CN105794561A - 油菜素唑提高水稻抗水稻黑条矮缩病毒病的应用及方法 - Google Patents

Abstract

本发明首次发现油菜素唑可用于提高水稻抗水稻黑条矮缩病毒病，具体方法是在1000mL烧杯中培养水稻生长至二~三叶期，每杯水稻有四十颗左右的水稻苗，共有四杯。分别将0.1％的tritonX‑100溶液和用0.1％的tritonX‑100稀释到1µM的油菜素唑用小喷壶均匀喷洒在二~三叶期的水稻叶片上，每隔2天喷一次，共处理三次。

Description

油菜素唑提高水稻抗水稻黑条矮缩病毒病的应用及方法

技术领域

本发明涉及农业领域，具体是一种利用油菜素唑提高水稻抗水稻黑条矮缩病毒病的应用及方法。

技术背景

水稻黑条矮缩病毒 (Rice black-streaked dwarf virus, RBSDV) 是呼肠孤病毒科(Reoviridae) 斐济病毒属 (Fijivirus) 一种双链RNA病毒。完整RBSDV粒子为二十面体结构，外观呈球形，直径约75 nm，具有双层衣壳。内外衣壳各存在12个突起，衣壳内的病毒基因组由10条线型双链RNA(double strand RNA，dsRNA)组成，按其在凝胶上的电泳迁移率由慢至快依次称为S1～S10。RBSDV基因组全长约为30 kb，包含12个开放阅读框(openreading frame，ORF)，其中P1，P2，P3，P4，P8和P10这6个蛋白是病毒粒子的结构蛋白。P5-1，P6，P7-1，P7-2，P9-1，P9-2这6个蛋白是非结构蛋白。水稻黑条矮缩病毒主要分布在中国，日本和朝鲜等东亚地区。该病毒主要由灰飞虱(Laodelphax Striatellus)作为传播介体以持久性不经卵方式传播，不经土壤、枝叶摩擦和种子传播。RBSDV自然寄主范围广泛，主要包括水稻、玉米、小麦、大麦等主要粮食作物等共60多种禾谷类作物和禾本科杂草。对农业生产带来了极大危害。RBSDV侵染植物寄主后可以引起植物畸形生长，主要症状表现为植株分蘖增加叶色深绿以及叶背和茎秆上出现白色瘤状突起，后变为褐色的短条瘤状***，穗很小，结实率低。该病毒在长江以南引起水稻黑条矮缩病毒病，在长江以北引起玉米粗缩病。近年来，随着气候的变暖，传播RBSDV的介体昆虫灰飞虱的虫口数量大幅增加，导致水稻黑条矮缩病爆发流行，严重危害我国粮食作物的安全生产。目前，对水稻黑条矮缩病的防治方法主要是喷洒杀虫剂来降低传毒介体灰飞虱的虫口密度，但防治效果并不十分理想，而且引发潜在的农药残留问题，因此寻找有效的制剂及制定合理的措施防治该病害已刻不容缓。

油菜素唑（Brassinazole，Brz）是一种BR合成的特异性抑制剂，其抑制油菜素甾醇(Brassinosteroid, BR)合成途径中催化6-氧-菜油甾烷醇生成卡它甾酮的单氧酶的活性。油菜素甾醇是植物内源合成的一类重要的生长促进型甾醇类激素。油菜素甾醇最早由Michelle于1970年从油菜花粉中提取出了一种能促进植物茎杆伸长和细胞***的高活性物质。很低浓度的油菜素甾醇就可以强烈诱导生长和分化。油菜素唑主要应用在阻断植物BR合成途径，用来研究植株缺乏BR后表现出相应的形态变化。然而，目前并没有关于利用油菜素唑提高水稻抗RBSDV的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用油菜素唑有效提高水稻抗水稻黑条矮缩病毒病的应用。

本发明所述的应用具体为将油菜素唑稀释液喷洒于水稻叶片上。

优选的，所述油菜素唑稀释液的浓度为1µM。

优选地，所述水稻叶片为处在二~三叶期的水稻叶片。

优选地，所述油菜素唑稀释液是用0.1％的tritonX-100进行稀释。

优选地，喷洒周期为：每隔2天喷一次，共处理三次。

优选地，喷施容量为浸湿整个叶片，即叶片上开始滴水为止。本发明首次发现油菜素唑可用于提高水稻抗水稻黑条矮缩病毒病，并对其机理进行推测，认为外源油菜素唑通过提高水稻自身的抗性，从而对RBSDV产生抗性。

附图说明

图1 健康的水稻植株（左）和RBSDV侵染的水稻植株（右）；

图2 对照组A2水稻植株带毒检测；

图3 处理组B2水稻带毒检测情况。

具体实施方法

实例1 获得携带RBSDV灰飞虱的方法

1．首先将实验室饲养的能够产卵的5龄灰飞虱成虫扫到种在1000毫升烧杯里的2-3叶龄（10-12d）的武育粳3号水稻苗上产卵，3-4天后将灰飞虱成虫从烧杯中扫出来。

2．灰飞虱成虫产卵8-10天后，即可孵化出1-2龄幼虫，将1-2龄幼虫扫入种在5000毫升烧杯内的感染水稻黑条矮缩病毒的病株上饲毒，3-4天后饲毒结束。需要注意的是，水稻黑条矮缩病毒的病苗，要提前将茎处理干净，把干枯的叶鞘剪掉，尽量露出比较新鲜的茎，因为灰飞虱主要通过吃水稻病苗的茎获毒。

3．将饲毒4天的灰飞虱转移到事先播好的2-3叶龄（10-12d）的武育粳3号水稻苗上，让病毒在灰飞虱体内渡循回期，病毒在灰飞虱体内的循回时间一般为12-15天，即获得携带RBSDV的灰飞虱。

实例2 tritonX-100溶液处理水稻及饲养健康灰飞虱和携带RBSDV的灰飞虱

1．将待接毒的水稻品种置于培养皿中浸种2天，催芽1天，发芽后分别播于1L烧杯中，每杯28株，共两杯。

2．配制0.1％的tritonX-100溶液,然后用小喷壶均匀喷洒在二~三叶期的水稻（淮稻5号）叶片上，每隔2天喷一次，共处理三次。

3．喷施的量为溶液浸湿整个叶片，即叶片上开始滴水为止。

4．处理16个小时后，分别用健康的灰飞虱和携带RBSDV的灰飞虱进行水稻接毒。按每苗４虫的有效接种虫量将灰飞虱接种于３~４叶期的淮稻５号水稻幼苗上，健康的灰飞虱作为对照组A1，携带RBSDV的灰飞虱作为对照组A2（表1）。

5．接种3天后，将灰飞虱扫除，并将水稻秧苗移栽至温室（28℃，16h光照8h黑暗）培养观察。

6．培养90天后，观察并分别统计对照组A1和A2水稻植株高矮状况（见表1）。

实例3 油菜素唑处理水稻以及饲养健康灰飞虱和携带RBSDV的灰飞虱

1．将待接毒的水稻品种置于培养皿中浸种2天，催芽1天，发芽后分别播于1L烧杯中，每杯28株，共两杯。

2．将油菜素唑用0.1％的tritonX-100稀释到1 µM,然后用小喷壶均匀喷洒在二~三叶期的水稻（淮稻5号）叶片上，每隔2天喷一次，共处理三次。

3．喷施的量为JA浸湿整个叶片，即叶片上开始滴水为止。

4．处理16个小时后，分别用健康的灰飞虱和携带RBSDV的灰飞虱进行水稻接毒。按每苗４虫的有效接种虫量将灰飞虱接种于３~４叶期的淮稻５号水稻幼苗上，健康的灰飞虱作为处理组B1，携带RBSDV的灰飞虱作为对照组B2（表1）。

5．接种3天后，将灰飞虱扫除，并将水稻秧苗移栽至温室（28℃，16h光照8h黑暗）培养观察。

6．培养90天后，观察并分别统计处理组B1和B2水稻植株高矮状况（见表1）。

实例4 水稻植株中RBSDV病毒检测

4.1 RNA的提取及逆转录反应

接毒RBSDV的样品用液氮速冻充分研磨后，加入1~2 mL TRIzol，按照TRIzol试剂盒说明书进行提取，取适量样品用液氮速冻充分研磨，加入1~2 mL的Trizol继续研磨，融化后转入1.5 mL的离心管中；加入0.2 mL的氯仿-异戊醇(24:1)，混匀后静置5 min，于4℃下12000 g离心10 min，吸取上清后加入等体积的氯仿-异戊醇，重复上述步骤一次；取上清加入等体积的异丙醇混匀后置于室温10 min，于4℃下12,000 g离心10 min；弃上清并加入1 mL75%乙醇进行洗涤，于4℃下12,000 g离心5 min，重复上述步骤一次；待沉淀适度干燥后，用20-40μL的RNase-free水溶解RNA。随后采用iScript cDNA Synthesis试剂盒进行逆转录反应，合成第一链cDNA。

逆转录反应体系如下：

RNA样品	7.5 μL (500 ng)
		5x iScript reaction mix	2 μL
iScript reverse transcriptase	0.5 μL
		Total Volume	10 μL

将样品混匀后，25°C 5 min，42°C 30 min，80°C 5 min，4°C保存。获得cDNA模板后置于-20°C保存备用。

4.2 RT-PCR检测RBSDV病毒

以RBSDV的基因组S10设计了两对引物，引物序列如下：

RB-S10-F	AACAACCGACCAACAATCAC
		RB-S10-R	GAGCAGGAACTTCACGACAG

进行RT-PCR，根据PCR 产物大小，序列分析以及感染RBSDV阳性对照水稻植株判断水稻是否感染RBSDV。PCR体系：10×缓冲液1uL，dNTP 1uL,RB-S4-F 和RB-S4-R 引物各0.3uL，cDNA 模板１uL，HiFi酶0.3uL，加dd H２ O补至10uL。PCR扩增条件为：94°C 3min；94°C 30s，58°C 30 s，72°C 30s，共35个循环；最后72°C 10 min延伸。

结果如下：

1. 90天时，淮稻５号植株A1组和B1组植株长势正常，对照A2组全部28株水稻植株表现明显矮缩症状（见图1），而处理B2组28株水稻有13株出现矮缩症状(见表1)，这表明油菜素唑处理后能够显著提供水稻抗RBSDV。

2. 利用RT-PCR方法检测水稻植株带毒情况，PCR扩增产物与表2中的水稻植株高矮一致，A2 PCR扩增产物的比例为100%（见图2，其中：M，Marker；-，健康的水稻植株对照；+，携带RBSDV的水稻植株阳性对照；1-28，0.1％Triton X-100处理后接种RBSDV的植株），B2扩增出产物有13株（共有28株）（见图3，其中：M，Marker；-，健康的水稻植株对照；+，携带RBSDV的水稻植株阳性对照；1-28，油菜素唑处理后接种RBSDV的植株）。因此，水稻出现矮缩症状的即为携带RBSDV植株。

表1 油菜素唑处理水稻和接毒方案

Claims (7)

1.油菜素唑在提高水稻抗水稻黑条矮缩病毒病的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，将油菜素唑稀释液喷洒于水稻叶片上。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述油菜素唑稀释液的浓度为1µM。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述水稻叶片为处在二~三叶期的水稻叶片。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述油菜素唑稀释液是用0.1％的tritonX-100进行稀释。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，喷洒周期为：每隔2天喷一次，共处理三次。

7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，喷施容量为浸湿整个叶片，即叶片上开始滴水为止。