，无论哪种没有碱基的共价结合变形，在5’末端起第6个位置上被运用的话，像非碱基核苷酸取代一样，可以预想，在维持中靶抑制效率的同时，脱靶效应将完全地清除，新的RNA干扰诱导核酸被发明出来。
首先，如图11a所示，以没有碱基的形状共价结合的变形中，选择最小形状的C3间隔物，如图11b所示，将其应用于miR-124的5’末端起第6个位置上，在(miR-124-6c3)第5个和第7个核苷酸共价结合变形后，为了了解中靶和脱靶效果，用和上述实施例8同样的方法测定IC50并且做了比较调查。
结果是，如图11C所示，观察到，miR-124-6c3(IC50＝0.15nM)和miR-124的从5‘末端起第6个用dSpacer取代的miR-124-pi(IC50＝0.15nM)相比更优秀，和没有变形的miR-124(IC50＝0.15nM)一样，相当于siRNA的中靶，有效的降低了完美匹配(perfectmatch)的目标。
而且，如图11d所示，观察到，对于出现siRNA的脱靶效应的种子结合目标，将C3在miR-124的从5‘末端起第6个上应用的时候，基因抑制效果完全地消失了。
此外，将对从5’末端起第6个C3间隔物变形，应用到PCSK9基因抑制用siRNA的A2，MAPK12基因抑制用siRNA的siMAPK14-1(Jackson,A.L.,etal.,Rna,12(7):1179)和siRL时，如图11e和图11j所示，通过对IC50的测定，可以确认到所有优秀的中靶抑制效果，而且完全阻止了脱靶效应。
从上面可以看到，可以知道，从siRNA的5’末端的第5个和第7个核苷酸，以在第6个位置上以没有碱基的形状发生共价结合的变形，在C3间隔物的情况来看，其骨架即使不是核苷酸的任何变形，只要其变形是可与单一核苷酸取代的相同大小的共价结合变形，就可以呈现出比6pi优秀或相同的上靶抑制效率，并且脱靶抑制效果可完全地被阻止。
【实施例10】
从3‘末端起第1个和第2个核苷酸被取代成间隔物的siRNA分子的基因表达抑制效果和微RNA类似脱靶中3’末端补偿结合的相关效果及瞄中目标基因表达抑制效果的评价
siRNA使用时出现的脱靶效果，像微RNA一样，主要通过种子位置的碱基配对识别目标基因，而且依附于其序列和碱基配对结合出现。微RNA在生命体上识别目标的情况，通过这种种子结合的目标基因抑制现象，种子部分和目标的结合较弱时，通过在3’末端部分形成的附加碱基配对的3‘末端补偿配对(3'-compensatorypairing)，报告表明出现了目标基因降低的现象(Cell.2009；136:215-233)。因此，微RNA类似脱靶现象，也会作为这种3‘末端补偿结合机制呈现一部分，因此需要可以阻止这些现象发生的方法。
现有的siRNA，在3‘末端起第1个和第2个上一般带有脱氧核糖核苷酸硫铵(dT)，其主要在siRNA双重聚合物中以凸出(overhang)的结构出现。dT的情况，因为RNA的腺苷酸(A)和碱基配对是可以的，所以其参与3’末端补偿结合并可以呈现出微RNA类似脱靶效应效果。因此，为了阻止这种3‘末端补偿结合造成的脱靶效应，如图12a所示，对在3’末端起第1个和第2个核苷酸应用无法进行碱基配对的间隔物取代变形。即，发明人注意到，当将3‘末端的第1个和第2个核苷酸用没有碱基的间隔物形状应用dSpacer或者C3间隔物变形时，维持现有的siRNA双重结构，因此其中靶抑制效率很高，同时3’末端补偿结合造成的脱靶效应可以清除，从而发明了本RNA干扰诱导核酸。
为此，miR-124的3‘末端起第1个和第2个核苷酸被取代成没有碱基的间隔物变形形状之后，和上述实施例8用同一方法测定IC50，对中靶效果和3’末端补偿结合，造成的脱靶效应进行了调查。结果是，如图12b和图12c所示，没有变形的miR-124的3‘末端补偿结合造成的目标降低的siRNA脱靶效应虽然被观察到了，但是3’末端的第1个和第2个核苷酸被取代为dSpacer或者C3间隔物的情况下，可以观察到这样的脱靶效应完全消失了。
