CN105785016A - 基于pg磁微粒的双标记时间分辨荧光免疫分析试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于PG磁微粒的双标记时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其制备方法与检测方法，属于免疫检测分析技术和纳米生物技术领域，在所述试剂盒中，包括各自独立包装的反应缓冲液、浓缩清洗液、增强液、包被PGI单克隆抗体的磁微粒溶液、包被PGII单克隆抗体的磁微粒溶液、PG的校准品溶液、铕标记的PGII单克隆抗体溶液和钐标记的PGI单克隆抗体溶液，上述试剂盒可以提供一种接近均相的双标记反应体系，保证同时检测PGI和PGII的含量，使得同一样品液体中的PGI和PGII的检测结果准确度高、误差小，同时大大缩短了反应时间，缩短检测时间，提高了效率，提高检测灵敏度和特异性，为临床使用提供了极大便利。

Description

基于PG磁微粒的双标记时间分辨荧光免疫分析试剂盒
技术领域
本发明属于免疫检测分析技术和纳米生物技术领域，具体涉及一种基于PG磁微粒的双标记时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其制备方法和检测方法。
背景技术
胃蛋白酶原(Pesinogen，PG)是胃液中胃蛋白酶的无活性前体，人胃蛋白酶原可分为两种生化和免疫活性特征不同的胃蛋白酶原群：胃蛋白酶原Ⅰ(简称PGⅠ)和胃蛋白酶原II(简称PGII)，PGⅠ主要由胃底腺的主细胞和颈黏液细胞分泌，大部分进入胃腔，少量进入血液循环，PGII来源于全胃腺和远端十二指肠Brunner氏腺，胃粘膜合成的PGII约为总量的25％。PGII大部分进入消化道，少量进入血液循环，因此PG被称为“反映胃部状态和功能的指针”，其水平的变化可以直接反映胃粘膜和十二指肠状态和细胞数量的改变。国内外临床研究指出，PG与胃底粘膜病变的相关性较大，测定PG含量有助检测出十二指肠溃疡、萎缩性胃炎，胃炎，胃癌等其他消化道疾病，供临床检测和体检筛查需要，PG检测作为非侵入性方法，降低患者痛苦，简便、经济，具有普查价值。
胃蛋白酶原(PG)对胃部疾病的发展历程，一般可表述为：浅表性胃炎—胃粘膜糜烂溃疡—萎缩性胃炎—胃癌，及其它疾病具有良好的诊断和筛选作用。胃蛋白酶原Ⅰ/Ⅱ检测试纸盒用于检测血清或者血浆中的胃蛋白酶原Ⅰ/Ⅱ的含量，具有简便、快速的优势，避免了X-射线对人体的侵害和胃镜的不便。但现有技术中的胃蛋白酶原检测试纸盒都为单一检测盒，即只能单独单次对胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II进行检测，而在实际操作中，有时候需要检测同一样品液体中的胃蛋白酶原I和II，以获得同一样品液体中的胃蛋白酶原I和胃蛋白酶原II的含量之比或二者的其他比值PGI/PGII，如果PGI/PGII比值低于6，则萎缩性胃炎和胃癌的风险增加，若采用胃蛋白酶原I和胃蛋白酶原II单独的检测，在检测过程中难免会有误差，若胃蛋白酶原I产生一个正的误差，胃蛋白酶原II产生一个负的误差，在计算PGI/PGII比值时会出现误差放大的情况，将会导致胃蛋白酶原I和胃蛋白酶原II的检测所得比值与实际比值存在误差，致使结果不准确。
对于胃蛋白酶原的检测，目前临床常用的方法包括：乳胶增强免疫比浊法、酶联免疫法(ELISA)、化学发光法(CLIA)以及时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)。乳胶增强免疫比浊法，操作简单，可以全自动化，但是，其灵敏度不高，无法实现精确定量。CLIA法以进口试剂为主，成本较高，技术成熟度在国内相对弱。虽然ELISA法和TRFIA法能够准确定量，但操作过程复杂，且不适合单人份和较小批量检测使用，而且目前利用时间分辨荧光免疫分析技术对于胃蛋白酶原的检测，仅能单独检测胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II。如中国专利文献CN202854147U中公开的一种胃蛋白酶原II时间分辨荧光免疫检测试剂盒中公开的试剂盒仅能检测胃蛋白酶原II。
然而，目前还未提出一种利用时间分辨荧光免疫分析技术同时检测PGI和PGII的试剂盒及其制备方法和检测方法，为此，本发明将双标记时间分辨荧光免疫分析技术与磁微粒相结合，提供了一种基于PG磁微粒的双标记时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其制备方法和检测方法，不仅能够同时检测样品中的PGI和PGII水平，而且还保证检测结果更加准确可靠，具有更高的检测灵敏度和特异性，并达到了较佳的性能参数。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于现有技术中不能同时检测PGI和PGII，计算得到的PGI/PGII比值误差大，检测结果准确性低，而且检测时间长，灵敏度、特异性差，效率低，不宜进行大量样品筛查，进而提供一种可同时检测PGI和PGII、检测结果准确可靠且灵敏度、特异性高和检测时间短的基于PG磁微粒的双标记时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其检测方法和用途。
为此，本发明提供一种基于PG磁微粒的双标记时间分辨荧光免疫分析试剂盒，包括各自独立包装的反应缓冲液、浓缩清洗液、增强液、包被PGI单克隆抗体的磁微粒溶液、包被PGII单克隆抗体的磁微粒溶液、PG的校准品溶液、铕标记的PGII单克隆抗体溶液和钐标记的PGI单克隆抗体溶液。
所述的基于PG磁微粒的双标记时间分辨荧光免疫分析试剂盒，所述铕标记的PGII单克隆抗体溶液以Eu3+-N2-[P-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸钠标记PGII单克隆抗体制备得到，所述PGII单克隆抗体与所述Eu3+-N2-[P-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸钠的质量比为5:1；
所述钐标记的PGI单克隆抗体溶液以Sm3+-N2-[P-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸钠标记PGI单克隆抗体制备得到，所述PGI单克隆抗体与所述Sm3+-N2-[P-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸钠的质量比为5:1；
所述包被PGI单克隆抗体的磁微粒溶液经直径为1-300纳米的活化的磁微粒与所述PGI单克隆抗体连接、洗涤、封闭、洗涤制备得到；
所述包被PGII单克隆抗体的磁微粒溶液经直径为1-300纳米的活化的磁微粒与所述PGII单克隆抗体连接、洗涤、封闭、洗涤制备得到。
所述的基于PG磁微粒的双标记时间分辨荧光免疫分析试剂盒，所述的浓缩清洗液为含12.1lg/L的Tris，312.43g/L的NaCl，27.74g/L的Tween-20，1g/L的TritonX-100，以盐酸调节pH为7.8的缓冲溶液；
所述的增强液为含体积浓度为3.6‰的冰醋酸，0.5g/L的醋酸钠，0.05g/L的β-萘甲酰三氟丙酮，0.03g/L的三辛基氧化膦和体积浓度为1‰的TritonX-100的混合溶液；
所述的反应缓冲液的制备为6.06g三羟甲基氨基甲烷和8.8gNaCl溶于去离子水中，用盐酸调节pH值为7.8，然后加入60g的质量浓度为≥98％的BSA、1g的NaN3；
所述PG的校准品溶液为用含2g/L的BSA和1g/L的NaN3的50mmol/L的pH7.8Tris-HCl,反应缓冲液将所述PG抗原配制成含所述PGI抗原浓度为0ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、300ng/mL以及所述PGII抗原浓度为0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、25ng/mL、40ng/mL的浓度系列的混合校准品溶液。
所述的基于PG磁微粒的双标记时间分辨荧光免疫分析试剂盒，每支所述试剂盒的配方为：
所述的浓缩清洗液，40mL；
所述的增强液，30mL；
所述的反应缓冲液，50mL；
所述铕标记的PGII单克隆抗体溶液，0.01-0.1mg/mL,2mL；
所述钐标记的PGI单克隆抗体溶液，0.01-0.1mg/mL,2mL；
6×所述PG的校准品溶液，每瓶1mL；
所述包被PGI单克隆抗体的磁微粒溶液，0.05-0.1mg/mL，2mL；
所述包被PGII单克隆抗体的磁微粒溶液，0.05-0.1mg/mL，2mL。
本发明提供了一种制备所述的基于PG磁微粒的双标记时间分辨荧光免疫分析试剂盒的方法，包括如下制备方法中的任意一种或几种：
所述PG的校准品溶液的制备：取浓度为1mg/mL的PGI抗原溶液和1mg/mL的PGII抗原溶液用含2g/L的BSA和1g/L的NaN3的50mmol/L的pH为7.8的Tris-Hcl反应缓冲液配制成含所述PGI抗原浓度为0ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、300ng/mL以及所述PGII抗原浓度为0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、25ng/mL、40ng/mL的浓度系列的混合校准品溶液，进行分装，冻干，4℃保存；或
所述的包被PGI单克隆抗体的磁微粒溶液的制备：取直径为1-300nm的四氧化三铁微球用质量浓度为5-10％的戊二醛活化，室温混匀4小时后，用0.05mol/L的pH为7.2的PBS缓冲液清洗1-3次，然后用上述缓冲溶液进行悬浮，制成浓度为100mg/mL的磁微粒悬浮液；取100μL所述磁微粒悬浮液，然后加入1mL的0.05mol/L的pH为7.2的PBS缓冲液和50μg的PGI单克隆抗体，于25℃混匀温育2小时，然后进行磁性分离，保留磁微粒，用0.05mol/L的pH为7.2的PBS缓冲液清洗1-3次，用1mL的含质量浓度为5％BSA的0.0lmol/L的pH为7.2的PBS缓冲液于25℃下封闭30分钟，用0.05mol/L的pH为7.2的PBS缓冲液清洗1-3次，用含有质量浓度为0.5％BSA和质量浓度为0.1％的NaN3的0.05mol/L的pH为7.2的Tris-HCl缓冲液重悬，分装，置于2-8℃下保存；或
