CN105779491A - 嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白、其制备方法及应用、其基因工程菌的构建 - Google Patents
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Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白基因工程菌的构建方法,所述的嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,所述构建方法包括以下步骤:步骤A:高温烷烃地芽孢杆菌的培养;步骤B:基因组DNA的提取与融合蛋白基因序列构建;步骤C:设计引物及用聚合酶链式反应(PCR)法钓取嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白目的基因;步骤D:构建重组表达载体;步骤E:将重组表达载体转化到宿主细胞中。发明的嗜热β-1,4木聚糖酶具有极高的热稳定性,耐碱性环境以及对金属离子、有机溶剂及表面活性剂的抗性,可用于生物质能源生产、功能糖、功能糖醇生产中。
Description
技术领域
本发明涉及一种嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白基因工程菌的构建方法、所制备的嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
木聚糖是植物细胞壁半纤维素的重要组成部分,它是仅次于纤维素、自然界中含量第二丰富的多聚糖,几乎占地球可再生碳源的三分之一(Collinset.al.FEMSMicrobiologyReviews.2005,29:3-23)。木聚糖来源广泛,可由林业、农业、木材加工以及造纸等工业的副产品获得,其主链主要是由木聚糖残基以β-1,4-糖苷键构成。而根据来源的不同,木聚糖的侧链可以被***糖、葡聚糖醛酸、乙酰基等残基取代,由于成份复杂,木聚糖需要在包括木聚糖酶、D-木糖苷酶、葡萄糖醛酸酶以及α-L-***呋喃糖酶等的共同作用下才能够被彻底降解。
β-1,4木聚糖酶(Endo-β-1,4-xylanase,EC3.2.1.8)主要从主链内部作用于木糖苷键,能够专一降解木聚糖为低聚木糖和木糖,是木聚糖降解过程中最重要的酶之一(KulkamiN,ShendyeA,RaoM.Molecularandbiotechnologicalaspectsofxylanases[J].FEMSMicrobiol.Rev.1999,23(4):411-456)。能够产生木聚糖酶的微生物有很多,包括丝状真菌、细菌、放线菌等。但较真菌所产木聚糖酶而言,细菌木聚糖酶有更好的热稳定性,具有更广泛的工业应用前景,并受到学术界的普遍关注(BadalC.Hemicellulosebioconversion[J].JIndMicrobiolBiotechnol,2003,30:279-291)。
木聚糖酶产生菌株高温烷烃地芽孢杆菌(GeobacillusthermoleovoransDSM5366)在75℃的高温下达到最佳生长环境,具有良好的耐热和耐酸性,非常适合在生物质利用以及木糖、木糖醇等功能糖领域。通过序列比对发现,它与其它已研究的木聚糖酶基因序列具有较低的同源性,我们希望通过此研究来发掘性质优良的新型木聚糖酶源。
发明内容
本发明的目的是提供一种嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白基因工程菌的构建方法,以克服现有木聚糖酶源所产木聚糖酶与已研究的木聚糖酶基因序列同源性低的缺陷;
本发明的另一目的是提供一种嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白;
本发明的另一目的是提供一种嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白的制备方法;
本发明的另一目的是提供一种嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白的应用。
本发明是通过以下技术方案来实现的:一种嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白基因工程菌的构建方法,所述的嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示,所述构建方法包括以下步骤:
步骤A:高温烷烃地芽孢杆菌的培养
配置厌氧培养基,按照100体积份的厌氧培养基注入1体积高温烷烃地芽孢杆菌的比例,将高温烷烃地芽孢杆菌接种到厌氧培养基中进行培养;
步骤B:基因组DNA的提取
将步骤A培养的高温烷烃地芽孢杆菌用细菌基因组DNA提取试剂盒提取高温烷烃地芽孢杆菌的基因组,得到基因组DNA溶液;
步骤C:设计引物及用聚合酶链式反应法钓取嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白目的基因
通过在下游引物中终止密码子前加入6个His标签,在聚合酶链式反应过程中同步获得融合蛋白xyl-his,其中,
