CN105779488B - 一种诱导外源基因在革兰氏阴性菌中表达的***及其应用 - Google Patents

一种诱导外源基因在革兰氏阴性菌中表达的***及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种诱导外源基因在革兰氏阴性菌中表达的***及其应用。本发明提供了一种在革兰氏阴性菌中表达外源基因的方法，为为用含有阻遏蛋白表达盒和RNA聚合酶表达盒的调控元件调控外源基因表达盒在革兰氏阴性菌中表达；本发明的实验证明，本发明提供革兰氏阴性菌中高效诱导表达***由特定聚合酶和其对应的启动子两部分构成，在革兰氏阴性菌中诱导表达聚合酶、启动子和驱动的外源基因，可实现外源基因的高效大量表达，实现工业生产中具备简化提取步骤、提高蛋白表达量、降低生产成本的重要意义，具有广泛的应用前景，具有广阔的商业利用价值。

Description

一种诱导外源基因在革兰氏阴性菌中表达的***及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种诱导外源基因在革兰氏阴性菌中表达的***及其应用。
背景技术
发酵工业中，对工业微生物的改造是提升发酵效率、获得新产品、降低发酵成本的基本方法之一。而改造的目的主要是提高微生物生长速率，增加微生物内在的表达效率，提升产品转化率。因此，对微生物进行底盘改造，在菌株内构建高效的表达***则成为了达到这一目的的有效手段。
在已有的底盘微生物中，带有T7表达***，使用IPTG进行诱导的大肠杆菌是最为常用的发酵微生物之一，众多的蛋白都由此类菌株诱导表达产生，产量高，操作容易，覆盖面广。T7表达***来源于噬菌体中的一种，而不同种类的噬菌体带有不同的表达***，目前尚缺乏对除T7噬菌体外表达***的更深入研究，更缺少将此类表达***移植到工业微生物菌株中的尝试。
革兰氏阴性菌是对一类细菌的统称，含有多个细菌种类，如盐单胞菌，罗氏真养菌和假单胞菌。在革兰氏阴性菌中，多种细菌含有生产聚羟基脂肪酸酯(PHA)的能力或潜能。如罗氏真养菌可以生产聚3-羟基丁酸酯(PHB)。这些革兰氏阴性菌可以被视为潜在的工业菌株，可以通过基因改造获得具备表达基因和蛋白的性能，进而成为工业的重组菌。除此之外，另一类革兰氏阴性菌：盐单胞菌是在高盐浓度下正常生长的细菌。盐单胞菌Halomonas为一类盐单胞菌的统称，包括Halomonas sp.TD01和Halomonas sp.LS21等。盐单胞菌Halomonas已经被证明具有生长速度快、干重高、不需灭菌以及可以进行低成本连续发酵等优点，并且可以高效生产聚羟基脂肪酸酯PHA，具备成为优秀底盘微生物的潜力。
但是目前潜在的工业菌株的分子生物学操作仍处于初始阶段，缺少能在其中高效诱导表达基因蛋白的表达***，制约了更多工业发酵产品在菌株内的生产。在革兰氏阴性菌中构建高效诱导表达***是当务之急，更是开拓发酵工业的必由之路。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种在革兰氏阴性菌中表达外源基因的方法。
本发明提供的方法，为用含有阻遏蛋白表达盒和RNA聚合酶表达盒的调控元件调控外源基因表达盒在革兰氏阴性菌中表达；
所述RNA聚合酶表达盒中的RNA聚合酶与所述外源基因表达盒中的驱动外源基因表达的启动子相匹配；
所述RNA聚合酶为K1F、VP4或MmP1；
所述K1F相匹配的驱动外源基因表达的启动子为K1F-P；
所述VP4相匹配的驱动外源基因表达的启动子为VP4-P；
所述MmP1相匹配的驱动外源基因表达的启动子为MmP1-P；
所述K1F为如下a或b：
a)序列表中序列8所示的蛋白质；
b)将序列表中序列8所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列8衍生的蛋白质；
所述VP4为如下c或d：
c)序列表中序列9所示的蛋白质；
d)将序列表中序列9所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列9衍生的蛋白质；
所述MmP1为如下e或f：
e)序列表中序列10所示的蛋白质；
f)将序列表中序列10所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列10衍生的蛋白质；
所述启动子K1F-P为如下1)或2)：
1)编码区为序列表中序列4所示的DNA分子；
2)将序列4经过一个或几个核苷酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列4衍生的DNA分子；
2)优选为如下：
K1F对应启动子突变体1的核苷酸序列为将K1F对应启动子序列的第13-16位的tata替换为tttg得到的序列。
K1F对应启动子突变体2的核苷酸序列为将K1F对应启动子序列的第13-16位的tata替换为tgtg得到的序列。
K1F对应启动子突变体3的核苷酸序列为将K1F对应启动子序列的第13-16位的tata替换为tgtt得到的序列。
K1F对应启动子突变体4的核苷酸序列为将K1F对应启动子序列的第13-16位的tata替换为ttgg得到的序列。
K1F对应启动子突变体5的核苷酸序列为将K1F对应启动子序列的第13-16位的tata替换为ttgt得到的序列。
K1F对应启动子突变体6的核苷酸序列为将K1F对应启动子序列的第13-16位的tata替换为cggg得到的序列。
K1F对应启动子突变体7的核苷酸序列为将K1F对应启动子序列的第13-16位的tata替换为gagg得到的序列。
所述启动子VP4-P为如下3)或4)：
3)编码区为序列表中序列5所示的DNA分子；
4)将序列5经过一个或几个核苷酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列5衍生的DNA分子；
4)优选为如下：
VP4对应启动子突变体1的核苷酸序列为将VP4对应启动子序列的第13-17位的tata替换为cata得到的序列。
VP4对应启动子突变体2的核苷酸序列为将VP4对应启动子序列的第13-17位的tata替换为tgta得到的序列。
VP4对应启动子突变体3的核苷酸序列为将VP4对应启动子序列的第13-17位的tata替换为aata得到的序列。
VP4对应启动子突变体4的核苷酸序列为将VP4对应启动子序列的第13-17位的tata替换为catg得到的序列。
VP4对应启动子突变体5的核苷酸序列为将VP4对应启动子序列的第13-17位的tata替换为cttt得到的序列。
VP4对应启动子突变体6的核苷酸序列为将VP4对应启动子序列的第13-17位的tata替换为tctt得到的序列。
VP4对应启动子突变体7的核苷酸序列为将VP4对应启动子序列的第13-17位的tata替换为cgtt得到的序列。
所述启动子MmP1-P为如下5)或6)：
5)编码区为序列表中序列6所示的DNA分子；
6)将序列6经过一个或几个核苷酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列6衍生的DNA分子。
6)优选为如下：
MMP1对应启动子突变体1的核苷酸序列为将MMP1对应启动子序列的第13-17位的tata替换为tctt得到的序列。
MMP1对应启动子突变体2的核苷酸序列为将MMP1对应启动子序列的第13-17位的tata替换为tagg得到的序列。
MMP1对应启动子突变体3的核苷酸序列为将MMP1对应启动子序列的第13-17位的tata替换为cctt得到的序列。
MMP1对应启动子突变体4的核苷酸序列为将MMP1对应启动子序列的第13-17位的tata替换为actt得到的序列。
MMP1对应启动子突变体5的核苷酸序列为将MMP1对应启动子序列的第13-17位的tata替换为gctc得到的序列。
MMP1对应启动子突变体6的核苷酸序列为将MMP1对应启动子序列的第13-17位的tata替换为cgtg得到的序列。
MMP1对应启动子突变体7的核苷酸序列为将MMP1对应启动子序列的第13-17位的tata替换为atgt得到的序列。
所述K1F的基因为如下(1)或(2)或(3)：
(1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；
(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子；
(3)与(1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子；
所述VP4的基因为如下(1)或(2)或(3)：
(1)编码区为序列表中序列2所示的DNA分子；
(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子；
(3)与(1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子；
所述MmP1的基因为如下(1)或(2)或(3)：
(1)编码区为序列表中序列3所示的DNA分子；
(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子；
(3)与(1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子。
上述方法中，含有阻遏蛋白表达盒和RNA聚合酶表达盒的调控元件从5’端依次由阻遏蛋白表达盒、无义随机片段、RNA聚合酶启动子和RNA聚合酶编码基因组成。
所述外源基因表达盒由外源基因启动子和外源基因组成；
所述阻遏蛋白表达盒由阻遏蛋白启动子和阻遏蛋白编码基因组成；
所述RNA聚合酶表达盒由RNA聚合酶启动子和RNA聚合酶编码基因组成；
利用乳糖操纵子原理，通过是否诱导，调控阻遏蛋白是否阻遏RNA聚合酶的表达，从而调控外源基因启动子是否启动外源基因的表达。
上述方法中，所述阻遏蛋白为lacI，但不限于lacI；本实施例优选为lacI。
调控元件LacIK1F，从5’端依次由LacI表达盒、无义随机片段、启动聚合酶表达的启动子TacP和K1Fase聚合酶编码基因组成，且LacI蛋白和K1F聚合酶表达方向相反。LacI蛋白的氨基酸序列为序列27，K1F聚合酶的氨基酸序列为序列8；所述LacI表达盒(由LacI启动子和LacI编码基因组成)的核苷酸序列为序列19；所述无义随机片段的核苷酸序列序列为序列29，所述启动聚合酶表达的启动子TacP核苷酸序列为序列28，所述K1Fase聚合酶编码基因核苷酸序列为序列1。
调控元件LacIVP4，从5’端依次由LacI表达盒、无义随机片段、启动聚合酶表达的启动子TacP和VP4聚合酶编码基因组成，且LacI蛋白和VP4聚合酶表达方向相反。LacI蛋白的氨基酸序列为序列27，VP4聚合酶的氨基酸序列为序列9；LacI表达盒的核苷酸序列为序列19；所述无义随机片段序列为序列29，所述启动子TacP核苷酸序列为序列28，所述VP4聚合酶编码基因核苷酸序列为序列2。
调控元件LacIMmP1，从5’端依次由LacI表达盒、无义随机片段、启动聚合酶表达的启动子TacP和MmP1聚合酶编码基因组成，且LacI蛋白和MmP1聚合酶表达方向相反。LacI蛋白的氨基酸序列为序列27，MmP1聚合酶的氨基酸序列为序列10；LacI表达盒的核苷酸序列为序列19；所述无义随机片段序列为序列29，所述启动聚合酶表达的启动子TacP核苷酸序列为序列28，所述MmP1聚合酶编码基因核苷酸序列为序列3。
LacI的氨基酸序列为序列表中序列27。
上述方法中，所述革兰氏阴性菌为非大肠杆菌；所述非大肠杆菌具体为生产聚羟基脂肪酸酯的菌株。
上述方法中，所述生产聚羟基脂肪酸酯的菌株为盐单胞菌、罗氏真养菌或假单胞菌。盐单胞菌出发菌为Halomonas其中任何一类亚种，包括但不仅限于Halomonas sp.TD01以及Halomonas sp.LS21等具体亚种。罗氏真养菌的出发菌包括但不仅限于H16，假单胞菌的出发菌包括但不仅限于KT2440。
上述方法中，所述方法包括如下步骤：将所述调控元件的编码基因和外源基因表达盒导入革兰氏阴性菌中，得到重组菌，诱导培养重组菌，实现外源基因的表达。
上述方法中，所述调控元件的编码基因和所述外源基因表达盒通过整合或非整合的方式导入所述革兰氏阴性菌。
上述方式为：所述调控元件的编码基因和所述外源基因表达盒均整合，所述调控元件的编码基因和所述外源基因表达盒均不整合；所述调控元件的编码基因整合，和所述外源基因表达盒不整合；所述调控元件的编码基因不整合，和所述外源基因表达盒整合。其中所述非整合的方式可以是存在于质粒中。
上述方法为如下1)或2)或3)：
1)包括如下步骤：将所述调控元件通过同源重组整合到所述革兰氏阴性菌中，得到中间菌；再将所述外源基因表达盒通过重组载体A导入所述中间菌中，得到重组菌，诱导培养所述重组菌，实现外源基因表达；
所述重组载体A为将所述含有对应的外源基因启动子及外源基因的片段***表达载体中得到的重组载体；
2)包括如下步骤：将所述调控元件通过同源重组整合到所述革兰氏阴性菌中，得到中间菌；再将所述外源基因表达盒通过同源重组整合到所述中间菌中，得到重组菌，诱导培养所述重组菌，实现外源基因表达；
3)包括如下步骤：将所述调控元件和所述外源基因表达盒通过重组载体B导入所述革兰氏阴性菌中，得到重组菌，诱导培养所述重组菌，实现外源基因表达；
所述重组载体B为将所述调控元件和所述外源基因表达盒均***表达载体中得到的载体。
上述方法中，在阻遏蛋白LacI表达的情况下，TacP丧失转录起始能力，RNA聚合酶不表达，不能转录外源基因；在加入IPTG后，TacP恢复转录起始能力，RNA聚合酶恢复表达，转录外源基因。
本发明的另一个目的是提供一种在革兰氏阴性菌中表达外源基因的***。
本发明提供的***，为如下1)或2)或3)或4)：
1)由所述调控元件和所述外源基因表达盒组成；
2)表达所述调控元件的重组载体和表达所述外源基因表达盒的重组载体组成；
3)表达所述调控元件和所述外源基因表达盒的重组载体；
4)重组菌，为含有所述调控元件和所述外源基因表达盒的革兰氏阴性菌。
上述重组菌为将所述调控元件的编码基因和所述外源基因表达盒导入革兰氏阴性菌中，得到重组菌。
所述调控元件的编码基因和所述外源基因表达盒具体通过整合或非整合的方式导入所述革兰氏阴性菌。
上述方法中，上述外源基因为菌体伸长形状相关基因、报告基因或PHA颗粒表面的结合蛋白编码基因；外源基因具体包括但并不仅限于菌体伸长基因MinCD和PHA相关基因TD-PhaP蛋白编码基因、4AK4-PhaP蛋白编码基因或Re-PhaR蛋白编码基因；
上述方法中，在本发明的实施例中，所述外源基因表达盒中的外源基因为菌体伸长相关操纵子；所述重组菌为将所述调控元件和所述菌体伸长相关操纵子表达盒导入革兰氏阴性菌中，得到重组菌；所述菌体伸长相关操纵子具体为MinCD操纵子；
或，所述外源基因表达盒中的外源基因为PHA颗粒表面的结合蛋白；所述重组菌为将所述调控元件和所述PHA颗粒表面结合蛋白基因表达盒导入革兰氏阴性菌中，得到重组菌；所述PHA颗粒表面结合蛋白基因具体为TD-PhaP蛋白编码基因、4AK4-PhaP蛋白编码基因或Re-PhaR蛋白编码基因。所述的MinCD操纵子的核苷酸序列见序列7；
所表达的MinC基因氨基酸序列见序列11，所表达的MinD基因氨基酸序列见序列12；
MinCD操纵子表达盒为MmP1-P-MinCD，其核苷酸序列从5’端起依次由MmP1对应启动子的核苷酸序列(序列6)和MinCD操纵子序列(序列7)组成；
PHA颗粒表面的结合蛋白TD-PhaP蛋白的氨基酸序列为序列16，其编码基因的核苷酸序列为序列13；TD-PhaP蛋白基因表达盒为MmP1-P-TD-PhaP，其核苷酸序列从5’端起依次由MmP1-P的核苷酸序列(序列6)和TD-PhaP片段编码基因(序列13)组成。
PHA颗粒表面的结合蛋白4AK4-PhaP蛋白的氨基酸序列为序列17，其编码基因的核苷酸序列为序列14；4AK4-PhaP蛋白基因表达盒为MmP1-P-4AK4-PhaP，其核苷酸序列从5’端起依次由MmP1-P的核苷酸序列(序列6)和4AK4-PhaP片段编码基因(序列14)组成。
PHA颗粒表面的结合蛋白Re-PhaR蛋白的氨基酸序列为序列18，其编码基因的核苷酸序列为15。Re-PhaR蛋白表达和为MmP1-P-Re-PhaR，其核苷酸序列从5’端起依次由MmP1-P的核苷酸序列(序列6)和Re-PhaR片段编码基因(序列15)组成。
上述方法或上述重组菌或上述***在控制外源基因表达中的应用也是本发明保护的范围。
本发明第三个目的是提供一种可控表达外源基因的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：通过是否诱导培养上述的重组菌，调控外源基因的表达量；经过诱导培养的外源基因的表达量大于未经过诱导培养的外源基因的表达量。
需要说明的是，随亚种的不同，高效诱导表达平台在重组菌株中的表现可能会有所差异。
上述办法中通过使用任意一种使用高效诱导表达***表达特定基因或蛋白的功能菌株属于本专利的保护范围。
本发明中获得的平台菌和功能菌具有优良的表达效率和生物学性质，可供工业发酵和研究之用。
本发明的实验证明，本发明提供革兰氏阴性菌中高效诱导表达***由特定聚合酶和其对于的启动子两部分构成，在革兰氏阴性菌中诱导表达聚合酶、启动子和驱动的外源基因，可实现外源基因的高效大量表达，实现工业生产中具备简化提取步骤、提高蛋白表达量、降低生产成本的重要意义，具有广泛的应用前景，具有广阔的商业利用价值。
附图说明
图1为高效正交表达***原理示意图。
图2为三种启动子库在对应的平台菌中表达强度。
图3为重组菌菌体伸长的显微镜照片。
图4为重组菌表达PhaP和PhaR蛋白的SDS PAGE电泳图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
所用酶试剂采购自ThermoFisher公司和New England Biolabs(NEB)公司，提取质粒所用的试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，回收DNA片段的试剂盒购自美国omega公司，相应的操作步骤严格按照产品说明书进行，所有培养基如无特殊说明均用去离子水配制。
培养基配方：
1)一般培养基
LB培养基：5g/L酵母提取物(购自英国OXID公司，产品目录号LP0021)，10g/L蛋白胨(购自英国OXID公司，产品目录号LP0042),10g/L NaCl，其余为水。调pH值至7.0-7.2，高压蒸汽灭菌。
2)盐单胞菌培养基
60LB培养基：5g/L酵母提取物(购自英国OXID公司，产品目录号LP0021)，10g/L蛋白胨(购自英国OXID公司，产品目录号LP0042),60g/L NaCl，其余为水。调pH值至7.0-7.2，高压蒸汽灭菌。
在实际培养过程中，可向上述培养基中加入一定浓度的抗生素以维持质粒的稳定性，如100μg/mL氨苄青霉素或25μg/mL的氯霉素。
高效诱导表达***的作用原理见图1。图1中的RNA聚合酶代表3种***各自的RNA聚合酶，而启动子代表与每种聚合酶相对应的启动子。外源基因为绿色荧光蛋白GFP，可以在流式细胞仪下检测荧光强度。
下述实施例中的接合转化方法具体如下：
1.将含有目标质粒的大肠杆菌S17-1pir(Biovector中国质粒载体菌株基因库，货号：Biovector-104802，http://www.biovector.net/)37℃培养至OD600 0.6-0.8，4000rpm，4℃，10min离心，用新鲜LB洗涤一次并在同样条件下离心，然后用500μl新鲜LB重悬。
2.将Halomonas sp.TD01在37℃过夜培养，4000rpm,4℃,10min离心，用新鲜含有60g/L氯化钠的LB培养基(以下简称为60LB)洗涤一次并在同样条件下离心，然后用1ml新鲜含有60g/L氯化钠的LB培养基。
3.二者各100μl轻轻混合，并滴在30LB平板上(含有30g/L氯化钠的LB平板)中央，37℃下接合6h。
4.用新鲜含有60g/L氯化钠的LB培养基1ml将上述平板上的菌苔洗下来，涂筛选平板(60LB+CmR+PH10；含有60g/L氯化钠的LB固体培养基，含有25μg/mL氯霉素，PH调节为10)，倒置培养24-36小时。挑取单菌落用目标质粒的特异性引物进行菌落PCR验证。
实施例1、外源基因高效诱导表达***的制备
一、高效诱导表达***元件
高效诱导表达***元件包括含有阻遏蛋白表达盒和RNA聚合酶表达盒的调控元件和外源基因表达盒；
RNA聚合酶表达盒中的RNA聚合酶与外源基因表达盒中的驱动外源基因表达的启动子相匹配；
RNA聚合酶为K1F、VP4或MmP1；
K1F相匹配的驱动外源基因表达的启动子为K1F-P；
VP4相匹配的驱动外源基因表达的启动子为VP4-P；
MmP1相匹配的驱动外源基因表达的启动子为MmP1-P；
含有阻遏蛋白表达盒和RNA聚合酶表达盒的调控元件从5’端依次由阻遏蛋白表达盒、无义随机片段、RNA聚合酶启动子和RNA聚合酶编码基因组成。
外源基因表达盒由外源基因启动子和外源基因组成；
阻遏蛋白表达盒由阻遏蛋白启动子和阻遏蛋白编码基因组成，阻遏蛋白为lacI；
RNA聚合酶表达盒由RNA聚合酶启动子和RNA聚合酶编码基因组成。
1、调控元件LacIK1F
通过南京金斯瑞公司，合成如下三种调控元件：
调控元件LacIK1F，从5’端依次由LacI表达盒、无义随机片段、启动聚合酶表达的启动子TacP和K1Fase聚合酶编码基因组成，且LacI蛋白和K1F聚合酶表达方向相反。LacI蛋白的氨基酸序列为序列27，K1F聚合酶的氨基酸序列为序列8；LacI表达盒(由LacI启动子和LacI编码基因组成)的核苷酸序列为序列19；无义随机片段的核苷酸序列序列为序列29TTCGTCAGGCCACATAGCTTTCTTGTTCTGATCGGAACGATCGTTGGCTG，启动聚合酶表达的启动子TacP核苷酸序列为序列28，K1Fase聚合酶编码基因核苷酸序列为序列1。
调控元件LacIVP4，从5’端依次由LacI表达盒、无义随机片段、启动聚合酶表达的启动子TacP和VP4聚合酶编码基因组成，且LacI蛋白和VP4聚合酶表达方向相反。LacI蛋白的氨基酸序列为序列27，VP4聚合酶的氨基酸序列为序列9；LacI表达盒的核苷酸序列为序列19；无义随机片段序列为序列29，启动子TacP核苷酸序列为序列28，VP4聚合酶编码基因核苷酸序列为序列2。
调控元件LacIMmP1，从5’端依次由LacI表达盒、无义随机片段、启动聚合酶表达的启动子TacP和MmP1聚合酶编码基因组成，且LacI蛋白和MmP1聚合酶表达方向相反。LacI蛋白的氨基酸序列为序列27，MmP1聚合酶的氨基酸序列为序列10；LacI表达盒的核苷酸序列为序列19；无义随机片段序列为序列29，启动聚合酶表达的启动子TacP核苷酸序列为序列28，MmP1聚合酶编码基因核苷酸序列为序列3。
LacI的氨基酸序列为序列表中序列27。
2、驱动外源基因表达的启动子
K1F对应启动子，命名为K1F-P，其核苷酸序列为序列表中序列4；
VP4对应启动子，命名为VP4-P，其核苷酸序列为序列表中序列5；
MmP1对应启动子，命名为MmP1-P，其核苷酸序列为序列表中序列6。
二、表达调控元件的重组载体和表达外源基因启动子及外源基因的重组载体
表达调控元件的重组载体如下：
表达调控元件LacIK1F的重组载体P321-LACIK1F为将LacIK1F***pSEVA321质粒(Silva-Rocha,R.,de Lorenzo,V.,2013.The Standard European Vector Architecture(SEVA):a coherent platform for the analysis and deployment of complexprokaryotic phenotypes.NucleicAcidsRes.41,666–675.)的EcoRI和SpeI酶切位点间得到的载体；
表达调控元件LacIVP4的重组载体P321-LACIVP4为将LacVP4***pSEVA321质粒的EcoRI和SpeI酶切位点间得到的载体；
表达调控元件LacIMmP1的重组载体P321-lacIMmP1为将LacMmP1***pSEVA321质粒的EcoRI和SpeI酶切位点间得到的载体；
含有启动子及其启动的外源基因的重组载体如下：
表达K1F-P启动子重组载体为将K1F-P-GFP片段***质粒pSVEA321的XbaI和PstI位点间得到的重组载体，且K1F-P启动子驱动GFP的表达，该重组载体命名为P321-K1FP-GFP；其中，K1F-P-GFP的核苷酸序列从5’端起依次由K1F对应启动子的核苷酸序列(序列4)和GFP片段编码基因(序列表中序列20)组成。
表达VP4-P启动子重组载体为将VP4-P-GFP片段***质粒pSVEA321的XbaI和PstI位点间得到的重组载体，且VP4-P启动子驱动GFP的表达，该重组载体命名为p321-VP4P-GFP；其中，VP4-P-GFP的核苷酸序列从5’端起依次由VP4对应启动子的核苷酸序列(序列5)和GFP片段编码基因(序列表中序列20)组成。
表达MmP1-P启动子重组载体为将MmP1-P-GFP片段***质粒pSVEA321的XbaI和PstI位点间得到的重组载体，且MmP1-P启动子驱动GFP的表达，该重组载体命名为p321-MmP1P-GFP；其中，MmP1-P-GFP的核苷酸序列从5’端起依次由MmP1对应启动子的核苷酸序列(序列6)和GFP片段编码基因(系列表中序列20)组成。
三、表达调控元件的重组菌(又称为平台菌)的构建
重组菌为将上述一制备的调控元件导入出发菌盐单胞菌Halomonas sp.TD01(已于2010年11月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCCNo.4353，分类命名为盐单胞菌Halomonas sp.TD01；专利的公开号CN102816729A)中得到的重组菌；
上述导入可以为将调控元件整合到出发菌基因组中；也可以为将调控元件以质粒形式导入出发菌中。
1、调控元件整合到出发菌基因组得到的平台菌
采用两步重组法(Fu XZ,Tan D,Ai***la G,Wu Q,Chen JC,Chen GQ(2014)Development of Halomonas TD01as a host for open productionof chemicals.MetabEng 23:78–91)将三种调控元件分别整合到盐单胞菌Halomonas sp.TD01的基因组的特定位点，该位点由***质粒构建过程中特定的引物所决定，本实施例中具体如下：
表1为杀质粒构建过程中的引物
具体步骤如下：
1)***质粒构建
使用H1F-H1R引物对和H2F-H2R引物对，分别以Halomonas sp.TD01基因组为模板进行PCR，得到大小为0.5kb的H1(序列表中序列21)和大小为0.5kb的H2(序列表中序列22)，将H1和H2进行Overlap PCR，得到1kb大小的H1H2。
将1kb大小的H1H2(序列表中序列23)***pRE112-6IsceI质粒(Fu XZ,Tan D,Ai***la G,Wu Q,Chen JC,Chen GQ(2014)Development of Halomonas TD01as a hostfor open productionof chemicals.Metab Eng 23:78–91)的SacI和SphI位点间，得到的重组载体pRE112-6IsceI-H1H2；再将调控元件LacIK1F的编码DNA分子***pRE112-6IsceI-H1H2载体的SpeI和PstI位点间，得到重组载体pRE112-6IsceI-H1-lacIK1F-H2。
采用同样的方法，将调控元件LacIVP4的编码DNA分子替换调控元件lacIK1F的编码基因，得到重组载体pRE112-6IsceI-H1-lacIVP4-H2。
采用同样的方法，将调控元件LacIMmP1的编码DNA分子替换调控元件lacIK1F的编码基因，得到重组载体pRE112-6IsceI-H1-lacIMmP1-H2。
2、一次同源重组
将上述重组质粒pRE112-6IsceI-H1-lacIK1F-H2作为目标质粒先通过电转化方法转入大肠杆菌S17-1pir中，然后通过接合转化方法转入Halomonas sp.TD01中(具体方法如前所述)，利用***质粒不能在宿主菌内复制的特性，用25μg/mL氯霉素抗性的60LB平板筛选出阳性克隆1。在阳性克隆1中，带有同源片段的***质粒整合到基因组由H1和H2所决定的特定位置(经过测序,该阳性克隆1基因组中含有pRE112-6IsceI-H1-lacIK1F-H2的全序列)。
3、筛选二次同源重组突变株
诱导质粒pMCS1-Spe-araC-ISceI(Fu XZ,Tan D,Ai***la G,Wu Q,Chen JC,Chen GQ(2014)Development of Halomonas TD01as a host for open productionofchemicals.Metab Eng 23:78–91)表达一种归位内切酶I-SceI，将在一次同源重组后产生的***突变株基因组的6个I-SceI位点进行切割，产生双链的DNA缺口(Double-Strand-Break)，这一行为将强烈的诱发第二次同源重组的发生，产生突变型或者野生型，然后通过特异的PCR引物将突变株筛选出来。最后将PCR产物进行测序进一步确认，具体步骤如下：
将上述阳性克隆1通过接合转化导入诱导质粒pMCS1-Spe-araC-ISceI，在含有25μg/mL氯霉素和100μg/mL壮观霉素的60LB平板上筛选得到阳性克隆2。
在***糖诱导下培养(在含有0.3％***糖浓度的60LB固体平板上，37℃培养24h)阳性克隆2，对得到的单克隆使用T-F和T-R引物对进行验证，得到6kb条带的为阳性克隆3。
测序该阳性克隆3的基因组DNA，发现其在基因组H1和H2片段之间含有完整的K1F***的RNA聚合酶序列。
将阳性克隆3命名为Halomonas sp.TD K1F，其为将调控元件lacIK1F的编码基因整合到TD01基因组的H1片段和H2片段中间得到的重组菌，能够表达lacIK1F。
采用同样的方法，将重组载体pRE112-6IsceI-H1-lacIVP4-H2和重组载体pRE112-6IsceI-H1-lacIMmP1-H2分别导入TD01进行两步重组，得到重组菌Halomonas sp.TD VP4和Halomonas sp.TD MmP1。
重组菌Halomonas sp.TD VP4为将调控元件lacIVP4的编码基因整合到TD01基因组的H1片段和H2片段中间得到的重组菌，表达序列9所示的RNA聚合酶VP4。
重组菌Halomonas sp.TD MmP1为将调控元件lacIMmP1的编码基因整合到TD01基因组的H1片段和H2片段中间得到的重组菌，表达序列10所示的RNA聚合酶MmP1。
在本实施例中，三种RNA聚合酶在基因组上的***位点包括但不限于上文所述的特定位点。而其它位点的选择由上表中H1F,H1R,H2F,H2R引物序列所决定。
2、调控元件通过质粒导入出发菌得到的平台菌
将前文所述的含有RNA聚合酶的质粒转入Halomonas，具体如下：
将重组载体P321-LACIK1F导入出发菌盐单胞菌Halomonas sp.TD01中(结合转化方法如前文所述)，得到重组菌TD01/P15A-K1F(提取质粒测序检测为阳性。)；
将重组载体P321-LACIVP4导入出发菌盐单胞菌Halomonas sp.TD01中(结合转化方法如前文所述)，得到重组菌TD01/P15A-VP4(提取质粒测序检测为阳性。)；
将重组载体P321-lacIMmP1导入出发菌盐单胞菌Halomonas sp.TD01中(结合转化方法如前文所述)，得到重组菌TD01/P15A-MmP1(提取质粒测序检测为阳性。)。
四、高效诱导表达***的获得
高效诱导表达***为如下A或B或C：
A)由配合使用的调控元件lacIK1F和其对应的驱动外源基因表达的启动子K1F-P组成；
B))由配合使用的调控元件VP4和其对应的驱动外源基因表达的启动子VP4-P组成；
C)由配合使用的调控元件MmP1和其对应的驱动外源基因表达的启动子MmP1-P组成。
实施例2、高效诱导表达***诱导表达外源基因
驱动外源基因表达的启动子可以构建在表达构建于调控元件的重组菌体内同一或不同的质粒上，或构建于菌株调控元件的重组菌本身的基因组上。
一、启动子的存在形式
A、启动子和其驱动的外源基因以质粒形式在调控元件的重组菌表达
1、表达外源基因重组菌构建
将重组载体P321-K1FP-GFP通过接合转化(前文所述)转入Halomonas-K1F中，得到重组菌TD1/K1FP-GFP：LACIK1F；
将重组载体p321-VP4P-GFP通过接合转化(前文所述)转入Halomonas-VP4中，得到重组菌TD1/VP4P-GFP：LACIVP4；
将重组载体p321-MmP1P-GFP通过接合转化(前文所述)转入Halomonas-VP4中，得到重组菌TD1/MmP1P-GFP：lacIMmP1。
3、重组菌表达GFP
将上述重组菌TD1/K1FP-GFP：lacIK1F、TD1/VP4P-GFP：lacIVP4和TD1/MmP1P-GFP：lacIMmP1培养至OD＝0.5时使用200mg/L的IPTG进行诱导培养，18小时后使用流式细胞仪检测荧光强度。
结果如表2所示，阴性对照TD01/LacIq-Ptrc，(其启动子为可诱导启动子，外源基因为GFEP)(该TD01/LacIq-Ptrc记载在如下文献中：Tan,D.,Wu,Q.,Chen,J.C.&Chen,G.Q.Engineering Halomonas TD01for the low-cost production ofpolyhydroxyalkanoates.Metabolic Engineering 26,34-47(2014)。
表2为重组菌表达GFP的强度
可以看出，与阴性对照相比，使用实施例1的高效诱导表达***中的调控元件及其对应的启动子可以提高GFP表达量。
B、启动子和其驱动的外源基因整合到调控元件的重组菌的基因组上。重组位点由下表中的引物决定：
表3
1、表达外源基因重组菌构建
1)***质粒构建
使用L1F-L1R引物对和L2F-L2R引物对，分别以Halomonas sp.TD01基因组为模板进行PCR，得到大小为0.5kb的L1(序列表中序列24)和大小为0.5kb的L2(序列表中序列25)，将L1和L2进行Overlap PCR，得到1kb大小的L1L2片段(序列表中序列26)，该片段中含有SpeI和PstI位点。。
将1031bp大小的L1L2片段***pRE112-6IsceI质粒(前文所述)的SacI和SphI位点间，得到的重组载体pRE112-6IsceI-L1L2；再将K1F-P-GFP片段***pRE112-6IsceI-L1L2载体的SpeI和PstI位点间，得到重组载体pRE112-6IsceI-L1-K1F-P-GFP-L2。
2、一次同源重组
将上述重组质粒pRE112-6IsceI-L1-K1F-P-GFP-L2作为目标质粒先通过电转化方法转入大肠杆菌S17-1pir中，然后通过接合转化方法转入Halomonas sp.TD K1F中(具体方法如前所述)，利用***质粒不能在宿主菌内复制的特性，用25μg/mL氯霉素抗性的60LB平板筛选出阳性克隆A。在阳性克隆A中，带有同源片段的***质粒整合到基因组由L1和L2所决定的特定位置(经过测序，该阳性克隆1基因组中含有pRE112-6IsceI-L1-K1F-P-GFP-L2的全序列)。
3、筛选二次同源重组突变株将诱导质粒pMCS1-Spe-araC-ISceI(前文所述)通过结合转化转入上述阳性克隆A，在含有25μg/mL氯霉素和100μg/mL壮观霉素的60LB平板上筛选得到阳性克隆B。
在***糖诱导下培养(在含有0.3％***糖浓度的60LB固体平板上，37℃培养24h)阳性克隆B，对得到的单克隆使用LT-F和LT-R引物对进行验证，得到1kb条带的为阳性克隆C。
测序该阳性克隆C的基因组DNA，发现其在基因组H1和H2片段之间含有完整的K1F***的RNA聚合酶序列，且在L1和L2片段之间含有完整的K1F启动子序列和GFP基因序列。
将阳性克隆命名为Halomonas sp.TD-K1F-GFP，其为将K1F-P-GFP片段整合到Halomonas sp.TD K1F基因组的L1序列和L2序列中间得到的重组菌。
采用同样的方法，将VP4-P-GFP片段替换K1F-P-GFP片段，得到重组菌Halomonassp.TD-VP4-GFP，其为将VP4-P-GFP片段整合到Halomonas sp.TD VP4基因组的L1序列和L2序列中间得到的重组菌。
采用同样的方法，将MmP1-P-GFP片段替换K1F-P-GFP片段，得到重组菌Halomonassp.TD-MmP1-GFP1，其为将MmP1-P-GFP片段整合到Halomonas sp.TD MmP1基因组的L1序列和L2序列中间得到的重组菌。
2、重组菌表达GFP
将上述重组菌Halomonas sp.TD-K1F-GFP、Halomonas sp.TD-VP4-GFP和Halomonas sp.TD-MmP1-GFP1培养至OD＝0.5时使用200mg/L的IPTG进行诱导培养，18小时后使用流式细胞仪检测荧光强度。
结果如表4所示：
表4为重组菌表达GFP的荧光强度
可以看出，与阴性对照相比，使用实施例1的高效诱导表达***中的调控元件及其对应的启动子可以提高GFP表达量。
二、启动子库的构建及其应用
1、构建启动子库
本实施例中替换启动子序列中的四个碱基，得到K1F对应启动子库、VP4对应启动子库、MmP1对应启动子库(图2所示)。具体使用简并引物替换K1F对应启动子，VP4对应启动子和MmP1对应启动子目标碱基，引物及对应的模板如下表5(n为a,t,c,g中任一种)：
表5为引物及对应的模板
使用简并引物，以对应的模板为体系进行环形PCR，对产物进行回收后，使用核苷酸激酶(NEB)在产物两端加磷，然后使用T4连接酶(NEB)进行环状化，将环状产物转化入大肠杆菌S17-1，得到使用突变启动子库替换原有启动子的突变体，并对启动子库的序列进行测定，得到一系列启动子突变库。具体如下：
K1F对应启动子库由K1F对应启动子(K1F-P)、K1F对应启动子突变体1、K1F对应启动子突变体2、K1F对应启动子突变体3、K1F对应启动子突变体4、K1F对应启动子突变体5、K1F对应启动子突变体6组成,K1F对应启动子突变体7组成；
K1F对应启动子突变体1的核苷酸序列为将K1F对应启动子序列的第13-16位的tata替换为tttg得到的序列。
K1F对应启动子突变体2的核苷酸序列为将K1F对应启动子序列的第13-16位的tata替换为tgtg得到的序列。
K1F对应启动子突变体3的核苷酸序列为将K1F对应启动子序列的第13-16位的tata替换为tgtt得到的序列。
K1F对应启动子突变体4的核苷酸序列为将K1F对应启动子序列的第13-16位的tata替换为ttgg得到的序列。
K1F对应启动子突变体5的核苷酸序列为将K1F对应启动子序列的第13-16位的tata替换为ttgt得到的序列。
K1F对应启动子突变体6的核苷酸序列为将K1F对应启动子序列的第13-16位的tata替换为cggg得到的序列。
K1F对应启动子突变体7的核苷酸序列为将K1F对应启动子序列的第13-16位的tata替换为gagg得到的序列。
VP4对应启动子库由VP4对应启动子(VP4-P)、VP4对应启动子突变体1、VP4对应启动子突变体2、VP4对应启动子突变体3、VP4对应启动子突变体4、VP4对应启动子突变体5、VP4对应启动子突变体6组成，VP4对应启动子突变体7组成；
VP4对应启动子突变体1的核苷酸序列为将VP4对应启动子序列的第13-17位的tata替换为cata得到的序列。
VP4对应启动子突变体2的核苷酸序列为将VP4对应启动子序列的第13-17位的tata替换为tgta得到的序列。
VP4对应启动子突变体3的核苷酸序列为将VP4对应启动子序列的第13-17位的tata替换为aata得到的序列。
VP4对应启动子突变体4的核苷酸序列为将VP4对应启动子序列的第13-17位的tata替换为catg得到的序列。
VP4对应启动子突变体5的核苷酸序列为将VP4对应启动子序列的第13-17位的tata替换为cttt得到的序列。
VP4对应启动子突变体6的核苷酸序列为将VP4对应启动子序列的第13-17位的tata替换为tctt得到的序列。
VP4对应启动子突变体7的核苷酸序列为将VP4对应启动子序列的第13-17位的tata替换为cgtt得到的序列。
MmP1对应启动子库由MmP1对应启动子(MmP1-P)、MmP1对应启动子突变体1、MmP1对应启动子突变体2、MmP1对应启动子突变体3、MmP1对应启动子突变体4、MmP1对应启动子突变体5、MmP1对应启动子突变体6组成,MmP1对应启动子突变体7组成；
MmP1对应启动子突变体1的核苷酸序列为将MMP1对应启动子序列的第13-17位的tata替换为tctt得到的序列。
MmP1对应启动子突变体2的核苷酸序列为将MMP1对应启动子序列的第13-17位的tata替换为tagg得到的序列。
MmP1对应启动子突变体3的核苷酸序列为将MMP1对应启动子序列的第13-17位的tata替换为cctt得到的序列。
MmP1对应启动子突变体4的核苷酸序列为将MMP1对应启动子序列的第13-17位的tata替换为actt得到的序列。
MmP1对应启动子突变体5的核苷酸序列为将MMP1对应启动子序列的第13-17位的tata替换为gctc得到的序列。
MmP1对应启动子突变体6的核苷酸序列为将MMP1对应启动子序列的第13-17位的tata替换为cgtg得到的序列。
MMP1对应启动子突变体7的核苷酸序列为将MMP1对应启动子序列的第13-17位的tata替换为atgt得到的序列。
2、启动子库的应用
将上述K1F对应启动子库中的启动子突变体分别替换Halomonas sp.TD-K1F-GFP中的K1F-P启动子，检测各个启动子突变体的表达效果，方法同前，结果如表6；
将上述VP4对应启动子库中的启动子突变体分别替换Halomonas sp.TD-VP4-GFP中的VP4-P启动子，检测各个启动子突变体的表达效果，方法同前，结果如表7；
将上述MmP1对应启动子库中的启动子突变体分别替换Halomonas sp.TD-MmP1-GFP中的MmP1-P启动子，检测各个启动子突变体的表达效果，方法同前，结果如表8；
表6
表7
表8
上述结果可在同一张图中进行体现，见图2.横轴为对荧光强度进行Lg处理后的数值，反应数量级的差异。由此可见，启动子库内的突变体具有广泛的表达谱，能够从低到高的对目标基因进行表达，扩展了高效诱导表达***的应用范围。
三、启动子及其启动的外源基因和调控元件构建在同一载体上进行高效诱导表达
1、重组载体的构建
表达lacIK1F及K1F-P的重组载体为将lacIK1F***pSEVA321载体的EcoRI和SpeI酶切位点间，且同时将K1F-P-GFP片段***pSEVA321载体的SpeI和PstI酶切位点间得到载体，命名为pSEVA321-lacIK1F-K1F-P-GFP；
表达lacIVP4及VP4-P的重组载体为将lacIVP4***pSEVA321载体的EcoRI和SpeI酶切位点间，且同时将VP4-P-GFP片段***pSEVA321载体的SpeI和PstI酶切位点间得到载体，命名为pSEVA321-lacIVP4-VP4-P-GFP；
表达lacIMmP1及MmP1-P的重组载体为将lacIMmP1***pSEVA321载体的EcoRI和SpeI酶切位点间，且同时将MmP1-P-GFP片段***pSEVA321载体的SpeI和PstI酶切位点间得到载体，命名为pSEVA321-lacIMmP1-MmP1-P-GFP；
2、重组菌的构建
分别将上述重组载体pSEVA321-lacIK1F-K1F-P-GFP、pSEVA321-lacIVP4-VP4-P-GFP、pSEVA321-lacIMmP1-MmP1-P-GFP导入罗氏真养菌(罗氏真养菌H16，Chen G-Q.2009.Amicrobial polyhydroxyalkanoates(PHA)based bio-and materials industry.ChemSoc.Rev 38:2434–2446.10.1039/b812677c，O.Hrabak,FEMS Microbiol.Rev.,1992,103,251,清华大学，公众可通过清华大学获得)中，得到3种重组罗氏真养菌，分别命名为RE-K1F-GFP,RE-VP4-GFP,RE-MmP1-GFP。
分别将上述重组载体pSEVA321-lacIK1F-K1F-P-GFP、pSEVA321-lacIVP4-VP4-P-GFP、pSEVA321-lacIMmP1-MmP1-P-GFP导入假单胞菌(假单胞菌KT2440、M.J.de Smet,G.Eggink,B.Witholt,J.Kingma and H.Wynberg,J.Bacteriol.,1983,154,870.，清华大学，公众可通过清华大学获得)中，得到3种重组假单胞菌,分别命名为PU-K1F-GFP,PU-VP4-GFP,PU-MmP1-GFP。
3、重组菌表达GFP
将RE-K1F-GFP,RE-VP4-GFP,RE-MmP1-GFP分别培养至OD＝0.5时使用200mg/L的IPTG进行诱导培养，18小时后使用流式细胞仪检测荧光强度。
结果如表9所示：
表9
将PU-K1F-GFP,PU-VP4-GFP,PU-MmP1-GFP分别培养至OD＝0.5时使用200mg/L的IPTG进行诱导培养，18小时后使用流式细胞仪检测荧光强度。
结果如表10所示：
表10
上述结果可以看出，高效诱导表达***在多种革兰氏阴性菌中都能获得显著地表达，且表达强度有所不同，互为补充。优选地，如需最大强度的表达，可采用MmP1表达***；如需中等强度表达，可以选择K1F表达***；如需少量诱导表达，可以选择VP4表达***。
实施例3、高效诱导表达***诱导表达菌体伸长形状相关基因
菌体伸长形状相关操纵子为MinCD，含有基因MinC和基因MinD在盐单胞菌Halomonas sp.TD01的基因组上以单拷贝形式存在，通过抑制细菌***环的形成阻遏细胞***，进而使菌体伸长(Tan D,Wu Q,Chen JC,Chen GQ.Engineering Halomonas TD01forthe low-cost production of polyhydroxyalkanoates.Metab Eng.2014Sep 16；26C:34-47.)。在野生型盐单胞菌中处于微量表达状态，因此需对其进行过表达。本实施例中包括但不仅限于使用MmP1表达***对其进行过表达。
MinCD操纵子的核苷酸序列见序列7，所表达的MinC基因氨基酸序列见序列11，所表达的MinD基因氨基酸序列见序列12。
使用MinCD操纵子序列替换GFP作为外源基因进行高效诱导表达。
一、启动子和其驱动的外源基因以质粒形式表达在调控元件的重组菌
1、表达启动子和其驱动的外源基因的重组载体
重组载体为将MmP1-P-MinCD片段***质粒pSVEA321的EcoRI和PstI位点间得到的重组载体，且MmP1对应启动子驱动MinCD的表达，该重组载体命名为p321-MmP1-P-MinCD；其中，MmP1-P-MinCD的核苷酸序列从5’端起依次由MmP1对应启动子的核苷酸序列(序列6)和MinCD操纵子序列(序列7)组成。
2、重组菌
将重组载体P321-lacIMmP1-P-MinCD接合转化入实施例1的三制备的重组平台菌Halomonas sp.TD-MmP1中，得到阳性克隆Halomonas sp.TD-MmP1/p321-MmP1-P-MinCD。活化阳性克隆后，在60LB培养基中进行培养，待OD＝0.5时，使用200mg/L的IPTG进行诱导24h。
诱导后Halomonas sp.TD-MmP1/p321-MmP1-P-MinCD和Halomonas sp.TD野生空白菌进行菌体拍照，结果如图3的1和2所示，1为野生空白菌阴性对照，2为Halomonas-MmP1/p321-MmP1-P-MinCD，可以看出，与对照相比，Halomonas-MmP1/p321-MmP1-P-MinCD菌株变长，证明高效诱导表达***MmP1-MmP1-P成功过表达了MinCD基因，使菌株获得了伸长。
二、启动子以基因组形式整合到调控元件的重组菌
采用两步重组法，具体如下：
本实施例的***质粒为将MmP1-P-MinCD片段***pRE112-6IsceI-L1L2载体的SpeI和PstI位点间，得到重组载体pRE112-6IsceI-L1-MmP1-P-MinCD-L2。
将该重组载体导入重组平台菌Halomonas sp.TD-MmP1中，发生二次同源重组(方法如前文所述)，得到重组菌Halomonas sp.TD-MmP1-MinCD，该重组菌在基因组H1和H2片段之间含有完整的MmP1***的RNA聚合酶序列，且在基因组L1和L2序列间含有完整的MmP1-P-MinCD序列。
将Halomonas sp.TD-MmP1-MinCD菌株使用60LB活化，待OD＝0.5时，加入IPTG使终浓度为200mg/L，24h和48h后显微镜拍照。
结果如图3的3所示,2为Halomonas-MmP1/p321-MmP1-P-MinCD，3为Halomonassp.TD-MmP1-MinCD，可以看出，与1相比，Halomonas sp.TD-MmP1-MinCD菌株变长，与2相比，图3的变长数量和比例更高。证明基因组上的MinCD获得了完全表达，且持续时间长，表达稳定。
三、使用伸长菌株积累聚羟基脂肪酸酯(PHA)。
为了验证高效表达***和PHA积累的关系，将上述二制备的Halomonas sp.TD-MmP1-MinCD使用60LB活化后，接种于含有葡萄糖的60LB培养基中，在OD＝0.5时加入IPTG进行诱导48h。培养基中葡萄糖含量为30g/L，接种量为5％v/v。
48h后取菌体样本进行显微照相，见图3的4，4和3进行对比，发现4中的菌株产生了明显的结节，证明其积累了PHA。使用气象色谱检测诱导后培养液中PHA含量，方法如下：
酯化方法为：取30mg冰干菌体于酯化管中，加入2mL氯仿、2mL酯化液混匀，加盖密闭，100℃烘箱中酯化4小时。冷却至室温后，加入1mL蒸馏水，充分振荡混匀，静置分层。待氯仿相与水完全分离后，取氯仿相进行气相色谱分析。
1升酯化液配置方法：1g苯甲酸、30mL浓硫酸溶于970mL甲醇，得到酯化液。同时取10mg的标样物质进行酯化。
气相色谱(GC)分析：依照HP公司Hewlett Packard 6890(HP，USA)气相色谱仪的说明书操作气相色谱仪。设定柱头温度为140℃，进样器温度为200℃，检测器温度为220℃，柱头压力为0.25Mpa，程序升温条件为：140℃1分钟，以20℃/分的速度升温至220℃，并在此温度保持1分钟。样品进样量为1μl。结果取三次平均值,结果如下表11：
表11
本实施例中，可以同时完成菌体伸长和PHA的生产。二者相互独立，可通过是否加入葡萄糖等碳源来控制PHA的积累，也可以通过控制IPTG的加入来控制菌体的延长。
实施例4、高效诱导表达***诱导表达其余外源基因
本实施例使用包括但并不仅限于Halomonas sp.TD进行蛋白质的过表达。
三种目的蛋白的基因分别命名为名为TD-PhaP，4AK4-PhaP，Re-PhaR，其基因分别存在于盐单胞菌Halomonas，嗜水气单胞菌，罗氏真养菌的基因组上。这三种蛋白均为PHA颗粒表面的结合蛋白，经实验验证，均具有良好的双亲性和抗逆性，可作为表面活性剂或乳化剂使用。本实施例中使用包括但不仅限于MmP1表达***对其进行过表达，以启动子以质粒形式表达在调控元件的重组菌为例。
TD-PhaP蛋白的氨基酸序列为序列16，其编码基因的核苷酸序列为序列13；
4AK4-PhaP蛋白的氨基酸序列为序列17，其编码基因的核苷酸序列为序列14；
Re-PhaR蛋白的氨基酸序列为序列18，其编码基因的核苷酸序列为15。
1、表达启动子及其启动的外源基因的重组载体
重组载体为将MmP1-P-TD-PhaP片段***质粒pSVEA321的EcoRI和PstI位点间得到的重组载体，且MmP1-P启动TD-PhaP的表达，该重组载体命名为p321-MmP1-P-TD-PhaP；其中，MmP1-P-TD-PhaP的核苷酸序列从5’端起依次由MmP1-P的核苷酸序列(序列6)和TD-PhaP片段编码基因(序列13)组成。
重组载体为将MmP1-P-4AK4-PhaP片段***质粒pSVEA321的EcoRI和PstI位点间得到的重组载体，且MmP1-P启动4AK4-PhaP的表达，该重组载体命名为p321-MmP1-P-4AK4-PhaP；其中，MmP1-P-4AK4-PhaP的核苷酸序列从5’端起依次由MmP1-P的核苷酸序列(序列6)和4AK4-PhaP片段编码基因(序列14)组成。
重组载体为将MmP1-P-Re-PhaR片段***质粒pSVEA321的EcoRI和PstI位点间得到的重组载体，且MmP1-P启动Re-PhaR的表达，该重组载体命名为p321-MmP1-P-Re-PhaR；其中，MmP1-P-Re-PhaR的核苷酸序列从5’端起依次由MmP1-P的核苷酸序列(序列6)和Re-PhaR片段编码基因(序列15)组成。
2、重组菌
分别将重组载体p321-MmP1-P-TD-PhaP、p321-MmP1-P-4AK4-PhaP和p321-MmP1-P-Re-PhaR接合转化(前文所述)入实施例1的三制备的平台菌重组菌Halomonas-MmP1中，得到阳性克隆Halomonas-MmP1/p321-MmP1-P-TD-PhaP、Halomonas-MmP1/p321-MmP1-P-4AK4-PhaP和Halomonas-MmP1/p321-MmP1-P-Re-PhaR。
活化阳性克隆后，按照2％的接种量接种于50ml60LB培养基中进行培养，培养条件为37℃，200rpm。待OD＝0.5时，使用200mg/L的IPTG进行诱导，以不加IPTG的菌液为阴性对照组。30℃，200rpm诱导4-6小时后，取1ml菌液，使用BugBuster Master Mix(Merck公司购买获得)提取细菌总蛋白。使用NuPAGEBis-Tris Mini Gels(Life Technologies公司购买获得)对提取得到的细菌蛋白进行SDS PAGE分析。
电泳结果如图4,1-6分别为Halomonas-MmP1/p321-MmP1-P-TD-PhaP诱导前/后，Halomonas-MmP1/p321-MmP1-P-4AK4-PhaP诱导前/后，Halomonas-MmP1/p321-MmP1-P-Re-PhaR诱导前/后。由图可见，非诱导菌株并未表达蛋白。对表达蛋白的菌株，采用QuantityOne软件分析表达的目的蛋白占总蛋白的比例；采用Bradford蛋白定量试剂盒测量细菌总蛋白浓度。
最终计算出三种目的蛋白的产量,方法如下，
使用NuPAGE Bis-Tris Mini Gels(Life Technologies公司购买获得)对提取得到的细菌蛋白进行SDS PAGE分析后，利用考马斯亮蓝染色法对蛋白胶进行染色，室温下染色2小时，之后用脱色液对蛋白胶进行脱色，直至背景接近透明，蛋白条带清晰可见。
1升染色液配置方法：考马斯亮蓝R-250 2.5g，乙醇：水：冰乙酸＝4.5：4.5：1(体积比)。
1升脱色液配置方法：乙醇：水：冰乙酸＝4.5：4.5：1(体积比)。
采用Quantity One软件分析表达的目的蛋白占总蛋白的比例，方法如下：
将脱色后的蛋白胶拍照保存，将图片格式转化为TIFF。利用Quantity One软件打开蛋白胶图片，选择lane-auto frame lanes识别泳道，再选择lane-lane background排除泳道的背景。选择band-detect band识别出泳道中的蛋白条带，对软件自动识别出的蛋白条带进行适当调整后，选择band-Gauss Model Bands命令将挤在一起的条带通过高斯建模处理，将挤靠在一起、边界互相重合的蛋白条带描绘成具有独立光密度分布的曲线，最后点击band-band information，将变成蓝色感叹号的鼠标移动到目的蛋白条带PhaP或PhaR上，查看Relative qty一栏，该栏所显示的数字为目的蛋白条带的光密度占整条泳道所有蛋白条带光密度总和的百分数，即代表目的蛋白占总蛋白的比例。
采用Bradford蛋白定量试剂盒测量细菌总蛋白浓度，Bradford法通过测定吸光值大小并对照标准蛋白的吸光度，推算出蛋白浓度，具体方法如下：完全溶解蛋白标准品(5mg/ml BSA)后,稀释10倍，使其终浓度为0.5mg/ml。将稀释后的标准品进行梯度稀释，得到终浓度分别为0,0.025,0.05,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5mg/ml；将待测蛋白样品和稀释号的标准品各取20l分别加到96孔板中，各孔再加入200l Bradford染色液，混匀后室温放置5分钟，用酶标仪测定A595的吸光度。最后根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度，根据样品蛋白的稀释倍数，算出每升菌液总蛋白浓度
目的蛋白的产量计算公式如下：
目的蛋白产量＝目的蛋白占总蛋白的比例*每升菌液所得到的总蛋白的浓度(mg/L)
目的蛋白占总蛋白的比例以及产量，如表12所示。
表12

Claims (12)

1.一种在革兰氏阴性菌中表达外源基因的方法，为用含有阻遏蛋白表达盒和RNA聚合酶表达盒的调控元件调控外源基因表达盒在革兰氏阴性菌中表达；
所述RNA聚合酶表达盒中的RNA聚合酶与所述外源基因表达盒中的驱动外源基因表达的启动子相匹配；
所述RNA聚合酶为K1F、VP4或MmP1；
所述K1F相匹配的驱动外源基因表达的启动子为K1F-P；
所述VP4相匹配的驱动外源基因表达的启动子为VP4-P；
所述MmP1相匹配的驱动外源基因表达的启动子为MmP1-P；
所述K1F为序列表中序列8所示的蛋白质；
所述VP4为序列表中序列9所示的蛋白质；
所述MmP1为序列表中序列10所示的蛋白质；
所述启动子K1F-P为编码区为序列表中序列4所示的DNA分子；
所述启动子VP4-P为编码区为序列表中序列5所示的DNA分子；
所述启动子MmP1-P为编码区为序列表中序列6所示的DNA分子。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述革兰氏阴性菌为非大肠杆菌；所述非大肠杆菌具体为生产聚羟基脂肪酸酯的菌株。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：将所述调控元件和所述外源基因表达盒导入革兰氏阴性菌中，得到重组菌，诱导培养重组菌，实现外源基因的表达。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述调控元件和所述外源基因表达盒通过整合或非整合的方式导入所述革兰氏阴性菌。
5.一种在革兰氏阴性菌中表达外源基因的组合物，为如下1）或2）或3）：
1）由权利要求1-4中任一所述的方法中的所述调控元件和所述外源基因表达盒组成；
2）由表达权利要求1-4中任一所述的方法中的所述调控元件的重组载体和表达权利要求1-4中任一所述的方法中的所述外源基因表达盒的重组载体组成；
3）表达权利要求1-4中任一所述的方法中的所述调控元件和所述外源基因表达盒的重组载体。
6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于：
所述外源基因表达盒中的外源基因为菌体伸长相关操纵子；所述菌体伸长相关操纵子为MinCD操纵子；
或，所述外源基因表达盒中的外源基因为PHA颗粒表面的结合蛋白；所述PHA颗粒表面结合蛋白基因为TD-PhaP蛋白、4AK4-PhaP 蛋白或Re-PhaR 蛋白。
7.一种在革兰氏阴性菌中表达外源基因的重组菌，为含有权利要求1-4中任一所述的方法中的所述调控元件和所述外源基因表达盒的革兰氏阴性菌。
8.根据权利要求7所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为将所述调控元件和所述外源基因表达盒导入革兰氏阴性菌中，得到重组菌。
9.根据权利要求8所述的重组菌，其特征在于：所述调控元件的编码基因和所述外源基因表达盒通过整合或非整合的方式导入所述革兰氏阴性菌。
10.根据权利要求7-9中任一所述的重组菌，其特征在于：
所述外源基因表达盒中的外源基因为菌体伸长相关操纵子；所述重组菌为将所述调控元件和所述菌体伸长相关操纵子表达盒导入革兰氏阴性菌中，得到重组菌；所述菌体伸长相关操纵子具体为MinCD操纵子；
或，所述外源基因表达盒中的外源基因为PHA颗粒表面的结合蛋白；所述重组菌为将所述调控元件和所述PHA颗粒表面结合蛋白基因表达盒导入革兰氏阴性菌中，得到重组菌；所述PHA颗粒表面结合蛋白基因具体为TD-PhaP蛋白、4AK4-PhaP 蛋白或Re-PhaR 蛋白。
11.权利要求1-4任一所述方法或权利要求5或6所述的组合物或7-10任一所述重组菌在控制外源基因表达中的应用。
12.一种可控表达外源基因的方法，包括如下步骤：通过是否诱导培养7-10任一中的所述重组菌，调控外源基因的表达量；经过诱导培养的外源基因的表达量大于未经过诱导培养的外源基因的表达量。
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