所述的包被PGII单克隆抗体的磁微粒溶液的制备：取直径为1-300nm的四氧化三铁微球用浓度为5-10％的戊二醛活化，室温混匀4小时后，用0.05mol/L的pH为7.2的PBS缓冲液清洗1-3次，然后用上述缓冲溶液进行悬浮，制成浓度为100mg/mL的磁微粒悬浮液；取100μL所述磁微粒悬浮液，然后加入1mL的0.05mol/L的pH为7.2的PBS缓冲液和50μg的PGII单克隆抗体，于25℃混匀温育2小时，然后进行磁性分离，保留磁微粒，用0.05mol/L的pH为7.2的PBS缓冲液清洗1-3次，用1mL的含质量浓度为5％BSA的0.0lmol/L的pH为7.2的PBS缓冲液于25℃下封闭30分钟，用0.05mol/L的pH为7.2的PBS缓冲液清洗1-3次，用含有质量浓度为0.5％BSA和质量浓度为0.1％NaN3的0.05mol/L的pH为7.2的Tris-HCl缓冲液重悬，分装，置于2-8℃下保存，即得；或
所述的钐标记的PGI单克隆抗体溶液的制备:取PGI抗体1mL，经PD-10柱转换缓冲条件，洗脱液为含0.155mol/LNaCl的50mmol/L的pH为8.5的Na2CO3-NaHCO3缓冲液，收集蛋白峰，获得浓缩至2g/L的PGI单克隆抗体溶液，取所述PGI单克隆抗体溶液500μL加入0.2mg的所述异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸钐钠中，25℃磁力搅拌反应20小时，然后将反应液转移到预先用pH为7.8的浓度为80mmol/L的Tris缓冲液平衡的SepharoseCL-6B柱上进行层析，收集蛋白峰，稀释，进行分装，真空冷冻干燥，置于-20℃保存；或
所述的铕标记的PGII单克隆抗体溶液的制备：取PGII抗体1mL，经PD-10柱转换缓冲条件，洗脱液为含0.155mol/LNaCl的50mmol/L的pH为8.5的Na2CO3-NaHCO3缓冲液，收集蛋白峰，获得浓缩至2g/L的PGII单克隆抗体溶液，取所述PGII单克隆抗体溶液500μL加入0.2mg的异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸铕钠，25℃磁力搅拌反应20小时，将反应液转移到预先用pH为7.8的浓度为80mmol/L的Tris缓冲液平衡的SepharoseCL-6B柱上进行层析，收集蛋白峰，稀释，进行分装，真空冷冻干燥，置于-20℃保存；或
所述增强液的制备：取3.6mL冰醋酸、0.5g醋酸钠、0.05gβ-萘甲酰三氟丙酮、0.03g三辛基氧化膦和1mL的TritonX-100，混匀，加去离子水定容至1000mL，分装，置于2-8℃下保存，即得；或
所述反应缓冲液的制备：取6.06g三羟甲基氨基甲烷和8.8gNaCl溶于去离子水中，用盐酸调节PH值为7.8，然后加入60g的质量浓度为≥98％BSA、1g的NaN3，随后加去离子水定容至1L，分装，置于2-8℃下保存，即得；或
所述浓缩清洗液的配制：取12.1lg的Tris，312.43g的NaCl，27.74g的Tween-20和1g的TritonX-100加入去离子水中，完全溶解后，用盐酸调pH至7.8，然后加去离子水定容至1L，分装，置于2-8℃下保存，即得。
本发明提供了一种利用所述的基于PG磁微粒的双标记时间分辨荧光免疫分析试剂盒的同时检测PGI和PGII的方法，包括如下步骤，
S1、分别取所述PG的校准品溶液和待测样品，与所述包被PGI单克隆抗体的磁微粒溶液、包被PGII单克隆抗体的磁微粒溶液以及反应缓冲液混合，然后进行孵育，备用；
S2、将S1步骤中的孵育后的溶液进行磁性分离，然后吸弃上清液，然后加入所述浓缩清洗液进行清洗，混匀后，将所述溶液进行磁性分离，然后吸弃上清液，重复上述清洗步骤；
S3、将以所述反应缓冲液稀释的钐标记的PGI单克隆抗体溶液和铕标记的PGII单克隆抗体溶液加入步骤S2中的清洗后的溶液中，进行振荡孵育，然后用所述浓缩清洗液进行清洗，混匀后，进行磁性分离，然后吸弃上清液，重复上述清洗步骤，然后加入所述增强液，振荡反应；
S4、采用时间分辨荧光免疫分析仪分别测定S3步骤中的增强后的溶液中铕和钐的荧光值，分别获得所述PG的校准品溶液和待测样品的荧光值，然后分别根据所述PG的校准品溶液中所述PGI抗原的浓度和所述PGII抗原的浓度和其各自对应的荧光值绘制标准曲线，然后将所述待测样品的对应荧光值代入对应的所述PGI标准曲线或PGII标准曲线中，计算得到所述待测样品中PGI和PGII的含量。
所述的方法，包括如下步骤，
S1、分别取所述PG的校准品溶液和待测样品48-52μL，与所述包被PGI单克隆抗体的磁微粒溶液4-6μL、包被PGII单克隆抗体的磁微粒溶液4-6μL以及反应缓冲液140-160μL混合，加到透明微孔板的微孔或Ep管中，于23-27℃振荡孵育4-6分钟；
S2、将S1步骤中的所述透明微孔板或Ep管中的溶液进行磁性分离25-35秒，然后吸弃上清液，每个微孔或Ep管中加入290-310μL按1:48-52比例稀释的所述浓缩清洗液进行清洗，混匀后，将所述透明微孔板或Ep管中的溶液进行磁性分离18-22秒，然后吸弃上清液，重复上述清洗步骤5-6次；
S3、将以所述反应缓冲液按1：48-52比例稀释的钐标记的PGI单克隆抗90-110μL和铕标记的PGII单克隆抗体溶液90-110μL加入步骤S2中的所述透明微孔板或Ep管中，23-27℃振荡孵育4-6分钟，然后向每个微孔或Ep管中加入290-310μL按1:48-52比例稀释的所述浓缩清洗液进行清洗，混匀后，将所述透明微孔板或Ep管中的溶液进行磁性分离18-22秒，然后吸弃上清液，重复上述清洗步骤5-6次，然后向所述透明微孔板中微孔或Ep管中加入190-210μL所述增强液，于23-27℃振荡反应2.5-3.5min；
S4、采用时间分辨荧光免疫分析仪分别测定S3步骤中的增强后的溶液中铕和钐的荧光值，分别获得所述PG的校准品溶液和待测样品的荧光值，然后分别根据所述PG的校准品溶液中所述PGI抗原的浓度和所述PGII抗原的浓度和其各自对应的荧光值绘制标准曲线，然后将所述待测样品的对应荧光值代入对应的所述PGI标准曲线或PGII标准曲线中，计算得到所述待测样品中PGI和PGII的含量。
所述的方法，包括如下步骤，
S1、分别取所述PG的校准品溶液和待测样品50μL，与所述包被PGI单克隆抗体的磁微粒溶液5μL、包被PGII单克隆抗体的磁微粒溶液5μL以及反应缓冲液150μL混合，加到透明微孔板的微孔或Ep管中，于25℃振荡孵育5分钟；
S2、将S1步骤中的所述透明微孔板或Ep管中的溶液进行磁性分离30秒，然后吸弃上清液，每个微孔或Ep管中加入300μL按1:50比例稀释的所述浓缩清洗液进行清洗，混匀后，将所述透明微孔板或Ep管进行磁性分离20秒，然后吸弃上清液，重复上述清洗步骤5-6次；
S3、将以反应缓冲液按1：50比例稀释的钐标记的PGI单克隆抗100μL和铕标记的PGII单克隆抗体溶液100μL加入步骤S2步骤中的所述透明微孔板或Ep管中，25℃振荡孵育5分钟，然后向每个微孔或Ep管中加入300μL按1:50比例稀释的所述浓缩清洗液进行清洗，混匀后，将所述透明微孔板或Ep管中溶液进行磁性分离20秒，然后吸弃上清液，重复上述清洗步骤5-6次，然后向所述透明微孔板中微孔或Ep管中加入200μL所述增强液，于25℃振荡反应3min；
S4、采用时间分辨荧光免疫分析仪分别测定S3步骤中的增强后的溶液中铕和钐的荧光值，分别获得所述PG的校准品溶液和待测样品的荧光值，然后分别根据所述PG的校准品溶液中所述PGI抗原的浓度和所述PGII抗原的浓度和其各自对应的荧光值绘制标准曲线，然后将所述待测样品的对应荧光值代入对应的所述PGI标准曲线或PGII标准曲线中，计算得到所述待测样品中PGI和PGII的含量。
所述的方法，所述S1步骤中，所述待测样品还包括预处理步骤，取待测样品于3000rpm离心5分钟，然后取上层液即为用于检测的所述待测样品。
本发明提供了所述的试剂盒或所述的方法在检测PGII和/或PGI中的用途。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
(1)本发明所述的基于PG磁微粒的双标记时间分辨荧光免疫分析试剂盒，包括各自独立包装的反应缓冲液、浓缩清洗液、增强液、包被PGI单克隆抗体的磁微粒溶液、包被PGII单克隆抗体的磁微粒溶液、PG的校准品溶液、铕标记的PGII单克隆抗体溶液和钐标记的PGI单克隆抗体溶液，通过稀土离子钐(Sm)标记的PGI单克隆抗体和磁微粒包被的PGI单克隆抗体与PGI抗原结合，形成Sm标记PGI抗体-PGI抗原-磁微粒包被PGI抗体的夹心免疫复合物，以稀土离子铕(Eu)标记的PGII单克隆抗体和磁微粒包被的PGII单克隆抗体与抗原结合，形成Eu标记PGII抗体-PGII抗原-磁微粒包被PGII抗体的夹心免疫复合物，两种免疫复合物在外加磁场中直接沉淀，不需离心即可将免疫反应形成的复合物与未结合的其它物质分离，15min内即可同时检测得到血清中PGI和PGII的含量，克服了现有技术中放射免疫分析法、酶联免疫分析法、单标时间分辨荧光免疫分析法、化学发光法只能分别测定PGI、PGII后再计算PGII/PGI比值而带来的误差积累，检测结果准确可靠，特别是对提高PGII/PGI比值参数检测准确性具有突出优势，除了拥有TRFIA技术的灵敏度高、储存时间长、无放射性污染、标准曲线范围宽等诸多优点外，还可通过免疫磁微粒的富集作用以及磁微粒在液体中充分扩散使得结合表面积扩大的特性，大大缩短反应时间，提高检测灵敏度，同时磁微粒与抗体通过化学基团定向连接，大大减少了配对抗体的用量以及显著提高检测的精密度，同时实现自动化，克服了传统微孔板式TRFIA技术需要样本积累到一定数量才能检测，实现了样本的即时检测，效率高；
