CN105779491A - 嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白、其制备方法及应用、其基因工程菌的构建 - Google Patents
嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白、其制备方法及应用、其基因工程菌的构建 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105779491A CN105779491A CN201410822236.3A CN201410822236A CN105779491A CN 105779491 A CN105779491 A CN 105779491A CN 201410822236 A CN201410822236 A CN 201410822236A CN 105779491 A CN105779491 A CN 105779491A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- xylanase
- fusion protein
- thermophilic
- nitrae
- isosorbide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 61
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 52
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 26
- 238000010276 construction Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 9
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 title description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims abstract description 33
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims abstract description 25
- 150000001335 aliphatic alkanes Chemical class 0.000 claims abstract description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 24
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 12
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 54
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 53
- 101710135378 pH 6 antigen Proteins 0.000 claims description 27
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 24
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 21
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 21
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 19
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 claims description 18
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 16
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 241000218636 Thuja Species 0.000 claims description 14
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 claims description 14
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 14
- 150000004823 xylans Chemical class 0.000 claims description 14
- 229920001221 xylan Polymers 0.000 claims description 13
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 12
- 230000004087 circulation Effects 0.000 claims description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 11
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 9
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 claims description 8
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 claims description 8
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 claims description 8
- NCMVOABPESMRCP-SHYZEUOFSA-N 2'-deoxycytosine 5'-monophosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NCMVOABPESMRCP-SHYZEUOFSA-N 0.000 claims description 7
- PGSPUKDWUHBDKJ-UHFFFAOYSA-N 6,7-dihydro-3h-purin-2-amine Chemical compound C1NC(N)=NC2=C1NC=N2 PGSPUKDWUHBDKJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 241000235061 Pichia sp. Species 0.000 claims description 7
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N adenyl group Chemical class N1=CN=C2N=CNC2=C1N GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 6
- 241000235648 Pichia Species 0.000 claims description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 5
- 238000013461 design Methods 0.000 claims description 5
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 5
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 claims description 5
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 claims description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 4
