CN105816869A - 水貂犬瘟热病毒活疫苗制备的方法及用该方法制备的疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及兽用生物制品领域,具体而言,涉及一种水貂犬瘟热病毒活疫苗制备的方法,包括:将制苗用敏感细胞接种于生物反应器中并用微载体进行培养;待所述敏感细胞培养至50%以上长成致密单层后向所述生物反应器中接种犬瘟热病毒进行增殖培养;收获病毒培养液及微载体,冻融后去除微载体及细胞碎片得到病毒液,将所述病毒液配制后得到疫苗。通过完善各步骤的反应条件,优化生产流程,本发明达到了生产周期短、病毒滴度高、产品质量稳定、生产效率提高、副反应小的技术效果。
Description
技术领域
本发明涉及兽用生物制品领域,具体而言,涉及一种水貂犬瘟热病毒活疫苗制备的方法及用该方法制备的疫苗。
背景技术
水貂犬瘟热也叫貂瘟热,是由副黏病毒科(Paramyxoviridae)、麻疹病毒属(Morbillivirus)的犬瘟热病毒(Caninedistempervirus,CDV)引起的急性、热性、传染性极强的高度接触性传染病,是水貂养殖业的主要传染病之一。
国际上反应器悬浮培养技术已广泛用于生物制药生产,且在高表达细胞株的构建、个性化培养基的研发等方面不断发展,大量新建反应器和产物表达量的提高已导致反应器容量过剩,发达国家市场出现饱和向发展中国家扩展的趋势。在国内,细胞悬浮技术虽然起步较晚,但经过几十年来的研究与实践,目前动物细胞大规模培养技术已有了飞速发展。随着这一技术的进一步发展,使用生物反应器进行细胞高密度培养生产兽用疫苗是该行业发展的必然趋势。伴随着生产工艺的进一步完善及生物反应器设计的更为合理,悬浮细胞培养将会变得越来越容易,不断成熟的大规模动物细胞培养技术也将更有力地推动兽用疫苗规模化生产的发展。
目前,国外已有使用微载体在生物反应器中悬浮培养敏感细胞生产部分病毒性疫苗的记载,如赛诺菲巴斯德的脊髓灰质炎疫苗、狂犬病疫苗,百特的流感疫苗等。国内辽宁成大生物股份有限公司从国外引进了生物反应器高密度培养敏感细胞生产疫苗的技术,已用于大规模制备人用狂犬病疫苗,南京梅里亚使用微载体在生物反应器中培养敏感细胞生产鸡传染性法氏囊疫苗,均取得了良好的社会效益和经济效益。但目前关于使用微载体在生物反应器中培养敏感细胞生产犬瘟热疫苗方面仍是空白。
现有的水貂犬瘟热疫苗都是通过传统的转瓶培养工艺生产。传统转瓶工艺存在诸多缺点如:自动化程度低、劳动强度大;培养细胞的环境不可控,容易被环境污染;耗时长、效率低、生产成本高,难以扩大生产;不同批次间质量差异大;涉及生物安全和公共卫生问题。
有鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种悬浮培养敏感细胞生产水貂犬瘟热病毒活疫苗的方法,所述的方法与传统水貂犬瘟热病毒活疫苗生产工艺相比,生产周期短、病毒滴度高,使用该方法生产的产品质量稳定、生产效率提高、副反应小。
一种水貂犬瘟热病毒活疫苗制备的方法,包括如下步骤:
1)将制苗用敏感细胞接种于生物反应器中并用微载体进行培养;
2)、待所述敏感细胞培养至50%以上长成致密单层后向所述生物反应器中接种犬瘟热病毒进行增殖培养;
3)、收获病毒培养液及微载体,冻融后去除微载体及细胞碎片得到病毒液,将所述病毒液配制后得到疫苗。
细胞微载体悬浮培养更容易更换培养液,且提供了更大的供细胞贴壁生长的表面积,因而使得细胞达到更高的培养密度;本申请所用的生物反应器具体为搅拌反应器(微载体培养用),配合微载体悬浮培养技术,可达到占地空间少、细胞产量高(进而病毒滴度高)、生产成本低的技术效果。在本领域中,应用悬浮培养法生产水貂犬瘟热病毒活疫苗尚属首次,本发明通过完善各步骤的反应条件,优化生产流程,达到了生产周期短、产品质量稳定、生产效率提高、副反应小的技术效果。
优选的,如上所述的水貂犬瘟热病毒活疫苗制备的方法:
所述制苗用敏感细胞为Vero、MDCK、Marc-145;
所述犬瘟热病毒的毒株为CDV3-CL株,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC,保藏编号CGMCCNO.10768。
CDV3-CL株保藏地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏时间为:2015年06月10日。
优选的,如上所述的水貂犬瘟热病毒活疫苗制备的方法,在步骤1)中:
所接种的制苗用敏感细胞的细胞密度为4×105~2×106个/mL;
用于培养的微载体为Cytodex微载体,其使用密度为3~10g/L。
微载体培养(microcarrierculture)是一种用于高产量培养贴壁细胞的实用技术。Cytodex专用于培养各类动物细胞,其培养体积可以从数毫升到6000升以上。应用Cytodex微载体技术,可以实现简单的贴壁细胞悬浮化培养,每毫升培养液可得到数百万细胞。微载体适于摇瓶、转瓶、搅拌罐以及WAVE生物反应器等各种培养***。本发明所用微载体具体可为Cytodex-1、2、3,优选为Cytodex-1,购自GE(通用电气)公司。
进一步优选的,如上所述的水貂犬瘟热病毒活疫苗制备的方法,在步骤1)中:
在培养所述制苗用敏感细胞时所用的细胞培养液为:含5%~8%的新生牛血清的DMEM培养液;
用微载体培养时的培养条件为:温度36~38℃、CO2含量4.8~5.2%、搅拌速度为55~65rpm、溶氧为45~55%、pH7.2~7.4、反应器自动控制培养。
优选的,如上所述的水貂犬瘟热病毒活疫苗制备的方法,在步骤1)中,在生物反应器中培养所述敏感细胞时包括单级培养或放大培养;
所述单级培养为5~14L生物反应器单级培养模式;
所述放大培养为40~140L放大培养模式;放大培养的操作为将单级培养后的微载体上生长的细胞作为初始细胞在密闭容器中用胰酶消化,通过90~120μm的滤网过滤,将细胞悬液接入下一级更大的生物反应器中继续培养,将培育得到细胞作为下一次放大培养操作的初始细胞并重复上述放大培养的操作,逐次放大到40~140L的生产规模。
本发明消化放大模式采用了自制的消化装置(即所述密闭容器)消化细胞,避免了大规模生产时消化细胞工艺的繁琐操作,且细胞不易受到污染。使用90~120μm的不锈钢网过滤将消化细胞与原培养载体分离,避免了在培养过程中细胞在新旧球贴附不均的现象。
所述自制的消化装置可以放入水浴中加热,容器主体部顶端含有三通孔,其中一端连有装有37℃预热的浓度为0.25%胰酶-0.02%EDTA的胰酶消化液,另一端连接排液瓶。
进一步优选的,如上所述的水貂犬瘟热病毒活疫苗制备的方法,步骤2)中的操作具体包括:
待所述敏感细胞培养20~48h后,接种犬瘟热病毒进行增殖培养,接种量为0.001~0.01MOI;
或,待所述敏感细胞培养48~72h后,停止搅拌,待微载体沉淀到罐底后排出所有细胞培养液;加入细胞维持液并接种犬瘟热病毒进行增殖培养,接种量为0.001~0.01MOI。
更优选的,当细胞培养20~48h后,细胞密度为1×106~3×106个/mL时即可接种犬瘟热病毒。
优选的,如上所述的水貂犬瘟热病毒活疫苗制备的方法:
所述细胞维持液的配方为:含1.8~2.2%新生牛血清的DMEM培养液;
所述增殖培养的条件为:温度33~35℃、CO2含量4.8~5.2%、搅拌速度为55~65rpm、溶氧为45~55%、pH6.9~7.2、反应器自动控制培养。
增殖培养的温度并非最适宜细胞生长的温度,但经申请人多次实验证明,较低的生长温度更利于病毒的增殖。增殖培养时采用33~35℃的培养温度,制苗用敏感细胞最短培养20~28h后即可用于接种病毒,其得到的病毒滴度与制苗用敏感细胞培养72h后再接种病毒于37℃培养所得到的病毒滴度相同,但培养制苗用敏感细胞的时间却大为减少,节约了培养时间,缩短了生产周期,降低了生产的成本。