该试剂盒是以纳米磁微粒为载体的高效双标记时间分辨荧光技术：磁微粒与PG单克隆抗体的自由氨基连接，形成包被有PG单克隆抗体的免疫磁微粒，该免疫磁微粒依靠其超大的比表面积可在短时间内“捕获”大量带有Eu或Sm标记的PG抗原抗体复合物，形成免疫磁珠-PG抗原-Eu或Sm标记PG抗体的夹心免疫复合物，用增强液将Eu和Sm从复合物上解离下来后，与增强液中的螫合剂螯合形成一种胶态分子团，分子团在紫外光的激发下能发出很强的发射波长(615nm和643nm)和寿命(820μs和880μs)不同的荧光，信号增强了百万倍且两个信号易区分，可同时检测血清中PGI和PGII抗原的含量，一次测量同时得到PGI、PGII和PGI/PGII三个结果，由于条件一致，PGI/PGII的比值更准确。
(2)本发明所述的基于PG磁微粒的双标记时间分辨荧光免疫分析试剂盒，所述铕标记的PGII单克隆抗体溶液以Eu3+-N2-[P-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸钠标记PGII单克隆抗体制备得到，所述PGII单克隆抗体与所述Eu3+-N2-[P-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸钠的质量比为5:1；所述钐标记的PGI单克隆抗体溶液以Sm3+-N2-[P-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸钠标记PGI单克隆抗体制备得到，所述PGI单克隆抗体与所述Sm3+-N2-[P-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸钠的质量比为5:1；所述包被PGI/PGII单克隆抗体的磁微粒经直径为1-300纳米的活化的磁微粒与所述PG单克隆抗体连接、洗涤、封闭、洗涤制备得到；通过采用镧系元素钐(Sm3+)和铕(Eu3+)分别标记PGI和PGII抗体，荧光强度高，且荧光的发射光谱峰范围窄，是类线光谱，检测特异性好；激发光和发射光的stokes位移大，激发光不能直接到达光电接受器，解决了激发光的杂散光影响，大幅度提高了检测的灵敏度和特异性；荧光寿命长，通过延缓测量时间，短寿命的背景荧光衰变消失后，再记录特异性的荧光，完全避免本底的干扰。
(3)本发明所述的制备所述的基于PG磁微粒的双标记时间分辨荧光免疫分析试剂盒的方法，在所述PG的校准品溶液的制备中，通过合理的调整所述PG的校准品系列浓度，使得绘制的标准曲线更能够准确的测定PGI和/或PGII的含量；在所述的包被PGI或PGII单克隆抗体的磁微粒溶液的制备中，通过使用质量浓度为5-10％的戊二醛活化四氧化三铁微球，大大提高了磁微粒与PGI或PGII单克隆抗体的连接，提高效率；所述的钐标记的PGI或PGII单克隆抗体的制备中，通过使用Na2CO3-NaHCO3缓冲液洗脱，收集得到的单克隆抗体溶液更纯，有利于PGI或PGII单克隆抗体的标记。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例2中所述的PGI标准曲线图；
图2是本发明实施例2中所述的PGII标准曲线图。
具体实施方式
下述实施例中涉及试剂或仪器的均为市售产品，不同厂家的产品在技术效果上并不会带来明显差别，其中Eu3+-N2-[P-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸钠、Sm3+-N2-[P-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸钠，购自PerkinElmerLifeandAnalyticalSciences(Waltham,MA,USA)；
待测血清，取自江苏省江原医院；
磁微粒(四氧化三铁微球)，购自JSRLifeSciences(Tokyo,Japan)；
PGI抗原，购自无锡市江原实业技贸总公司；
PGII抗原，购自无锡市江原实业技贸总公司；
PGI单克隆抗体，购自无锡市江原实业技贸总公司；
PGII单克隆抗体，购自无锡市江原实业技贸总公司；
Tween-20，购自Sigma(St.Louis,MO,USA)；
TritonX-100，购自Sigma(St.Louis,MO,USA)；
BSA，购自Sigma(St.Louis,MO,USA)；
SepharoseCL-6B，购自GE公司；
紫外分光光度计，购自美国MD公司，型号为M5；
磁分离器，购自嘉兴凯实生物科技有限公司，型号为CFL-1；
PD-10柱，购自美国GE公司；
时间分辨荧光免疫分析仪，美国PE公司，型号AutoDELFIA1235。
实施例1
本实施例提供了一种基于PG磁微粒的双标记时间分辨荧光免疫分析试剂盒，包括各自独立包装的反应缓冲液、浓缩清洗液、增强液、包被PGI单克隆抗体的磁微粒溶液、包被PGII单克隆抗体的磁微粒溶液、PG的校准品溶液、铕标记的PGII单克隆抗体溶液和钐标记的PGI单克隆抗体溶液,其中：
所述铕标记的PGII单克隆抗体溶液以Eu3+-N2-[P-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸钠标记PGII单克隆抗体制备得到，所述PGII单克隆抗体与所述Eu3+-N2-[P-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸钠的质量比为5:1；
所述钐标记的PGI单克隆抗体溶液以Sm3+-N2-[P-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸钠标记PGI单克隆抗体制备得到，所述PGI单克隆抗体与所述Sm3+-N2-[P-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸钠的质量比为5:1；
所述包被PGI单克隆抗体的磁微粒溶液经直径为1纳米的活化的磁微粒与所述PGI单克隆抗体连接、洗涤、封闭、洗涤制备得到；
所述包被PGII单克隆抗体的磁微粒溶液经直径为1纳米的活化的磁微粒与所述PGII单克隆抗体连接、洗涤、封闭、洗涤制备得到；
所述的浓缩清洗液为含12.1lg/L的Tris，312.43g/L的NaCl，27.74g/L的Tween-20，1g/L的TritonX-100，以盐酸调节pH为7.8的缓冲溶液；
所述的增强液为含体积浓度为3.6‰的冰醋酸，0.5g/L的醋酸钠，0.05g/L的β-萘甲酰三氟丙酮，0.03g/L的三辛基氧化膦和和体积浓度为1‰的TritonX-100的混合溶液；
所述的反应缓冲液为含6.06g/L的三羟甲基氨基甲烷，8.8g/L的NaCl，60g/L的BSA，体积浓度为1g/L的NaN3，以盐酸调节pH为7.8的缓冲溶液；
所述PG的校准品溶液为用含2g/L的BSA和1g/L的NaN3的50mmol/L的pH7.8Tris-Hcl反应缓冲液将所述PG抗原配制成含所述PGI抗原浓度为0ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、300ng/mL以及所述PGII抗原浓度为0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、25ng/mL、40ng/mL的浓度系列的混合校准品溶液。
每支所述试剂盒的配方为：
所述的浓缩清洗液，40mL；
所述的增强液，30mL；
所述的反应缓冲液，50mL；
所述铕标记的PGII单克隆抗体溶液，0.05mg，2mL；
所述钐标记的PGI单克隆抗体溶液，0.05mg，2mL；
6×所述PG的校准品溶液，每瓶1mL；
所述包被PGI单克隆抗体的磁微粒溶液，0.08mg/mL，2mL；
所述包被PGII单克隆抗体的磁微粒溶液，0.08mg/mL，2mL。
本实施例还提供了一种制备上述试剂盒的方法，具体包括如下步骤：
所述PG的校准品溶液的制备：取浓度为1mg/mL的PGI抗原溶液和1mg/mL的PGII抗原溶液用含2g/L的BSA和1g/L的NaN3的50mmol/L的pH为7.8的Tris-Hcl反应缓冲液配制成含所述PGI抗原浓度为0ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、300ng/mL以及所述PGII抗原浓度为0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、25ng/mL、40ng/mL的浓度系列的混合校准品溶液，进行分装，每瓶1mL，冻干，4℃保存，即得；
所述的包被PGI单克隆抗体的磁微粒溶液的制备：取直径为1nm的四氧化三铁微球用浓度为5％的戊二醛活化，室温混匀4小时后，用0.05mol/L的pH为7.2的PBS缓冲液清洗1-3次，然后用上述缓冲溶液进行悬浮，制成浓度为100mg/mL的磁微粒悬浮液；取100μL所述磁微粒悬浮液，然后加入1mL的0.05mol/L的pH为7.2的PBS缓冲液和50μg的PGI单克隆抗体，于25℃混匀温育2小时，然后进行磁性分离，保留磁微粒，用0.05mol/L的pH为7.2的PBS缓冲液清洗1-3次，用1mL的含质量浓度为5％BSA的0.0lmol/L的pH为7.2的PBS缓冲液于25℃下封闭30分钟，用0.05mol/L的pH为7.2的PBS缓冲液清洗1-3次，用1mL的含有质量浓度为0.5％BSA和质量浓度为0.1％NaN3的0.05mol/L的pH为7.2的Tris-HCl缓冲液重悬，制成浓度为0.08mg/mL的所述的包被PGI单克隆抗体的磁微粒溶液，置于2-8℃下保存，即得；