如上所述，siRNA双重聚合体结构的miR-124的3‘末端起第1个和第2个核苷酸被取代成没有碱基的间隔物变形形状dSpacer(pi)或者C3spacer的情况(IC50＝0.15nM)，如图12d和12e所示，即使对siRNA中靶对应的完全匹配结合目标，也呈现出了与没有变形的miR-124(IC50＝0.15nM)相同的中靶抑制效果。此外，将3’末端起第1个和第2个，以间隔物形状的pi或C3应用至siRNA即siMAPK14-1和siRL时，如图12f和12h所示，观察到了和没有发生变形的siRNA同样的抑制中靶效果。
通过上述结果，3‘末端起第1个和第2个核苷酸被没有碱基的共价结合形状的变形间隔物取代的RNA干扰诱导核酸，可以呈现出，在维持抑制目标基因的表达效果的同时，呈现出由3’末端补偿结合来避开脱靶效应的效果。
上述本发明的说明只不过是为了举例，本发明所属技术领域的一般技术人员应该理解，在不改变本发明的技术思想或必须特征的前提下，其可以容易地被变形成为其他具体形状，因此，应当理解，上面陈述的实施例，在所有方面都是示例性的，并不是用来限定的。

Claims (15)

1.一种RNA干扰诱导核酸，其特征在于，在RNA干扰诱导核酸的双链的至少一个单链中，包括至少一个从5'末端起第六个核苷酸或从3'末端起第一个和第二个核苷酸被取代为间隔物的变形。
2.如权利要求1所述的RNA干扰诱导核酸，其特征在于，所述双链中，成为变形对象的单链，具有可与引起RNA干扰现象的AGO蛋白结合的能力。
3.如权利要求1所述的RNA干扰诱导核酸，其特征在于，所述间隔物，是包括磷酰基或磺酰基的羟基碳链。
4.如权利要求1所述的RNA干扰诱导核酸，其特征在于，所述间隔物，是从由脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和碳原子数为3的烷基链组成的组中选择出来的骨架，无法形成碱基对。
5.如权利要求1所述的RNA干扰诱导核酸，其特征在于，所述RNA干扰诱导核酸，进一步包括：通过由取代引起的与目标基因的RNA的不匹配碱基配对或通过由***引起的凸起生成。
6.如权利要求1所述的RNA干扰诱导核酸，其特征在于，所述核酸，从由siRNA、miRNA、shRNA、DsiRNA、lsiRNA、ss-siRNA、piRNA、endo-siRNA和asiRNA组成的组中选择。
7.如权利要求1所述的RNA干扰诱导核酸，其特征在于，所述RNA干扰诱导核酸，抑制目标基因的表达。
8.一种用于抑制基因的表达的化合物，其含有权利要求1所述的RNA干扰诱导核酸。
9.一种用于抑制基因的表达的试剂盒，其含有权利要求1所述的RNA干扰诱导核酸。
10.一种用于抑制细胞内目标基因的表达的方法，其包括将权利要求1所述的RNA干扰诱导核酸导入细胞内的步骤。
11.一种用于抑制细胞内目标基因的表达的方法，其包括使权利要求1所述的RNA干扰诱导核酸在细胞内表达的步骤。
12.一种用于抑制RNA干扰诱导核酸的介导链引起的脱靶效应的方法，其包括将权利要求1所述的RNA干扰诱导核酸导入细胞内的步骤。
13.一种用于抑制RNA干扰诱导核酸的过客链引起的脱靶效应的方法，其包括将权利要求1所述的RNA干扰诱导核酸导入细胞内的步骤。
14.一种用于抑制RNA干扰诱导核酸的介导链引起的脱靶效应的方法，其包括使权利要求1所述的RNA干扰诱导核酸在细胞内表达的步骤。
15.一种用于抑制RNA干扰诱导核酸的过客链引起的脱靶效应的方法，其包括使权利要求1所述的RNA干扰诱导核酸在细胞内表达的步骤。
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