CN105821063A - 内切褐藻胶裂解酶Alg2B及编码基因和制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种来源黄杆菌(Flavobacterium sp.S20)的内切褐藻胶裂解酶Alg2B的基因序列。本发明还提供了一种制备该新型褐藻胶裂解酶的方法，即利用基因工程的技术方法，将该新褐藻胶裂解酶的基因克隆到大肠杆菌表达载体上，获得可异源表达该酶的大肠杆菌重组菌株，用该菌株异源表达制备的褐藻胶裂解酶Alg2B，能降解褐藻酸钠产生单糖和寡糖。本发明提供的褐藻胶裂解酶Alg2B可广泛应用于农业、食品、饲料添加、医药及海藻遗传工程等领域。

Description

内切褐藻胶裂解酶Alg2B及编码基因和制备与应用

技术领域

本发明涉及一种来源于黄杆菌(Flavobacteriumsp.S20，保藏编号：CGMCCNO.5026)的内切褐藻胶裂解酶Alg2B的基因序列及其制备方法和应用。本发明还提供了该内切褐藻胶裂解酶的重组质粒和重组基因工程菌株。本发明的内切褐藻胶裂解酶Alg2B可广泛应用于农业、食品、饲料添加、医药及海藻遗传工程等领域。

背景技术

褐藻是海洋中含量丰富的经济类海藻植物，它含有褐藻胶(algin)、褐藻糖胶(fucoidan)及海带淀粉(laminaran)等多种多糖。在藻体中，褐藻胶主要以褐藻酸(alginicacid)、碱金属盐类(钠盐、钾盐)和二价盐类(钙盐、镁盐)等形式存在(TusiSKetal.，Biomaterials，2011，32：5438-5458；秦国奎等，中国生物工程杂志，2004，24：26-33)。目前市场上的褐藻酸钠(商品名为海藻酸钠)或其他褐藻酸盐主要是从褐藻中获得。降解褐藻酸钠可以获得单糖和/或寡糖，其中单糖可用于发酵生产生化试剂或生物燃料(WargackiAJetal.，Science，2012，335：308-313)，而寡糖因其具有免疫调节、神经保护、促生长、诱导植物抗性等多种生物活性，可广泛应用于农业、食品、饲料添加和医药等领域(窦勇,广西轻工业,2009,10:12-13)。

褐藻胶裂解酶是一类通过β-消去反应断裂褐藻胶的裂解酶，因其具有专一、高效及反应温和等优点，且能为后续研究寡糖化学结构提供信息，故而褐藻胶裂解酶逐步成为优先降解褐藻酸钠的方法。另外，褐藻胶裂解酶还能应用于肺囊肿性纤维化症的治疗、海藻饲料加工及海藻遗传工程等领域的研究(WongTYetal.，AnnualReviewofMicrobiology,2000,54:289-340)。褐藻酸裂解酶来源丰富，包括海洋动植物和多种微生物(包括海洋细菌、土壤细菌和真菌)。褐藻胶裂解酶按底物专一性可分为聚甘露糖醛酸片段裂解酶(EC4.2.2.3)和聚古洛糖醛酸片段裂解酶(EC4.2.2.11)，也可按反应模式分为内切或外切酶(李丽妍等，生物工程学报，2011，27:838-845)。天然的褐藻胶裂解酶可通过常规的蛋白质分离纯化技术从产酶的生物体中获得。此种方法虽然能有效的获得一定量的酶蛋白，但产量有限，成本较高，较难满足实际应用需求。基因工程技术的发展，为褐藻胶裂解酶的高效生产提供了新途径。通过基因克隆方法已从假单胞菌、链霉菌、鞘氨醇单胞菌等多种微生物中获得褐藻胶裂解酶(Makietal.，JournalofGeneralMicrobiology,1993,139:987-993；Kimetal.，MarineBiotechnology.2009.11:10-16；Hye-JinYoonetal.，ProteinExpressionandPurification，2000，19：84-90)。黄杆菌属是一类典型的好氧化能异养细菌，有文献报道黄杆菌具有良好降解褐藻酸钠的能力(BERNARDETetal，Prokaryotes，2006，7:481–531；AnQDetal，CanadianJournalofMicrobiology，2008，54：314-320)，目前对于该属菌株所产褐藻胶裂解酶基因研究报道较少，因此将黄杆菌菌株Flavobacteriumsp.S20作为出发菌，挖掘其褐藻胶裂解酶基因资源。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种新型的内切褐藻胶裂解酶Alg2B及其编码基因。