所述的包被PGII单克隆抗体的磁微粒溶液的制备：取直径为1-300nm的四氧化三铁微球用浓度为5％的戊二醛活化，室温混匀4小时后，用0.05mol/L的pH为7.2的PBS缓冲液清洗1-3次，然后用上述缓冲溶液进行悬浮，制成浓度为100mg/mL的磁微粒悬浮液；取100μL所述磁微粒悬浮液，然后加入1mL的0.05mol/L的pH为7.2的PBS缓冲液和50μg的PGII单克隆抗体，于25℃混匀温育2小时，然后进行磁性分离，保留磁微粒，用0.05mol/L的pH为7.2的PBS缓冲液清洗1-3次，用1mL的含质量浓度为5％BSA的0.0lmol/L的pH为7.2的PBS缓冲液于25℃下封闭30分钟，用0.05mol/L的pH为7.2的PBS缓冲液清洗1-3次，用1mL的含有质量浓度为0.5％BSA和质量浓度为0.1％的NaN3的0.05mol/L的pH为7.2的Tris-HCl缓冲液重悬，制成浓度为0.08mg/mL的所述的包被PGII单克隆抗体的磁微粒溶液，置于2-8℃下保存，即得；或
所述的钐标记的PGI单克隆抗体溶液的制备:取所述PGI单克隆抗体抗体1mL，经PD-10柱转换缓冲条件，洗脱液为含0.155mol/LNaCl的50mmol/L的pH为8.5的Na2CO3-NaHCO3缓冲液，收集蛋白峰，获得浓缩至2g/L的PGI单克隆抗体溶液，取所述PGI单克隆抗体溶液500μL加入0.2mg的所述异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸钐钠中，25℃磁力搅拌反应20小时，然后将反应液转移到预先用pH为7.8的浓度为80mmol/L的Tris缓冲液平衡的SepharoseCL-6B柱上进行层析，收集蛋白峰，稀释成浓度为0.08mg/mL，进行分装，每瓶2mL，真空冷冻干燥，置于-20℃保存，即得；
所述的铕标记的PGII单克隆抗体溶液的制备取PGII抗体1mL，经PD-10柱转换缓冲条件，洗脱液为含0.155mol/LNaCl的50mmol/L的pH为8.5的Na2CO3-NaHCO3缓冲液，收集蛋白峰，获得浓缩至2g/L的PGI单克隆抗体溶液，取所述PGII单克隆抗体溶液500μL加入0.2mg的异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸铕钠，25℃磁力搅拌反应20小时，将反应液转移到预先用pH为7.8的浓度为80mmol/L的Tris缓冲液平衡的SepharoseCL-6B柱上进行层析，收集蛋白峰，稀释成浓度为0.08mg/mL，进行分装，每瓶2mL，真空冷冻干燥，置于-20℃保存，即得；
所述增强液的制备：取3.6mL冰醋酸、0.5g醋酸钠、0.05gβ-萘甲酰三氟丙酮、0.03g三辛基氧化膦和1mL的TritonX-100，混匀，加去离子水定容至1000mL，进行分装，每瓶30mL，置于2-8℃下保存，即得；
所述反应缓冲液的制备：取6.06g三羟甲基氨基甲烷和8.8g的NaCl溶于去离子水中，用盐酸调节PH值为7.8，然后加入60g的质量浓度为≥98％BSA和1g的NaN3，随后加去离子水定容至1L，进行分装，每瓶50mL，置于2-8℃下保存，即得；
所述浓缩清洗液的配制：取12.1lg的Tris，312.43g的NaCl，27.74g的Tween-20和1g的TritonX-100加入去离子水中，完全溶解后，用盐酸调pH至7.8，然后加去离子水定容至1L，进行分装，每瓶40mL，置于2-8℃下保存，即得。
实施例2
本实施例提供了一种基于PG磁微粒的双标记时间分辨荧光免疫分析试剂盒，包括各自独立包装的反应缓冲液、浓缩清洗液、增强液、包被PGI单克隆抗体的磁微粒溶液、包被PGII单克隆抗体的磁微粒溶液、PG的校准品溶液、铕标记的PGII单克隆抗体溶液和钐标记的PGI单克隆抗体溶液,其中：
所述铕标记的PGII单克隆抗体溶液以Eu3+-N2-[P-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸钠标记PGII单克隆抗体制备得到，所述PGII单克隆抗体与所述Eu3+-N2-[P-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸钠的质量比为5:1；
所述钐标记的PGI单克隆抗体溶液以Sm3+-N2-[P-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸钠标记PGI单克隆抗体制备得到，所述PGI单克隆抗体与所述Sm3+-N2-[P-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸钠的质量比为5:1；
所述包被PGI单克隆抗体的磁微粒溶液经直径为300纳米的活化的磁微粒与所述PGI单克隆抗体连接、洗涤、封闭、洗涤制备得到；
所述包被PGII单克隆抗体的磁微粒溶液经直径为300纳米的活化的磁微粒与所述PGII单克隆抗体连接、洗涤、封闭、洗涤制备得到；
所述的浓缩清洗液为含12.1lg/L的Tris，312.43g/L的NaCl，27.74g/L的Tween-20，1g/L的TritonX-100，以盐酸调节pH为7.8的缓冲溶液；
所述的增强液为含体积浓度为3.6‰的冰醋酸，0.5g/L的醋酸钠，0.05g/L的β-萘甲酰三氟丙酮，0.03g/L的三辛基氧化膦和和体积浓度为1‰的TritonX-100的混合溶液；
所述的反应缓冲液为含6.06g/L的三羟甲基氨基甲烷，8.8g/L的NaCl，60g/L的BSA，体积浓度为1g/L的NaN3，以盐酸调节pH为7.8的缓冲溶液；
所述PG的校准品溶液为用含2g/L的BSA和1g/L的NaN3的50mmol/L的pH7.8Tris-Hcl反应缓冲液将所述PG抗原配制成含所述PGI抗原浓度为0ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、300ng/mL以及所述PGII抗原浓度为0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、25ng/mL、40ng/mL的浓度系列的混合校准品溶液。
每支所述试剂盒的配方为：
所述的浓缩清洗液，40mL；
所述的增强液，30mL；
所述的反应缓冲液，50mL；
所述铕标记的PGII单克隆抗体溶液，0.1mg；2mL
所述钐标记的PGI单克隆抗体溶液，0.1mg；2mL
6×所述PG的校准品溶液，每瓶1mL；
所述包被PGI单克隆抗体的磁微粒溶液，0.05mg/mL，2mL；
所述包被PGII单克隆抗体的磁微粒溶液，0.05mg/mL，2mL。
本实施例还提供了一种制备上述试剂盒的方法，具体包括如下步骤：
所述PG的校准品溶液的制备：取浓度为1mg/mL的PGI抗原溶液和1mg/mL的PGII抗原溶液用含2g/L的BSA和1g/L的NaN3的50mmol/L的pH为7.8的Tris-Hcl反应缓冲液配制成含所述PGI抗原浓度为0ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、300ng/mL以及所述PGII抗原浓度为0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、25ng/mL、40ng/mL的浓度系列的混合校准品溶液，进行分装，每瓶1mL，冻干，4℃保存，即得；
所述的包被PGI单克隆抗体的磁微粒溶液的制备：取直径为300nm的四氧化三铁微球用质量浓度为10％的戊二醛活化，室温混匀4小时后，用0.05mol/L的pH为7.2的PBS缓冲液清洗1-3次，然后用上述缓冲溶液进行悬浮，制成浓度为100mg/mL的磁微粒悬浮液；取100μL所述磁微粒悬浮液，然后加入1mL的0.05mol/L的pH为7.2的PBS缓冲液和50μg的PGI单克隆抗体，于25℃混匀温育2小时，然后进行磁性分离，保留磁微粒，用0.05mol/L的pH为7.2的PBS缓冲液清洗1-3次，用1mL的含质量浓度为5％BSA的0.0lmol/L的pH为7.2的PBS缓冲液于25℃下封闭30分钟，用0.05mol/L的pH为7.2的PBS缓冲液清洗1-3次，用1mL的含有质量浓度为0.5％BSA和质量浓度为0.1％NaN3的0.05mol/L的pH为7.2的Tris-HCl缓冲液重悬，制成浓度为0.1mg/mL的所述的包被PGI单克隆抗体的磁微粒溶液，置于2-8℃下保存，即得；
所述的包被PGII单克隆抗体的磁微粒溶液的制备：取直径为300nm的四氧化三铁微球用质量浓度为10％的戊二醛活化，室温混匀4小时后，用0.05mol/L的pH为7.2的PBS缓冲液清洗1-3次，然后用上述缓冲溶液进行悬浮，制成浓度为100mg/mL的磁微粒悬浮液；取100μL所述磁微粒悬浮液，然后加入1mL的0.05mol/L的pH为7.2的PBS缓冲液和50μg的PGII单克隆抗体，于25℃混匀温育2小时，然后进行磁性分离，保留磁微粒，用0.05mol/L的pH为7.2的PBS缓冲液清洗1-3次，用1mL的含质量浓度为5％BSA的0.0lmol/L的pH为7.2的PBS缓冲液于25℃下封闭30分钟，用0.05mol/L的pH为7.2的PBS缓冲液清洗1-3次，用1mL的含有质量浓度为0.5％BSA和质量浓度为0.1％NaN3的0.05mol/L的pH为7.2的Tris-HCl缓冲液重悬，制成浓度为0.1mg/mL的所述的包被PGII单克隆抗体的磁微粒溶液，置于2-8℃下保存，即得；
所述的钐标记的PGI单克隆抗体溶液的制备:取所述PGI单克隆抗体1mL，经PD-10柱转换缓冲条件，洗脱液为含0.155mol/LNaCl的50mmol/L的pH为8.5的Na2CO3-NaHCO3缓冲液，收集蛋白峰，获得浓缩至2g/L的PGI单克隆抗体溶液，取所述PGI单克隆抗体溶液500μL加入0.2mg的所述异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸钐钠中，25℃磁力搅拌反应20小时，然后将反应液转移到预先用pH为7.8的浓度为80mmol/L的Tris缓冲液平衡的SepharoseCL-6B柱上进行层析，收集蛋白峰，稀释成浓度为0.05mg/mL，进行分装，每瓶2mL，真空冷冻干燥，置于-20℃保存，即得；