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 claims description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 claims description 3
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 claims description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 3
- 108050009160 DNA polymerase 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 claims description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 16
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 abstract description 6
- 239000003513 alkali Substances 0.000 abstract description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 abstract description 3
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 abstract description 3
- 101710104295 Beta-1,4-xylanase Proteins 0.000 abstract description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 abstract description 2
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 abstract description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 abstract description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract 1
- 101710121765 Endo-1,4-beta-xylanase Proteins 0.000 description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 6
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 6
- 150000004804 polysaccharides Chemical class 0.000 description 6
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 6
- 241001070947 Fagus Species 0.000 description 5
- 235000010099 Fagus sylvatica Nutrition 0.000 description 5
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920002488 Hemicellulose Polymers 0.000 description 4
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 4
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 4
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PJWWRFATQTVXHA-UHFFFAOYSA-N Cyclohexylaminopropanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCNC1CCCCC1 PJWWRFATQTVXHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 2
- TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N Xylitol Natural products OCCC(O)C(O)C(O)CCO TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 102000057593 human F8 Human genes 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 229920003063 hydroxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- 229940031574 hydroxymethyl cellulose Drugs 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000006213 oxygenation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 2
- 229940047431 recombinate Drugs 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- 239000000811 xylitol Substances 0.000 description 2
- HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N xylitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N 0.000 description 2
- 229960002675 xylitol Drugs 0.000 description 2
- 235000010447 xylitol Nutrition 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NHQAUSOKYWFWHO-UHFFFAOYSA-N 4-aminobutane-2-sulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C(C)CCN NHQAUSOKYWFWHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000672034 Bacillus sp. (strain GL1) Unsaturated glucuronyl hydrolase Proteins 0.000 description 1
- 235000018185 Betula X alpestris Nutrition 0.000 description 1
- 235000018212 Betula X uliginosa Nutrition 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 D-xylosidase Proteins 0.000 description 1
- 101100381997 Danio rerio tbc1d32 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 101100381999 Mus musculus Tbc1d32 gene Proteins 0.000 description 1