本发明的第二个目的是提供一种制备新型内切褐藻胶裂解酶Alg2B的方法。

本发明的第三个目的是提供含有所述的内切褐藻胶裂解酶Alg2B基因重组表达质粒和重组基因工程菌株。

本发明的另一个目的是提供新型内切褐藻胶裂解酶Alg2B在褐藻酸钠降解中的应用。

本发明所提供的内切褐藻胶裂解酶Alg2B，来源于土壤中分离纯化的黄杆菌属新菌株Flavobacteriumsp.S20(保藏编号：CGMCCNO.5026)，其氨基酸序列具有如下特征之一：

1)序列表中的SEQIDNO.2从氨基端开始的第1-754或28-754位氨基酸残基序列，其中1-27位为信号肽，28-754位为有活性的褐藻胶裂解酶Alg2B的氨基酸序列。

2)将序列表中的SEQIDNO.2从氨基端开始的第1-754或28-754位氨基酸残基进行一个或几个氨基酸取代、缺失或添加而形成具有褐藻胶裂解酶活性不变的氨基酸序列。

本发明还提供了内切褐藻胶裂解酶Alg2B的编码基因(命名为alg2B)，具有下述核苷酸序列特征之一：

1)序列表中SEQIDNO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

2)编码序列表中SEQIDNO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

3)与SEQIDNO.1限定的脱氧核糖核酸(DNA)序列的同源性达到80％及以上，且能编码降解褐藻酸盐的蛋白质的脱氧核糖核酸(DNA)序列。

3)对序列表中SEQIDNO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列进行一个或几个核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有褐藻胶裂解酶活性的核苷酸序列。

本发明的褐藻胶裂解酶Alg2B的氨基酸序列及其核苷酸编码序列也可以根据预测的Alg2B的氨基酸序列及其核苷酸编码序列人工合成获得。

制备重组酶Alg2B的方法，是将编码基因alg2B克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的内切褐藻胶裂解酶。

所述的重组表达内切褐藻胶裂解酶Alg2B的表达载体可以是大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体等。

用于重组表达内切褐藻胶裂解酶Alg2B的的重组菌或转基因细胞系，可以是大肠杆菌宿主细胞(如EscherichiacoliBL21、EscherichiacoliJM109、EscherichiacoliDH5α等)、酵母菌宿主细胞(如Saccharomycescerevisiae、Pichiapastoris、Kluyveromyceslactis等)、枯草杆菌宿主细胞(如BacillussubtilisR25、Bacillussubtilis9920等)、乳酸菌宿主细胞(如LacticacidbacteriaCOCC101等)、放线菌宿主细胞(如Streptomycesspp.等)、丝状真菌宿主细胞(如Trichodermaviride，Trichodermareesei，Aspergillusniger、Aspergillusnidulans等)、昆虫细胞(如Bombyxmori，Antharaeaeucalypti等)或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞CHO，幼小仓鼠肾脏细胞BHK、中国仓鼠肺细胞CHL等)。

本发明的内切褐藻胶裂解酶Alg2B的基因序列是通过热不对称交错PCR(TAIL-PCR)技术从黄杆菌菌株S20(Flavobacteriumsp.S20)中克隆得到。该基因编码区长2265bp，编码了754个氨基酸，分子量约84.48kDa，属于多糖裂解酶17家族。大肠杆菌重组表达获得的Alg2B，以褐藻酸钠为底物时，在40℃、pH8.0的条件下具有最高酶活性，比活为0.035U/mg。相对于褐藻酸钠和聚古洛糖醛酸片段(polyG)这两种底物，Alg2B对聚甘露糖醛酸片段(polyM)有更高的降解活性。