所述的铕标记的PGII单克隆抗体溶液的制备取PGII抗体1mL，经PD-10柱转换缓冲条件，洗脱液为含0.155mol/LNaCl的50mmol/L的pH为8.5的Na2CO3-NaHCO3缓冲液，收集蛋白峰，获得浓缩至2g/L的PGI单克隆抗体溶液，取所述PGII单克隆抗体溶液500μL加入0.2mg的异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸铕钠，25℃磁力搅拌反应20小时，将反应液转移到预先用pH为7.8的浓度为80mmol/L的Tris缓冲液平衡的SepharoseCL-6B柱上进行层析，收集蛋白峰，稀释成浓度为0.05mg/mL，进行分装，每瓶2mL，真空冷冻干燥，置于-20℃保存，即得；
所述增强液的制备：取3.6mL冰醋酸、0.5g醋酸钠、0.05gβ-萘甲酰三氟丙酮、0.03g三辛基氧化膦和1mL的TritonX-100，混匀，加去离子水定容至1000mL，进行分装，每瓶30mL，置于2-8℃下保存，即得；
所述反应缓冲液的制备：取6.06g三羟甲基氨基甲烷和8.8gNaCl溶于去离子水中，用盐酸调节PH值为7.8，然后加入60g的质量浓度为≥98％BSA和1g的NaN3，随后加去离子水定容至1L，进行分装，每瓶50mL，置于2-8℃下保存，即得；
所述浓缩清洗液的配制：取12.1lg的Tris，312.43g的NaCl，27.74g的Tween-20和1g的TritonX-100加入去离子水中，完全溶解后，用盐酸调pH至7.8，然后加去离子水定容至1L，进行分装，每瓶40mL，置于2-8℃下保存，即得。
实施例3
本实施例提供了一种基于PG磁微粒的双标记时间分辨荧光免疫分析试剂盒，包括各自独立包装的反应缓冲液、浓缩清洗液、增强液、包被PGI单克隆抗体的磁微粒溶液、包被PGII单克隆抗体的磁微粒溶液、PG的校准品溶液、铕标记的PGII单克隆抗体溶液和钐标记的PGI单克隆抗体溶液,其中：
所述铕标记的PGII单克隆抗体溶液以Eu3+-N2-[P-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸钠标记PGII单克隆抗体制备得到，所述PGII单克隆抗体与所述Eu3+-N2-[P-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸钠的质量比为5:1；
所述钐标记的PGI单克隆抗体溶液以Sm3+-N2-[P-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸钠标记PGI单克隆抗体制备得到，所述PGI单克隆抗体与所述Sm3+-N2-[P-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸钠的质量比为5:1；
所述包被PGI单克隆抗体的磁微粒溶液经直径为200纳米的活化的磁微粒与所述PGI单克隆抗体连接、洗涤、封闭、洗涤制备得到；
所述包被PGII单克隆抗体的磁微粒溶液经直径为200纳米的活化的磁微粒与所述PGII单克隆抗体连接、洗涤、封闭、洗涤制备得到；
所述的浓缩清洗液为含12.1lg/L的Tris，312.43g/L的NaCl，27.74g/L的Tween-20，1g/L的TritonX-100，以盐酸调节pH为7.8的缓冲溶液；
所述的增强液为含体积浓度为3.6‰的冰醋酸，0.5g/L的醋酸钠，0.05g/L的β-萘甲酰三氟丙酮，0.03g/L的三辛基氧化膦和和体积浓度为1‰的TritonX-100的混合溶液；
所述的反应缓冲液为含6.06g/L的三羟甲基氨基甲烷，8.8g/L的NaCl，60g/L的BSA，体积浓度为1g/L的NaN3，以盐酸调节pH为7.8的缓冲溶液；
所述PG的校准品溶液为用含2g/L的BSA和1g/L的NaN3的50mmol/L的pH7.8Tris-Hcl反应缓冲液将所述PG抗原配制成含所述PGI抗原浓度为0ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、300ng/mL以及所述PGII抗原浓度为0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、25ng/mL、40ng/mL的浓度系列的混合校准品溶液。
每支所述试剂盒的配方为：
所述的浓缩清洗液，40mL；
所述的增强液，30mL；
所述的反应缓冲液，50mL；
所述铕标记的PGII单克隆抗体溶液，0.01mg；2mL
所述钐标记的PGI单克隆抗体溶液，0.01mg；2mL
6×所述PG的校准品溶液，每瓶1mL；
所述包被PGI单克隆抗体的磁微粒溶液，0.1mg/mL，2mL；
所述包被PGII单克隆抗体的磁微粒溶液，0.1mg/mL，2mL。
本实施例还提供了一种制备上述试剂盒的方法，具体包括如下步骤：
所述PG的校准品溶液的制备：取浓度为1mg/mL的PGI抗原溶液和1mg/mL的PGII抗原溶液用含2g/L的BSA和1g/L的NaN3的50mmol/L的pH为7.8的Tris-Hcl反应缓冲液配制成含所述PGI抗原浓度为0ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、300ng/mL以及所述PGII抗原浓度为0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、25ng/mL、40ng/mL的浓度系列的混合校准品溶液，进行分装，每瓶1mL，冻干，4℃保存，即得；或
所述的包被PGI单克隆抗体的磁微粒溶液的制备：取直径为200nm的四氧化三铁微球用质量浓度为8％的戊二醛活化，室温混匀4小时后，用0.05mol/L的pH为7.2的PBS缓冲液清洗1-3次，然后用上述缓冲溶液进行悬浮，制成浓度为100mg/mL的磁微粒悬浮液；取100μL所述磁微粒悬浮液，然后加入1mL的0.05mol/L的pH为7.2的PBS缓冲液和50μg的PGI单克隆抗体，于25℃混匀温育2小时，然后进行磁性分离，保留磁微粒，用0.05mol/L的pH为7.2的PBS缓冲液清洗1-3次，用1mL的含质量浓度为5％BSA的0.0lmol/L的pH为7.2的PBS缓冲液于25℃下封闭30分钟，用0.05mol/L的pH为7.2的PBS缓冲液清洗1-3次，用1mL的含有质量浓度为0.5％BSA和质量浓度为0.1％NaN3的0.05mol/L的pH为7.2的Tris-HCl缓冲液重悬，制成浓度为0.01mg/mL的所述的包被PGI单克隆抗体的磁微粒溶液，置于2-8℃下保存，即得；
所述的包被PGII单克隆抗体的磁微粒溶液的制备：取直径为200nm的四氧化三铁微球用质量浓度为8％的戊二醛活化，室温混匀4小时后，用0.05mol/L的pH为7.2的PBS缓冲液清洗1-3次，然后用上述缓冲溶液进行悬浮，制成浓度为100mg/mL的磁微粒悬浮液；取100μL所述磁微粒悬浮液，然后加入1mL的0.05mol/L的pH为7.2的PBS缓冲液和50μg的PGII单克隆抗体，于25℃混匀温育2小时，然后进行磁性分离，保留磁微粒，用0.05mol/L的pH为7.2的PBS缓冲液清洗1-3次，用1mL的含质量浓度为5％BSA的0.0lmol/L的pH为7.2的PBS缓冲液于25℃下封闭30分钟，用0.05mol/L的pH为7.2的PBS缓冲液清洗1-3次，用1mL的含有质量浓度为0.5％BSA和质量浓度为0.1％NaN3的0.05mol/L的pH为7.2的Tris-HCl缓冲液重悬，制成浓度为0.01mg/mL的所述的包被PGII单克隆抗体的磁微粒溶液，置于2-8℃下保存，即得；
所述的钐标记的PGI单克隆抗体溶液的制备:取PGI单克隆抗体溶液1mL，经PD-10柱转换缓冲条件，洗脱液为含0.155mol/LNaCl的50mmol/L的pH为8.5的Na2CO3-NaHCO3缓冲液，收集蛋白峰，获得浓缩至2g/L的PGI单克隆抗体溶液，取所述PGI单克隆抗体溶液500μL加入0.2mg的所述异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸钐钠中，25℃磁力搅拌反应20小时，然后将反应液转移到预先用pH为7.8的浓度为80mmol/L的Tris缓冲液平衡的SepharoseCL-6B柱上进行层析，收集蛋白峰，稀释成浓度为0.1mg/mL，进行分装，每瓶2mL，真空冷冻干燥，置于-20℃保存，即得；
所述的铕标记的PGII单克隆抗体溶液的制备：取PGII单克隆抗体溶液1mL，经PD-10柱转换缓冲条件，洗脱液为含0.155mol/LNaCl的50mmol/L的pH为8.5的Na2CO3-NaHCO3缓冲液，收集蛋白峰，获得浓缩至2g/L的PGI单克隆抗体溶液，取所述PGII单克隆抗体溶液500μL加入0.2mg的异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸铕钠，25℃磁力搅拌反应20小时，将反应液转移到预先用pH为7.8的浓度为80mmol/L的Tris缓冲液平衡的SepharoseCL-6B柱上进行层析，收集蛋白峰，稀释成浓度为0.1mg/mL，进行分装，每瓶2mL，真空冷冻干燥，置于-20℃保存，即得；
所述增强液的制备：取3.6mL冰醋酸、0.5g醋酸钠、0.05gβ-萘甲酰三氟丙酮、0.03g三辛基氧化膦和1mL的TritonX-100，混匀，加去离子水定容至1000mL，进行分装，每瓶30mL，置于2-8℃下保存，即得；
所述反应缓冲液的制备：取6.06g三羟甲基氨基甲烷和8.8gNaCl溶于去离子水中，用盐酸调节PH值为7.8，然后加入60g的质量浓度为≥98％BSA和1g的NaN3，随后加去离子水定容至1L，进行分装，每瓶50mL，置于2-8℃下保存，即得；或
所述浓缩清洗液的配制：取12.1lg的Tris，312.43g的NaCl，27.74g的Tween-20和1g的TritonX-100加入去离子水中，完全溶解后，用盐酸调pH至7.8，然后加去离子水定容至1L，进行分装，每瓶40mL，置于2-8℃下保存，即得。
实施例4
利用实施例1所述的试剂盒同时检测胃蛋白酶原I(PGI)和胃蛋白酶原II(PGII)含量的方法，包括如下步骤：