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N Nitrogen oxide Substances O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 108010084650 alpha-N-arabinofuranosidase Proteins 0.000 description 1
- 239000007569 anaerocellum medium Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002551 biofuel Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000009529 body temperature measurement Methods 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 230000002301 combined effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 101150024923 da gene Proteins 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- GYRVPKXEKRPIGJ-UHFFFAOYSA-N ethanesulfonate;quinolin-1-ium Chemical compound CCS([O-])(=O)=O.[NH+]1=CC=CC2=CC=CC=C21 GYRVPKXEKRPIGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 1
- TWNIBLMWSKIRAT-VFUOTHLCSA-N levoglucosan Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]2CO[C@@H]1O2 TWNIBLMWSKIRAT-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001455 metallic ions Chemical class 0.000 description 1
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N methanol Natural products OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000003946 protein process Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007862 touchdown PCR Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白基因工程菌的构建方法，所述的嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述构建方法包括以下步骤：步骤A：高温烷烃地芽孢杆菌的培养；步骤B：基因组DNA的提取与融合蛋白基因序列构建；步骤C：设计引物及用聚合酶链式反应(PCR)法钓取嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白目的基因；步骤D：构建重组表达载体；步骤E：将重组表达载体转化到宿主细胞中。发明的嗜热β-1，4木聚糖酶具有极高的热稳定性，耐碱性环境以及对金属离子、有机溶剂及表面活性剂的抗性，可用于生物质能源生产、功能糖、功能糖醇生产中。
Description
技术领域
本发明涉及一种嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白基因工程菌的构建方法、所制备的嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
木聚糖是植物细胞壁半纤维素的重要组成部分，它是仅次于纤维素、自然界中含量第二丰富的多聚糖，几乎占地球可再生碳源的三分之一(Collinset.al.FEMSMicrobiologyReviews.2005，29：3-23)。木聚糖来源广泛，可由林业、农业、木材加工以及造纸等工业的副产品获得，其主链主要是由木聚糖残基以β-1，4-糖苷键构成。而根据来源的不同，木聚糖的侧链可以被***糖、葡聚糖醛酸、乙酰基等残基取代，由于成份复杂，木聚糖需要在包括木聚糖酶、D-木糖苷酶、葡萄糖醛酸酶以及α-L-***呋喃糖酶等的共同作用下才能够被彻底降解。
β-1，4木聚糖酶(Endo-β-1，4-xylanase，EC3.2.1.8)主要从主链内部作用于木糖苷键，能够专一降解木聚糖为低聚木糖和木糖，是木聚糖降解过程中最重要的酶之一(KulkamiN，ShendyeA，RaoM.Molecularandbiotechnologicalaspectsofxylanases[J].FEMSMicrobiol.Rev.1999，23(4)：411-456)。能够产生木聚糖酶的微生物有很多，包括丝状真菌、细菌、放线菌等。但较真菌所产木聚糖酶而言，细菌木聚糖酶有更好的热稳定性，具有更广泛的工业应用前景，并受到学术界的普遍关注(BadalC.Hemicellulosebioconversion[J].JIndMicrobiolBiotechnol，2003，30：279-291)。
木聚糖酶产生菌株高温烷烃地芽孢杆菌(GeobacillusthermoleovoransDSM5366)在75℃的高温下达到最佳生长环境，具有良好的耐热和耐酸性，非常适合在生物质利用以及木糖、木糖醇等功能糖领域。通过序列比对发现，它与其它已研究的木聚糖酶基因序列具有较低的同源性，我们希望通过此研究来发掘性质优良的新型木聚糖酶源。
发明内容
本发明的目的是提供一种嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白基因工程菌的构建方法，以克服现有木聚糖酶源所产木聚糖酶与已研究的木聚糖酶基因序列同源性低的缺陷；
本发明的另一目的是提供一种嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白；
本发明的另一目的是提供一种嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白的制备方法；
本发明的另一目的是提供一种嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白的应用。
本发明是通过以下技术方案来实现的：一种嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白基因工程菌的构建方法，所述的嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述构建方法包括以下步骤：
步骤A：高温烷烃地芽孢杆菌的培养
配置厌氧培养基，按照100体积份的厌氧培养基注入1体积高温烷烃地芽孢杆菌的比例，将高温烷烃地芽孢杆菌接种到厌氧培养基中进行培养；
步骤B：基因组DNA的提取
将步骤A培养的高温烷烃地芽孢杆菌用细菌基因组DNA提取试剂盒提取高温烷烃地芽孢杆菌的基因组，得到基因组DNA溶液；
步骤C：设计引物及用聚合酶链式反应法钓取嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白目的基因
通过在下游引物中终止密码子前加入6个His标签，在聚合酶链式反应过程中同步获得融合蛋白xyl-his，其中，
上游引物：5’CCAGTCCCATGGATGCGGAACGTCGTGCGTAA3’，划线部分为NcoI的酶切位点；
下游引物：5’CGACGACTCGAGCTAATGATGATGATGATGATGTTTGTGGTCGATAATAGCCCA3’，划线部分为XhoI的酶切位点；