本发明的内切褐藻胶裂解酶Alg2B可广泛应用农业、食品、饲料添加、医药及海藻遗传工程等领域。

附图说明

图1：褐藻胶裂解酶Alg2B基因的电泳检测

图2：重组褐藻胶裂解酶Alg2B纯化的聚丙烯酰胺凝胶电泳图(SDS-PAGE)。各泳道加入的样品分别是：泳道M-预染蛋白分子量标准；泳道1-E.coliBL21(DE3)/pET21a-Alg2B破菌后上清；泳道2-破菌上清经镍柱的流出液；泳道3-20mmol/L咪唑洗脱液；泳道4-40mmol/L咪唑洗脱液；泳道5-60mmol/L咪唑洗脱液；泳道6-80mmol/L咪唑洗脱液；泳道7-100mmol/L咪唑洗脱液；泳道8-120mmol/L咪唑洗脱液；泳道9-150mmol/L咪唑洗脱液

图3：pH值对内切褐藻胶裂解酶Alg2B的影响曲线；A-Alg2B的最适反应pH值；B-Alg2B的pH值稳定性。

图4：温度对内切褐藻胶裂解酶Alg2B的影响曲线；A-Alg2B的最适反应温度；B-Alg2B的热稳定性。

图5：内切褐藻胶裂解酶Alg2B的底物偏好性曲线。

图6：内切褐藻胶裂解酶Alg2B降解褐藻酸钠所得产物的薄层层析分析。泳道1：半乳糖醛酸标准品；泳道2：poly(M)；泳道3-7：Alg2B降解poly(M)不同时间的水解产物(3：10min；4：20min；5：40min；6：60min；7：90min)。

本发明中所述黄杆菌Flavobacteriumsp.S20，保藏编号为CGMCCNO.5026，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2011年7月5日。

具体实施方式

实施例1褐藻胶裂解酶全长基因克隆

按细菌基因组DNA提取试剂盒(TaKaRa公司)操作步骤提取黄杆菌菌株S20的基因组DNA。对CarbohydrateActiveEnzyme(CAZy)数据库中裂解酶17家族的褐藻胶裂解酶基因序列进行多序列比对分析后，设计简并引物PL17-F:5’-TTYTGGCARTGYYTAAAYGA-3’；PL17-R:5’-GTATTRTGNGCWATNGTTTGTTTKGCCCA-3’。以菌株S20的基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应条件为：94℃5min，1个循环；94℃30s，45℃30s，72℃1min30s，30个循环；72℃10min，1个循环。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析后，切胶回收目的片段，连接到pMD18-T载体后测序。根据已获得的酶基因核苷酸序列设计巢式特异引物，而随机引物选自先前已报道的文献(Gongetal.，AfricanJournalofAgriculturalResearch，2009，4：402-408)，然后根据参考文献(Liuetal.，Genomic，1995，25:674-681)中的热不对称交错PCR方法来扩增褐藻胶裂解酶基因保守段序列两侧的未知序列。PCR产物进行电泳分析，挑选理想条带切下胶回收，与pMD18-T载体连接，测序分析并进行序列拼接。根据拼接得到的酶基因全长序列设计引物(PF:5’-ATGATATATTTTTATAAAACAAAA-3’；PR:5’-TTATTTAATTAATGTATTATAATG-3’)，以菌株S20的基因组DNA为模板，用PfuDNA聚合酶扩增褐藻胶裂解酶基因全长。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析后(见图1)，切胶回收目的片段，连接到pMD18-T载体后测序。

实施例2褐藻胶裂解酶基因序列分析

测序的结果采用GenBank数据库中的BasicLocalAlignmentSearchTool(BLAST)分析，VectorNTISuite8.0软件进行多序列比对，分析其同源性。采用SimpleModularArchitectureResearchTool(SMART)在线工具分析序列的结构域。

获得的褐藻胶裂解酶基因(命名为alg2B)编码区长2265bp，其核苷酸序列如SEQIDNO1所示。alg2B的核苷酸序列与来源于CellulophagaalgicolaDSM14237菌株的肝素酶II/III家族蛋白的基因(登录号CP002453.1)有最高一致性(70％)。alg2B编码754个氨基酸和一个终止密码子，其氨基酸序列如SEQIDNO2所示，蛋白质理论分子量为84.48kDa，预测等电点为8.26。SMART分析表明，Alg2B的氨基酸序列中1-27位为信号肽，405-554位为肝素酶II/III样蛋白结构域。Alg2B的结构域特征与多糖裂解酶17家族成员更为相似，由此表明Alg2B为PL17家族的一名新成员。用SWISS-MODEL同源建模服务器(http://swissmodel.expasy.org)对褐藻胶裂解酶Alg2B的蛋白质三维结构进行同源建模，结果显示构建的Alg2B结构模型的QMEAN(QMEAN为评价模型质量的分值)较低，说明得到的Alg2B三维结构模型不可信。