上游引物:5’CCAGTCCCATGGATGCGGAACGTCGTGCGTAA3’,划线部分为NcoI的酶切位点;
下游引物:5’CGACGACTCGAGCTAATGATGATGATGATGATGTTTGTGGTCGATAATAGCCCA3’,划线部分为XhoI的酶切位点;
以步骤B所得基因组DNA溶液为模板,在所述上游引物和下游引物的参与下进行聚合酶链式反应,得到聚合酶链式反应扩增产物,再对扩增产物进行纯化,得到纯化的聚合酶链式反应产物,然后用限制性内切酶NcoI和XhoI进行双酶切,得到嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白目的基因;将其与同样进行双酶切的pET-28a(+)质粒采用DNA连接酶进行连接,采用点击的方式转化入大肠杆菌DH5α中,筛选5个克隆子提取质粒进行克隆片段测序鉴定,成功获得含有融合蛋白的质粒pET-28a(+)-xyl-His;
步骤D:构建重组表达载体
将pET-28a(+)-xyl-His和pRSII418采用限制性内切酶NcoI和XhoI进行双酶切,将获得的xyl-His片段与线性化的pRSII418质粒进行连接,得到重组表达载体pRSII418-xyl-His;
步骤E:将重组表达载体转化到宿主细胞中
将步骤D所得重组表达载体转化到毕赤酵母中进行培养,采用腺嘌呤缺陷型培养基进行筛选,并对筛选出的克隆子中质粒进行测序验证,最终获得了具有嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白基因的腺嘌呤缺陷型毕赤酵母工程菌。
其中,按照德国微生物菌种保藏中心的配方配置步骤A中的厌氧培养基。
其中,所述的聚合酶链式反应的反应体系按以下方法配制:DNA聚合酶1μl,DNA聚合酶缓冲液5μl,作为模板的基因组DNA溶液2μl,2.5mM脱氧核苷酸混合物8μl,上游引物和下游引物各加40pmol,加超纯水至总体积50μl。
其中,所述的聚合酶链式反应的反应程序包括以下两个步骤:
步骤一、94℃预变性3min;
步骤二、然后98℃变性30s,退火温度从70-56℃,每个循环降低1℃,退火时间30s,72℃延伸60s,共15个循环;之后再98℃变性30s,退火温度55℃,退火时间30s,72℃延伸60s,共20个循环;最后再72℃延伸20min。
其中,所述步骤C所述的用限制性内切酶NcoI和XhoI进行双酶切的酶切体系包括:500ng纯化的质粒,上游引物和下游引物各2μl,限制性内切酶缓冲液4.9μl。
其中,所述的脱氧核苷酸混合物是脱氧腺嘌呤苷酸、脱氧鸟嘌呤苷酸、脱氧胞嘧啶核苷酸和脱氧胸腺嘧啶核苷酸的混合物,其中脱氧腺嘌呤苷酸和脱氧胸腺嘧啶核苷酸的浓度均为30nmol/L,脱氧鸟嘌呤苷酸和脱氧胞嘧啶核苷酸的浓度均为20nmol/L。
其中,步骤D所述的用限制性内切酶NcoI和XhoI进行双酶切的酶切体系包括:pRSII418空载体45μl,上游引物和下游引物各2μl,限制性内切酶缓冲液6μl,加超纯水至总体积50μl。
一种用所述嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白基因工程菌制备的嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白,所述嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。
所述的嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白的制备方法,将构建的具有嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白基因的腺嘌呤缺陷型毕赤酵母工程菌进行放大培养,然后通过细胞超声破碎、过镍柱收集、咪唑缓冲液洗脱,盐析再复性分离纯化得到嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白。
所述的嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白在生物质能源生产、木糖和木聚糖生产中的应用。
本发明的有益效果是:采用Touch-downPCR方法有效避免了由于3端引物过长导致Tm过高、以及存在发卡结构导致的错配问题;选择的质粒pET-28a(+)具有高拷贝数,能够有效实现基因的扩增;本发明的嗜热β-1,4木聚糖酶具有极高的热稳定性,耐碱性环境以及对金属离子、有机溶剂及表面活性剂的抗性,可用于生物质能源生产、功能糖、功能糖醇生产中。
附图说明
图1为重组表达载体pRSII418-xyl-His的构建示意图;
图2为嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白SDS-PAGE电泳图;
图3为嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白在不同pH下相对酶活性示意图;
图4为嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白在不同温度下相对酶活性示意图。
具体实施方式
