CN105779532A - 一种生产硫酸软骨素的方法 - Google Patents

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赵芳芳
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Abstract

本发明提供了一种生产硫酸软骨素的方法，将巨大芽孢杆菌以4‑6％接种量至种子培养基中，振荡培养得到种子液，将种子液以接种量为 4‑6％接入发酵培养基中，在摇床上进行培养发酵得到含硫酸软骨素的发酵液；将得到的硫酸软骨素发酵液提纯后得到硫酸软骨素。本发明方法步骤简单，条件温和，产量较高，发酵生产原料不受动物骨原料短缺的限制，发酵产品可用于药品原料和保健品原料。

Description

一种生产硫酸软骨素的方法
技术领域
本发明属于微生物发酵领域，涉及一种硫酸软骨素，具体来说是一种生产硫酸软骨素发酵液方法。
背景技术
硫酸软骨素 (Chondroitin Sulfate，CS) 是广泛分布于动物软骨组织中的一类酸性黏多糖。2010 年 Jolly 对许多微生物发酵进行分析，发现有多种微生物也能产生硫酸软骨素。例如巴斯德杆菌（Pasteurella multocida ），大肠杆菌（Escherichia coli），芽孢杆菌（Bacillus），等少数细菌中存在硫酸软骨素。硫酸软骨素分子结构为由 D- 葡萄糖醛酸和 N- 乙酰氨基半乳糖构成的重复二糖单位组成的多糖，硫酸软骨素一般含有50~70个二糖基本单位，相对分子质量在10 000~50 000之间。按酯化的硫酸基团位置不同，硫酸软骨素分为A、B、C、D、E、F等多种类型。临床上主要用于关节炎、肩关节痛、冠心病、心绞痛等辅助治疗，近年来，硫酸软骨素在医药制剂、医学材料、化妆品、保健品等领域更广泛得到应用，市场需求趋愈来愈大。我国生产和出口量逐年大幅增长，发展前景广阔。
目前，我国主要采用酶解法或碱提-酶解法工艺从动物骨头制备硫酸软骨素。极少有采用微生物发酵法生产硫酸软骨素的报道。而动物骨资源比较贫乏，急待开发新的生物资源及新的技术工艺来生产硫酸软骨素。
发明内容
针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种生产硫酸软骨素的方法，所述的这种生产硫酸软骨素的方法要解决现有技术从动物骨头中生产硫酸软骨素的方法中，骨头原料短缺难以扩大生产规模的技术问题。
本发明提供了一种生产硫酸软骨素的方法，包括如下步骤：
1)将巨大芽孢杆菌以接种量为 4-6％接种至种子培养基上进行震荡培养15-18h，得到种子培养液，种子培养条件为：转速120-160r/m，初始pH 值为 7.0-7.2，发酵温度为28-35℃；
2)将步骤1)得到种子液以接种量为 4-6％接种到装有发酵培养基的容器中，在摇床上培养30-35h；即可得到含硫酸软骨素发酵液，培养条件为：转速120-160r/m，初始pH 值为7.0-7.2，温度为30-35℃；
3)将得到的硫酸软骨素发酵液提纯后得到硫酸软骨素。
进一步的，所述的巨大芽孢杆菌为巨大芽孢杆菌 CICC 10487。
进一步的，所述种子培养基由蔗糖、蛋白胨、酵母粉、氯化钠、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钙、硫酸锰和水组成，每L培养基中，含有蔗糖15-20g，蛋白胨15-20g，酵母粉15-20g，氯化钠0.5-1.0g，硫酸镁0.5-1.0g，磷酸二氢钾1.5-2.5g，所述的氯化钙0.2-0.5g，硫酸锰0.1-0.5g，余量为水。
进一步的，所述发酵培养基由蔗糖、蛋白胨、酵母粉、氯化钠、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钙、硫酸锰和水组成，所述缓冲液由磷酸氢二钠，磷酸二氢钠组成；每L培养基中，含有蔗糖20-50g，蛋白胨10-15g，酵母粉10-15g，氯化钠0.5-2.0g，硫酸镁1.5-2.5g，磷酸二氢钾1.5-2.5g，氯化钙0.2-0.5g，硫酸锰0.05-0.15g，磷酸氢二钠1.0－4.0 g，磷酸二氢钠0.3－3.0g，余量为水。