S1、分别取所述PG的校准品溶液和待测样品48μL，与所述包被PGI单克隆抗体的磁微粒溶液6μL、包被PGII单克隆抗体的磁微粒溶液6μL以及反应缓冲液140μL混合，加到透明微孔板的微孔或Ep管中，于27℃振荡孵育4分钟；其中，取待测样品于3000rpm离心5分钟，然后取上层液即为用于检测的所述待测样品；
S2、将S1步骤中的所述透明微孔板或Ep管中的溶液进行磁性分离35秒，然后吸弃上清液，每个微孔或Ep管中加入290μL按1:52比例稀释的所述浓缩清洗液进行清洗，混匀后，将所述透明微孔板或Ep管中的溶液进行磁性分离18秒，然后吸弃上清液，重复上述清洗步骤5-6次；
S3、将以所述反应缓冲液按1：52比例稀释的钐标记的PGI单克隆抗体溶液90μL和铕标记的PGII单克隆抗体溶液90μL加入步骤S2中的所述透明微孔板或Ep管中，27℃振荡孵育4分钟，然后向每个微孔或Ep管中加入310μL按1:52比例稀释的所述浓缩清洗液进行清洗，混匀后，将所述透明微孔板或Ep管中的溶液进行磁性分离18秒，然后吸弃上清液，重复上述清洗步骤5-6次，然后向所述透明微孔板中微孔或Ep管中加入210μL所述增强液，于23℃振荡反应3.5min；
S4、采用时间分辨荧光免疫分析仪分别测定S3步骤中的增强后的溶液中铕和钐的荧光值，分别获得所述PG的的校准品溶液和待测样品的荧光值，然后分别根据所述PG的校准品溶液中所述PGI抗原的浓度和所述PGII抗原的浓度和其各自对应的荧光值绘制标准曲线，然后将所述待测样品的对应荧光值代入对应的所述PGI标准曲线或PGII标准曲线中，计算得到所述待测样品中PGI和PGII的含量。
实施例5
利用实施例2所述的试剂盒同时检测胃蛋白酶原I(PGI)和胃蛋白酶原II(PGII)含量的方法，包括如下步骤：
S1、分别取所述PG的校准品溶液和待测样品52μL，与所述包被PGI单克隆抗体的磁微粒溶液4μL、包被PGII单克隆抗体的磁微粒溶液4μL以及反应缓冲液160μL混合，加到透明微孔板的微孔或Ep管中，于23℃振荡孵育6分钟；其中，取待测样品于3000rpm离心5分钟，然后取上层液即为用于检测的所述待测样品；
S2、将S1步骤中的所述透明微孔板或Ep管中的溶液进行磁性分离25秒，然后吸弃上清液，每个微孔或Ep管中加入310μL按1:48比例稀释的所述浓缩清洗液进行清洗，混匀后，将所述透明微孔板或Ep管中的溶液进行磁性分离22秒，然后吸弃上清液，重复上述清洗步骤5-6次；
S3、将以所述反应缓冲液按1：48比例稀释的钐标记的PGI单克隆抗体溶液110μL和铕标记的PGII单克隆抗体溶液110μL加入步骤S2中的所述透明微孔板或Ep管中，23℃振荡孵育6分钟，然后向每个微孔或Ep管中加入290μL按1:48比例稀释的所述浓缩清洗液进行清洗，混匀后，将所述透明微孔板或Ep管中的溶液进行磁性分离22秒，然后吸弃上清液，重复上述清洗步骤5-6次，然后向所述透明微孔板中微孔或Ep管中加入190μL所述增强液，于27℃振荡反应2.5min；
S4、采用时间分辨荧光免疫分析仪分别测定S3步骤中的增强后的溶液中铕和钐的荧光值，分别获得所述PG的的校准品溶液和待测样品的荧光值，然后分别根据所述PG的校准品溶液中所述PGI抗原的浓度和所述PGII抗原的浓度和其各自对应的荧光值绘制标准曲线，然后将所述待测样品的对应荧光值代入对应的所述PGI标准曲线或PGII标准曲线中，计算得到所述待测样品中PGI和PGII的含量。
实施例6
利用实施例3所述的试剂盒同时检测胃蛋白酶原I(PGI)和胃蛋白酶原II(PGII)含量的方法，包括如下步骤：
S1、分别取所述PG的校准品溶液和待测样品50μL，与所述包被PGI单克隆抗体的磁微粒溶液5μL、包被PGII单克隆抗体的磁微粒溶液5μL以及反应缓冲液150μL混合，加到透明微孔板的微孔或Ep管中，于25℃振荡孵育5分钟；其中，取待测样品于3000rpm离心5分钟，然后取上层液即为用于检测的所述待测样品；
S2、将S1步骤中的所述透明微孔板或Ep管中的溶液进行磁性分离30秒，然后吸弃上清液，每个微孔或Ep管中加入300μL按1:50比例稀释的所述浓缩清洗液进行清洗，混匀后，将所述透明微孔板或Ep管进行磁性分离20秒，然后吸弃上清液，重复上述清洗步骤5-6次；
S3、将以反应缓冲液按1：50比例稀释的钐标记的PGI单克隆抗体溶液100μL和铕标记的PGII单克隆抗体溶液100μL加入步骤S2步骤中的所述透明微孔板或Ep管中，25℃振荡孵育5分钟，然后向每个微孔或Ep管中加入300μL按1:50比例稀释的所述浓缩清洗液，混匀后，将所述透明微孔板或Ep管进行磁性分离20秒，然后吸弃上清液，重复上述清洗步骤5-6次，然后向所述透明微孔板中微孔或Ep管中加入200μL所述增强液，于25℃振荡反应3min；
S4、采用时间分辨荧光免疫分析仪分别测定S3步骤中的增强后的溶液中铕和钐的荧光值，分别获得所述PG的校准品溶液和待测样品的荧光值，然后根据所述PG的校准品溶液浓度和对应荧光值绘制标准曲线，校准品溶液PGI的浓度分别为0ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、300ng/mL，每个浓度做5个平行样，检测结果见表1，检测结果以荧光信号值为纵坐标，PGI的校准品溶液浓度为横坐标，建立方程并拟合标准曲线，PGI标准曲线见图1，校准品溶液PGII的浓度分别为0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、25ng/mL、40ng/mL，每个浓度做5个平行样，检测结果见表2，检测结果以荧光信号值为纵坐标，PGII的校准品溶液浓度为横坐标，建立方程并拟合标准曲线，PGII标准曲线见图2，然后将所述待测样品检测得到的对应荧光值代入对应的所述PGI标准曲线或PGII标准曲线中，计算得到所述待测样品中PGI和PGII的含量见表3。
表1PGI校准品的检测结果
表2PGII校准品的检测结果
表3样本检测结果
对比例
与市售胃蛋白酶原试剂盒的比较
分别采用市售的胃蛋白酶原时间分辨免疫荧光试剂盒(TRFIA)(无锡市江原实业技贸总公司)和实施例6中的方法检测样品(所述样品中PGI浓度范围为40-300ng/mL，PGII浓度范围为7-60ng/mL)重复三次，验证本发明的试剂盒的检测结果正确性，结果见下表4。
表4样本检测结果
比较实施例6和市售胃蛋白酶原时间分辨免疫荧光试剂盒检测的误差均小于10％，该试剂的检测结果准确可靠。相比于对比例，本发明所述的基于PG磁微粒的双标记时间分辨荧光免疫分析试剂盒，具有如下优势：1)灵敏度高，PGI的灵敏度为0.9ng/mL，PGII的灵敏度为0.08ng/mL，血清(浆)样本不需要稀释；2)量程宽，PGI样品浓度值介于0.9-300ng/mL的都能准确检测；3)检测时间短，从样品孵育到检测，约25min完成；4)样品需求量少，一次上样只需50μL。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.基于PG磁微粒的双标记时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其特征在于，包括各自独立包装的反应缓冲液、浓缩清洗液、增强液、包被PGI单克隆抗体的磁微粒溶液、包被PGII单克隆抗体的磁微粒溶液、PG的校准品溶液、铕标记的PGII单克隆抗体溶液和钐标记的PGI单克隆抗体溶液。
2.根据权利要求1所述的基于PG磁微粒的双标记时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其特征在于，
所述铕标记的PGII单克隆抗体溶液以Eu3+-N2-[P-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸钠标记PGII单克隆抗体制备得到，所述PGII单克隆抗体与所述Eu3+-N2-[P-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸钠的质量比为5:1；
所述钐标记的PGI单克隆抗体溶液以Sm3+-N2-[P-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸钠标记PGI单克隆抗体制备得到，所述PGI单克隆抗体与所述Sm3+-N2-[P-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸钠的质量比为5:1；
所述包被PGI单克隆抗体的磁微粒溶液经直径为1-300纳米的活化的磁微粒与所述PGI单克隆抗体连接、洗涤、封闭、洗涤制备得到；
所述包被PGII单克隆抗体的磁微粒溶液经直径为1-300纳米的活化的磁微粒与所述PGII单克隆抗体连接、洗涤、封闭、洗涤制备得到。
3.根据权利要求2所述的基于PG磁微粒的双标记时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其特征在于，
所述的浓缩清洗液为含12.1lg/L的Tris，312.43g/L的NaCl，27.74g/L的Tween-20，1g/L的TritonX-100，以盐酸调节pH为7.8的缓冲溶液；
所述的增强液为含体积浓度为3.6‰的冰醋酸，0.5g/L的醋酸钠，0.05g/L的β-萘甲酰三氟丙酮，0.03g/L的三辛基氧化膦和体积浓度为1‰的TritonX-100的混合溶液；
所述的反应缓冲液的制备为6.06g三羟甲基氨基甲烷和8.8gNaCl溶于去离子水中，用盐酸调节pH值为7.8，然后加入60g的质量浓度为≥98％的BSA、1g的NaN3；
所述PG的校准品溶液为用含2g/L的BSA和1g/L的NaN3的50mmol/L的pH7.8Tris-HCl,反应缓冲液将所述PG抗原配制成含所述PGI抗原浓度为0ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、300ng/mL以及所述PGII抗原浓度为0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、25ng/mL、40ng/mL的浓度系列的混合校准品溶液。