实施例3alg2B基因在大肠杆菌中的重组表达

以菌株S20的基因组DNA为模板，利用设计的上游引物(NX-F:5’-CCCCCATATGCAAGGGCATCCAAGACTAATCATG-3’)和下游引物(NX-R:5’-CCCCTCGAGTTTAATTAATGTATTATAATGTAC-3’)扩增编码褐藻胶裂解酶的成熟蛋白的基因序列(不包括信号肽基因)。上下游引物中分别含有NdeI和XhoI酶切位点。PCR扩增产物和表达载体pET21a(美国Novagen公司)用NdeI和XhoI进行双酶切，酶切产物经电泳分离和凝胶回收后，将经过双酶切的PCR产物与同样经过双酶切pET-21a载体用T4DNA连接酶连接。将连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，涂布在含100μg/mL氨苄青霉素的Luria-Bertani培养基固体平板上，37℃培养14h，挑取单克隆；将单克隆接入含有100μg/mL氨苄西林的液体Luria-Bertani培养基中培养，提取质粒；将质粒用正向引物NX-F和反向引物NX-R进行菌落PCR验证，结果得到大小正确的扩增产物，初步证明构建的重组质粒正确；接着将该重组质粒送去英潍捷基公司测序，结果表明，在pET-21a的NedI和XhoI酶切位点之间***SEQIDNO1所示的alg2B基因，且***方向正确，所以进一步证明构建的重组质粒正确，将该重组质粒命名为pET21a-Alg2B。

将pET21a-Alg2B转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)(购自美国Novagen公司)，然后按照该公司提供的操作步骤进行褐藻胶裂解酶Alg2B诱导表达及纯化。用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测褐藻胶裂解酶Alg2B的纯化情况，结果如图2所示，纯化后的褐藻胶裂解酶Alg2B在电泳胶上呈单一条带，且位置与预测的分子量相吻合。