优选的,如上所述的水貂犬瘟热病毒活疫苗制备的方法:
在步骤1)中,所述制苗用敏感细胞接种于生物反应器中并用微载体进行培养的培养方式为批培养或连续灌注培养;
在步骤2)中,所述增殖培养的培养方式为批培养。
批培养是指先将细胞和培养液一次性装入反应器内进行培养,细胞不断生长,同时产物也不断形成,经过一段时间的培养后,终止培养。
在灌注培养中,细胞保留在反应器***中,收获培养液的同时不断地加入新鲜的培养基。灌注培养的主要优点是连续灌注的培养基可以提供充分的营养成分,并可带走代谢产物;同时,细胞保留在反应器***中,可以达到很高的细胞密度。同其他方法相比,灌注培养的产率可以提高一个数量级,并可大大降低劳动力消耗。
优选的,如上所述的水貂犬瘟热病毒活疫苗制备的方法,在步骤3)中,所述收获病毒培养液及微载体的时机为:
80%以上的敏感细胞出现典型的致细胞病变效应。
在具体操作时,DO(溶解氧含量)值明显上升也是收获病毒培养液及微载体的一个指示信号,可与致细胞病变效应(CPE)结合起来达到更准确的估计。CPE是指病毒在宿主细胞内大量增殖,导致细胞病变甚至死亡的现象。
用如上所述的水貂犬瘟热病毒活疫苗制备的方法制备的水貂犬瘟热病毒活疫苗。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
1)、本发明通过完善各步骤的反应条件,优化生产流程,可达到生产周期短、病毒滴度高、产品质量稳定、生产效率提高、副反应小的技术效果。
2)、应用生物反应器生产疫苗,具有自动化程度高、生产工艺简单稳定,易操作,产量大占地小,易于快速扩大生产规模;批次间质量均衡稳定。
3)、本发明消化放大模式采用了自制的消化装置用以消化细胞,避免了大规模生产时消化细胞工艺的繁琐操作,且细胞不易受到污染。使用100μm的不锈钢网过滤将消化细胞与原培养载体分离,避免了在培养过程中细胞在新旧球帖附不均的现象。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
本申请提供的犬瘟热病毒毒株CDV3-CL株,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC,保藏编号CGMCCNO.10768。保藏地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏时间为:2015年06月10日,检测结果为存活。
图1为本发明的工艺流程图;
图2为实施例3步骤303中细胞接种后24h的微载体细胞图片;
图3为实施例1步骤102中细胞接种后48h的微载体细胞图片;
图4为实施例4中细胞接种后72h的微载体细胞图片。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将会理解,下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
在本发明的实施例1中提供了一种水貂犬瘟热病毒活疫苗制备的方法,包括以下步骤:
步骤101:将制苗用Marc-145细胞按照4×105个/mL的密度接种于5L的生物反应器中并用微载体进行培养;用于培养的微载体为Cytodex微载体,其使用密度为3g/L;在培养所述制苗用敏感细胞时所用的细胞培养液为:含5%的新生牛血清的DMEM培养液;用微载体培养时的培养条件为:温度36℃、CO2含量4.8%、搅拌速度为55rpm、溶氧为45%、pH7.2、反应器自动控制培养;
步骤102:待所述敏感细胞培养48h后,70%以上长成致密单层,向所述生物反应器中按照0.01MOI的比例接种犬瘟热病毒CDV3-CL株进行增殖培养;增殖培养所用的细胞维持液的配方为:含1.8%新生牛血清的DMEM培养液;增殖培养的条件为:温度33℃、CO2含量4.8%、搅拌速度为55rpm、溶氧为45%、pH6.9、反应器自动控制培养;