以步骤B所得基因组DNA溶液为模板，在所述上游引物和下游引物的参与下进行聚合酶链式反应，得到聚合酶链式反应扩增产物，再对扩增产物进行纯化，得到纯化的聚合酶链式反应产物，然后用限制性内切酶NcoI和XhoI进行双酶切，得到嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白目的基因；将其与同样进行双酶切的pET-28a(+)质粒采用DNA连接酶进行连接，采用点击的方式转化入大肠杆菌DH5α中，筛选5个克隆子提取质粒进行克隆片段测序鉴定，成功获得含有融合蛋白的质粒pET-28a(+)-xyl-His；
步骤D：构建重组表达载体
将pET-28a(+)-xyl-His和pRSII418采用限制性内切酶NcoI和XhoI进行双酶切，将获得的xyl-His片段与线性化的pRSII418质粒进行连接，得到重组表达载体pRSII418-xyl-His；
步骤E：将重组表达载体转化到宿主细胞中
将步骤D所得重组表达载体转化到毕赤酵母中进行培养，采用腺嘌呤缺陷型培养基进行筛选，并对筛选出的克隆子中质粒进行测序验证，最终获得了具有嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白基因的腺嘌呤缺陷型毕赤酵母工程菌。
其中，按照德国微生物菌种保藏中心的配方配置步骤A中的厌氧培养基。
其中，所述的聚合酶链式反应的反应体系按以下方法配制：DNA聚合酶1μl，DNA聚合酶缓冲液5μl，作为模板的基因组DNA溶液2μl，2.5mM脱氧核苷酸混合物8μl，上游引物和下游引物各加40pmol，加超纯水至总体积50μl。
其中，所述的聚合酶链式反应的反应程序包括以下两个步骤：
步骤一、94℃预变性3min；
步骤二、然后98℃变性30s，退火温度从70-56℃，每个循环降低1℃，退火时间30s，72℃延伸60s，共15个循环；之后再98℃变性30s，退火温度55℃，退火时间30s，72℃延伸60s，共20个循环；最后再72℃延伸20min。
其中，所述步骤C所述的用限制性内切酶NcoI和XhoI进行双酶切的酶切体系包括：500ng纯化的质粒，上游引物和下游引物各2μl，限制性内切酶缓冲液4.9μl。
其中，所述的脱氧核苷酸混合物是脱氧腺嘌呤苷酸、脱氧鸟嘌呤苷酸、脱氧胞嘧啶核苷酸和脱氧胸腺嘧啶核苷酸的混合物，其中脱氧腺嘌呤苷酸和脱氧胸腺嘧啶核苷酸的浓度均为30nmol/L，脱氧鸟嘌呤苷酸和脱氧胞嘧啶核苷酸的浓度均为20nmol/L。
其中，步骤D所述的用限制性内切酶NcoI和XhoI进行双酶切的酶切体系包括：pRSII418空载体45μl，上游引物和下游引物各2μl，限制性内切酶缓冲液6μl，加超纯水至总体积50μl。
一种用所述嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白基因工程菌制备的嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白，所述嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。
所述的嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白的制备方法，将构建的具有嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白基因的腺嘌呤缺陷型毕赤酵母工程菌进行放大培养，然后通过细胞超声破碎、过镍柱收集、咪唑缓冲液洗脱，盐析再复性分离纯化得到嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白。
所述的嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白在生物质能源生产、木糖和木聚糖生产中的应用。
本发明的有益效果是：采用Touch-downPCR方法有效避免了由于3端引物过长导致Tm过高、以及存在发卡结构导致的错配问题；选择的质粒pET-28a(+)具有高拷贝数，能够有效实现基因的扩增；本发明的嗜热β-1，4木聚糖酶具有极高的热稳定性，耐碱性环境以及对金属离子、有机溶剂及表面活性剂的抗性，可用于生物质能源生产、功能糖、功能糖醇生产中。
附图说明
图1为重组表达载体pRSII418-xyl-His的构建示意图；
图2为嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白SDS-PAGE电泳图；
图3为嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白在不同pH下相对酶活性示意图；
图4为嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白在不同温度下相对酶活性示意图。
具体实施方式
一种嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白基因工程菌的构建方法,所述的嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述构建方法包括以下步骤：
步骤A：高温烷烃地芽孢杆菌(GeobacillusthermoleovoransDSM5366)的培养
按照DSMZ的配方配置培养基，按照100体积份的厌氧培养基注入1体积高温烷烃地芽孢杆菌的比例，将高温烷烃地芽孢杆菌接种到培养基中进行培养；
步骤B、基因组DNA的提取
将步骤A培养的高温烷烃地芽孢杆菌用细菌基因组DNA提取试剂盒提取高温烷烃地芽孢杆菌的基因组，得到基因组DNA溶液；
步骤C：引物设计及用聚合酶链式反应(PCR)法钓取嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白目的基因，通过在下游引物中终止密码子前加入6个His标签，在PCR过程中同步获得融合蛋白xyl-his，其中，
上游引物：5’CCAGTCCCATGGATGCGGAACGTCGTGCGTAA3’，划线部分为NcoI的酶切位点；
下游引物：5’CGACGACTCGAGCTAATGATGATGATGATGATGTTTGTGGTCGATAATAGCCCA3’，划线部分为XhoI的酶切位点；
以步骤B所得基因组DNA溶液为模板，在上述上游引物和下游引物的参与下进行PCR反应，得到PCR扩增产物，再对扩增产物进行纯化，得到纯化的PCR产物，然后用限制性内切酶NcoI和XhoI进行双酶切，得到嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白目的基因，将其与同样进行双酶切的pET-28a(+)质粒采用Takara的DNA连接酶进行连接，采用点击的方式转化入大肠杆菌DH5α中，筛选5个克隆子提取质粒进行克隆片段测序鉴定，成功获得含有融合蛋白的质粒pET-28a(+)-xyl-His；
步骤D：构建重组表达载体
将pET-28a(+)-xyl-His和pRSII418采用限制性内切酶NcoI和XhoI进行双酶切，将获得的xyl-His片段与线性化的pRSII418质粒进行连接，得到重组表达载体pRSII418-xyl-His；
步骤E：将重组表达载体转化到宿主细胞中
将步骤D所得重组表达载体转化到毕赤酵母(PMAD16(Ade),采购自Invitrogen公司)中进行培养，采用腺嘌呤缺陷型培养基进行筛选，并对筛选出的克隆子中质粒进行测序验证，最终获得了具有嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白基因的腺嘌呤缺陷型毕赤酵母工程菌。
作为优选的技术方案，所述的PCR反应的反应体系按以下方法配制：
步骤一、DNA聚合酶(PfU酶，Takara公司)1μl，DNA聚合酶缓冲液(Primerstarbuffer)5μl，作为模板的基因组DNA溶液2μl，2.5mM脱氧核苷酸混合物(dNTP)8μl，上下游引物各加40pmol，加超纯水至总体积50μl；
步骤二、所述的PCR反应的反应程序为：94℃预变性3min；