具体的，采用乙醇沉淀法进行纯化处理得到硫酸软骨素。
通过本发明方法获得的硫酸软骨素多糖的产量约127mg/L。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明的方法步骤简单，条件温和，产量较高，发酵生产原料不受动物骨原料短缺的限制，发酵产品可用于药品原料和保健品原料。
具体实施方式
实施例1
本发明提供了一种生产硫酸软骨素的方法，包括如下步骤：
（1）将巨大芽孢杆菌 CICC 10487以接种量为 5％接种至种子培养基上进行震荡培养16h，得到种子培养液。种子培养条件为：转速120/m，初始pH 值为 7.0，发酵温度为30℃，所述种子培养基由蔗糖、蛋白胨、酵母粉、氯化钠、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钙、硫酸锰和水组成，每L培养基中，含有蔗糖15-20g，蛋白胨15-20g，酵母粉15-20g，氯化钠0.5-1.0g，硫酸镁0.5-1.0g，磷酸二氢钾1.5-2.5g，氯化钙0.2-0.5g，硫酸锰0.1-0.5g，余量为水。
（2）将(1)得到种子液以接种量为 5％接种到装有发酵培养基三角瓶中，在摇床上培养30h；即可得到硫酸软骨素发酵液。培养条件为：转速120r/m，初始pH 值为7.2，温度为32℃。所述发酵培养基由蔗糖、蛋白胨、酵母粉、氯化钠、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钙、硫酸锰和水组成，所述缓冲液由磷酸氢二钠，磷酸二氢钠组成。每L培养基中，含有蔗糖20-50g，蛋白胨10-15g，酵母粉10-15g，氯化钠0.5-2.0g，硫酸镁1.5-2.5g，磷酸二氢钾1.5-2.5g，氯化钙0.2-0.5g，硫酸锰0.05-0.15g，磷酸氢二钠1.0－4.0g，磷酸二氢钠0.3－3.0g，余量为水。
（3）生产的发酵液再经过本领域常用的乙醇沉淀法进行纯化处理即可得到硫酸软骨素，多糖的产量约112mg/L。
实施例2
本发明提供了一种生产硫酸软骨素的方法，包括如下步骤：
（1）将巨大芽孢杆菌CICC 10487以接种量为 4％接种至种子培养基上进行震荡培养18h，得到种子培养液。种子培养条件为：转速140r/m，初始pH 值为 7.1，发酵温度为28℃，所述种子培养基由蔗糖、蛋白胨、酵母粉、氯化钠、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钙、硫酸锰和水组成，每L培养基中，含有蔗糖15-20g，蛋白胨15-20g，酵母粉15-20g，氯化钠0.5-1.0g，硫酸镁0.5-1.0g，磷酸二氢钾1.5-2.5g，氯化钙0.2-0.5g，硫酸锰0.1-0.5g，余量为水。
（2）将(1)得到种子液以接种量为 4％接种到装有发酵培养基三角瓶中，在摇床上培养35h；即可得到硫酸软骨素发酵液。培养条件为：转速120r/m，初始pH 值为7.2，温度为30℃。所述发酵培养基由蔗糖、蛋白胨、酵母粉、氯化钠、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钙、硫酸锰和水组成，所述缓冲液由磷酸氢二钠，磷酸二氢钠组成；每L培养基中，每L培养基中，含有蔗糖20-50g，蛋白胨10-15g，酵母粉10-15g，氯化钠0.5-2.0g，硫酸镁1.5-2.5g，磷酸二氢钾1.5-2.5g，氯化钙0.2-0.5g，硫酸锰0.05-0.15g，磷酸氢二钠1.0－4.0g，磷酸二氢钠0.3－3.0g，余量为水。
（3）生产的发酵液再经过本领域常用的乙醇沉淀法进行纯化处理即可得到硫酸软骨素，多糖的产量约105mg/L。