步骤103:待增殖培养的细胞中,80%以上的敏感细胞出现典型的致细胞病变效应时收获病毒培养液及微载体,冻融后去除微载体及细胞碎片得到病毒液,利用其进行疫苗配制。
实施例2
在本发明的实施例2中提供了一种水貂犬瘟热病毒活疫苗制备的方法,包括以下步骤:
步骤201:将制苗用MDCK细胞按照2×106个/mL的密度接种于5L的生物反应器中并用微载体进行培养;用于培养的微载体为Cytodex微载体,其使用密度为10g/L;在培养所述制苗用敏感细胞时所用的细胞培养液为:含8%的新生牛血清的DMEM培养液;用微载体培养时的培养条件为:温度38℃、CO2含量5.2%、搅拌速度为65rpm、溶氧为55%、pH7.4、反应器自动控制培养;培养细胞的方式为分批培养;
步骤202:待步骤201中所述敏感细胞培养20h后,50%以上长成致密单层,向所述生物反应器中按照0.001MOI的比例接种犬瘟热病毒CDV3-CL株进行增殖培养;增殖培养所用的培养液仍为步骤201中所述的细胞培养液;增殖培养的条件为:温度35℃、CO2含量5.2%、搅拌速度为65rpm、溶氧为55%、pH7.2、反应器自动控制培养;增殖培养的方式为分批培养或连续灌注培养;
步骤203:待增殖培养的细胞中,80%以上的敏感细胞出现典型的致细胞病变效应时收获病毒培养液及微载体,冻融后去除微载体及细胞碎片得到病毒液,利用其进行疫苗配制。
实施例3
为了能更详细地描述本申请的技术方案,本发明还在实施例1和2的基础上,通过对各操作的进一步细化与限定得到实施例3,包括以下步骤,请参考图1:
所用设备及试剂:
生物反应器:齐志生物工程设备有限公司14L生物反应器;
微载体:GE公司Cytodex-1;
制苗用犬瘟热病毒:CDV3-CL株,由中国农业科学院特产研究所鉴定、保管和供应;
DMEM培养基(干粉):GIBCO公司;
新生牛血清:内蒙古金源康生物工程有限公司;
胰蛋白酶(干粉):GIBCO公司。
步骤301:生物反应器、微载体准备
将生物反应器罐体进行彻底清洗,连接反应器进出管路及气路,校准pH和DO电极并安装到罐体上,进行漏点检测;完成后进行121℃高压湿热灭菌,待冷却至室温,无菌链接进液管路、出液管路,将高压液体排出,按GE公司说明书预处理微载体,连同无菌过滤好的细胞生长培养基导入生物反应器内,微载体的密度为6g/L;设定培养参数,打开反应器温度、搅拌及通气控制进行预培养,过夜待用。
步骤302:敏感细胞的制备
取生长良好的Vero细胞,倒掉细胞培养液,用pH7.2的PBS缓冲液清洗细胞面,加入浓度为0.25%胰酶-EDTA溶液细胞消化液消化,加入含6%血清浓度的DMEM细胞培养液终止消化,按照1:3的比例进行细胞传代培养,37℃培养,转机转速为7~9r/min。
步骤303:生物反应器微载体培养
按步骤302中记载的方法消化步骤302中培养得到的细胞,收集细胞悬液,细胞计数后按9×105个/mL的细胞密度接种于生物反应器中。细胞培养液为:含6%的新生牛血清的DMEM培养液;生物反应器培养设定参数为培养温度37℃、搅拌速度为60rpm、溶氧为50%、pH7.2~7.4、反应器自动控制培养。细胞培养的24h的细胞状态图片如图3所示。培养时采用批培养的培养方式。
步骤304:生物反应器病毒液的增殖培养
将步骤303中的细胞培养24h后,50%以上长成致密单层,显微镜观察微载体上基本长满细胞,细胞计数为2×106个/mL后接种病毒液,以接种量为0.005MOI接种犬瘟热病毒株(CDV3株),接种病毒后仍用步骤302所述的细胞培养液进行培养。生物反应器培养设定参数为培养温度33℃、搅拌速度为60rpm、溶氧为50%、pH6.9~7.2、反应器自动控制培养。培养时采用批培养的培养方式。
步骤305:收获病毒培养液及微载体
接毒20h后每隔4h取反应器中微载体观察细胞病变,待微载体上80%以上的敏感细胞出现典型的致细胞病变效应,且DO值明显呈上升趋势,结束培养。收获病毒培养液及微载体,置-20℃反复冻融两次,经离心或过滤去除微载体及细胞碎片,收获病毒液,测定病毒含量为6.8logTCID50/mL。
步骤306:疫苗配制
将检验合格的病毒液与冻干保护剂按适宜比例混合,加入适宜抗生素后充分混合,同时用0.1mol/L的NaHCO3调pH值7.4,充分混合,定量分装冻干后制成成品。
接下来,为了使得本发明实施例3的悬浮培养敏感细胞生产水貂犬瘟热病毒活疫苗的方法得到更好的应用,本发明还在上述实施例3的基础之上提供了实施例4,实施例4是实施例3的进一步限定和增加,追加了放大培养的具体步骤,现做详细的阐述和解释:
实施例4
按照实施例3中步骤301~303进行操作。不同之处在于,在步骤303中,细胞培养了72h,80%以上长成致密单层,细胞密度达4×106个/mL以上时进行步骤403.5的操作。
步骤403.5:微载体的放大培养(图1中未显示):
停止生物反应器的搅拌,使微载体自然沉降,排出上清培养液,用pH7.2的PBS缓冲液洗涤2遍,将长满细胞的微载体收集到一种的自制的密闭容器(消化装置)中。自制的消化装置如图3所示,该容器可以放入水浴中加热,容器主体部顶端含有三通孔,其中一端连有装有37℃预热的浓度为0.25%胰酶-0.02%EDTA的胰酶消化液,另一端连接排液瓶。
打入胰酶消化液后,待微载体自然沉降,排出含有PBS清洗液及胰酶消化液的上清液,消化5~20min后加入细胞生长液终止消化,将细胞与微载体的混合液打入14L生物反应器中,开启搅拌。无菌连接14L生物反应器管路与40L生物反应器管路,将细胞悬液通过90~120μm的不锈钢网过滤,将细胞悬液打入40L生物反应器,并按3g/ml的微载体量加入新载体,参数设定培养工艺条件为温度37℃、CO2含量5%、搅拌速度为60rpm、溶氧为50%、pH7.2、反应器自动控制培养;观察细胞生长情况,测定葡萄糖含量,判断是否需要换液,培养28h。
步骤404:生物反应器病毒液的增殖培养
细胞培养28h后,显微镜观察微载体上大部分细胞生长状态良好时,接种病毒液,接种量为0.001~0.01MOI接种犬瘟热病毒株(CDV3株),生物反应器培养设定参数为培养温度35℃、搅拌速度为60rpm、溶氧为50%、pH7.0、反应器自动控制培养。
步骤405:收获病毒培养液及微载体
接毒20h后每隔4h取反应器中微载体观察细胞病变,待微载体上80%细胞已脱离,且DO值明显呈上升趋势,结束培养,收获病毒培养液及微载体,置-20℃反复冻融两次,经离心或过滤去除微载体及细胞碎片,收获病毒液,测定病毒含量为6.5logTCID50/mL,将收获液保存于-20℃备用。
步骤406:疫苗配制
将检验合格的病毒液与冻干保护剂按适宜比例混合,加入适宜抗生素后充分混合,同时用0.1mol/L的NaHCO3调pH值7.4,充分混合,定量分装冻干后制成成品。
实验例
传统的转瓶方法在生产水貂犬瘟热病毒活疫苗时的工艺流程一般可简述为:
取生长良好的Vero细胞,倾掉细胞培养液,用pH7.2的PBS缓冲液清洗细胞面,加入浓度为0.25%胰酶-EDTA溶液细胞消化液消化,加入含8%血清浓度的MEM细胞培养液终止消化,按照1:3的比例进行细胞传代培养,37℃培养,转机转速为7~9rmp/min。
将生产用毒种用MEM细胞维持液作5倍稀释,按5%的比例接种于长成良好单层的Vero细胞转瓶,37℃吸附1小时,加入细胞维持液。将细胞培养转瓶置35~37℃条件下旋转培养,连续观察4日。待细胞CPE达到70%以上时即可收获,置-20℃保存。
将实施例4与传统转瓶法进行比较,比较结果如表1所示:
表1实施例4与传统转瓶法生产水貂犬瘟热病毒活疫苗比较