步骤三、然后98℃变性30s，退火温度从70-56℃，每个循环降低1℃，退火时间30s，72℃延伸60s，共15个循环；之后再98℃变性30s，退火温度55℃，退火时间30s，72℃延伸60s，共20个循环；最后再72℃延伸20min，
作为优选的技术方案，所述步骤C所述的用限制性内切酶NcoI和XhoI进行双酶切的酶切体系包括：500ng纯化的质粒，上游引物和下游引物各2μl，限制性内切酶缓冲液(FDbuffer)4.9μl。
作为优选的技术方案，所述的脱氧核苷酸混合物是脱氧腺嘌呤苷酸、脱氧鸟嘌呤苷酸、脱氧胞嘧啶核苷酸和脱氧胸腺嘧啶核苷酸的混合物，其中脱氧腺嘌呤苷酸和脱氧胸腺嘧啶核苷酸每种浓度为30nmol/L，脱氧鸟嘌呤苷酸、脱氧胞嘧啶核苷酸每种浓度为20nmol/L。
作为优选的技术方案，步骤D所述的用限制性内切酶NcoI和XhoI进行双酶切的酶切体系包括：pRSII418空载体100ng，上游引物和下游引物各2μl，限制性内切酶缓冲液(FDbuffer)6μl，加超纯水至总体积50μl。
一种用上述嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白基因工程菌制备的嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。
该嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白具有以下特性：
(1)最适反应温度
在45-85℃表现催化活力，最适反应温度为75℃；
(2)最适反应pH
在pH4.2-12.0范围内表现催化活力，最适pH为8.0；
(3)底物特异性
能够有效地催化桦木木聚糖(Birchwood)，山毛榉木聚糖(Beechhood)，燕麦木聚糖(OatSpelts)，高粘度羟甲基纤维素(高粘度CMC)，低粘度羟甲基纤维素(低粘度CMC)的水解，其中水解的最适底物为山毛榉木聚糖；
(4)热稳定性
将嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白在不同温度孵育，表现出很好的热稳定性，其中75℃下保温6h仍然保持70％的活力，80℃下保温3h仍然保持40％的活力；
(5)对一价金属离子有很好的抗性。
上述嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白的制备方法是，将构建的毕赤酵母进行放大培养，然后通过细胞超声破碎、过镍柱收集、咪唑缓冲液洗脱，盐析再复性分离纯化得到嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白。
所述的嗜热β-1，4木聚糖酶融合蛋白用于生物质能源生产、木糖和木聚糖等功能糖生产中。
高温烷烃地芽孢杆菌(GeobacillusthermoleovoransDSM5366)是一株极度嗜热的细菌，可以降解纤维素，半纤维素，其最适生长温度为75℃。菌种购买于德国微生物菌种保藏中心DSMZ(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturen)，通过随机引物PCR对高温烷烃地芽孢杆菌(GeobacillusthermoleovoransDSM5366)的纤维素和半纤维素代谢酶系进行分析发现，该菌基因组可以编码一种嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白，可以将其DNA分子中表达嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白活性的基因序列称为嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白基因xyl。由于嗜热的高温烷烃地芽孢杆菌(GeobacillusthermoleovoransDSM5366)是一株极端环境细菌，培养条件复杂，人工培养比较困难，菌体密度过低，很难大批量的生产该酶，因此直接用培养该菌来生产嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白成本比较高且周期比较长。将嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白基因转入易培养、可快速繁殖的常温宿主如毕赤酵母内，能够有效地解决上述问题。
对高温烷烃地芽孢杆菌(GeobacillusthermoleovoransDSM5366)通过培养、目的基因的提取，得到本发明所述嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白基因，我们委托北京生工生物技术有限公司进行基因测序，其核苷酸序列如序列表SEQIDNo.1所示。
将嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白基因装载在pRSII418***载体上，然后转入到毕赤酵母(ADE缺陷型)宿主中，得到一株含目的基因的毕赤酵母工程菌。表达的产物是细胞可溶性蛋白，通过细胞超声破碎、、过镍柱收集、咪唑缓冲液洗脱，盐析再复性分离纯化得到嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白。
工程菌表达的嗜热蛋白为嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQIDNo.2所示。该嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白的最适催化温度为70℃，最适pH为7.2，可以催化木聚糖水解，有广泛的应用前景。如在生物能源领域，在以碱预处理木质纤维素为底物制取生物燃料时，采用该酶能有效耐受碱处理物料pH，减少碱处理后调pH步骤，同时能很好地与高温纤维素酶作用，有效降低生产成本；提取纤维素后剩余的木质纤维素中存在大量半纤维素原料，碱预处理后废液也同样含有大量的寡聚半纤维素，由于该酶在碱性范围有良好的活性，而且对废液中的金属离子具有极好的抗性，可以用于生产木糖、***糖等功能糖，进一步获得木糖醇等产品。
实施例1：嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白工程菌的构建及其酶的表达：1、高温烷烃地芽孢杆菌(GeobacillusthermoleovoransDSM5366)的培养及其基因组DNA的提取，按照DSMZ的配方，配置厌氧培养基(anaerocellummedium)，分装于厌氧试管中，每管5ml，培养基封闭后用真空泵将试管中的空气抽干，并充入一定量的氮气和二氧化碳的混合气体(80％N2和20％CO2)，在厌氧箱中用培养基1ml溶解购买于DSMZ的高温烷烃地芽孢杆菌(GeobacillusthermoleovoransDSM5366)，按照1％的接菌量接种于5ml试管中，混匀，70℃静置培养数天，直至细菌开始生长起来。然后转移至装有100ml培养基的锥形瓶中70℃培养数天，-80℃保存菌体备用。
取5ml小试管培养的高温烷烃地芽孢杆菌(GeobacillusthermoleovoransDSM5366)，用北京普博欣生物技术有限责任公司的细菌基因组DNA小量提取试剂盒(BacteriaGenomicMiniPreparationKit)提取细菌的基因组，所得染色体DNA溶液放4℃冰箱备用。
2、引物设计及用PCR法提取并获得嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白基因及重组载体的制备；
嗜热细菌高温烷烃地芽孢杆菌(GeobacillusthermoleovoransDSM5366)基因组中含有几段预测的可能的嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白基因。选择核苷酸序列如表SEQIDNo.1所示的基因作为研究对象，命名为xyl。该酶基因通过PCR方法从步骤1所得的基因组DNA中扩增而得到。两个引物是根据基因的序列及载体的限制性内切酶位点而设计的，委托上海生工生物工程公司合成。上游引物5’CCAGTCCCATGGATGCGGAACGTCGTGCGTAA3’，划线部分；为NcoI的酶切位点；下游引物：5’CGACGACTCGAGCTAATGATGATGATGATGATGTTTGTGGTCGATAATAGCCCA3’，划线部分为XhoI的酶切位点；两个引物所设置的酶切位点与表达载体pET-28a(+)的NcoI和XhoI相匹配，适合于在大肠杆菌中高效表达。