序列表

SEQIDNO.1

ATGATATATTTTTATAAAACAAAAGCATTTGCCATTATAGTATTAGCGATGGTTTTAGTGATGGGGCAAAGTGTCCTTGCTCAAGGGCATCCAAGACTAATCATGACTAAAAAAGGGGTTCAGGAAATCAGAAGTCAGTTGGCAAAAGTGCCTTTGTTTGATGCTTCATTGGTTGAGGTAAAAAAAGAAGTGGATGCCGAAATGCTTTTAAAGATTGATGTGCCATTACCTAAAGATTTTTCAGGAGGTTATACTCATGAACGTCATAAAAAGAATTTCTTGATTGCTCAAAAAGCAGGTGCCTTGTTTCAGATTACAGGGGATAAAAAGTACGGAAATTATGTTAAGGAAATGCTTTTGGCTTATACAAAATTATATCCTACTTTGCCTTTGCATCCGCAAGAACGTTCTTATGCTCGTGGTAAATTGTTTTGGCAGGCATTAAATGATGCCAATTGGTTAGTGTATATGAGTCAGGCTTATGATTGTGTGTATGATTTTATTGGTGCAAAAGACCGTGCCATCATCGAAAAAGATTTGTTTAAGCCTTTTGCCGATTTTATTTCGATAGGGTCTCCACAATATTTCAATAGAGTGCATAATCACAGTACTTGGGGGAATGTTGCAGTGGGAATGATTGCTTTGGTGATGGACGATGCAGAATTATTAGATCGTGCAATGAACGGTTTAAAAGAAGACGGTTTGACGCCAGGAATGAAAGATAATGATGGTGGCTTGATTAAAAAAGAAGGTCAAAAAACAGGGTTTTTAGCTAATGTCGATGAGCCTTTTTCACCTGATGGTTATTATAATGAAGGGCCATATTACCAAAGATATGCCATGTATCCCTTTATGGTTTTTGCTGAAGCTTTACAAAATACGAAGCCAGAATTAAAAATATTTGAATATAAGAACGGAATCTTAATTAAAGCCGTTTATGCTTTATTGAATCTTACGAATTCGGAGGGAGAGTTTTTTCCGCTGAATGACGGTCAAAAAGGGATGTCTTATTATTCAAGAGAATTAGTTTCTGCTGTTGATATCGCTTATTTGTATGGCGGAAAAGATGCTTCATTGTTGTCTATAGCTGAAAAACAAGGACGTGTTCAATTAGATAATTCAGGAATGGCGGTCGCTTTGGGTATCAAAAACAAATTAGCAAAACCATTTGTTAAAAAATCAATCAATTTATCTGACGGACCCGATGGAGAACAAGGGGGTGTGGCTATTATTCGTAATAAAGTCAAAAATAGCGAATTGAGTTTGGTAATGAAATACGCTTCCCAAGGTTCCAGTCACGGACATTTTGATAAACTATCTTTTTCCTATTACAATAATGGGGATGAGATTCTGCAAGATTATGGTTTGGCACGATTTGTTAATATTGAACAAAAAGGAGGGGGAAATTATTTAAAAGAAAATGCTACTTGGGCCAAACAAACCATCGCACATAATACCATTGTGCAGAATGAAACCTCACATTTTAAAGGTGATTTTGAAACAGGAAATCAATTTTCATCTAAAAAATATTGTTATGATGTAGCCAATCCCAAAGTTCAATTGATAAGTGCTACAGAAGGCAATGCTTATCCAGGAACCCAAATGCATCGTACGATGGTTTTATGGGAAACTGAAGGTTTTGAAAAACCAATTTTATTGGATATTTTTCAATTGGATTCTAAATCAGCTAATCAATATGATTTGCCTTTTTATTACTTTGGACAAATAATGACTACAAATTTTAAATATGATACTCCTGCTACGCTAGAATCATTGGGTAAAGCGAATGGGTACCAACATTTATGGAAAGAAGGAGCAGGGAAAGCTACGGAGGCAAATACCAAATTTTCTTGGTTGCATAACGGTAGTTTTTATACATTGACCTCGGCGACTCAGGCAAATGATGAGTTGTTGTTAGTGCGATTAGGAGCAAATGACCCCAATTTTAATTTGCGTAGAGATGCGGGGTTAATCATTCGAAAAAAGAACAGTCAAAAAGCCACATTTGTAAATGCAATTGAAACACATGGTAGTTATAGTCCTGTTACAGAAAATGCAGTTAATGCTTTTAGTGCGATTGCAAATTTGGAACTAGTATATGAGGATGCTAATTATGTTGGGGTATCCGTACAAAATAAAGAAGGCGTGAAGGCATTGTTTGTTTTGTCCACTTCGAATAATTCGGCAACACAAAAACATACTTTAGAAATAAAAGGAAAAACCTACTCATGGGTAGGAGTACATTATAATACATTAATTAAATAA

SEQIDNO.2

MIYFYKTKAFAIIVLAMVLVMGQSVLAQGHPRLIMTKKGVQEIRSQLAKVPLFDASLVEVKKEVDAEMLLKIDVPLPKDFSGGYTHERHKKNFLIAQKAGALFQITGDKKYGNYVKEMLLAYTKLYPTLPLHPQERSYARGKLFWQALNDANWLVYMSQAYDCVYDFIGAKDRAIIEKDLFKPFADFISIGSPQYFNRVHNHSTWGNVAVGMIALVMDDAELLDRAMNGLKEDGLTPGMKDNDGGLIKKEGQKTGFLANVDEPFSPDGYYNEGPYYQRYAMYPFMVFAEALQNTKPELKIFEYKNGILIKAVYALLNLTNSEGEFFPLNDGQKGMSYYSRELVSAVDIAYLYGGKDASLLSIAEKQGRVQLDNSGMAVALGIKNKLAKPFVKKSINLSDGPDGEQGGVAIIRNKVKNSELSLVMKYASQGSSHGHFDKLSFSYYNNGDEILQDYGLARFVNIEQKGGGNYLKENATWAKQTIAHNTIVQNETSHFKGDFETGNQFSSKKYCYDVANPKVQLISATEGNAYPGTQMHRTMVLWETEGFEKPILLDIFQLDSKSANQYDLPFYYFGQIMTTNFKYDTPATLESLGKANGYQHLWKEGAGKATEANTKFSWLHNGSFYTLTSATQANDELLLVRLGANDPNFNLRRDAGLIIRKKNSQKATFVNAIETHGSYSPVTENAVNAFSAIANLELVYEDANYVGVSVQNKEGVKALFVLSTSNNSATQKHTLEIKGKTYSWVGVHYNTLIK

