CN105802967B - 新型合成寡脱氧核苷酸及含有其作为有效成分的用于预防及治疗纤维化疾病的药物组合物 - Google Patents

新型合成寡脱氧核苷酸及含有其作为有效成分的用于预防及治疗纤维化疾病的药物组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种同时抑制DNA和RNA的新型合成寡脱氧核苷酸及含有其作为有效成分的用于预防及治疗纤维化疾病的药物组合物，本发明具有提供同时抑制DNA和RNA的新型合成寡脱氧核苷酸的效果，并且还具有提供含有所述新型合成寡脱氧核苷酸作为有效成分的、用于预防及治疗纤维化疾病的药物组合物的突出的效果。

Description

新型合成寡脱氧核苷酸及含有其作为有效成分的用于预防及 治疗纤维化疾病的药物组合物
技术领域
本发明涉及一种同时抑制DNA和RNA的新型合成寡脱氧核苷酸(syntheticoligodeoxynucleotide，Synthetic ODN)及含有其作为有效成分的用于预防及治疗纤维化疾病的药物组合物，更详细地，涉及一种新型合成寡脱氧核苷酸及含有其作为有效成分的用于预防及治疗诸如肝、肾及动脉硬化等纤维化疾病的药物组合物，所述新型合成寡脱氧核苷酸通过结合调节转录因子的诱骗寡脱氧核苷酸(decoy oligodeoxynucleotide，DecoyODN)和调节mRNA表达的反义寡脱氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide，AntisenseODN)，从而具有同时抑制DNA和RNA的表达的机理。
背景技术
大多数的脏器在组织受到损伤后将经过炎症和治愈过程，但是，如果受到持续性的损伤，则在治愈过程中会发生组织的纤维化。在该纤维化过程中，胶原蛋白或纤维连接蛋白等的细胞外基质在组织中累积而破坏正常结构，从而带来功能上的障碍。代表性的疾病有肝纤维化症、肾功能衰竭症、肺纤维化症及动脉硬化等。
肝纤维化为肝硬化的前驱病变，是引起慢性肝病的严重肝损伤的结果，肝纤维化由各种细胞因子和生长因子的作用开始。通常，肝纤维化是可逆的，如果由薄纤维(thinfibril)组成且没有结节形成，并且肝损伤的原因为暂时性的情况下，则增加的细胞外基质(extracell ular matrix，ECM)通过细胞凋亡(apoptosis)过程和基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMP)而被分解，从而可以恢复正常(李俊成、金忠勋，在肝纤维化、门静脉高压症及肝癌血管生成过程中活化的肝星状细胞的作用，The Korean Journal ofHepatology 13(3)：309-319,2007)，但是，如果肝纤维化症过程反复持续，则会成为形成粗纤维(thick fibril)且具有结节的肝硬化。另外，因多种炎症诱发因素而使肝细胞受到损伤，并通过包括胶原蛋白的非正常细胞外基质蛋白质进行累积的肝纤维化过程而诱发肝硬化，因此，为了调节肝硬化的表达，调节细胞外基质的累积非常重要。
肝细胞受到损伤时的炎症反应通过活化休止期的肝星状细胞而分泌细胞外基质和多种细胞因子(cytokine)及趋化因子(chemokine)，其中的转化生长因子-β1(TGF-β1)起到强有力的生长抑制剂的作用。TGF-β1作为25kD的物质，与潜伏TGF-β1结合蛋白质(latentTGF-β1 binding protein)结合，从而以未活化潜伏(inactive latent)的形态分泌，并且以与1,4型胶原质、层粘连蛋白(laminin)及核心蛋白聚糖(decorin)等的细胞外基质结合的状态存在，从而通过各种刺激得到活化。