4.根据权利要求1-3任一项所述的基于PG磁微粒的双标记时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其特征在于，每支所述试剂盒的配方为：
所述的浓缩清洗液，40mL；
所述的增强液，30mL；
所述的反应缓冲液，50mL；
所述铕标记的PGII单克隆抗体溶液，0.01-0.1mg/mL,2mL；
所述钐标记的PGI单克隆抗体溶液，0.01-0.1mg/mL,2mL；
6×所述PG的校准品溶液，每瓶1mL；
所述包被PGI单克隆抗体的磁微粒溶液，0.05-0.1mg/mL，2mL；
所述包被PGII单克隆抗体的磁微粒溶液，0.05-0.1mg/mL，2mL。
5.一种制备权利要求1-4任一项所述的基于PG磁微粒的双标记时间分辨荧光免疫分析试剂盒的方法，其特征在于，包括如下制备方法中的任意一种或几种：
所述PG的校准品溶液的制备：取浓度为1mg/mL的PGI抗原溶液和1mg/mL的PGII抗原溶液用含2g/L的BSA和1g/L的NaN3的50mmol/L的pH为7.8的Tris-Hcl反应缓冲液配制成含所述PGI抗原浓度为0ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、300ng/mL以及所述PGII抗原浓度为0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、25ng/mL、40ng/mL的浓度系列的混合校准品溶液，进行分装，冻干，4℃保存；或
所述的包被PGI单克隆抗体的磁微粒溶液的制备：取直径为1-300nm的四氧化三铁微球用质量浓度为5-10％的戊二醛活化，室温混匀4小时后，用0.05mol/L的pH为7.2的PBS缓冲液清洗1-3次，然后用上述缓冲溶液进行悬浮，制成浓度为100mg/mL的磁微粒悬浮液；取100μL所述磁微粒悬浮液，然后加入1mL的0.05mol/L的pH为7.2的PBS缓冲液和50μg的PGI单克隆抗体，于25℃混匀温育2小时，然后进行磁性分离，保留磁微粒，用0.05mol/L的pH为7.2的PBS缓冲液清洗1-3次，用1mL的含质量浓度为5％BSA的0.0lmol/L的pH为7.2的PBS缓冲液于25℃下封闭30分钟，用0.05mol/L的pH为7.2的PBS缓冲液清洗1-3次，用含有质量浓度为0.5％BSA和质量浓度为0.1％的NaN3的0.05mol/L的pH为7.2的Tris-HCl缓冲液重悬，分装，置于2-8℃下保存；或
所述的包被PGII单克隆抗体的磁微粒溶液的制备：取直径为1-300nm的四氧化三铁微球用浓度为5-10％的戊二醛活化，室温混匀4小时后，用0.05mol/L的pH为7.2的PBS缓冲液清洗1-3次，然后用上述缓冲溶液进行悬浮，制成浓度为100mg/mL的磁微粒悬浮液；取100μL所述磁微粒悬浮液，然后加入1mL的0.05mol/L的pH为7.2的PBS缓冲液和50μg的PGII单克隆抗体，于25℃混匀温育2小时，然后进行磁性分离，保留磁微粒，用0.05mol/L的pH为7.2的PBS缓冲液清洗1-3次，用1mL的含质量浓度为5％BSA的0.0lmol/L的pH为7.2的PBS缓冲液于25℃下封闭30分钟，用0.05mol/L的pH为7.2的PBS缓冲液清洗1-3次，用含有质量浓度为0.5％BSA和质量浓度为0.1％NaN3的0.05mol/L的pH为7.2的Tris-HCl缓冲液重悬，分装，置于2-8℃下保存，即得；或
所述的钐标记的PGI单克隆抗体溶液的制备:取PGI抗体1mL，经PD-10柱转换缓冲条件，洗脱液为含0.155mol/LNaCl的50mmol/L的pH为8.5的Na2CO3-NaHCO3缓冲液，收集蛋白峰，获得浓缩至2g/L的PGI单克隆抗体溶液，取所述PGI单克隆抗体溶液500μL加入0.2mg的所述异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸钐钠中，25℃磁力搅拌反应20小时，然后将反应液转移到预先用pH为7.8的浓度为80mmol/L的Tris缓冲液平衡的SepharoseCL-6B柱上进行层析，收集蛋白峰，稀释，进行分装，真空冷冻干燥，置于-20℃保存；或
所述的铕标记的PGII单克隆抗体溶液的制备：取PGII抗体1mL，经PD-10柱转换缓冲条件，洗脱液为含0.155mol/LNaCl的50mmol/L的pH为8.5的Na2CO3-NaHCO3缓冲液，收集蛋白峰，获得浓缩至2g/L的PGII单克隆抗体溶液，取所述PGII单克隆抗体溶液500μL加入0.2mg的异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸铕钠，25℃磁力搅拌反应20小时，将反应液转移到预先用pH为7.8的浓度为80mmol/L的Tris缓冲液平衡的SepharoseCL-6B柱上进行层析，收集蛋白峰，稀释，进行分装，真空冷冻干燥，置于-20℃保存；或
所述增强液的制备：取3.6mL冰醋酸、0.5g醋酸钠、0.05gβ-萘甲酰三氟丙酮、0.03g三辛基氧化膦和1mL的TritonX-100，混匀，加去离子水定容至1000mL，分装，置于2-8℃下保存，即得；或
所述反应缓冲液的制备：取6.06g三羟甲基氨基甲烷和8.8gNaCl溶于去离子水中，用盐酸调节PH值为7.8，然后加入60g的质量浓度为≥98％BSA、1g的NaN3，随后加去离子水定容至1L，分装，置于2-8℃下保存，即得；或
所述浓缩清洗液的配制：取12.1lg的Tris，312.43g的NaCl，27.74g的Tween-20和1g的TritonX-100加入去离子水中，完全溶解后，用盐酸调pH至7.8，然后加去离子水定容至1L，分装，置于2-8℃下保存，即得。
6.一种利用权利要求1-4任一项所述的基于PG磁微粒的双标记时间分辨荧光免疫分析试剂盒的同时检测PGI和PGII的方法，其特征在于，包括如下步骤，
S1、分别取所述PG的校准品溶液和待测样品，与所述包被PGI单克隆抗体的磁微粒溶液、包被PGII单克隆抗体的磁微粒溶液以及反应缓冲液混合，然后进行孵育，备用；
S2、将S1步骤中的孵育后的溶液进行磁性分离，然后吸弃上清液，然后加入所述浓缩清洗液进行清洗，混匀后，将所述溶液进行磁性分离，然后吸弃上清液，重复上述清洗步骤；
S3、将以所述反应缓冲液稀释的钐标记的PGI单克隆抗体溶液和铕标记的PGII单克隆抗体溶液加入步骤S2中的清洗后的溶液中，进行振荡孵育，然后用所述浓缩清洗液进行清洗，混匀后，进行磁性分离，然后吸弃上清液，重复上述清洗步骤，然后加入所述增强液，振荡反应；
S4、采用时间分辨荧光免疫分析仪分别测定S3步骤中的增强后的溶液中铕和钐的荧光值，分别获得所述PG的校准品溶液和待测样品的荧光值，然后分别根据所述PG的校准品溶液中所述PGI抗原的浓度和所述PGII抗原的浓度和其各自对应的荧光值绘制标准曲线，然后将所述待测样品的对应荧光值代入对应的所述PGI标准曲线或PGII标准曲线中，计算得到所述待测样品中PGI和PGII的含量。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，包括如下步骤，
S1、分别取所述PG的校准品溶液和待测样品48-52μL，与所述包被PGI单克隆抗体的磁微粒溶液4-6μL、包被PGII单克隆抗体的磁微粒溶液4-6μL以及反应缓冲液140-160μL混合，加到透明微孔板的微孔或Ep管中，于23-27℃振荡孵育4-6分钟；
S2、将S1步骤中的所述透明微孔板或Ep管中的溶液进行磁性分离25-35秒，然后吸弃上清液，每个微孔或Ep管中加入290-310μL按1:48-52比例稀释的所述浓缩清洗液进行清洗，混匀后，将所述透明微孔板或Ep管中的溶液进行磁性分离18-22秒，然后吸弃上清液，重复上述清洗步骤5-6次；
S3、将以所述反应缓冲液按1：48-52比例稀释的钐标记的PGI单克隆抗90-110μL和铕标记的PGII单克隆抗体溶液90-110μL加入步骤S2中的所述透明微孔板或Ep管中，23-27℃振荡孵育4-6分钟，然后向每个微孔或Ep管中加入290-310μL按1:48-52比例稀释的所述浓缩清洗液进行清洗，混匀后，将所述透明微孔板或Ep管中的溶液进行磁性分离18-22秒，然后吸弃上清液，重复上述清洗步骤5-6次，然后向所述透明微孔板中微孔或Ep管中加入190-210μL所述增强液，于23-27℃振荡反应2.5-3.5min；
S4、采用时间分辨荧光免疫分析仪分别测定S3步骤中的增强后的溶液中铕和钐的荧光值，分别获得所述PG的校准品溶液和待测样品的荧光值，然后分别根据所述PG的校准品溶液中所述PGI抗原的浓度和所述PGII抗原的浓度和其各自对应的荧光值绘制标准曲线，然后将所述待测样品的对应荧光值代入对应的所述PGI标准曲线或PGII标准曲线中，计算得到所述待测样品中PGI和PGII的含量。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，包括如下步骤，
S1、分别取所述PG的校准品溶液和待测样品50μL，与所述包被PGI单克隆抗体的磁微粒溶液5μL、包被PGII单克隆抗体的磁微粒溶液5μL以及反应缓冲液150μL混合，加到透明微孔板的微孔或Ep管中，于25℃振荡孵育5分钟；
S2、将S1步骤中的所述透明微孔板或Ep管中的溶液进行磁性分离30秒，然后吸弃上清液，每个微孔或Ep管中加入300μL按1:50比例稀释的所述浓缩清洗液进行清洗，混匀后，将所述透明微孔板或Ep管进行磁性分离20秒，然后吸弃上清液，重复上述清洗步骤5-6次；
S3、将以反应缓冲液按1：50比例稀释的钐标记的PGI单克隆抗100μL和铕标记的PGII单克隆抗体溶液100μL加入步骤S2步骤中的所述透明微孔板或Ep管中，25℃振荡孵育5分钟，然后向每个微孔或Ep管中加入300μL按1:50比例稀释的所述浓缩清洗液进行清洗，混匀后，将所述透明微孔板或Ep管中溶液进行磁性分离20秒，然后吸弃上清液，重复上述清洗步骤5-6次，然后向所述透明微孔板中微孔或Ep管中加入200μL所述增强液，于25℃振荡反应3min；