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明,然而应意识到,在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此,这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
Claims (10)
1.一种水貂犬瘟热病毒活疫苗制备的方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)将制苗用敏感细胞接种于生物反应器中并用微载体进行培养;
2)、待所述敏感细胞培养至50%以上长成致密单层后向所述生物反应器中接种犬瘟热病毒进行增殖培养;
3)、收获病毒培养液及微载体,冻融后去除微载体及细胞碎片得到病毒液,将所述病毒液配制后得到疫苗。
2.根据权利要求1所述的水貂犬瘟热病毒活疫苗制备的方法,其特征在于:
所述制苗用敏感细胞为Vero、MDCK、Marc-145;
所述犬瘟热病毒的毒株为CDV3-CL株,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC,保藏编号CGMCCNO.10768。
3.根据权利要求2所述的水貂犬瘟热病毒活疫苗制备的方法,其特征在于,在步骤1)中:
所接种的制苗用敏感细胞的细胞密度为4×105~2×106个/mL;
用于培养的微载体为Cytodex微载体,其使用密度为3~10g/L。
4.根据权利要求3所述的水貂犬瘟热病毒活疫苗制备的方法,其特征在于,在步骤1)中:
在培养所述制苗用敏感细胞时所用的细胞培养液为:含5%~8%的新生牛血清的DMEM培养液;
用微载体培养时的培养条件为:温度36~38℃、CO2含量4.8~5.2%、搅拌速度为55~65rpm、溶氧为45~55%、pH7.2~7.4、反应器自动控制培养。
5.根据权利要求3所述的水貂犬瘟热病毒活疫苗制备的方法,其特征在于,在步骤1)中,在生物反应器中培养所述敏感细胞时包括单级培养或放大培养;
所述单级培养为5~14L生物反应器单级培养模式;
所述放大培养为40~140L放大培养模式;放大培养的操作为:
将单级培养后的微载体上生长的细胞作为初始细胞在密闭容器中用胰酶消化,通过90~120μm的滤网过滤,将细胞悬液接入下一级更大的生物反应器中继续培养,将培育得到细胞作为下一次放大培养操作的初始细胞并重复上述放大培养的操作,逐次放大到40~140L的生产规模。
6.根据权利要求5所述的水貂犬瘟热病毒活疫苗制备的方法,其特征在于,步骤2)中的操作具体包括:
待所述敏感细胞培养20~48h后,接种犬瘟热病毒进行增殖培养,接种量为0.001~0.01MOI;
或,待所述敏感细胞培养48~72h后,停止搅拌,待微载体沉淀到罐底后排出所有细胞培养液;加入细胞维持液并接种犬瘟热病毒进行增殖培养,接种量为0.001~0.01MOI。
7.根据权利要求6所述的水貂犬瘟热病毒活疫苗制备的方法,其特征在于:
所述细胞维持液的配方为:含1.8~2.2%新生牛血清的DMEM培养液;
所述增殖培养的条件为:温度33~35℃、CO2含量4.8~5.2%、搅拌速度为55~65rpm、溶氧为45~55%、pH6.9~7.2、反应器自动控制培养。
8.根据权利要求1所述的水貂犬瘟热病毒活疫苗制备的方法,其特征在于:
在步骤1)中,所述制苗用敏感细胞接种于生物反应器中并用微载体进行培养的培养方式为批培养或连续灌注培养;
在步骤2)中,所述增殖培养的培养方式为批培养。
9.根据权利要求1所述的水貂犬瘟热病毒活疫苗制备的方法,其特征在于,在步骤3)中,所述收获病毒培养液及微载体的时机为:
80%以上的敏感细胞出现典型的致细胞病变效应。
10.用权利要求1~9任一项所述的水貂犬瘟热病毒活疫苗制备的方法制备的水貂犬瘟热病毒活疫苗。
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