一种嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白基因工程菌的构建方法,所述的嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示,所述构建方法包括以下步骤:
步骤A:高温烷烃地芽孢杆菌(GeobacillusthermoleovoransDSM5366)的培养
按照DSMZ的配方配置培养基,按照100体积份的厌氧培养基注入1体积高温烷烃地芽孢杆菌的比例,将高温烷烃地芽孢杆菌接种到培养基中进行培养;
步骤B、基因组DNA的提取
将步骤A培养的高温烷烃地芽孢杆菌用细菌基因组DNA提取试剂盒提取高温烷烃地芽孢杆菌的基因组,得到基因组DNA溶液;
步骤C:引物设计及用聚合酶链式反应(PCR)法钓取嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白目的基因,通过在下游引物中终止密码子前加入6个His标签,在PCR过程中同步获得融合蛋白xyl-his,其中,
上游引物:5’CCAGTCCCATGGATGCGGAACGTCGTGCGTAA3’,划线部分为NcoI的酶切位点;
下游引物:5’CGACGACTCGAGCTAATGATGATGATGATGATGTTTGTGGTCGATAATAGCCCA3’,划线部分为XhoI的酶切位点;
以步骤B所得基因组DNA溶液为模板,在上述上游引物和下游引物的参与下进行PCR反应,得到PCR扩增产物,再对扩增产物进行纯化,得到纯化的PCR产物,然后用限制性内切酶NcoI和XhoI进行双酶切,得到嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白目的基因,将其与同样进行双酶切的pET-28a(+)质粒采用Takara的DNA连接酶进行连接,采用点击的方式转化入大肠杆菌DH5α中,筛选5个克隆子提取质粒进行克隆片段测序鉴定,成功获得含有融合蛋白的质粒pET-28a(+)-xyl-His;
步骤D:构建重组表达载体
将pET-28a(+)-xyl-His和pRSII418采用限制性内切酶NcoI和XhoI进行双酶切,将获得的xyl-His片段与线性化的pRSII418质粒进行连接,得到重组表达载体pRSII418-xyl-His;
步骤E:将重组表达载体转化到宿主细胞中
将步骤D所得重组表达载体转化到毕赤酵母(PMAD16(Ade),采购自Invitrogen公司)中进行培养,采用腺嘌呤缺陷型培养基进行筛选,并对筛选出的克隆子中质粒进行测序验证,最终获得了具有嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白基因的腺嘌呤缺陷型毕赤酵母工程菌。
作为优选的技术方案,所述的PCR反应的反应体系按以下方法配制:
步骤一、DNA聚合酶(PfU酶,Takara公司)1μl,DNA聚合酶缓冲液(Primerstarbuffer)5μl,作为模板的基因组DNA溶液2μl,2.5mM脱氧核苷酸混合物(dNTP)8μl,上下游引物各加40pmol,加超纯水至总体积50μl;
步骤二、所述的PCR反应的反应程序为:94℃预变性3min;
步骤三、然后98℃变性30s,退火温度从70-56℃,每个循环降低1℃,退火时间30s,72℃延伸60s,共15个循环;之后再98℃变性30s,退火温度55℃,退火时间30s,72℃延伸60s,共20个循环;最后再72℃延伸20min,
作为优选的技术方案,所述步骤C所述的用限制性内切酶NcoI和XhoI进行双酶切的酶切体系包括:500ng纯化的质粒,上游引物和下游引物各2μl,限制性内切酶缓冲液(FDbuffer)4.9μl。
作为优选的技术方案,所述的脱氧核苷酸混合物是脱氧腺嘌呤苷酸、脱氧鸟嘌呤苷酸、脱氧胞嘧啶核苷酸和脱氧胸腺嘧啶核苷酸的混合物,其中脱氧腺嘌呤苷酸和脱氧胸腺嘧啶核苷酸每种浓度为30nmol/L,脱氧鸟嘌呤苷酸、脱氧胞嘧啶核苷酸每种浓度为20nmol/L。
作为优选的技术方案,步骤D所述的用限制性内切酶NcoI和XhoI进行双酶切的酶切体系包括:pRSII418空载体100ng,上游引物和下游引物各2μl,限制性内切酶缓冲液(FDbuffer)6μl,加超纯水至总体积50μl。
一种用上述嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白基因工程菌制备的嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白,其氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。
该嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白具有以下特性:
(1)最适反应温度
在45-85℃表现催化活力,最适反应温度为75℃;
(2)最适反应pH
在pH4.2-12.0范围内表现催化活力,最适pH为8.0;
(3)底物特异性
能够有效地催化桦木木聚糖(Birchwood),山毛榉木聚糖(Beechhood),燕麦木聚糖(OatSpelts),高粘度羟甲基纤维素(高粘度CMC),低粘度羟甲基纤维素(低粘度CMC)的水解,其中水解的最适底物为山毛榉木聚糖;