TGF-β1是通过减少胶原酶(collagenase)的生产或增加胶原酶抑制物质的生产来调节胶原蛋白的表达，在巨噬细胞中增加肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1(IL-1)及血小板衍生生长因子(platelet derived growthfactor，PDGF)等的生产，并且在纤维化过程中起到重要的作用。目前，在慢性肝病中，TGF-β1只在进行纤维化的部位表达，不会在正常肝组织或非活动性的部位进行表达，因此TGF-β1在肝纤维化中起到重要的作用(Sanderson N，Factor V，Nagy P，et al.，Hepaticexpression of mature transforming growth factor b1 in transgenic mice resultsin multiple tissue lesions，Proc Natl Acad Sci USA.92：2572-2576，1995)。
TGF-β1的信号传递体系通过称为Smad的下部蛋白质信号传递体系来传递，当结合TGF-β1时，通过属于TGF-β家族的具有配体丝氨酸(ligand serine)/苏氨酸蛋白激酶(threonine kinase)活性的II型、I型细胞膜受体和细胞内的Smad蛋白质传递。根据TGF-β1信号传递的细胞内反应被确定，并且通过抑制Smad蛋白质的作用而使得Smad的信号传递过程自主调节成负反馈过程。
基因治疗法是对基因表达体系进行调节，并且将其传递到疾病部位，从而特异性地抑制特定基因的表达，因此基因治疗法是对预防及治疗多种疾病非常有效的方法。尤其，最近在基因治疗法中，对于转录因子(transcription factor)的诱骗性寡脱氧核苷酸投入方法正在尝试通过抑制转录因子的作用而作为减少特定基因表达的工具。理论上，欲抑制这些转录因子活动的战略表示将诱骗性寡脱氧核苷酸注入到细胞内，从而所述诱骗寡脱氧核苷酸结合于在细胞内对应的转录因子。即，转录因子的DNA结合部位通过诱骗结合，从而使转录因子不能结合到对应基因的启动子上。
作为本发明的现有专利技术，在韩国授权专利第10-0958943号中公开有用于预防及治疗TGF-β1相关疾病的药物组合物，所述药物组合物包含G-α12/G-α13蛋白质功能的下向调节剂。然而，所述专利涉及一种用于预防及治疗纤维化、硬化、免疫疾病及肿瘤等的与TGFβ1(transforming growth factor beta1，TGFβ1)相关的疾病的组合物，所述组合物通过对G-α12/G-α13(Ga12/Ga13)蛋白质的功能进行下向调节(down-regulation)来实现。此外，韩国授权专利第10-1368871号中公开有用于诊断、预防及治疗肝病的组合物。然而，所述专利涉及一种用于诊断肝疾病的信息提供方法，其通过测定TM 4SF5蛋白质水平及TM4SF5表达相关信号传递蛋白质的表达及磷酸化水平，并与正常对照组试样进行比较来实现；一种筛选治疗肝疾病的物质的方法；一种用于预防及治疗肝病的组合物，所述组合物包含阻碍TM4SF5蛋白质或TM4SF5表达相关的信号传递蛋白质的表达及磷酸化阻碍物质。
此外，韩国授权专利第10-1452863号中公开有含有五味子提取物作为有效成分的用于预防及治疗血管纤维化的组合物。然而，所述专利涉及一种用于预防或改善血管疾病的食品组合物，所述组合物含有五味子提取物、五味子素B或戈米辛N作为有效成分。
此外，韩国授权专利第10-1460884号中公开有用于诊断或治疗肾脏纤维化的组合物。然而，所述专利涉及一种包含能够检测Runx2的制剂的用于诊断肾脏纤维化的组合物、包含所述组合物的用于诊断肾脏纤维化的试剂盒、利用所述用于诊断的组合物或试剂盒来提供用于诊断肾脏纤维化的信息的方法、以及包含所述Runx2基因或蛋白质的用于预防或治疗肾脏纤维化的药物组合物。
