CN105779568B - 一种体外获能后***质量评估的试剂盒及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种体外获能后***质量评估的试剂盒及其使用方法。所述的试剂盒包括检测缓冲液1、BWW培养液、体外获能液、荧光试剂、唾液酸酶标准原液和检测缓冲液2；所述的检测缓冲液1为磷酸缓冲液或者BWW培养液；所述的检测缓冲液2为含0.05 mmol/l乙酸钠和0.25μg/μl牛血清白蛋白的磷酸缓冲液。通过***体外获能后获能液中唾液酸酶活性的检测，为临床原因不明的男性不育患者提供诊断依据及临床咨询。

Description

一种体外获能后***质量评估的试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明属于医疗检测技术领域，具体涉及一种体外获能后***质量评估的试剂盒及其使用方法。
背景技术
随着社会工业的不断发展，不育夫妇的总发病率明显升高。2004年欧洲生殖学会统计：育龄夫妇1年内不能怀孕者占25%，其中15%寻求治疗，男方因素引起不育占50%。男性不育的病因有性功能障碍(1.7% )，***(12. 3% )，生殖道感染(6.6%)，先天性发育异常(2.1%)后天获得性疾病(2.6% )，内分泌紊乱(0.6%)，免疫性因素(3.1%)，其他异常(3%)，但是高达60%~75%的患者找不到原因，称为特发性男性不育，他们只表现为少精、弱精或畸形***症等***质量异常。不明原因的男性不育可能由于多种因素造成，如长期应激环境因素引起内分泌紊乱、活性氧和基因缺陷等。
多年来，传统的***常规分析一直是用于判断男性生育力的最基本临床指标。临床上对绝大部分的男性不育患者的真正不育原因仍然不清楚。尤其是临床上大约有三分之一不育患者，男性的常规***分析结果均正常和接近正常。临床上把这类患者划为不明原因不育症。因此，长期以来，临床对男性不育的诊断存在很大的困难。最主要的原因是常规***分析只测定***的数量，存活力，活动率和形态。这些指标只能反映最基本的***质量，不能反映所有的***功能，比如，***核的成熟和DNA损伤，***与人卵透明带结合反应与穿透，顶体状况和反应及与卵黄膜结合能力等。因此，需要建立特殊的***功能试验才能测定以上这些功能。***获能是精卵结合形成受精卵的必要条件，虽然***获能的相关研究已有一些进展, 但仍然存在很多尚未阐明的问题。
临床工作中，一部分原发或继发的不育男性病人利用现有的常规***质量检查项目提示***及***质量无异常。目前常用的***检测手段为CASA(计算机辅助***分析Computer aided of semen analysis)，以及抗***抗体等。当今最为广泛使用的CASA技术和一些形态学的相关检测，主要能评价***的活动能力和活***比率，从而推测其进入女性生殖道的受精能力，而依赖目前的***功能评价体系，对***质量及功能的评价存在一定的缺陷，以及难于给病人提供相应的临床咨询。事实上，这仅仅是评价***功能的一个方面，我们应该考虑到可能还有影响***生殖能力的更多没有被揭示的因素。