PCR反应：在50μl反应体系中含有1μlPrimerstarDNA聚合酶，Primerstarbuffer5μl，模板DNA(基因组DNA)2μl，2.5mMdNTP混合物(其中脱氧腺嘌呤苷酸和脱氧胸腺嘧啶核苷酸每种浓度为30nmol/L，脱氧鸟嘌呤苷酸、脱氧胞嘧啶核苷酸每种浓度为20nmol/L)8μl，上下游引物各加40pmol，，加无菌超纯水至总体积50μl。PCR反应程序为：94℃预变性3min；循环程序为98℃变性30s，退火温度从70-56℃，每个循环降低1℃，退火时间30s，72℃延伸60s，共15个循环；之后再98℃变性30s，退火温度55℃，退火时间30s，72℃延伸60s，共20个循环；最后再72℃延伸20min。用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，分子量大小为1224bp，与预测的结果一致。
将纯化的PCR产物用限制性内切酶NcoI和XhoI进行双酶切，酶切体系包括：
采用天根公司质粒提取试剂盒提取pET-28(a)-xyl-His质粒，500ng的含有目的基因质粒中加入NcoI和XhoI各2μl，FD-buffer4.9μl，37℃下保温2小时。酶切完毕后用0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳，再用DNA凝胶检测试剂盒回收酶切后的DNA片段。
用同样的限制性内切酶NcoI和XhoI来酶切pRCII418载体，反应体系为50μl，体系包括：pRCII418空载体45μl，上游引物和下游引物各2μl，限制性内切酶缓冲液6μl，加超纯水至总体积50μl。37℃下保温2小时，然后再用磷酸酶(FastAP)处理去磷酸化，反应二十分钟左右，用0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，再用胶回收试剂盒回收。
在16℃用连接试剂盒来连接木聚糖酶基因和载体。将连接载体转入DH5α中，用含卡那霉素的琼脂平板进行单克隆菌株的筛选和鉴定。挑取一个阳性的单克隆，加入到含卡那霉素的试管中，37℃180rpm/min培养过夜，取菌液进行PCR验证，得到一条大小为1224bp的条带即为目的基因，证明目的基因已经与载体连接并转化到宿主中。测序正确后，提取重组质粒转化到毕赤酵母中进行表达pRCII418-xyl-His。测序工作由上海华大基因完成。
3、重组载体在宿主细菌中的表达：
将重组的DNA质粒、pRCII418-xyl-His转化到毕赤酵母中。毕赤酵母制备及其载体转化方法参照《分子克隆实验指南》。挑取阳性转化菌，置5ml不含腺膘呤的培养液中37℃振荡培养过夜，次日接种到100ml新鲜的不含腺膘呤的2YT培养基中，37℃继续培养4h。将初步放大的种子液以1％的比例接入1L的2YT培养基中培养(37℃，120rpm/min)，其中不含腺膘呤，当OD600达到0.8左右时加入200mg/ml的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG),降低培养温度至22℃，诱导菌体表达目的蛋白。4℃过夜诱导表达，得到本发明所述工程菌，10000rpm，10min离心搜集菌体。然后用50mM，pH8.0的Tris-HCl缓冲液重悬菌体，超声破碎(1s×1s，30min)后14,000离心30分钟获得粗酶液。
粗酶液进一步过镍柱后采用适当浓度的咪唑缓冲液洗脱，得到目的酶，然后在pH7.2、温度56℃条件下，以山毛榉木聚糖为底物测定不同处理后的酶活力以及相应的蛋白浓度，得到不同处理后的蛋白纯化表，如表1所示。
表1嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白的蛋白纯化表：
应用SDS-PAGE(12％)电泳检测重组蛋白的纯度，可见46.5KDa附近可见一条电泳条带，如图1所示。
实施例2：重组嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白的活性分析
重组嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白活性使用DNS法进行分析：在pH7.2，70℃条件下，300μl的反应体系包括5μl适当稀释的酶液，150μl2％的底物(g/100mL)，60μl缓冲液(20mM)和85μlddH2O，反应5min，加入600μlDNS终止反应，沸水煮5min，冷却后540nm测定OD值，以葡萄糖为标准曲线，计算酶活力。1个酶活单位(U)定义为在给定条件每分钟降解1％的木聚糖溶液释放1umol还原糖所需要的酶量。
实施例3：重组嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白的性质测定。
1、重组嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白的最适pH和pH稳定性的测定方法如下：将实施例1纯化的重组嗜热β-1，4木聚糖酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。以山毛榉木聚糖作为底物，利用实施例2中的反应体系，用20mmol不同pH的缓冲液在60℃下进行木聚糖酶活力测定。结果如图2所示，表明嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白的最适pH为8.0，在pH6.5-9.5的范围内，酶活性可以维持最大酶活性的60％以上。嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白于上述不同pH缓冲液中室温条件处理240min，再在60℃下测定酶活性，以研究酶的pH耐性。结果表明嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白在pH5-12之间均很稳定，在此pH范围内处理240min后剩余酶活性在90％以上，这说明此酶具有非常好的pH稳定性。所使用的缓冲液为宽范围pHbuffer：以乙酸、N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸(HEPS)、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、3-环己胺基丙磺酸(CAPS)和2-码啉乙磺酸(MES))为基础，分别在70℃下精确配制100mM不同pH的缓冲液。
2、重组嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白的最适反应温度和热稳定性的测定方法；
嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白的最适温度的测定为以山毛榉木聚糖作为底物，在宽范围缓冲液(pH7.2)体系及40-85℃温度范围内测定嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白的活力。热稳定性测定为嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白在不同温度下处理不同时间，再在75℃下进行酶活测定。酶反应最适温度测定结果如图3所示，表明最适温度为70℃。酶的热稳定性试验结果如图4所示，表明嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白在60℃下稳定性非常好，在75℃下保温4h仍然可以保持70％的酶活力，80℃下保温3h仍然可以保持40％的酶活力。
当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明权利要求的保护范围。