(4)热稳定性
将嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白在不同温度孵育,表现出很好的热稳定性,其中75℃下保温6h仍然保持70%的活力,80℃下保温3h仍然保持40%的活力;
(5)对一价金属离子有很好的抗性。
上述嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白的制备方法是,将构建的毕赤酵母进行放大培养,然后通过细胞超声破碎、过镍柱收集、咪唑缓冲液洗脱,盐析再复性分离纯化得到嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白。
所述的嗜热β-1,4木聚糖酶融合蛋白用于生物质能源生产、木糖和木聚糖等功能糖生产中。
高温烷烃地芽孢杆菌(GeobacillusthermoleovoransDSM5366)是一株极度嗜热的细菌,可以降解纤维素,半纤维素,其最适生长温度为75℃。菌种购买于德国微生物菌种保藏中心DSMZ(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturen),通过随机引物PCR对高温烷烃地芽孢杆菌(GeobacillusthermoleovoransDSM5366)的纤维素和半纤维素代谢酶系进行分析发现,该菌基因组可以编码一种嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白,可以将其DNA分子中表达嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白活性的基因序列称为嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白基因xyl。由于嗜热的高温烷烃地芽孢杆菌(GeobacillusthermoleovoransDSM5366)是一株极端环境细菌,培养条件复杂,人工培养比较困难,菌体密度过低,很难大批量的生产该酶,因此直接用培养该菌来生产嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白成本比较高且周期比较长。将嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白基因转入易培养、可快速繁殖的常温宿主如毕赤酵母内,能够有效地解决上述问题。
对高温烷烃地芽孢杆菌(GeobacillusthermoleovoransDSM5366)通过培养、目的基因的提取,得到本发明所述嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白基因,我们委托北京生工生物技术有限公司进行基因测序,其核苷酸序列如序列表SEQIDNo.1所示。
将嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白基因装载在pRSII418***载体上,然后转入到毕赤酵母(ADE缺陷型)宿主中,得到一株含目的基因的毕赤酵母工程菌。表达的产物是细胞可溶性蛋白,通过细胞超声破碎、、过镍柱收集、咪唑缓冲液洗脱,盐析再复性分离纯化得到嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白。
工程菌表达的嗜热蛋白为嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白,其氨基酸序列如序列表SEQIDNo.2所示。该嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白的最适催化温度为70℃,最适pH为7.2,可以催化木聚糖水解,有广泛的应用前景。如在生物能源领域,在以碱预处理木质纤维素为底物制取生物燃料时,采用该酶能有效耐受碱处理物料pH,减少碱处理后调pH步骤,同时能很好地与高温纤维素酶作用,有效降低生产成本;提取纤维素后剩余的木质纤维素中存在大量半纤维素原料,碱预处理后废液也同样含有大量的寡聚半纤维素,由于该酶在碱性范围有良好的活性,而且对废液中的金属离子具有极好的抗性,可以用于生产木糖、***糖等功能糖,进一步获得木糖醇等产品。
实施例1:嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白工程菌的构建及其酶的表达:1、高温烷烃地芽孢杆菌(GeobacillusthermoleovoransDSM5366)的培养及其基因组DNA的提取,按照DSMZ的配方,配置厌氧培养基(anaerocellummedium),分装于厌氧试管中,每管5ml,培养基封闭后用真空泵将试管中的空气抽干,并充入一定量的氮气和二氧化碳的混合气体(80%N2和20%CO2),在厌氧箱中用培养基1ml溶解购买于DSMZ的高温烷烃地芽孢杆菌(GeobacillusthermoleovoransDSM5366),按照1%的接菌量接种于5ml试管中,混匀,70℃静置培养数天,直至细菌开始生长起来。然后转移至装有100ml培养基的锥形瓶中70℃培养数天,-80℃保存菌体备用。
取5ml小试管培养的高温烷烃地芽孢杆菌(GeobacillusthermoleovoransDSM5366),用北京普博欣生物技术有限责任公司的细菌基因组DNA小量提取试剂盒(BacteriaGenomicMiniPreparationKit)提取细菌的基因组,所得染色体DNA溶液放4℃冰箱备用。
2、引物设计及用PCR法提取并获得嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白基因及重组载体的制备;
嗜热细菌高温烷烃地芽孢杆菌(GeobacillusthermoleovoransDSM5366)基因组中含有几段预测的可能的嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白基因。选择核苷酸序列如表SEQIDNo.1所示的基因作为研究对象,命名为xyl。该酶基因通过PCR方法从步骤1所得的基因组DNA中扩增而得到。两个引物是根据基因的序列及载体的限制性内切酶位点而设计的,委托上海生工生物工程公司合成。上游引物5’CCAGTCCCATGGATGCGGAACGTCGTGCGTAA3’,划线部分;为NcoI的酶切位点;下游引物:5’CGACGACTCGAGCTAATGATGATGATGATGATGTTTGTGGTCGATAATAGCCCA3’,划线部分为XhoI的酶切位点;两个引物所设置的酶切位点与表达载体pET-28a(+)的NcoI和XhoI相匹配,适合于在大肠杆菌中高效表达。
PCR反应:在50μl反应体系中含有1μlPrimerstarDNA聚合酶,Primerstarbuffer5μl,模板DNA(基因组DNA)2μl,2.5mMdNTP混合物(其中脱氧腺嘌呤苷酸和脱氧胸腺嘧啶核苷酸每种浓度为30nmol/L,脱氧鸟嘌呤苷酸、脱氧胞嘧啶核苷酸每种浓度为20nmol/L)8μl,上下游引物各加40pmol,,加无菌超纯水至总体积50μl。PCR反应程序为:94℃预变性3min;循环程序为98℃变性30s,退火温度从70-56℃,每个循环降低1℃,退火时间30s,72℃延伸60s,共15个循环;之后再98℃变性30s,退火温度55℃,退火时间30s,72℃延伸60s,共20个循环;最后再72℃延伸20min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,分子量大小为1224bp,与预测的结果一致。
将纯化的PCR产物用限制性内切酶NcoI和XhoI进行双酶切,酶切体系包括:
采用天根公司质粒提取试剂盒提取pET-28(a)-xyl-His质粒,500ng的含有目的基因质粒中加入NcoI和XhoI各2μl,FD-buffer4.9μl,37℃下保温2小时。酶切完毕后用0.8%的琼脂糖凝胶进行电泳,再用DNA凝胶检测试剂盒回收酶切后的DNA片段。
用同样的限制性内切酶NcoI和XhoI来酶切pRCII418载体,反应体系为50μl,体系包括:pRCII418空载体45μl,上游引物和下游引物各2μl,限制性内切酶缓冲液6μl,加超纯水至总体积50μl。37℃下保温2小时,然后再用磷酸酶(FastAP)处理去磷酸化,反应二十分钟左右,用0.8%的琼脂糖凝胶进行电泳检测,再用胶回收试剂盒回收。
在16℃用连接试剂盒来连接木聚糖酶基因和载体。将连接载体转入DH5α中,用含卡那霉素的琼脂平板进行单克隆菌株的筛选和鉴定。挑取一个阳性的单克隆,加入到含卡那霉素的试管中,37℃180rpm/min培养过夜,取菌液进行PCR验证,得到一条大小为1224bp的条带即为目的基因,证明目的基因已经与载体连接并转化到宿主中。测序正确后,提取重组质粒转化到毕赤酵母中进行表达pRCII418-xyl-His。测序工作由上海华大基因完成。
3、重组载体在宿主细菌中的表达:
将重组的DNA质粒、pRCII418-xyl-His转化到毕赤酵母中。毕赤酵母制备及其载体转化方法参照《分子克隆实验指南》。挑取阳性转化菌,置5ml不含腺膘呤的培养液中37℃振荡培养过夜,次日接种到100ml新鲜的不含腺膘呤的2YT培养基中,37℃继续培养4h。将初步放大的种子液以1%的比例接入1L的2YT培养基中培养(37℃,120rpm/min),其中不含腺膘呤,当OD600达到0.8左右时加入200mg/ml的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG),降低培养温度至22℃,诱导菌体表达目的蛋白。4℃过夜诱导表达,得到本发明所述工程菌,10000rpm,10min离心搜集菌体。然后用50mM,pH8.0的Tris-HCl缓冲液重悬菌体,超声破碎(1s×1s,30min)后14,000离心30分钟获得粗酶液。
粗酶液进一步过镍柱后采用适当浓度的咪唑缓冲液洗脱,得到目的酶,然后在pH7.2、温度56℃条件下,以山毛榉木聚糖为底物测定不同处理后的酶活力以及相应的蛋白浓度,得到不同处理后的蛋白纯化表,如表1所示。
表1嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白的蛋白纯化表:
应用SDS-PAGE(12%)电泳检测重组蛋白的纯度,可见46.5KDa附近可见一条电泳条带,如图1所示。
实施例2:重组嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白的活性分析
重组嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白活性使用DNS法进行分析:在pH7.2,70℃条件下,300μl的反应体系包括5μl适当稀释的酶液,150μl2%的底物(g/100mL),60μl缓冲液(20mM)和85μlddH2O,反应5min,加入600μlDNS终止反应,沸水煮5min,冷却后540nm测定OD值,以葡萄糖为标准曲线,计算酶活力。1个酶活单位(U)定义为在给定条件每分钟降解1%的木聚糖溶液释放1umol还原糖所需要的酶量。
实施例3:重组嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白的性质测定。
1、重组嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白的最适pH和pH稳定性的测定方法如下:将实施例1纯化的重组嗜热β-1,4木聚糖酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。以山毛榉木聚糖作为底物,利用实施例2中的反应体系,用20mmol不同pH的缓冲液在60℃下进行木聚糖酶活力测定。结果如图2所示,表明嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白的最适pH为8.0,在pH6.5-9.5的范围内,酶活性可以维持最大酶活性的60%以上。嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白于上述不同pH缓冲液中室温条件处理240min,再在60℃下测定酶活性,以研究酶的pH耐性。结果表明嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白在pH5-12之间均很稳定,在此pH范围内处理240min后剩余酶活性在90%以上,这说明此酶具有非常好的pH稳定性。所使用的缓冲液为宽范围pHbuffer:以乙酸、N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸(HEPS)、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、3-环己胺基丙磺酸(CAPS)和2-码啉乙磺酸(MES))为基础,分别在70℃下精确配制100mM不同pH的缓冲液。
2、重组嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白的最适反应温度和热稳定性的测定方法;
嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白的最适温度的测定为以山毛榉木聚糖作为底物,在宽范围缓冲液(pH7.2)体系及40-85℃温度范围内测定嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白的活力。热稳定性测定为嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白在不同温度下处理不同时间,再在75℃下进行酶活测定。酶反应最适温度测定结果如图3所示,表明最适温度为70℃。酶的热稳定性试验结果如图4所示,表明嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白在60℃下稳定性非常好,在75℃下保温4h仍然可以保持70%的酶活力,80℃下保温3h仍然可以保持40%的酶活力。
当然,本发明还可有其它多种实施例,在不背离本发明精神及其实质的情况下,熟悉本领域的技术人员可根据本发明作出各种相应的改变和变形,但这些相应的改变和变形都应属于本发明权利要求的保护范围。
Claims (10)
1.一种嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白基因工程菌的构建方法,其特征在于,所述的嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示,所述构建方法包括以下步骤:
步骤A:高温烷烃地芽孢杆菌的培养
配置厌氧培养基,按照100体积份的厌氧培养基注入1体积高温烷烃地芽孢杆菌的比例,将高温烷烃地芽孢杆菌接种到厌氧培养基中进行培养;
步骤B:基因组DNA的提取
将步骤A培养的高温烷烃地芽孢杆菌用细菌基因组DNA提取试剂盒提取高温烷烃地芽孢杆菌的基因组,得到基因组DNA溶液;
步骤C:设计引物及用聚合酶链式反应法钓取嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白目的基因
通过在下游引物中终止密码子前加入6个His标签,在聚合酶链式反应过程中同步获得融合蛋白xyl-his,其中,
上游引物:5’CCAGTCCCATGGATGCGGAACGTCGTGCGTAA3’,划线部分为NcoI的酶切位点;