在先专利201310431847.0，提出了一种影响***功能的唾液酸酶检测方法。第一步，通过单***荧光强度分析直观的量化唾液酸酶在***中的表达，或者利用显微镜下荧光成像直观的观察唾液酸酶在***中的表达；若唾液酸酶在***中高表达，则进行第二步，利用体外获能液使***影响***功能的唾液酸酶检测方法获能，并用荧光法检测唾液酸酶活性。该专利虽然公开了唾液酸酶蛋白分子在***中的表达和基本活性的检测。但方法中包含有***唾液酸酶NEU1/3的表达检测，需要荧光显微镜或流式细胞仪，存在以下缺点：1）技术流程复杂；2）对实验设备和操作人员技能和经验要求高；3）不适于应用于临床实验室和常规技术人员使用；4）使用abcam公司的试剂盒，价格昂贵。另外，由于不同样本的***数量不同，表达的蛋白值不同，相应的酶活值也不同，因此，单纯比较不同样本的酶活值并不科学。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供了一种体外获能后***质量评估的试剂盒及其使用方法。通过***体外获能后获能液中唾液酸酶活性的检测，评估获能后的***质量，为临床原因不明的男性不育患者提供诊断依据及临床咨询。
为了实现上述发明目的，本发明采用如下的技术方案：
一种体外获能后***质量评估的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括检测缓冲液1、BWW培养液、体外获能液、荧光试剂、唾液酸酶标准原液和检测缓冲液2。
所述的检测缓冲液1为PBS（磷酸缓冲液）或者BWW培养液。
所述的检测缓冲液2为含0.05 mmoL/L乙酸钠和0.25μg/μl牛血清白蛋白的PBS。检测缓冲液2的缓冲体系，是针对唾液酸酶活性检测特定配制的。
优选地，所述乙酸钠的pH值为5-6，是针对唾液酶活性最佳的工作环境。
所述的体外获能液为含HSA (人血清白蛋白) 5mg/ml的HTF（人输卵管液）。
所述的唾液酸酶标准原液为产气荚膜梭菌唾液酸酶（AUS），浓度为5U/ml，能方便的稀释为5/2.5/1.25/0.625/0.312/0 mU/ml这些浓度梯度。采用产气荚膜梭菌唾液酸酶适用于本发明少量***的检测方法。
所述的荧光试剂是2′-4-甲基伞形酮基-α-D-N-乙酰神经氨酸钠，具有较高的灵敏度。
所述2′-4-甲基伞形酮基-α-D-N-乙酰神经氨酸钠的具体结构如下：
优选地，所述荧光试剂的浓度为10mM，提供荧光试剂的浓缩液，可保证其稳定性，不易分解和淬灭，另可减少体积，便于装盒。
本发明所述体外获能后***质量评估的试剂盒的使用方法：具体步骤如下：
A、***的洗涤
收集新鲜液化***标本，检测缓冲液1洗涤***，充分除去残留的***成分，再离心分离出***。
本发明先向***标本中加入检测缓冲液1进行洗涤，再离心分离得到***沉淀。这是由于***本身黏稠，直接对其离心不能使***中所有***充分沉淀，加入检测缓冲液1对其进行稀释后，离心操作效果更好。
优选地，对***进行3次离心，保证检测没有***干扰的情况下，尽可能减少离心***的次数，保证***活力。
B、 ***的体外获能
向A步骤分离出的***中加入BWW培养液，采用上游法，在5%的CO2细胞培养箱中培养，收获上游***，计数***数量，用体外获能液在5%的CO2细胞培养箱中孵育***3~4 h；离心分离，收取的上清液再次离心分离，收取上清液作为待测样本。在上游法获得活力较好的***后，马上对其进行获能处理，实验结果更科学客观。
优选地，控制上游***数量在1X107以上，根据检测灵敏度的需要而设定。
C. ***获能液中唾液酸酶活性的测定
（1）用检测缓冲液2将唾液酸酶标准原液按5/2.5/1.25/0.625/0.312/0 mU/ml的浓度梯度将其稀释为唾液酸酶标准溶液，向检测板内依次加入各唾液酸酶标准溶液和待测样本。
标准溶液的梯度是根据获能后***唾液酸酶释放到获能液中的量和本发明方法所能检测到的灵敏度而设定的。