Claims (10)
1.一种嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述的嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述构建方法包括以下步骤：
步骤A：高温烷烃地芽孢杆菌的培养
配置厌氧培养基，按照100体积份的厌氧培养基注入1体积高温烷烃地芽孢杆菌的比例，将高温烷烃地芽孢杆菌接种到厌氧培养基中进行培养；
步骤B：基因组DNA的提取
将步骤A培养的高温烷烃地芽孢杆菌用细菌基因组DNA提取试剂盒提取高温烷烃地芽孢杆菌的基因组，得到基因组DNA溶液；
步骤C：设计引物及用聚合酶链式反应法钓取嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白目的基因
通过在下游引物中终止密码子前加入6个His标签，在聚合酶链式反应过程中同步获得融合蛋白xyl-his，其中，
上游引物：5’CCAGTCCCATGGATGCGGAACGTCGTGCGTAA3’，划线部分为NcoI的酶切位点；
下游引物：5’CGACGACTCGAGCTAATGATGATGATGATGATGTTTGTGGTCGATAATAGCCCA3’，划线部分为XhoI的酶切位点；
以步骤B所得基因组DNA溶液为模板，在所述上游引物和下游引物的参与下进行聚合酶链式反应，得到聚合酶链式反应扩增产物，再对扩增产物进行纯化，得到纯化的聚合酶链式反应产物，然后用限制性内切酶NcoI和XhoI进行双酶切，得到嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白目的基因；将其与同样进行双酶切的pET-28a(+)质粒采用DNA连接酶进行连接，采用点击的方式转化入大肠杆菌DH5α中，筛选5个克隆子提取质粒进行克隆片段测序鉴定，成功获得含有融合蛋白的质粒pET-28a(+)-xyl-His；
步骤D：构建重组表达载体
将pET-28a(+)-xyl-His和pRSII418采用限制性内切酶NcoI和XhoI进行双酶切，将获得的xyl-His片段与线性化的pRSII418质粒进行连接，得到重组表达载体pRSII418-xyl-His；
步骤E：将重组表达载体转化到宿主细胞中
将步骤D所得重组表达载体转化到毕赤酵母中进行培养，采用腺嘌呤缺陷型培养基进行筛选，并对筛选出的克隆子中质粒进行测序验证，最终获得了具有嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白基因的腺嘌呤缺陷型毕赤酵母工程菌。
2.根据权利要求1所述的嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白基因工程菌的构建方法，其特征在于，按照德国微生物菌种保藏中心的配方配置步骤A中的厌氧培养基。
3.根据权利要求1所述的嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述的聚合酶链式反应的反应体系按以下方法配制：DNA聚合酶1μl，DNA聚合酶缓冲液5μl，作为模板的基因组DNA溶液2μl，2.5mM脱氧核苷酸混合物8μl，上游引物和下游引物各加40pmol，加超纯水至总体积50μl。
4.根据权利要求1所述的嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述的聚合酶链式反应的反应程序包括以下两个步骤：
步骤一、94℃预变性3min；
步骤二、然后98℃变性30s，退火温度从70-56℃，每个循环降低1℃，退火时间30s，72℃延伸60s，共15个循环；之后再98℃变性30s，退火温度55℃，退火时间30s，72℃延伸60s，共20个循环；最后再72℃延伸20min。
5.根据权利要求1所述的嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述步骤C所述的用限制性内切酶NcoI和XhoI进行双酶切的酶切体系包括：500ng纯化的质粒，上游引物和下游引物各2μl，限制性内切酶缓冲液4.9μl。
6.根据权利要求3所述的嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述的脱氧核苷酸混合物是脱氧腺嘌呤苷酸、脱氧鸟嘌呤苷酸、脱氧胞嘧啶核苷酸和脱氧胸腺嘧啶核苷酸的混合物，其中脱氧腺嘌呤苷酸和脱氧胸腺嘧啶核苷酸的浓度均为30nmol/L，脱氧鸟嘌呤苷酸和脱氧胞嘧啶核苷酸的浓度均为20nmol/L。
7.根据权利要求1所述的嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤D所述的用限制性内切酶NcoI和XhoI进行双酶切的酶切体系包括：pRSII418空载体45μl，上游引物和下游引物各2μl，限制性内切酶缓冲液6μl，加超纯水至总体积50μl。
8.一种用所述嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白基因工程菌制备的嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白，其特征在于，所述嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。
9.权利要求8所述的嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白的制备方法，其特征在于，将构建的具有嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白基因的腺嘌呤缺陷型毕赤酵母工程菌进行放大培养，然后通过细胞超声破碎、过镍柱收集、咪唑缓冲液洗脱，盐析再复性分离纯化得到嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白。
10.权利要求8所述的嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白在生物质能源生产、木糖和木聚糖生产中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410822236.3A CN105779491A (zh) | 2014-12-25 | 2014-12-25 | 嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白、其制备方法及应用、其基因工程菌的构建 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410822236.3A CN105779491A (zh) | 2014-12-25 | 2014-12-25 | 嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白、其制备方法及应用、其基因工程菌的构建 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105779491A true CN105779491A (zh) | 2016-07-20 |
Family
ID=56378568
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410822236.3A Pending CN105779491A (zh) | 2014-12-25 | 2014-12-25 | 嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白、其制备方法及应用、其基因工程菌的构建 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105779491A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107619823A (zh) * | 2017-10-30 | 2018-01-23 | 梁方方 | 具有抗抑制活性的重组木聚糖酶XynB及其应用 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1675365A (zh) * | 2002-06-14 | 2005-09-28 | 戴弗萨公司 | 木聚糖酶、编码木聚糖酶的核酸以及制备和应用它们的方法 |