S4、采用时间分辨荧光免疫分析仪分别测定S3步骤中的增强后的溶液中铕和钐的荧光值，分别获得所述PG的校准品溶液和待测样品的荧光值，然后分别根据所述PG的校准品溶液中所述PGI抗原的浓度和所述PGII抗原的浓度和其各自对应的荧光值绘制标准曲线，然后将所述待测样品的对应荧光值代入对应的所述PGI标准曲线或PGII标准曲线中，计算得到所述待测样品中PGI和PGII的含量。
9.根据权利要求6-8任一项所述的方法，其特征在于，所述S1步骤中，所述待测样品还包括预处理步骤，取待测样品于3000rpm离心5分钟，然后取上层液即为用于检测的所述待测样品。
10.权利要求1-4任一项所述的试剂盒或权利要求6-9任一项所述的方法在检测PGI和/或PGII中的用途。
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Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107462726A (zh) * 2017-07-28 2017-12-12 佛山市烨泰科技有限公司 一种基于双单抗夹心的磁酶免疫双重定量elisa检测方法
CN109632758A (zh) * 2019-01-25 2019-04-16 黄飚 一种时间分辨荧光免疫分析内质控的方法
CN110836973A (zh) * 2019-09-09 2020-02-25 浙江博实生物科技有限公司 检测肌钙蛋白及复合物的双标记试剂盒及制备与检测方法
CN111122859A (zh) * 2019-11-14 2020-05-08 南方医科大学 基于免疫磁珠的双标记抗hiv及hcv时间分辨荧光免疫分析方法
CN111948390A (zh) * 2020-08-31 2020-11-17 浙江盛域医疗技术有限公司 检测t-PAI-C的时间分辨荧光免疫分析试剂盒及应用
CN111948407A (zh) * 2020-08-31 2020-11-17 浙江盛域医疗技术有限公司 检测pic的时间分辨荧光免疫分析试剂盒及应用
CN111948406A (zh) * 2020-08-31 2020-11-17 浙江盛域医疗技术有限公司 检测凝血酶-抗凝血酶复合物的时间分辨荧光免疫分析试剂盒及应用
CN112147328A (zh) * 2020-08-31 2020-12-29 浙江博实生物科技有限公司 一种基于胃蛋白酶原pgⅰ的免疫分析试剂盒及其制备方法和检测方法
CN112147338A (zh) * 2020-08-31 2020-12-29 浙江博实生物科技有限公司 一种检测免疫球蛋白g4时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其制备方法和检测方法
CN112147341A (zh) * 2020-08-31 2020-12-29 浙江博实生物科技有限公司 一种检测胃泌素g-17时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其制备方法和检测方法
CN112147339A (zh) * 2020-08-31 2020-12-29 浙江博实生物科技有限公司 一种检测M型磷脂酶A2受体-IgG的免疫分析试剂盒及其制备方法和检测方法
CN112147333A (zh) * 2020-08-31 2020-12-29 浙江博实生物科技有限公司 一种基于胃蛋白酶原pgⅱ的免疫分析试剂盒及其制备方法和检测方法
CN112180104A (zh) * 2020-08-31 2021-01-05 浙江博实生物科技有限公司 一种基于抗缪勒氏管激素amh时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其制备方法和检测方法
CN116254103A (zh) * 2021-12-01 2023-06-13 上海凯创生物技术有限公司 纳米荧光标记微球、pgⅰ/pgⅱ单克隆抗体探针以及pgⅰ/pgⅱ检测试剂盒

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1329300A (zh) * 2000-06-21 2002-01-02 国际商业机器公司 管理语音缓存的方法
CN102165071A (zh) * 2008-02-21 2011-08-24 Otc生物技术有限公司 制备均质塑料-粘附适体-磁珠-荧光团和其他夹心分析物的方法
CN102507947A (zh) * 2011-11-11 2012-06-20 南方医科大学 一种基于免疫磁珠的cea时间分辨荧光免疫分析试剂盒
CN102608335A (zh) * 2012-04-19 2012-07-25 协和生物制药（天津）有限公司 NT-proBNP时间分辨荧光免疫分析试剂盒的制备方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1329300A (zh) * 2000-06-21 2002-01-02 国际商业机器公司 管理语音缓存的方法
CN102165071A (zh) * 2008-02-21 2011-08-24 Otc生物技术有限公司 制备均质塑料-粘附适体-磁珠-荧光团和其他夹心分析物的方法
CN102507947A (zh) * 2011-11-11 2012-06-20 南方医科大学 一种基于免疫磁珠的cea时间分辨荧光免疫分析试剂盒
CN102608335A (zh) * 2012-04-19 2012-07-25 协和生物制药（天津）有限公司 NT-proBNP时间分辨荧光免疫分析试剂盒的制备方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZHI-QI REN ET AL: "Establishment of Magnetic Microparticles-Assisted Time-Resolved Fluoroimmunoassay for Determinating Biomarker Models in Human Serum", 《PLOS ONE》 *
张珏 等: "胃蛋白酶原双标记时间分辨荧光免疫分析及其初步临床应用", 《生物化学与生物物理进展》 *
朱利国 等: "基于磁性微球 AFP 时间分辨荧光免疫分析法的建立", 《标记免疫分析与临床》 *

Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107462726A (zh) * 2017-07-28 2017-12-12 佛山市烨泰科技有限公司 一种基于双单抗夹心的磁酶免疫双重定量elisa检测方法
CN109632758A (zh) * 2019-01-25 2019-04-16 黄飚 一种时间分辨荧光免疫分析内质控的方法
CN110836973A (zh) * 2019-09-09 2020-02-25 浙江博实生物科技有限公司 检测肌钙蛋白及复合物的双标记试剂盒及制备与检测方法
CN111122859A (zh) * 2019-11-14 2020-05-08 南方医科大学 基于免疫磁珠的双标记抗hiv及hcv时间分辨荧光免疫分析方法
CN111948390A (zh) * 2020-08-31 2020-11-17 浙江盛域医疗技术有限公司 检测t-PAI-C的时间分辨荧光免疫分析试剂盒及应用
CN111948407A (zh) * 2020-08-31 2020-11-17 浙江盛域医疗技术有限公司 检测pic的时间分辨荧光免疫分析试剂盒及应用
CN111948406A (zh) * 2020-08-31 2020-11-17 浙江盛域医疗技术有限公司 检测凝血酶-抗凝血酶复合物的时间分辨荧光免疫分析试剂盒及应用
CN112147328A (zh) * 2020-08-31 2020-12-29 浙江博实生物科技有限公司 一种基于胃蛋白酶原pgⅰ的免疫分析试剂盒及其制备方法和检测方法
CN112147338A (zh) * 2020-08-31 2020-12-29 浙江博实生物科技有限公司 一种检测免疫球蛋白g4时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其制备方法和检测方法
CN112147341A (zh) * 2020-08-31 2020-12-29 浙江博实生物科技有限公司 一种检测胃泌素g-17时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其制备方法和检测方法
CN112147339A (zh) * 2020-08-31 2020-12-29 浙江博实生物科技有限公司 一种检测M型磷脂酶A2受体-IgG的免疫分析试剂盒及其制备方法和检测方法
CN112147333A (zh) * 2020-08-31 2020-12-29 浙江博实生物科技有限公司 一种基于胃蛋白酶原pgⅱ的免疫分析试剂盒及其制备方法和检测方法
CN112180104A (zh) * 2020-08-31 2021-01-05 浙江博实生物科技有限公司 一种基于抗缪勒氏管激素amh时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其制备方法和检测方法
CN116254103A (zh) * 2021-12-01 2023-06-13 上海凯创生物技术有限公司 纳米荧光标记微球、pgⅰ/pgⅱ单克隆抗体探针以及pgⅰ/pgⅱ检测试剂盒
CN116254103B (zh) * 2021-12-01 2024-05-24 上海凯创生物技术有限公司 纳米荧光标记微球、pgⅰ/pgⅱ单克隆抗体探针以及pgⅰ/pgⅱ检测试剂盒

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