因此，所述专利文献中的任何地方都没有公开同时抑制DNA和RNA的新型合成寡脱氧核苷酸及含有其作为有效成分的用于预防及治疗纤维化疾病的组合物相关的发明。
发明内容
要解决的技术问题
因此，本发明的目的在于，提供一种新型合成寡脱氧核苷酸，所述新型合成寡脱氧核苷酸具有同时抑制DNA和RNA的机理。
本发明的另一目的在于，提供一种含有新型合成寡脱氧核苷酸作为有效成分的用于预防及治疗纤维化疾病的药物组合物，所述新型合成寡脱氧核苷酸具有同时抑制DNA和RNA的机理。
技术方案
本发明通过以下步骤来实现：合成寡脱氧核苷酸，所述寡脱氧核苷酸具有同时抑制DNA和RNA的机理；测定所述合成步骤中得到的合成寡脱氧核苷酸通过Mirus脂质体的传递而注入到肝组织中的效率；鉴定由所述合成寡脱氧核苷酸引起的阻碍TGF-β1及Smad基因的表达的效果；为了比较所述合成寡脱氧核苷酸的效果，通过H&E染色和Trichrom染色来确认肝组织的状态和胶原蛋白的累积；为了验证所述合成寡脱氧核苷酸对炎症诱发因子产生的影响，确认在肝组织内的TNF-α、IL-1β、IL-6的蛋白质的表达、以及通过对巨噬细胞因子F4/80进行染色来确认组织内巨噬细胞的表达；以及为了鉴定所述合成寡脱氧核苷酸对纤维化相关因子带来的效果，观察纤维连接蛋白(Fibronectin)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达。
有益效果
本发明具有提供新型合成寡脱氧核苷酸的效果，所述新型合成寡脱氧核苷酸具有同时抑制DNA和RNA的机理；本发明还具有提供用于预防及治疗纤维化疾病的药物组合物的突出的效果，所述药物组合物含有所述新型寡脱氧核苷酸作为有效成分。
附图说明
图1为示出本发明TGF-β1反义寡脱氧核苷酸的制作过程、以及结合本发明的Smad诱骗性寡脱氧核苷酸而制作的本发明的合成寡脱氧核苷酸的结构的照片。
图2为示出在肝纤维化动物模型中，注入本发明的合成寡脱氧核苷酸时传递到肝细胞的传递效率的照片和图表。
图3为示出在肝纤维化动物模型中，本发明的合成寡脱氧核苷酸抑制TGF-β1和Smad蛋白质表达的功效的照片。
图4为示出在肝纤维化动物模型中，给药本发明的Smad诱骗性寡脱氧核苷酸、TGF-β1反义寡脱氧核苷酸及合成寡脱氧核苷酸后的肝组织的损伤和胶原蛋白累积的照片。
图5为示出在肝纤维化动物模型中，给药本发明的合成寡脱氧核苷酸后在肝组织中的炎症相关因子的表达的图表和照片。
图6为示出在肝纤维化动物模型中，给药本发明合成寡脱氧核苷酸后在肝组织中的纤维化相关因子的表达的图表和照片。
图7为示出在肝纤维化动物模型中，给药本发明的合成寡脱氧核苷酸后，作为I型胶原蛋白(collagen I)和巨噬细胞标记物的F4/80的表达的照片。
具体实施方式
下面根据实施例对本发明的具体的内容进行详细说明。下述实施例仅是为了例示本发明，本发明并不限定于下述实施例。
例如，以本发明的具有同时抑制DNA和RNA的机理的合成寡脱氧核苷酸作为有效成分的药物组合物，不仅适用于肝纤维化的预防及治疗，而且还适用于纤维化相关的各种疾病和血管生成及细胞的异常增生相关的疾病，尤其适用于癌症。
实施例1：本发明的合成寡脱氧核苷酸的制备
本发明中使用的合成寡脱氧核苷酸的碱基序列如下：
TGF-β1反义寡脱氧核苷酸：
5′-GAATTCCCGAAAGCCCTGTATTCCGTCTCCTCGG-3′(SEQ ID NO：1)
Smad诱骗性寡脱氧核苷酸：
5′-GAATTCGTGTCTAGACTGAAAACAGTCTAGACAC-3′(SEQ ID NO：2)
