CN105779305A - 一种消除太子参连作障碍的专用复合微生物菌剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种消除太子参连作障碍的专用复合微生物菌剂，由通用有益菌与土著有益菌按体积比为4:6组成；所述通用有益菌由乳酸菌、光合细菌、酵母菌、放线菌按体积比为1:1:1:1的比例混合制成；所述土著有益菌由伯克霍尔德菌、假单胞菌、芽孢杆菌按体积比4:1:1的比例混合而成。本发明又公开了一种消除太子参连作障碍的专用复合微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：步骤一、土著拮抗菌的筛选；步骤二、通用复合菌液制备；步骤三、土著有益菌活化及扩大培养；步骤四、复合微生物菌剂制备。本发明制备的专用复合微生物菌剂，根际定殖能力好并且安全可靠，对太子参连作障碍、土传病害防治效果明显，并且对后茬其他作物均无致病侵染能力。

Description

一种消除太子参连作障碍的专用复合微生物菌剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及微生物和生物防治技术领域，尤其涉及一种消除太子参连作障碍的专用复合微生物菌剂及其制备方法。
背景技术
连作障碍是指即使在正常的田间管理措施下，同一地块连续多年种植相同植物造成植物生长发育不良、病虫害严重、产量品质下降的现象，也称为化感自毒现象或再植病害。药用植物普遍忌连作，据统计，约有70％的块根类药材都存在不同程度的连作障碍问题，这严重阻碍了我国现代医药产业的可持续发展。
多年田间观察发现，连作太子参植株生长发育不良，地下部块根无法正常膨大，通常收获后同一地块须间隔2～4年方可再种。前期研究认为，连作下根际微生物群落结构失衡，即有益菌减少，病原菌大量繁殖生长，是造成太子参连作障碍的主要因素。太子参连作还导致土壤酸化、自毒物质释放、土壤粘连板结、保水保肥能力下降等问题，同时，农户在尚不清楚太子参连作障碍形成机制的情况下，试图通过滥施农药和肥料来维持产量，往往效果不佳，还造成生产成本加大、肥料流失严重以及农残等问题。所以，探索一种环境友好型的连作障碍消减措施意义重大。
通过微生物菌剂或生物有机肥来改良恶化的连作土壤，提高土壤微生物多样性水平，修复重建健康的土壤生态***被认为是解决植物连作障碍的主要途径。如图1所示，本发明人前期从发病太子参植株和连作土壤中分离筛选到诸多强致病性的病原菌，如尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌、踝节镰刀菌等，并且多株病原菌表现出宿主特异性，即只侵染太子参而不侵染后茬其他作物如玉米、大豆、水稻等。所以，分离筛选能够拮抗太子参专化型病原菌的有益菌才能有效防治太子参再植病害。前期研究也发现，市面上销售的商品化菌剂或菌肥对防治太子参连作障碍的效果十分有限，这可能与有益菌的根际定殖能力有关，这些有益菌不适合在太子参连作土壤中生长。太子参连作导致土壤环境发生明显恶化，并且太子参持续释放多种次级代谢产物和药效成分，这些成分都可能导致市售菌剂中的有益菌无法在太子参根际中定殖，故采用微生物菌剂防治太子参再植病害时需综合考虑太子参土传病原菌的宿主特异性和连作土壤环境的特殊性。
有鉴于此，本发明人研究和设计了一种消除太子参连作障碍的专用复合微生物菌剂及其制备方法，本案由此产生。
发明内容
本发明的目的在于提供一种消除太子参连作障碍的专用复合微生物菌剂，用于生物防治药用植物太子参的连作障碍问题，起到促进块根生长和防治病害的双重目的。
本发明的另一目的在于提供一种消除太子参连作障碍的专用复合微生物菌剂的制备方法，由通用有益菌和土著有益菌通过优化配比混合而成，目的是保证有益菌在太子参根际的成功定殖，既能活化土壤养分，降解太子参释放的自毒物质，又能防治太子参专化型病原菌。
为了实现上述目的，本发明解决其技术问题所采取的技术方案是：
一种消除太子参连作障碍的专用复合微生物菌剂，由通用有益菌与土著有益菌按体积比为4:6组成；所述通用有益菌由乳酸菌、光合细菌、酵母菌、放线菌按体积比为1:1:1:1的比例混合制成；所述土著有益菌由伯克霍尔德菌、假单胞菌、芽孢杆菌按体积比4:1:1的比例混合而成。
作为实施例的优选方式，所述乳酸菌为植物乳杆菌、乳酸链球菌及干酪乳杆菌中的一种或几种。
作为实施例的优选方式，所述光合细菌为沼泽红假单胞菌及类球红细菌中的一种或两种。
作为实施例的优选方式，所述酵母菌为酿酒酵母及产朊假丝酵母中的一种或两种。
作为实施例的优选方式，所述放线菌为灰色链霉菌及白色链霉菌中的一种或两种。
作为实施例的优选方式，所述伯克霍尔德菌为Burkholderiaambifaria(Burkholderiaambifariasp.nov.,anovelmemberoftheBurkholderiacepaciacomplexincludingbiocontrolandcysticfibrosis-relatedisolates.TomCoenye、EshwarMahenthiralingam、DeborahHenry,et.InternationalJournalofSystematicandEvolutionaryMicrobiology，2001(51):1481-1490.)及新洋葱伯克霍尔德菌中的一种或者两种。
作为实施例的优选方式，所述假单胞菌为荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌、Pseudomonasprotegens(Pseudomonasprotegenssp.nov.,widespreadplant-protectingbacteriaproducingthebiocontrolcompounds2,4-diacetylphloroglucinolandpyoluteorin.AlbanRamette,MicheleFrapolli,MarionFischer-LeSaux.et.SystematicandAppliedMicrobiology，2011(34):180-188.)、韩国假单胞菌(Pseudomonaskoreensis)中的一种或几种。
作为实施例的优选方式，所述芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌中的一种或几种。
一种消除太子参连作障碍的专用复合微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、土著拮抗菌的筛选：
分别采用假单胞菌选择性培养基、芽孢杆菌选择性培养基对太子参根际假单胞菌、芽孢杆菌进行分离，采用无机培养基对自毒物质降解菌进行分离；
所述假单胞菌选择性培养基配方为：称取20g大豆-酪蛋白消化物琼脂培养基，加495.5mL双蒸水加热搅拌，充分溶解后，再加入1mL0.1％(wt/vol)结晶紫储备液，121℃高压灭菌15min，冷却至大约50℃时，往培养基中再添加3.5mL5％(wt/vol)呋喃咀啶储备液，所述呋喃咀啶储备液用N,N-二甲基甲酰胺作溶剂，倒板冷却，备用；
所述芽孢杆菌选择性培养基配方为：每升含5.0g蛋白胨，1.5g酵母提取物，1.5g牛肉膏，5.0gNaCl，20g琼脂，pH7.2；
所述无机培养基配方为：每升含NH4NO31.0g，NaCl0.5g，K2HPO4·3H2O1.5g，MgSO4·7H2O0.5g，(NH4)2SO40.5g，pH7.2；称取各组分溶解于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min，冷却至45～50℃时，加入太子参连作土壤中鉴定到的自毒物质，所述自毒物质包括没食子酸、香豆酸、3,4-二羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、香兰素、阿魏酸及苯甲酸，混合酚酸总浓度1000mg/L，接种10％太子参根际土壤悬浮液富集培养数代后，筛选有自毒物质降解能力和拮抗太子参病原菌的有益细菌；
步骤二、通用复合菌液制备：
往18L的井水或至少放置2天后的自来水中加入300g红糖和50mLMS母液，再加入1L活化好的EM液体菌种，置于35～37℃的室内密闭发酵2～3周，从发酵第二天开始每隔一天可打开密闭容器口放气减压一次，打开容器口时能闻到酸甜味，并且越来越明显，表示发酵扩培成功，即制得EM复合菌液，备用；成功的成品发酵液有酸甜味，pH3.0～4.0，活菌数大于100亿/mL；
步骤三、土著有益菌活化及扩大培养：
菌种活化：将筛选到的荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌、Pseudomonasprotegens、韩国假单胞菌分别接种于假单胞菌选择性培养基中，置于28～32℃培养箱中活化12～16h；将筛选到的伯克霍尔德菌及芽孢杆菌分别接种于LB固体培养中，置于37℃培养箱中活化8～16h；
扩大培养：将活化好的各种土著有益菌接种于液体培养中进行发酵培养，假单胞菌置于28～32℃下扩大培养，将伯克霍尔德菌及芽孢杆菌置于37℃下扩大培养，当活菌数高于1.0×109CFU/mL时停止扩大培养，备用；
步骤四、复合微生物菌剂制备：
将土著有益菌即伯克霍尔德菌、假单胞菌、芽孢杆菌按体积比为4:1:1的比例混合制成土著有益菌复合菌液，即IM复合菌液；将所述EM复合菌液与所述IM复合菌液按体积比为4:6的比例混合制成太子参专用复合微生物菌剂。
本发明所述的专用复合微生物菌剂具有以下几个优点：
1、本发明所述的专用复合微生物菌剂含有通用有益菌和太子参根际土著拮抗菌，其中土著拮抗菌包括伯克霍尔德菌、假单胞菌和芽孢杆菌，均是从太子参根际土壤中筛选获得，田间应用时其根际定殖能力好并且安全可靠，并且对后茬其他作物(如玉米、大豆、水稻、蔬菜等)均无致病侵染能力；
2、土著拮抗菌是通过大量的筛选工作而得到，是从3000株土壤细菌中筛选得到的，对太子参专化型病原菌(如尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌、踝节霉菌等)具有很强的拮抗效果。
3、本发明所述的土著拮抗菌筛选时往培养基中加入了较高浓度的自毒物质，作为选择压力，筛到的大部分土著有益菌对太子参根系分泌的自毒物质和药效成分(如太子参环肽B)具有降解转化功能。
4、本发明所述的土著拮抗菌除了能够抑制病原菌外还具有解磷能力，能够有效活化土壤养分，改善土壤理化性质，促进植物养分吸收方面具有重要作用。
5、本发明经长期实地验证，配方合理，功效稳定，对防治太子参连作障碍效果明显，提高连作太子参的产量品质。
附图说明
图1为太子参植株病害根部分离到的病原菌的菌落形态；其中，A：尖孢镰刀菌；B：串珠镰刀菌；C：踝节霉菌；
图2为土著拮抗菌与太子参专化型病原真菌(串珠镰刀菌)的对峙培养照片；其中，A：仅接种病原菌串珠镰刀菌；B：土著有益菌与串珠镰刀菌对峙培养；
图3为土著有益菌解磷能力测定；其中，箭头指示具有解磷能力的土著有益菌，菌落周围形成透明圈。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施方式以对本发明作进一步说明，
新洋葱伯克霍尔德氏菌Burkholderiacenocepacia、韩国假单胞菌Pseudomonaskoreensis、Pseudomonasprotegens及Burkholderiaambifaria已于2016年01月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号分别为CGMCCNo.12119、CGMCCNo.12122、CGMCCNo.12121及CGMCCNo.12120。
实施例1土著拮抗菌的筛选及其鉴定
分别采用假单胞菌选择性培养基、芽孢杆菌选择性培养基对太子参根际假单胞菌、芽孢杆菌进行分离，采用无机培养基(含较高浓度的太子参自毒物质)对自毒物质降解菌进行分离。
将上述不同培养基上随机挑选的单一菌落采用PDA平板对峙的方法分别评价它们对太子参专化型病原菌(如尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌、踝节霉菌等)的拮抗效果。将具有强拮抗能力的细菌采用16srRNA基因或16s-23srRNA区间PCR鉴定进行分子鉴定。16srRNA基因PCR扩增上下游引物分别为：27f(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1522r(5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3')；16s-23srRNA基因PCR扩增上下游引物分别为：1407f(5'-TTGTACACACCGCCCGTC-3')和456r(5'-CCTTTCCCTCACGGTACTG-3')。
所述培养基配方为：
(1)假单胞菌选择性培养基：称取20g大豆-酪蛋白消化物琼脂培养基，加495.5mL双蒸水加热搅拌，充分溶解后，再加入1mL0.1％(wt/vol)结晶紫储备液，121℃高压灭菌15min，冷却至大约50℃时，往培养基中再添加3.5mL5％(wt/vol)呋喃咀啶储备液(用N,N-二甲基甲酰胺作溶剂)，倒板冷却，备用。
(2)芽孢杆菌选择性培养基：每升含5.0g蛋白胨，1.5g酵母提取物，1.5g牛肉膏，5.0gNaCl，20g琼脂，pH7.2。
(3)自毒物质降解菌培养基：每升含NH4NO31.0g，NaCl0.5g，K2HPO4·3H2O1.5g，MgSO4·7H2O0.5g，(NH4)2SO40.5g，pH7.2。称取各组分溶解于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min，冷却至45～50℃时，加入太子参连作土壤中鉴定到的各种自毒物质(没食子酸、香豆酸、3,4-二羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、香兰素、阿魏酸、苯甲酸)，混合酚酸总浓度1000mg/L，接种10％太子参根际土壤悬浮液富集培养数代后，筛选有自毒物质降解能力和拮抗太子参病原菌的有益细菌。
经筛选鉴定共获得12株具有强拮抗能力的太子参根际土著有益菌，包括2株伯克霍尔德菌(Burkholderiaambifaria、新洋葱伯克霍尔德菌)；4株假单胞菌(荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌、Pseudomonasprotegens、韩国假单胞菌)；6株芽孢杆菌(解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌)。其中强拮抗菌新洋葱伯克霍尔德菌、Burkholderiaambifaria、Pseudomonasprotegens、韩国假单胞菌已于2016年1月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号分别为：CGMCCNO.12119、CGMCCNO.12120、CGMCCNO.12121、CGMCCNO.12122。
本发明土著拮抗菌是通过大量的筛选工作而得到，是从3000株土壤细菌中筛选得到的，对太子参专化型病原菌(如尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌、踝节霉菌等)具有很强的拮抗效果，如图2所示。本发明所述的土著拮抗菌除了能够抑制病原菌外还具有解磷能力，能够有效活化土壤养分，如图3所示，改善土壤理化性质，促进植物养分吸收方面具有重要作用。
实施例2专用复合微生物菌剂的制备
本发明所述的一种专用复合微生物菌剂，是由通用有益菌与土著有益菌按体积比为4：6的比例混合而成，具体制备方法如下：
2.1EM复合菌液制备
往18L的井水(自来水需至少放置2天后使用)中加入300g红糖和50mLMS母液，再加入1L活化好的EM液体菌种，置于35～37℃的室内密闭发酵2～3周，从发酵第二天开始每隔一天可打开密闭容器口放气减压一次，打开容器口时能闻到酸甜味，并且越来越明显，这是正常现象，即表示发酵扩培成功，备用。成功的成品发酵液有酸甜味，pH3.0～4.0，活菌数大于100亿/mL。
2.2土著有益菌活化及扩大培养
1)菌种活化
将荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌、Pseudomonasprotegens、韩国假单胞菌分别接种于假单胞菌选择性固体培养基中，置于28～32℃培养箱中活化12～16h。
将其他的土著有益菌(包括伯克霍尔德菌、芽孢杆菌)分别接种于LB固体培养中，置于37℃培养箱中活化8～16h。
2)扩大培养
将活化好的各种土著有益菌接种于液体培养中进行发酵培养，假单胞菌置于28～32℃下扩大培养，其他土著有益菌置于37℃下扩大培养，当活菌数高于1.0×109CFU/mL时停止扩大培养，备用。
2.3复合微生物菌剂制备
将土著有益菌即伯克霍尔德菌、假单胞菌、芽孢杆菌按体积比为4:1:1的比例混合制成土著有益菌复合菌液(IM复合菌液)。
进一步，将EM复合菌液与IM复合菌液按体积比为4:6的比例混合制成太子参专用复合微生物菌剂。
实施例3专用复合微生物菌剂防治太子参连作障碍田间效果评价
首先将制备的专用复合微生物菌剂与有机物料一起发酵制备生物有机肥，将其作为底肥对太子参连作土壤进行预先改良，之后整地起畦，种植太子参，并且从太子参苗期开始适时适量灌根追施专用的复合微生物液体菌剂，于收获期进行产量差异比较。具体防治措施如下：
3.1微生物有机底肥制备
将有机物料豆柏、米糠、烘干猪粪、鱼粉、红糖按重量比2:1:1:1:0.03进行混合拌匀，再加入适量的专用复合微生物液体菌剂，根据物料的干燥程度调整加入复合微生物液体菌剂的量，含水量控制在30％(以手捏易成团但不出水为宜)，充分拌匀后装袋或装桶进行密闭厌氧发酵，37℃、48h，发酵完毕，室温放置2～4周以后熟。在上述厌氧发酵产品里再接入适量的专用微生物液体菌剂，在密闭且通风的设备里37°发酵48h，制得专用微生物有机肥，总活菌数1.0～5.0亿/g。
3.2土壤改良
处理组：前茬作物收获后，进行第一次整地，每亩施入事先发酵好(至少提前1个月开始发酵)的微生物有机肥1200kg，深耕翻入土中，耙匀起畦，覆盖好黑色地膜，沟灌洇水至畦面微湿(但未淹至畦面)即停水，覆膜发酵至少1个月，以改良修复恶化的连作土壤环境。
对照组：施入等量用于发酵微生物有机肥的底料，后期不追施专用微生物液体菌剂，其他田间管理措施与处理组保持一致。
空白组：不施用于发酵微生物有机肥的底料，后期也不追施专用微生物液体菌剂，其他田间管理措施与处理组保持一致。
3.3太子参种植
种植前一周，进行第二次整地，在整好的畦面上按行距15厘米开深7～10厘米的直行条沟。栽种前，每亩用复合肥20kg，磷肥25kg，钾肥10kg混匀后施入种植沟内作种肥，稍加些盖土，然后按株距5～7厘米将种参斜排于沟壁，芽头朝上，芽距地平5cm左右，轻覆土。于11月下旬至12月栽种，每亩用种参25～35公斤。
3.4追施菌液
于2月中下旬，幼苗出土后，灌根施入100倍稀释的专用复合微生物菌液1次，3月中旬和4月中旬，再分别灌根施入50倍稀释的专用复合微生物菌液各1次，以抵抗土传病害发生。根据太子参长势及发病情况，调整灌根次数，若有发病症状，可适当增加灌根次数。对照组和空白组灌根施入等量的水。
3.5收获及产量差异比较
于6月下旬太子参植株枯萎倒苗时，选择晴天采挖太子参。用小锄头深挖15厘米以上，将太子参块根完整挖出，避免损伤块根，拣出、洗净、晾干、称鲜重。
多年试验结果表明，与连作太子参(对照组和空白组)相比，施用所发明的专用微生物菌剂可显著抑制发病情况，提高太子参亩产量，增产约30～65％。可见，本发明所述的专用微生物菌剂对防治太子参连作障碍田间效果显著，功效稳定，市场应用前景巨大。
本领域的普通技术人员能从本发明公开内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种消除太子参连作障碍的专用复合微生物菌剂，其特征在于：由通用有益菌与土著有益菌按体积比为4:6组成；所述通用有益菌由乳酸菌、光合细菌、酵母菌、放线菌按体积比为1:1:1:1的比例混合制成；所述土著有益菌由伯克霍尔德菌、假单胞菌、芽孢杆菌按体积比4:1:1的比例混合而成。
2.如权利要求1所述的一种消除太子参连作障碍的专用复合微生物菌剂，其特征在于：所述乳酸菌为植物乳杆菌、乳酸链球菌及干酪乳杆菌中的一种或几种。
3.如权利要求1所述的一种消除太子参连作障碍的专用复合微生物菌剂，其特征在于：所述光合细菌为沼泽红假单胞菌及类球红细菌中的一种或两种。
4.如权利要求1所述的一种消除太子参连作障碍的专用复合微生物菌剂，其特征在于：所述酵母菌为酿酒酵母及产朊假丝酵母中的一种或两种。
5.如权利要求1所述的一种消除太子参连作障碍的专用复合微生物菌剂，其特征在于：所述放线菌为灰色链霉菌及白色链霉菌中的一种或两种。
6.如权利要求1所述的一种消除太子参连作障碍的专用复合微生物菌剂，其特征在于：所述伯克霍尔德菌为Burkholderiaambifaria及新洋葱伯克霍尔德菌中的一种或者两种。
7.如权利要求1所述的一种消除太子参连作障碍的专用复合微生物菌剂，其特征在于：所述假单胞菌为荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌、Pseudomonasprotegens、韩国假单胞菌中的一种或几种。
8.如权利要求1所述的一种消除太子参连作障碍的专用复合微生物菌剂，其特征在于：所述芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌中的一种或几种。
9.一种如权利要求1所述的消除太子参连作障碍的专用复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、土著拮抗菌的筛选：
分别采用假单胞菌选择性培养基、芽孢杆菌选择性培养基对太子参根际假单胞菌、芽孢杆菌进行分离，采用无机培养基对自毒物质降解菌进行分离；
所述假单胞菌选择性培养基配方为：称取20g大豆-酪蛋白消化物琼脂培养基，加495.5mL双蒸水加热搅拌，充分溶解后，再加入1mL0.1％(wt/vol)结晶紫储备液，121℃高压灭菌15min，冷却至大约50℃时，往培养基中再添加3.5mL5％(wt/vol)呋喃咀啶储备液，所述呋喃咀啶储备液用N,N-二甲基甲酰胺作溶剂，倒板冷却，备用；由所述假单胞菌选择性培养基筛选到荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌、Pseudomonasprotegens及韩国假单胞菌；
所述芽孢杆菌选择性培养基配方为：每升含5.0g蛋白胨，1.5g酵母提取物，1.5g牛肉膏，5.0gNaCl，20g琼脂，pH7.2；由所述芽孢杆菌选择性培养基筛选到芽孢杆菌；
所述无机培养基配方为：每升含NH4NO31.0g，NaCl0.5g，K2HPO4·3H2O1.5g，MgSO4·7H2O0.5g，(NH4)2SO40.5g，pH7.2；称取各组分溶解于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min，冷却至45～50℃时，加入太子参连作土壤中鉴定到的自毒物质，所述自毒物质包括没食子酸、香豆酸、3,4-二羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、香兰素、阿魏酸及苯甲酸，混合酚酸总浓度1000mg/L，接种10％太子参根际土壤悬浮液富集培养数代后，筛选有自毒物质降解能力和拮抗太子参病原菌的有益细菌；
步骤二、通用复合菌液制备：
往18L的井水或至少放置2天后的自来水中加入300g红糖和50mLMS母液，再加入1L活化好的EM液体菌种，置于35～37℃的室内密闭发酵2～3周，从发酵第二天开始每隔一天可打开密闭容器口放气减压一次，打开容器口时能闻到酸甜味，并且越来越明显，表示发酵扩培成功，即制得EM复合菌液，备用；成功的成品发酵液有酸甜味，pH3.0～4.0，活菌数大于100亿/mL；
步骤三、土著有益菌活化及扩大培养：
菌种活化：将筛选到的荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌、Pseudomonasprotegens、韩国假单胞菌分别接种于假单胞菌选择性培养基中，置于28～32℃培养箱中活化12～16h；将筛选到的伯克霍尔德菌及芽孢杆菌分别接种于LB固体培养中，置于37℃培养箱中活化8～16h；
扩大培养：将活化好的各种土著有益菌接种于液体培养中进行发酵培养，假单胞菌置于28～32℃下扩大培养，将伯克霍尔德菌及芽孢杆菌置于37℃下扩大培养，当活菌数高于1.0×109CFU/mL时停止扩大培养，备用；
步骤四、复合微生物菌剂制备：
将土著有益菌即伯克霍尔德菌、假单胞菌、芽孢杆菌按体积比为4:1:1的比例混合制成土著有益菌复合菌液，即IM复合菌液；将所述EM复合菌液与所述IM复合菌液按体积比为4:6的比例混合制成太子参专用复合微生物菌剂。
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