下游引物:5’CGACGACTCGAGCTAATGATGATGATGATGATGTTTGTGGTCGATAATAGCCCA3’,划线部分为XhoI的酶切位点;
以步骤B所得基因组DNA溶液为模板,在所述上游引物和下游引物的参与下进行聚合酶链式反应,得到聚合酶链式反应扩增产物,再对扩增产物进行纯化,得到纯化的聚合酶链式反应产物,然后用限制性内切酶NcoI和XhoI进行双酶切,得到嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白目的基因;将其与同样进行双酶切的pET-28a(+)质粒采用DNA连接酶进行连接,采用点击的方式转化入大肠杆菌DH5α中,筛选5个克隆子提取质粒进行克隆片段测序鉴定,成功获得含有融合蛋白的质粒pET-28a(+)-xyl-His;
步骤D:构建重组表达载体
将pET-28a(+)-xyl-His和pRSII418采用限制性内切酶NcoI和XhoI进行双酶切,将获得的xyl-His片段与线性化的pRSII418质粒进行连接,得到重组表达载体pRSII418-xyl-His;
步骤E:将重组表达载体转化到宿主细胞中
将步骤D所得重组表达载体转化到毕赤酵母中进行培养,采用腺嘌呤缺陷型培养基进行筛选,并对筛选出的克隆子中质粒进行测序验证,最终获得了具有嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白基因的腺嘌呤缺陷型毕赤酵母工程菌。
2.根据权利要求1所述的嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白基因工程菌的构建方法,其特征在于,按照德国微生物菌种保藏中心的配方配置步骤A中的厌氧培养基。
3.根据权利要求1所述的嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白基因工程菌的构建方法,其特征在于,所述的聚合酶链式反应的反应体系按以下方法配制:DNA聚合酶1μl,DNA聚合酶缓冲液5μl,作为模板的基因组DNA溶液2μl,2.5mM脱氧核苷酸混合物8μl,上游引物和下游引物各加40pmol,加超纯水至总体积50μl。
4.根据权利要求1所述的嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白基因工程菌的构建方法,其特征在于,所述的聚合酶链式反应的反应程序包括以下两个步骤:
步骤一、94℃预变性3min;
步骤二、然后98℃变性30s,退火温度从70-56℃,每个循环降低1℃,退火时间30s,72℃延伸60s,共15个循环;之后再98℃变性30s,退火温度55℃,退火时间30s,72℃延伸60s,共20个循环;最后再72℃延伸20min。
5.根据权利要求1所述的嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白基因工程菌的构建方法,其特征在于,所述步骤C所述的用限制性内切酶NcoI和XhoI进行双酶切的酶切体系包括:500ng纯化的质粒,上游引物和下游引物各2μl,限制性内切酶缓冲液4.9μl。
6.根据权利要求3所述的嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白基因工程菌的构建方法,其特征在于,所述的脱氧核苷酸混合物是脱氧腺嘌呤苷酸、脱氧鸟嘌呤苷酸、脱氧胞嘧啶核苷酸和脱氧胸腺嘧啶核苷酸的混合物,其中脱氧腺嘌呤苷酸和脱氧胸腺嘧啶核苷酸的浓度均为30nmol/L,脱氧鸟嘌呤苷酸和脱氧胞嘧啶核苷酸的浓度均为20nmol/L。
7.根据权利要求1所述的嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白基因工程菌的构建方法,其特征在于,步骤D所述的用限制性内切酶NcoI和XhoI进行双酶切的酶切体系包括:pRSII418空载体45μl,上游引物和下游引物各2μl,限制性内切酶缓冲液6μl,加超纯水至总体积50μl。
8.一种用所述嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白基因工程菌制备的嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白,其特征在于,所述嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。
9.权利要求8所述的嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白的制备方法,其特征在于,将构建的具有嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白基因的腺嘌呤缺陷型毕赤酵母工程菌进行放大培养,然后通过细胞超声破碎、过镍柱收集、咪唑缓冲液洗脱,盐析再复性分离纯化得到嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白。
10.权利要求8所述的嗜热β-1,4木聚糖酶-His融合蛋白在生物质能源生产、木糖和木聚糖生产中的应用。
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