在95℃下，对制作的合成寡脱氧核苷酸进行变性3分钟后，将温度降至80～25℃而进行退火(annealing)。在已进行退火的寡脱氧核苷酸中加入T4连接酶(Takara公司，日本)，并在16℃下进行结扎(ligation)18小时，从而制得本发明的合成寡脱氧核苷酸(图1)。
实施例2：本发明的合成寡脱氧核苷酸的处理
为了制作根据本发明的慢性肝硬化动物模型，将体重为20～25g的雄性C57BL6小鼠作为对象注射四氯化碳，所述注射是以每周3次的频率注射8周，从而制得肝硬化动物模型。使用试剂盒(Mirus Trans IT In vivo Delivery kit；Mirus生物公司，威斯康星州，美国)，将实验中使用的合成寡脱氧核苷酸以两周的间隔注入到实验动物的尾部静脉中。8周后，分别处死5只实验动物，并取出肝组织。
在所述取出的肝组织中添加变性溶液(裂解缓冲液(Lysis buffer)，西格玛公司，密苏里州，美国)后，用组织粉碎机破坏细胞，并在12,000rpm下离心分离30分钟，从而分离出全部的蛋白质。使用蛋白质定量用试剂(Bio-Rad Laboratories，加利福尼亚州，美国)，并通过分光光度计(贝克曼，皮帕克，美国)对全部的蛋白质进行定量，并且用150V，在Bolt4-12％Bis-Tris凝胶(英杰公司，加利福尼亚州，美国)中，对定量的蛋白质进行1小时的电泳，并在30V下向尼龙膜传递蛋白质1小时。
在含有5％的脱脂乳的TBS-T(10mM三异丙基乙磺酰(Tris)，150mM氯化钠，0.1％吐温(Tween)20)中培养传递有蛋白质的尼龙膜1小时后，用作为一抗的抗肿瘤坏死因子-α(anti-TNF-α)、抗白细胞介素-6(anti-IL-6)(Abcam公司，马萨诸塞州，美国)及抗白细胞介素1β(anti-IL-1β)(圣克鲁兹，圣路易斯，美国)进行处理，从而粘贴1个半小时。然后，用TBS-T，在十分钟内清洗三次后，用结合有辣根过氧化物的抗-兔或抗-鼠免疫球蛋白(IgG-HRP)(圣克鲁斯生物技术公司，加利福尼亚州，美国)进行处理，再次结合1小时，并且用TBS-T，在十分钟内清洗4次，并用ECL探测装置(安玛西亚公司，白金汉郡，英国)进行可视化。
另外，为了观察肝组织中的纤维连接蛋白和α-SMA的表达抑制程度，实施免疫组织化学染色。免疫组织化学染色通过以下步骤进行：首先用旋转式切片机，将由石蜡包埋的肝的活检组织切成4μm的厚度，并粘在用粘附剂处理的载玻片上，并进行脱蜡化后，使用乙醇和蒸馏水进行浸渍。在用甲醇稀释的3％的过氧化氢溶液中处理30分钟，从而阻断对于内因性
Figure BDA0000820387640000071
过氧化酶的反应，并用蒸馏水清洗。在添加有事先预热的95℃的0.01mol/L柠檬酸盐缓冲剂的pH为6.0的DER溶液(Dako Epitope Retrieval Solution)中，放入组织切片而使其充分浸渍后，加热10分钟而实施抗原表位修复(epitope retrieval)过程，并且在室温下冷却后，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗。，在4℃下，使对于纤维连接蛋白和α-SMA的一抗反应16小时，并用生物素化的抗-小鼠(biotinylated anti-mouse)免疫球蛋白(IgG)(DAKO公司，加利福尼亚州，美国)，在37℃下反应15分钟。在37℃下，用细胞抗生物素蛋白过氧化物酶(Sepoavidin peroxidase；DAKO公司，加利福尼亚州，美国)反应15分钟，并且用3,3-二氨基联苯胺四盐酸(3,3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride，DAB)显色后，用苏木精进行对照染色，并用光学显微镜进行观察。