优选地，所述的检测板为96孔黑板。本发明采用荧光法来测定唾液酸酶的活性，黑色的检测板对灵敏度和特异性是最佳的，可以保护荧光染料不被光线淬灭，从而使检测的灵敏度大大提高。
（2）用检测缓冲液2稀释荧光试剂，将其加入上述各唾液酸酶标准溶液和待测样本的孔内，再将检测板置于37℃，避光孵育1-2小时后，用酶标仪读取各孔荧光强度，根据唾液酸酶活性标准曲线计算出待测样本的唾液酸酶活性，最后得出唾液酸酶活性/***数目的值即可。
优选地，用检测缓冲液2稀释至荧光试剂的浓度为0.05mM，为最佳的工作浓度。
优选地，酶标仪在激发波长和发射波长分别为365nm和450nm的波长下读取各孔荧光强度。365nm为最佳激发波长，450nm为最佳发射波长。
优选地，用于检测的孔内样本唾液酸酶活性应在0.3-5mU/ml范围内，如果超出则应将孔内待测样本的唾液酸酶活性值调整在此线性范围之内。
本发明的有益效果在于：
1、本发明试剂盒中的试剂均选择常规试验试剂，并结合对***检测的特殊性，降低了实验成本，所需的仪器设备、耗材种类少，仅为离心机、酶标仪、EP管、枪头和检测板等，均为常规实验室配置；并且操作方法简单，仅为离心、加样等，不存在需多次练习才能获得操作技巧的情况，可广泛应用于临床实验室和常规技术人员使用。
2、本发明的试剂盒用于评估获能后***的质量，根据单位***数量内唾液酸酶的活性值，作出人群表达唾液酸酶活性的临界值，可在临床上通过单位酶活值更深层次了解***功能，可应用于生殖辅助如试管婴儿等技术。
3、由于不同样本的***数量不同，表达的蛋白值不同，相应的酶活值也不同，这样一来，单纯比较不同样本的酶活值并不科学，因为假使一个样本的***数目很少，但***质量很高，而另一样本的***数目很多，但***质量较低，如果单纯比较酶活值，则前者很可能输给后者，但实际情况是，前者质量要高于后者。因此，本发明的检测的是唾液酸酶活性/***数目的单位酶活值，检测结果更加客观、准确可靠。
4、本发明对***进行充分的洗涤，充分除去残留的***成分，使***中残留的蛋白及唾液酸酶不会影响检测结果的准确性；优化了测***蛋白浓度时设置的标准品蛋白浓度梯度和测酶活时设置的标准品酶活梯度，如果梯度设置不合理，均会很影响结果的灵敏度和准确性；使用黑色检测板测酶活，可明显降低光线对荧光试剂淬灭的负面影响，由此大大提高实验结果的稳定性、灵敏度和准确性；最终的检测结果设计为唾液酸酶活/***数目的值，这样可降低不同样本之间的差异，使彼此更具有可比性，保证检测结果的稳定性和可靠性。
附图说明
图1为本发明试剂盒分别测定未获能***和获能***（A为小鼠，B为人）的唾液酸酶活性。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的实质性内容作进一步详细的描述。
实施例1
一种体外获能后***质量评估的试剂盒，所述的试剂盒包括检测缓冲液1、BWW培养液、体外获能液、荧光试剂、唾液酸酶标准原液和检测缓冲液2；所述的检测缓冲液1为磷酸缓冲液；所述的检测缓冲液2为含0.05 mmol/l 乙酸钠和0.25μg/μl牛血清白蛋白的磷酸缓冲液。
本发明试剂盒分别测定未获能***和获能***（A为小鼠，B为人）的唾液酸酶活性，结果显示获能后***可释放唾液酸酶至获能液中。
实施例2
一种体外获能后***质量评估的试剂盒，所述的试剂盒包括检测缓冲液1、BWW培养液、体外获能液、荧光试剂、唾液酸酶标准原液和检测缓冲液2；所述的检测缓冲液1为BWW培养液；所述的检测缓冲液2为含0.05 mmol/l 乙酸钠和0.25μg/μl牛血清白蛋白的磷酸缓冲液。
所述的体外获能液为含HSA 5mg/ml的HTF。
实施例3