实施例3
本发明提供了一种生产硫酸软骨素的方法，包括如下步骤：
（1）将芽孢杆菌CICC 10487以接种量为 6％菌接种至种子培养基上进行震荡培养15h，得到种子培养液。种子培养条件为：转速160r/m，初始pH 值为 7.0，发酵温度为32℃，所述种子培养基由蔗糖、蛋白胨、酵母粉、氯化钠、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钙、硫酸锰和水组成，每L培养基中，含有蔗糖15-20g，蛋白胨15-20g，酵母粉15-20g，氯化钠0.5-1.0g，硫酸镁0.5-1.0g，磷酸二氢钾1.5-2.5g，氯化钙0.2-0.5g，硫酸锰0.1-0.5g，余量为水。
（2）将(1)得到种子液以接种量为6％接种到装有发酵培养基三角瓶中，在摇床上培养32h；即可得到硫酸软骨素发酵液。培养条件为：转速160r/m，初始pH 值为 7.0，温度为30℃。所述发酵培养基由蔗糖、蛋白胨、酵母粉、氯化钠、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钙、硫酸锰和水组成，所述缓冲液由磷酸氢二钠，磷酸二氢钠组成；每L培养基中，含有蔗糖20-50g，蛋白胨10-15g，酵母粉10-15g，氯化钠0.5-2.0g，硫酸镁1.5-2.5g，磷酸二氢钾1.5-2.5g，氯化钙0.2-0.5g，硫酸锰0.05-0.15g，磷酸氢二钠1.0－4.0g，磷酸二氢钠0.3－3.0g,余量为水。
（3）生产的发酵液再经过本领域常用的乙醇沉淀法进行纯化处理即可得到硫酸软骨素，多糖的产量约127mg/L。
所述内容仅为本发明构思下的基本说明，而依据本发明的技术方案所作的任何等效变换，均应属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种生产硫酸软骨素的方法，其特征在于包括如下步骤：
1）将巨大芽孢杆菌以接种量为 4-6％接种至种子培养基上进行震荡培养15-18h，得到种子培养液，种子培养条件为：转速120-160r/m，初始pH 值为 7.0-7.2，发酵温度为28-35℃；
2）将步骤1)得到种子液以接种量为 4-6％接种到装有发酵培养基的容器中，在摇床上培养30-35h；即可得到含硫酸软骨素发酵液，培养条件为：转速120-160r/m，初始pH 值为7.0-7.2，温度为30-35℃；
3）将得到的硫酸软骨素发酵液提纯后得到硫酸软骨素。
2.根据权利要求1所述的一种生产硫酸软骨素的方法，其特征在于：所述的巨大芽孢杆菌为巨大芽孢杆菌 CICC 10487。
3.根据权利要求1所述的一种生产硫酸软骨素的方法，其特征在于：所述种子培养基由蔗糖、蛋白胨、酵母粉、氯化钠、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钙、硫酸锰和水组成，每L培养基中，含有蔗糖15-20g，蛋白胨15-20g，酵母粉15-20g，氯化钠0.5-1.0g，硫酸镁0.5-1.0g，磷酸二氢钾1.5-2.5g，所述的氯化钙0.2-0.5g，硫酸锰0.1-0.5g，余量为水。
4.根据权利要求1所述的一种生产硫酸软骨素的方法，其特征在于：所述发酵培养基由蔗糖、蛋白胨、酵母粉、氯化钠、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钙、硫酸锰和水组成，所述缓冲液由磷酸氢二钠，磷酸二氢钠组成；每L培养基中，含有蔗糖20-50g，蛋白胨10-15g，酵母粉10-15g，氯化钠0.5-2.0g，硫酸镁1.5-2.5g，磷酸二氢钾1.5-2.5g，氯化钙0.2-0.5g，硫酸锰0.05-0.15g，磷酸氢二钠1.0－4.0 g，磷酸二氢钠0.3－3.0g余量为水。
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