实施例4褐藻胶裂解酶Alg2B的酶学性质分析

(1)褐藻胶裂解酶活力的测定

3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定酶活((Qing-DaAnetal.ProcessBiochemistry,2008,43:842-847),底物为0.5％(w/v)的褐藻酸钠，反应时间30min。酶活力单位定义为:每分钟释放1μmol还原糖(以葡萄糖计)所需的酶量为一个酶活力单位(U)。发酵液酶活力单位定义为每毫升发酵液含酶活单位(U/mL)。使用***蛋白质定量测定试剂盒进行测定，以牛血清白蛋白为标准蛋白。

(1)pH对酶Alg2B的影响

将底物、重组酶液以及50mmol/L不同pH的缓冲液(pH6.0-7.5Na₂HPO₄-KH₂PO₄，pH7.5-10Tris-HCl)按4:3:3(v/v)的比例混合后，在35℃反应30min，按标准方法测定酶活。以最高酶活力为100％计算相对酶活。结果如图3A所示，Alg2B的最适反应pH值为8.0。

将重组酶液分别置于50mmol/L不同pH的缓冲液(pH4.0-5.0乙酸-乙酸钠，pH6.0-8.0Na₂HPO₄-KH₂PO₄，pH9-10Tris-HCl)中于4℃下放置24h，然后按标准方法检测残余酶活。以初始酶活为100％计算相对酶活。结果如图3B所示，Alg2B在pH值5～10之间具有较好的pH值稳定性。

(2)温度对酶Alg2B的影响

将底物、重组酶液以及50mmol/LNa₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液(pH7.5)按4:3:3(v/v)的比例混合后，分别在20℃、30℃、35℃、40℃、50℃、55℃、60℃下按标准方法测定酶活。以最高酶活力为100％计算相对酶活。结果如图4A所示，Alg2B的最适反应温度是40℃。在最适温度和最适pH条件下，按标准方法测得Alg2B的比活为0.035U/mg。

将重组酶液分别置于不同温度(30℃、40℃、45℃、50℃)下保温1h，然后按标准方法检测残余酶活。以初始酶活为100％计算相对酶活。结果如图4B所示，Alg2B在低于40℃的温度下具有较好的热稳定性。

(3)重组酶Alg2B的底物偏好性

将重组酶分别与0.5％(w/v)的褐藻酸钠、polyM和polyG三种不同底物按1:4(w/v)的比例混合，然后在30℃，pH7.0条件下反应。用荧光酶标仪记录不同反应时间产物在235nm的吸收值。根据紫外法测褐藻胶裂解酶的原理(Qing-DaAnetal.ProcessBiochemistry,2008,43:842–847)，证实Alg2B是裂解酶。另外，如图5所示，Alg2B对聚甘露糖醛酸片段降解速率快于对褐藻酸钠和聚古洛糖醛酸片段的降解，表明Alg2B偏好降解聚甘露糖醛酸片段。

实施例5金属离子对Alg2B活性的影响

将底物、重组酶液以及50mmol/LNa₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液(pH7.5)按4:3:3(v/v)的比例混合后，接着向反应体系中添加不同的金属离子，添加的离子终浓度为5mmol/L，然后在40℃反应30min，按标准方法检测酶活性。以没有加入金属离子的酶液活性作为对照，设为100％。结果如表1所示，一价离子K⁺、Na⁺对Alg2B的活性有微弱增强作用，二价离子Ca²⁺和Mg²⁺表现出显著提高酶活效果，分别提高Alg2B的活性约57％和118％。同为二价离子的Mn²⁺、Co²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺却抑制Alg2B的活性，其中Mn²⁺、Co²⁺分别抑制了约43％和64％的酶活，其余二价离子完全抑制Alg2B的活性。