一种体外获能后***质量评估的试剂盒，所述的试剂盒包括检测缓冲液1、BWW培养液、体外获能液、荧光试剂、唾液酸酶标准原液和检测缓冲液2；所述的检测缓冲液1为磷酸缓冲液；所述的检测缓冲液2为含0.05 mmol/l 乙酸钠和0.25μg/μl牛血清白蛋白的磷酸缓冲液。
所述的体外获能液为含HSA 5mg/ml的HTF。
所述的唾液酸酶标准原液为产气荚膜梭菌唾液酸酶，浓度为5U/ml。
实施例4
一种体外获能后***质量评估的试剂盒，所述的试剂盒包括检测缓冲液1、BWW培养液、体外获能液、荧光试剂、唾液酸酶标准原液和检测缓冲液2；所述的检测缓冲液1为磷酸缓冲液；所述的检测缓冲液2为含0.05 mmol/l 乙酸钠和0.25μg/μl牛血清白蛋白的磷酸缓冲液。
所述的体外获能液为含HSA 5mg/ml的HTF。
所述的唾液酸酶标准原液为产气荚膜梭菌唾液酸酶，浓度为5U/ml。
所述的荧光试剂是2′-4-甲基伞形酮基-α-D-N-乙酰神经氨酸钠。
所述乙酸钠的pH值为5.5。
实施例5
一种体外获能后***质量评估的试剂盒，所述的试剂盒包括检测缓冲液1、BWW培养液、体外获能液、荧光试剂、唾液酸酶标准原液和检测缓冲液2；所述的检测缓冲液1为磷酸缓冲液；所述的检测缓冲液2为含0.05 mmol/l 乙酸钠和0.25μg/μl牛血清白蛋白的磷酸缓冲液。
所述的体外获能液为含HSA 5mg/ml的HTF。
所述的唾液酸酶标准原液为产气荚膜梭菌唾液酸酶，浓度为5U/ml。
所述的荧光试剂是2′-4-甲基伞形酮基-α-D-N-乙酰神经氨酸钠。
所述荧光试剂的浓度为10mM。
所述乙酸钠的pH值为5。
实施例6
一种体外获能后***质量评估的试剂盒，所述的试剂盒包括检测缓冲液1、BWW培养液、体外获能液、荧光试剂、唾液酸酶标准原液和检测缓冲液2；所述的检测缓冲液1为磷酸缓冲液；所述的检测缓冲液2为含0.05 mmol/l 乙酸钠和0.25μg/μl牛血清白蛋白的磷酸缓冲液。
所述的体外获能液为含HSA 5mg/ml的HTF。
所述的唾液酸酶标准原液为产气荚膜梭菌唾液酸酶，浓度为5U/ml。
所述的荧光试剂是2′-4-甲基伞形酮基-α-D-N-乙酰神经氨酸钠。
所述荧光试剂的浓度为10mM。
所述乙酸钠的pH值为6。
实施例7
本发明所述的体外获能后***质量评估的试剂盒的使用方法，具体步骤如下：
A、***的洗涤
收集新鲜液化***标本，检测缓冲液1洗涤***，充分除去残留的***成分，再离心分离出***；
B、***的体外获能
向A步骤分离出的***中加入BWW培养液，采用上游法，在5%的CO2细胞培养箱中培养，收获上游***，计数***数量，用体外获能液在5%的CO2细胞培养箱中孵育***3~4 h；离心分离，收取的上清液再次离心分离，收取上清液作为待测样本；
C、***获能液中唾液酸酶活性的测定
（1）用检测缓冲液2将唾液酸酶标准原液按5/2.5/1.25/0.625/0.312/0 mU/ml的浓度梯度将其稀释为唾液酸酶标准溶液，向检测板内依次加入各唾液酸酶标准溶液和待测样本。
（2）用检测缓冲液2稀释荧光试剂，将其加入上述各唾液酸酶标准溶液和待测样本的孔内，再将检测板置于37℃，避光孵育1-2小时后，用酶标仪读取各孔荧光强度，根据唾液酸酶活性标准曲线计算出待测样本的唾液酸酶活性，最后得出唾液酸酶活性/***数目的值。
实施例8
本发明所述的体外获能后***质量评估的试剂盒的使用方法，具体步骤如下：
A、***的洗涤
收集新鲜液化***标本，检测缓冲液1洗涤***，充分除去残留的***成分，再离心分离出***；
B、***的体外获能