实验例1：确认本发明的合成寡脱氧核苷酸的传递效果
为了测定本发明合成寡脱氧核苷酸在根据实施例2的肝纤维化动物模型中，通过Mirus脂质体的传递注入到肝组织的效率，对本发明的合成寡脱氧核苷酸用作为荧光物质的异硫氰酸荧光素(FITC)标记，并注入到动物模型的尾部静脉中。之后，取出肝组织，并通过荧光显微镜确认本发明的合成寡脱氧核苷酸的传递功效的结果，确认了本发明的合成寡脱氧核苷酸在肝组织中显著表达。另外，利用脂质体(Lipofectamin)2000将标记有FITC的本发明的合成寡脱氧核苷酸以脂质体作为介质，注入到肝细胞中的结果，确认了本发明的合成寡脱氧核苷酸的80％以上被注入到细胞内(图2)。
实验例2：确认本发明的合成寡脱氧核苷酸对TGF-β1和Smad基因的阻碍效果
对根据实施例2的肝纤维化动物模型注入四氯化碳，所述四氯化碳注入以每周3次的频率进行8周，从而诱导肝纤维化，并每隔两周注入本发明合成寡脱氧核苷酸，共注入8周。8周后取出肝组织，并且用取出的肝组织制作石蜡切片，并用免疫荧光染色确认了TGF-β1和Smad基因的表达。因四氯化碳而进行纤维化后，在Scr ODN处理组中可以观察到TGF-β1和Smad基因的表达增加，然而，在本发明的合成寡脱氧核苷酸处理组中确认到TGF-β1和Smad基因的表达减少，由此，可以确认所施用的本发明的合成寡脱氧核苷酸能够有效减少TGF-β1mRNA和DNA内的Smad转录基因的表达，从而起到同时抑制DNA和RNA的作用(图3)。
实验例3：本发明的TGF-β1反义寡脱氧核苷酸、Smad诱骗性寡脱氧核苷酸及合成寡脱氧核苷酸的效果比较
为了比较本发明的寡脱氧核苷酸在根据实施例2的肝纤维化动物模型中的功效，将分别注入Scr、本发明的TGF-β1反义寡脱氧核苷酸、Smad诱骗性寡脱氧核苷酸及合成寡脱氧核苷酸的肝组织制作成石蜡切片，并进行H&E和Trichrom染色，从而确认了肝组织的状态和胶原蛋白的累积。实验结果表明，分别注入本发明的TGF-β1反义寡脱氧核苷酸和Smad诱骗性寡脱氧核苷酸时也显示出效果，但是，在注入合成寡脱氧核苷酸时的肝损伤少，并且胶原蛋白的累积也被抑制(图4)。
实验例4：本发明的合成寡脱氧核苷酸对炎症诱发因子产生的效果
对本发明的合成寡脱氧核苷酸对炎症诱发因子产生的效果进行分析的结果，肝纤维化动物模型的血清中的炎症因子白细胞介素-6(IL-6)和γ干扰素(IFN-γ)的表达量在本发明的合成寡脱氧核苷酸处理组中显著减少(图5)。另外，在肝组织中，用本发明的合成寡脱氧核苷酸进行处理后，炎症因子TNF-α、白细胞介素-1β(IL-1β)及IL-6的蛋白质表达得到减少(图5)。
为了观察由纤维化引起的巨噬细胞的活化，对经过活化的巨噬细胞因子F4/80进行染色，从而确认组织内巨噬细胞的表达的结果，在用Scr寡脱氧核苷酸进行处理的组中，观察到F4/80过表达，因此由纤维化引起的炎症反应增加。然而，在本发明的合成寡脱氧核苷酸处理组中，观察到F4/80的表达减少，由此，通过本发明的合成寡脱氧核苷酸的处理而活化的巨噬细胞的表达减少(图7)。从上述结果中，确认了本发明的合成寡脱氧核苷酸能够有效抑制因纤维化而在肝组织内所增加的炎症反应。
实验例5：本发明的合成寡脱氧核苷酸对纤维化相关因子产生的效果
在根据实施例2的肝纤维化动物模型中观察作为代表性纤维化因子的纤维连接蛋白和α-SMA的表达。为了确认这些纤维化因子在肝组织内的表达，实施免疫组织化学染色。染色结果，确认了因肝纤维化而纤维连接蛋白和α-SMA的表达增加，然而，用本发明的合成寡脱氧核苷酸进行处理的组中，纤维连接蛋白和α-SMA的表达显著减少(图6)。