表1金属离子对Alg2B活性的影响

a反应体系中金属离子终浓度为5mmol/L；

b以不添加金属离子的酶活性定为100％；

c没有检测到活性。

实施例5酶Alg2B的降解产物分析

取120μL4％(w/v)poly(M)、适量稀释酶液混合均匀，置于30℃水浴，在10、20、40、60、90min等时间点取样,样品煮沸10min将酶灭活，然后进行薄层层析(TLC)分析。TLC方法:取3μL样品点样于硅胶板上，将硅胶板放置在展开剂(正丁醇：甲酸：水＝4:6:1，v/v)中上行展开2次。展层结束后，在硅胶板上喷雾10％硫酸(溶于乙醇)显色液，于110℃烘干5min显色(Kimetal.，MarineBiotechnology，2009，11:10-16)。

如图6所示，在降解初期(10min)，TLC板上可观察到模糊的单糖斑点，并且随着酶解反应的进行，单糖逐渐积累成为主要的产物。酶解20min以后寡糖产物才有明显的积累，但寡糖产物始终较少。根据Alg2B降解poly(M)的产物组成特点，初步推测Alg2B可能为内切型酶。因此，Alg2B可被用于褐藻酸钠单糖和寡糖的制备以及与褐藻酸钠降解相关的领域，包括农业、食品、饲料添加、医药及海藻遗传工程等。

Claims (7)

1.一种内切褐藻胶裂解酶编码基因Alg2B，其核苷酸序列具有如下特征之一：

1)具有序列表中SEQIDNO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

2)编码SEQIDNO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

3)对序列表中SEQIDNO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列进行一个或几个核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有褐藻胶裂解酶活性的核苷酸序列。

2.按照权利要求1所述的内切褐藻胶裂解酶基因编码的内切褐藻胶裂解酶，其编码的氨基酸序列具有如下特征之一：

1)序列表中SEQIDNO.2从氨基端开始的第1-754或第28-754位氨基酸残基序列；

2)对序列表中SEQIDNO.2所示的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸取代、缺失或添加而形成的具有褐藻胶裂解酶活性的氨基酸序列。

3.一种内切褐藻胶裂解酶，该酶具有序列表中SEQIDNO.2所示的氨基酸序列，该酶对聚甘露糖醛酸片段降解速率快于对褐藻酸钠和聚古洛糖醛酸片段的降解速率。

4.一种制备如权利要求2所述的内切褐藻胶裂解酶的方法，其特征在于：是将权利要求1所述的内切褐藻胶裂解酶基因克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的外切褐藻胶裂解酶；

所述的重组表达内切褐藻胶裂解酶的表达载体，是指大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体。

5.按照权利要求4所述方法，其特征在于：用于重组表达内切褐藻胶裂解酶的重组菌或转基因细胞系，是指大肠杆菌宿主细胞(如EscherichiacoliBL21、EscherichiacoliJM109、EscherichiacoliDH5α等)、酵母菌宿主细胞(如Saccharomycescerevisiae、Pichiapastoris、Kluyveromyceslactis等)、枯草杆菌宿主细胞(如BacillussubtilisR25、Bacillussubtilis9920等)、乳酸菌宿主细胞(如LacticacidbacteriaCOCC101等)、放线菌宿主细胞(如Streptomycesspp.等)、丝状真菌宿主细胞(如Trichodermaviride，Trichodermareesei，Aspergillusniger、Aspergillusnidulans等)、昆虫细胞(如Bombyxmori，Antharaeaeucalypti等)，哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞CHO，幼小仓鼠肾脏细胞BHK、中国仓鼠肺细胞CHL等)中的一种。

6.一种如权利要求2所述的内切褐藻胶裂解酶在褐藻酸盐降解中的应用，其特征在于：具有如下用途之一或二种以上；

1)用于断裂褐藻酸盐或褐藻多糖的糖苷键，获得褐藻酸盐单糖和/或寡糖；

2)用于降解红藻、或褐藻细胞壁中的褐藻酸盐组分，抽提原生质体；

或3)用于破坏致病菌铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)所形成的菌膜中褐藻酸钠成分。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述内切褐藻胶裂解酶Alg2B与其他褐藻胶降解酶混合后，用于协同断裂褐藻酸盐糖苷键方面的应用。