向A步骤分离出的***中加入BWW培养液，采用上游法，在5%的CO2细胞培养箱中培养，收获上游***，计数***数量，用体外获能液在5%的CO2细胞培养箱中孵育***3~4 h；离心分离，收取的上清液再次离心分离，收取上清液作为待测样本；
C、***获能液中唾液酸酶活性的测定
（1）用检测缓冲液2将唾液酸酶标准原液按5/2.5/1.25/0.625/0.312/0 mU/ml的浓度梯度将其稀释为唾液酸酶标准溶液，向检测板内依次加入各唾液酸酶标准溶液和待测样本。
（2）用检测缓冲液2稀释荧光试剂，将其加入上述各唾液酸酶标准溶液和待测样本的孔内，再将检测板置于37℃，避光孵育1小时后，用酶标仪读取各孔荧光强度，根据唾液酸酶活性标准曲线计算出待测样本的唾液酸酶活性，最后得出唾液酸酶活性/***数目的值。
所述的检测板为96孔黑板。
实施例9
本发明所述的体外获能后***质量评估的试剂盒的使用方法，具体步骤如下：
A、***的洗涤
收集新鲜液化***标本，检测缓冲液1洗涤***，充分除去残留的***成分，再离心分离出***；
B、***的体外获能
向A步骤分离出的***中加入BWW培养液，采用上游法，在5%的CO2细胞培养箱中培养，收获上游***，计数***数量，用体外获能液在5%的CO2细胞培养箱中孵育***3~4 h；离心分离，收取的上清液再次离心分离，收取上清液作为待测样本；
C、***获能液中唾液酸酶活性的测定
（1）用检测缓冲液2将唾液酸酶标准原液按5/2.5/1.25/0.625/0.312/0 mU/ml的浓度梯度将其稀释为唾液酸酶标准溶液，向检测板内依次加入各唾液酸酶标准溶液和待测样本。
（2）用检测缓冲液2稀释至荧光试剂的浓度为0.05mM。，将其加入上述各唾液酸酶标准溶液和待测样本的孔内，再将检测板置于37℃，避光孵育2小时后，酶标仪在激发波长和发射波长分别为365nm和450nm的波长下读取各孔荧光强度。根据唾液酸酶活性标准曲线计算出待测样本的唾液酸酶活性，最后得出唾液酸酶活性/***数目的值。
所述的检测板为96孔黑板。
实施例10
本发明所述的体外获能后***质量评估的试剂盒的使用方法，具体步骤如下：
A、***的洗涤
收集新鲜液化***标本，检测缓冲液1洗涤***，充分除去残留的***成分，再离心分离出***；
B、***的体外获能
向A步骤分离出的***中加入BWW培养液，采用上游法，在5%的CO2细胞培养箱中培养，收获上游***，计数***数量，用体外获能液在5%的CO2细胞培养箱中孵育***3~4 h；离心分离，收取的上清液再次离心分离，收取上清液作为待测样本；
C、***获能液中唾液酸酶活性的测定
（1）用检测缓冲液2将唾液酸酶标准原液按5/2.5/1.25/0.625/0.312/0 mU/ml的浓度梯度将其稀释为唾液酸酶标准溶液，向检测板内依次加入各唾液酸酶标准溶液和待测样本。
（2）用检测缓冲液2稀释至荧光试剂的浓度为0.05mM，将其加入上述各唾液酸酶标准溶液和待测样本的孔内，再将检测板置于37℃，避光孵育1.5小时后，酶标仪在激发波长和发射波长分别为365nm和450nm的波长下读取各孔荧光强度。根据唾液酸酶活性标准曲线计算出待测样本的唾液酸酶活性，最后得出唾液酸酶活性/***数目的值。
所述的检测板为96孔黑板。
实施例11
耗材（均灭菌）：15mlEP管，1.5mlEP管，3种规格枪头（1ml/200μl/10μl），96孔透明板，96孔黑板
仪器：高速低温离心机，酶标仪
本发明所述的体外获能后***质量评估的试剂盒的使用方法，具体步骤如下：
A、 ***的洗涤
1. 收集新鲜液化***标本4-5ml（根据病人***数量调整，冰上保存与运输）.
2. 加入等体积PBS，吹打均匀。
3. 低速离心（1500g/5min），弃去上清液。
4.加入PBS至3-4ml，吹打均匀。
5. 低速离心（1500g5min），弃去上清液，将上清液剩至300μl左右，吹打均匀。
6. 加入PBS至1ml，高速离心（4度，12000rpm/5min），尽可能弃去上清液。
B、 ***的体外获能
1. 向***沉淀中加入BWW，上游法于37℃ 5%CO2细胞培养箱中培养30min，收获上游***，计数***数量（需1X107以上），低速离心（1500g/5min），得到***沉淀。
2. 加入体外获能液，于37℃ 5%CO2细胞培养箱中孵育4小时。
3. 低速离心（500g/5min），收取上清液。
4. 再低速离心（5000g/15min），收取上清液。
C. ***获能液中唾液酸酶活性的测定
1. 用检测缓冲液2将唾液酸酶标准原液按5/2.5/1.25/0.625/0.312/0 mU/ml的浓度梯度将其稀释为唾液酸酶标准溶液，向96孔检测板（黑色）内依次加入50μl各唾液酸酶标准溶液。
2. 用用检测缓冲液2稀释至荧光试剂的浓度为0.05mM，将其加入上述各孔内，50微升/孔。
3. 将96孔检测板（黑色）置于37℃，避光孵育1-2小时，然后用酶标仪在激发波长/发射波长为365/450nm波长下读取各孔荧光强度，根据唾液酸酶活性标准曲线计算出待测样本的唾液酸酶活性。
4. 最后将得到的唾液酸酶活性/***数目，计算得出单位酶活值(U AUS/104 sperm)。
用于检测的孔内样本唾液酸酶活性应在0.3-5mU/ml范围内，如果超出则应将孔内待测样本的唾液酸酶活性值调整在此线性范围之内。

Claims (9)

1.一种检测体外***获能液中唾液酸酶的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒由检测缓冲液1、BWW培养液、体外获能液、荧光试剂、唾液酸酶标准原液和检测缓冲液2组成；所述的检测缓冲液1为磷酸缓冲液或者BWW培养液；所述的检测缓冲液2为含0.05 mmol/l 乙酸钠和0.25μg/μl牛血清白蛋白的磷酸缓冲液；所述的体外获能液为含HSA 5mg/ml的HTF。
2.根据权利要求1所述的一种检测体外***获能液中唾液酸酶的试剂盒，其特征在于：所述的唾液酸酶标准原液为产气荚膜梭菌唾液酸酶，浓度为5U/ml。
3.根据权利要求1所述的一种检测体外***获能液中唾液酸酶的试剂盒，其特征在于：所述的荧光试剂是2′-4-甲基伞形酮基-α-D-N-乙酰神经氨酸钠。
4.根据权利要求3所述的一种检测体外***获能液中唾液酸酶的试剂盒，其特征在于：所述荧光试剂的浓度为10mM。
5.根据权利要求1所述的一种检测体外***获能液中唾液酸酶的试剂盒，其特征在于：所述乙酸钠的pH值为5-6。
6.根据权利要求1所述的一种检测体外***获能液中唾液酸酶的试剂盒的使用方法，其特征在于：具体步骤如下：
A、***的洗涤
收集新鲜液化***标本，检测缓冲液1洗涤***，充分除去残留的***成分，再离心分离出***；
B、***的体外获能
向A步骤分离出的***中加入BWW培养液，采用上游法，在5%的CO2细胞培养箱中培养，收获上游***，计数***数量，用体外获能液在5%的CO2细胞培养箱中孵育***3~4 h；离心分离，收取的上清液再次离心分离，收取上清液作为待测样本；
C、***获能液中唾液酸酶活性的测定
（1）用检测缓冲液2将唾液酸酶标准原液按5/2.5/1.25/0.625/0.312mU/ml的浓度梯度将其稀释为唾液酸酶标准溶液，向检测板内依次加入各唾液酸酶标准溶液和待测样本；
（2）用检测缓冲液2稀释荧光试剂，将其加入上述各唾液酸酶标准溶液和待测样本的孔内，再将检测板置于37℃，避光孵育1-2小时后，用酶标仪读取各孔荧光强度，根据唾液酸酶活性标准曲线计算出待测样本的唾液酸酶活性，最后得出唾液酸酶活性/***数目的值即可。
7.根据权利要求6所述的一种检测体外***获能液中唾液酸酶的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述的检测板为96孔黑板。
8.根据权利要求6所述的一种检测体外***获能液中唾液酸酶的试剂盒的使用方法，其特征在于：用检测缓冲液2稀释至荧光试剂的浓度为0.05mM。
9.根据权利要求6所述的一种检测体外***获能液中唾液酸酶的试剂盒的使用方法，其特征在于：酶标仪在激发波长和发射波长分别为365nm和450nm的波长下读取各孔荧光强度。
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