另外，通过免疫荧光染色对细胞外基质I型胶原蛋白的表达进行确认的结果，确认了肝纤维化被诱发后，I型胶原蛋白的表达增加，然而，在本发明合成寡脱氧核苷酸处理组中，I型胶原蛋白的表达减少(图7)。因此，确认了本发明的合成寡脱氧核苷酸通过抑制TGF-β1基因的表达和调节Smad转录因子的表达使纤维化动物模型中所增加的纤维化因子的表达减少。
工业实用性
如上所述，本发明具有提供新型合成寡脱氧核苷酸的效果，所述新型合成寡脱氧核苷酸同时抑制DNA和RNA；本发明还具有提供用于预防及治疗纤维化疾病的药物组合物的突出的效果，所述药物组合物含有所述新型合成寡脱氧核苷酸作为有效成分，因此，本发明是合成医药品工业上非常有用的发明。
Figure IDA0000820387710000011

Claims (5)

1.一种由SEQ ID NO：1构成的TGF-β1反义寡脱氧核苷酸。
2.一种由SEQ ID NO：2构成的Smad诱骗性寡脱氧核苷酸。
3.一种由SEQIDNO：1及SEQIDNO：2组成的合成寡脱氧核苷酸，
SEQIDNO：1的碱基序列如下：
5′-GAATTCCCGAAAGCCCTGTATTCCGTCTCCTCGG-3′
SEQIDNO：2的碱基序列如下：
5′-GAATTCGTGTCTAGACTGAAAACAGTCTAGACAC-3′
所述合成寡脱氧核苷酸通过如下方法制得：在95℃下，对SEQIDNO：1及SEQIDNO：2的寡脱氧核苷酸进行变性3分钟后，将温度降至80～25℃而进行退火，在已进行退火的寡脱氧核苷酸中加入T4连接酶，并在16℃下进行结扎18小时，从而制得所述合成寡脱氧核苷酸。
4.一种用于预防及治疗肝纤维化疾病的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有由SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2组成的合成寡脱氧核苷酸作为有效成分，并且减少TGF-β1mRNA和Smad转录基因的表达，从而具有同时抑制DNA和RNA的机理，
SEQIDNO：1的碱基序列如下：
5′-GAATTCCCGAAAGCCCTGTATTCCGTCTCCTCGG-3′
SEQIDNO：2的碱基序列如下：
5′-GAATTCGTGTCTAGACTGAAAACAGTCTAGACAC-3′
所述合成寡脱氧核苷酸通过如下方法制得：在95℃下，对SEQIDNO：1及SEQIDNO：2的寡脱氧核苷酸进行变性3分钟后，将温度降至80～25℃而进行退火，在已进行退火的寡脱氧核苷酸中加入T4连接酶，并在16℃下进行结扎18小时，从而制得所述合成寡脱氧核苷酸。
5.一种药物传递***，其特征在于，所述药物传递***配置成用于将由SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2组成的合成寡脱氧核苷酸注射于包括人在内的动物的静脉中，
SEQIDNO：1的碱基序列如下：
5′-GAATTCCCGAAAGCCCTGTATTCCGTCTCCTCGG-3′
SEQIDNO：2的碱基序列如下：
5′-GAATTCGTGTCTAGACTGAAAACAGTCTAGACAC-3′
所述合成寡脱氧核苷酸通过如下方法制得：在95℃下，对SEQIDNO：1及SEQIDNO：2的寡脱氧核苷酸进行变性3分钟后，将温度降至80～25℃而进行退火，在已进行退火的寡脱氧核苷酸中加入T4连接酶，并在16℃下进行结扎18小时，从而制得所述合成寡脱氧核苷酸。
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