| CN101952437A (zh) * | 2007-10-03 | 2011-01-19 | 维莱尼姆公司 | 木聚糖酶、编码它们的核酸以及其制备和应用方法 |
| CN102559567A (zh) * | 2011-12-08 | 2012-07-11 | 上海交通大学 | 嗜热内切木聚糖酶基因工程菌的构建及其酶的应用 |
| CN102816728A (zh) * | 2012-05-30 | 2012-12-12 | 上海交通大学 | β-1，4-内切木聚糖酶工程菌的构建及其酶的应用 |
| CN103642777A (zh) * | 2013-12-10 | 2014-03-19 | 江南大学 | 一种提高米曲霉木聚糖酶热稳定性的方法 |
-
2014
- 2014-12-25 CN CN201410822236.3A patent/CN105779491A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1675365A (zh) * | 2002-06-14 | 2005-09-28 | 戴弗萨公司 | 木聚糖酶、编码木聚糖酶的核酸以及制备和应用它们的方法 |
| CN101952437A (zh) * | 2007-10-03 | 2011-01-19 | 维莱尼姆公司 | 木聚糖酶、编码它们的核酸以及其制备和应用方法 |
| CN102559567A (zh) * | 2011-12-08 | 2012-07-11 | 上海交通大学 | 嗜热内切木聚糖酶基因工程菌的构建及其酶的应用 |
| CN102816728A (zh) * | 2012-05-30 | 2012-12-12 | 上海交通大学 | β-1，4-内切木聚糖酶工程菌的构建及其酶的应用 |
| CN103642777A (zh) * | 2013-12-10 | 2014-03-19 | 江南大学 | 一种提高米曲霉木聚糖酶热稳定性的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| DIGVIJAY VERMA等: "Cloning, expression and applicability of thermo-alkali-stable xylanase of Geobadllus thermoleovorans in generating xylooligosaccharides from agro-residues", 《BIORESOURCE TECHNOLOGY》 * |
| JEAN-GUY BERRIN等: "High-Level Production of Recombinant Fungal Endo-b-1,4-xylanase in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris", 《PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION》 * |
| 马银鹏等: "毕赤酵母表达***研究进展", 《黑龙江科学》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107619823A (zh) * | 2017-10-30 | 2018-01-23 | 梁方方 | 具有抗抑制活性的重组木聚糖酶XynB及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Willson et al. | Production of a functional cell wall-anchored minicellulosome by recombinant Clostridium acetobutylicum ATCC 824 | |
| KR20030027902A (ko) | 당화와 발효의 동시 수행을 위한 방법 및 조성물 | |
| CN102787130B (zh) | 一种耐酸性高温α-淀粉酶及其基因、工程菌和制备方法 | |
| CN109182360B (zh) | 一种小分子纤维素内切酶基因及其蛋白和应用 | |
| US10457925B2 (en) | Process for the production of cellulolytic and/or hemicellulolytic enzymes | |
| Colabardini et al. | Expression of two novel β-glucosidases from Chaetomium atrobrunneum in Trichoderma reesei and characterization of the heterologous protein products | |
| CN106916752B (zh) | 制备纤维素酶和/或木聚糖酶的方法及其专用菌株 | |
| CN102936601A (zh) | 一种内切葡聚糖酶编码基因和重组酶及应用 | |
| Vitcosque et al. | The functional properties of a xyloglucanase (GH12) of Aspergillus terreus expressed in Aspergillus nidulans may increase performance of biomass degradation | |
| CN102559567A (zh) | 嗜热内切木聚糖酶基因工程菌的构建及其酶的应用 | |
| CN101469325B (zh) | 一种马克斯克鲁维酵母外切菊粉酶的分泌表达方法 | |
| CN102816728A (zh) | β-1，4-内切木聚糖酶工程菌的构建及其酶的应用 | |
| CN103614303B (zh) | 一种表达糖化酶的里氏木霉菌株 | |
| CN103131720A (zh) | 一种真菌木糖异构酶基因及其应用 | |
| CN112322604A (zh) | 一种高比酶活木聚糖酶突变体及其应用 | |
| CN104726388B (zh) | 一种普鲁兰酶产酶菌株及提高其产酶能力的方法 | |
| CN105779491A (zh) | 嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白、其制备方法及应用、其基因工程菌的构建 | |
| CN102864132A (zh) | 一种极耐热木糖苷酶及其编码基因和应用 | |
| CN103614354A (zh) | 一种糖化酶及其重组表达菌株 | |
| Zhu et al. | MFα signal peptide enhances the expression of cellulase eg1 gene in yeast | |
| CN106701605A (zh) | 一株利用木糖高效发酵乙醇的转基因工程酿酒酵母sf4 | |
| CN102994476A (zh) | 一种糖化酶 | |
| CN116064616A (zh) | 一种纤维素酶基因、纤维素酶、重组载体及应用 | |
| CN103122342A (zh) | 一种耐热葡萄糖淀粉酶及其编码基因与应用 | |
| Benkő et al. | Thermoascus aurantiacus CBHI/Cel7A production in Trichoderma reesei on alternative carbon sources |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20160720 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |