CN105779293A

CN105779293A - 一种小球藻的保存方法

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Publication number: CN105779293A
Application number: CN201610330167.3A
Authority: CN
Inventors: 张拥军; 卢傲雪; 徐瑶瑶; 周添添
Original assignee: China Jiliang University
Current assignee: China Jiliang University
Priority date: 2016-05-18
Filing date: 2016-05-18
Publication date: 2016-07-20
Anticipated expiration: 2036-05-18
Also published as: CN105779293B

Abstract

本发明提供了一种小球藻的保存方法，所述的保存方法为：常温下，将小球藻浓缩液与无菌水按体积比1～3：1混合，然后添加甘油、茶叶提取物、山梨酸钾进行保存；所述甘油的质量终浓度为1％～4％、所述茶叶提取物的质量终浓度为1％～4％、所述山梨酸钾的质量终浓度为0.04％～0.08％；本发明保存工艺简单，易放大生产，针对小球藻在保存过程当中极易因操作不当受到污染，复活后小球藻生物量、叶绿素及活性多糖等重要指标快速下降等问题，通过安全高效保护剂的筛选复配，可有效避免上述问题，且可在常温下进行贮藏与运输，避免低温耗能与运输不便。

Description

一种小球藻的保存方法

(一)技术领域

本发明涉及一种淡水小球藻的保存方法。

(二)背景技术

1.小球藻的简介

小球藻(Chlorella)为绿藻门(Chlorophyta)、绿藻纲、绿球藻目、小球藻属的一种普生性的单细胞绿藻，一般为聚集成群的单细胞绿藻。小球藻分布范围极其广泛，在温带、热带、淡水或咸水中均能很好的生长。小球藻存在的时间长远，是地球上最早存在的生命之一，也是人类最早进行人工培养的微藻。

小球藻是一种天然的营养均衡的绿色营养健康食品，***卫生组织和粮农组织曾称誉其为“21世纪理想食品”与“21世纪的最佳食品”。小球藻细胞内叶绿素高达4％～6％，是自然界植物中含量最高的，其高强度的光合作用使藻细胞内含有非常丰富的营养物质如蛋白质、氨基酸、不饱和脂肪酸、多糖、维生素、矿物质以及生长因子、DHA、EDP等营养物质，具有很好的食用价值和医用价值。

2.小球藻的价值应用

杨鹭生等(杨鹭生,李国平,陈林水.蛋白核小球藻粉的蛋白质、氨基酸含量及营养价值评价[J].亚热带植物科学,2003,32(1):36～38.)研究指出，优良的小球藻藻粉蛋白质含量可达到60％以上，除优质鱼粉外，远超过其他蛋白质。藻粉中的氨基酸种类也非常丰富，有18种之多，其中包括8种为人体必需氨基酸；同时限制性氨基酸蛋氨酸和胱氨酸的含量较低，非常适合为人类的提供所需蛋白。除此之外，小球藻的叶绿素含量也颇高，可以达到4％～6％。还有占总脂肪酸含量65％的不饱和脂肪酸，如备受关注的亚油酸、亚麻酸等，由此小球藻具备了保健功能可以向市场进一步拓展。

根据李羡等(李羡,姜梦柔,何林乾,李乐乐,季东鑫,韩晓弟.小球藻提取物对几种十字花科蔬菜种子萌发的影响[J].江苏农业科学,2010(4):160～162.)利用小球藻提取物对大白菜、芥菜、萝卜种子等多种十字花科种子的研究，证明当浓度为4％时能够明显促进其快速发芽和胚根生长。并且经过毒理试验证明，该提取物没有毒性，因此可以作为环保农药快速发展。

在工业方面，日本很早就开始了对小球藻的研发，成功制作小球藻提取液CGF为食品添加剂，因其具有食品添加剂所特有的优点，被快速运用到许多食品中。而在发酵工业也利用小球藻的发酵作用使有利微生物快速繁殖。并且，在水产养殖方面，小球藻还可作为鱼、虾、蟹以及贝类等的饲料，具有良好的投喂效果。

在环境良好时，小球藻利用阳光、水和空气中的二氧化碳，转化产生ATP，并释放氧气，以此降低现今温室效应带来的影响。当其生存在污水中时，小球藻也能吸收铅、镉等重金属，将农药、芳香烃等多种有机物分解并利用。藻细胞以吸收的含氮化合物作为氮源，利用碳酸盐和空气中的二氧化碳作为碳源，进行光合作用。在氧气充足的情况下，磷酸盐被藻细胞转化成ATP和磷脂等有机物，而在无氧的时候，则是形成磷酸盐沉淀，起到净化污水的作用。

而在医疗方面，王凌等(王凌,孙利芹,周妍.小球藻多糖体外免疫调节活性研究[J].食品研究与开发,2013,34(7):30～33.)通过从小球藻中提取的多糖对小鼠体外的细胞免疫调节进行研究，结果发现吞噬细胞的能力提高，其他参与免疫功能的相关细胞的增殖速度加快，这就表明小球藻多糖能对小鼠的细胞免疫功能有明显助益。也有学者发现小球藻多糖对实验小鼠的肿瘤有明显抑制作用。这些研究虽然目前只在实验小鼠上取得成果，但是同时也为以后在人类身上进行相关治疗提供了坚实的理论基础。

3小球藻的保存方法

3.1继代保存

继代保存，与其他保存方法比较简便易行，设备简单，在普通实验室常被用来保存藻种。继代保存就是指把藻种接种在新鲜培养基上进行连续多代培养，通常条件控制在低温(指温度控制在0～4℃之间)或常低温(指在5～15℃之间)、弱光(通常指在冰箱内装一支8W的日光灯照明)，以达到保证有部分藻种存活的目的。接种1次可保藏至多1年，之后就必须转移。但多次转接容易致使藻种受到杂菌污染，甚至变异。

3.2固定化保存

固定化是指将酶或细胞固定在不易流动的载体上进行生物催化反应或细胞增殖等，一般包括吸附法、包埋法和偶联法三种。而藻类的固定化培养宜选择包埋法，用藻酸钙或K-角叉藻聚糖做为固定化载体，使微藻处于相对静止的状态，只能在圈定的范围内进行代谢活动，因此生长速度缓慢。经过恢复培养，藻细胞会随着环境条件(光照和营养)的改善，生命活动能力迅速恢复，颜色逐渐加深。然而不是所有的藻类都适合固定化培养，就如亚心形四片藻会在固定化培养过程中因细胞高密度而停止生长，甚至衰败死亡。因此，不同藻类的固定化保存需要根据藻种的生物特征确定最佳的保存时间以及环境条件。

马志珍和张继红两位(马志珍,张继红.海产饵用微藻固定化保种技术.[J]中国水产科学,1998,5(2):57～61.)对12种海产饵料微藻进行固定化保种的试验，结果发现固定化保种技术不适合隐藻门的波海红胞藻，而蓝藻门的聚球藻红色品系存活时间低于3个月，旋鞭巴夫藻和盐泽螺旋藻等五种藻类存活时间超过1年。另外微型小球藻、朱氏四片藻等五种藻类被置于4℃存活时间可达到2年左右。孟妍等(孟妍,张恩栋,王起华.包埋-脱水法常温和低温保存绿色巴夫藻[J].细胞生物学杂志,2008,30:131～135.)研究表明，用包埋-脱水法在常温和低温下保存绿色巴夫藻6个月，在常温(20℃)比在低温(4℃)的保存效果差。其中4℃保存的较高存活率58.5％，且保存后的藻细胞经恢复培养可达到保种前的水平。

固定化技术虽然对仪器设备的要求较低，能在一般的微藻实验室进行，对藻细胞生长抑制效果明显，并且恢复培养生长速度快，但是操作繁琐，过程中容易受到污染。另外还有许多相关资料显示，并非所有的微藻都适合固定化保存，每种微藻对固定化后的生长速率都不同。因此，为了得到相对有效的保存方法还需要进行更多深入的实验。

3.3冷冻保存

冷冻保藏包括低温法(0～4℃)和超低温法(-196℃)两种，与其他保存方法比较，具有基因稳定、变异几率小和保藏时间长等多方面的明显优点，并且在微藻、胚胎等多方面颇有成效。

3.3.1低温保存

低温保存通常指在0～4℃的条件下进行保存。与超低温法比较，低温法相对简便可行，但是仍存在保存时间短的缺陷。

3.3.2超低温保存

超低温保存是使投入液氮(-196℃)中的活细胞生长代谢几乎完全停止的一种保存方法。在这种冷冻条件下，细胞内的活性物质如各类酶活性受抑制，导致的正常生命代谢活动停止。并且在合适条件下活化后，细胞便能恢复到原有的细胞活性。目前虽然人们一直致力于研究在低温或超低温保存技术对微藻资源的应用，也取得了许多成果。迄今为止，绝大多数藻类是采用两步冷冻法进行保存，也有极少数是采用玻璃化法保存的。两步冷冻法即首先缓慢降温对藻类进行冷适应，然后再将其放入液氮中保存。而“玻璃化”，是指将某种物质通过改变其温度转化成玻璃样无晶体结构的过程，介于液态与固态之间。这种物理性质，具有避免冷冻细胞及组织结冰体积膨胀而损伤的优点，有利于长期保存。

在国外，英国的Morris(MorrisGJ.Cryopreservationof250strainsofChlorococcalesbythemethodoftwo～stepcooling[J]BrPhycolJ,1978,13:15～24.、MorrisGJ,CoulsonG,ClarkeA.ThecryopreservationofChlamydomonas[J].Cryobiol,1979,16:401～410.)采用冷冻保存法对Euglenagraeilis，Chlorella，Euglena等多种微藻进行研究，最终获得非常理想的研究成果。Santiago—V(Santiago-VzquezLZ,NewbergerNC,KerrRG.CryopreservationofthedinoX-agellatesymbiontoftheoctocoralPseudopterogorgiaelisabethae[J].MarBiol,2007,152(3):549～556.)以不同浓度的乙醇和甲醇作保护剂，分别采用低速冷冻法(1℃/min)、一步冷冻法(直接投入液氮)、两步冷冻法(-70℃放置2h后，再投入液氮)、三步冷冻法(-20℃放置2h，-70℃放置2h后，再投入液氮)对共生甲藻进行了超低温保存，结果发现第三种方法的保存效果最佳。而在国内，张跃群等(张跃群,石斌,陆德祥,王勇军.3种优质海洋微藻的低温保存研究[J].江苏农业科学,2009,6:314～316.)对亚心型扁藻、三角褐指藻、球等鞭金藻3011使用不同冷冻保护剂在-196℃超低温和-20℃低温条件下进行了冷冻试验，结果发现球等鞭金藻在超低温条件下最高存活率为10％左右。孙建华等(孙建华,王如才,赵强.高浓度小新月菱形藻保存方法的研究[J].海洋学报,1998,20(2):108～112.)在研究高浓度小新月菱形藻保存方法时，通过在20℃、0℃和-30℃条件下以抗生素、防腐剂、DMSO、甘油等作为保护剂进行3个月的保存研究，最终通过比较发现，在-30℃中加入DMSO组平均存活率最高，藻液呈现良好状态。蔡小宁等(蔡小宁,陈舒泛,陈俊,刘少华.小球藻的玻璃化超低温保存法[J].植物生理学通讯,2004,40(5):599～601.)采用三步冷冻法先将小球藻用预处理液处理20min，再用玻璃化液处理，再在0℃预冻1h，最后投置液氮中，获得高于60％的较高存活率。

3.4常温保存

目前国内外关于在常温下保存微藻的研究相对较少，但是相关的研究几乎都验证了添加保护剂的保存效果远比不添加任何保护剂的保存效果要好。如孟妍等(孟妍,张恩栋,王起华.包埋-脱水法常温和低温保存绿色巴夫藻[J].细胞生物学杂志,2008,30:131～135.)使用包埋-脱水法在常温和低温条件下对绿色巴夫藻进行试验，结果发现在常温(20℃)条件下保存6个月存活率为34.7％，低于在低温(-30℃)加入甘油后的存活率37.5％。董光宇等(董光宇,张恩栋,王起华.包埋-脱水法常温和低温下保存盐生杜氏藻的研究[J].安徽农学通报,2008,14(23):37～39.)也采用了相同的方法对盐生杜氏藻进行保存试验，实验发现藻细胞在20℃黑暗中保存6个月后的存活率低于20％。朱明等(朱明,阎斌伦,滕亚娟,张学成.三角褐指藻浓缩液长期保存技术研究[J].水产科技情报,2003,30(6):246～249.)研究发现，三角褐指藻在15℃和20℃的条件下，保存5周后的存活率低于50％，下降曲线呈现先快后慢的趋势。王培磊等(王培磊,宫庆礼,麦康森,赵明目.两种海洋单胞藻浓缩与保存效果的研究[J].海洋湖沼通报,2001,12(4):12～19.)对两种海洋单胞藻(小球藻和球等鞭金藻)进行浓缩和保存效果研究的时候发现，在常温(20±1℃)无任何保护剂组存活率最低；而加入茶叶提取物组存活率高达80％。王云鹏等(王云鹏,衣华波,王华民.单胞藻静置保种技术研究[J].齐鲁渔业,1997,14(4):29～30.)将扁藻、小球藻、金藻8701、金藻3011和小硅藻在高温(25～37℃)条件下进行静置保存，结果发现后三者及小球藻的沉积物出现结块死细胞，而扁藻呈现粘连细胞和结块死细胞；另外关于上层藻液，大多数显示只有个别运动细胞，其中小硅藻未发现健康细胞。

综上，继代保存法简单易行，通常在常温或常低温下保存，但缺点是保存时间短，需要频繁继代，并且容易发生污染和变异，只能用于藻类的短期保存；干燥保存法目前只能用于某些蓝藻和少数绿藻，且大多存活率很低；超低温保存需要较为复杂的操作技术和贵重的保存设备，且只能保存微量的藻种；固定化技术保存藻种恢复培养生长速度快，但是操作繁琐，过程中容易受到污染，且不适合所有藻种。因此，具有能够避免杂菌污染、保存效果好、时间长、并且在常温下能够保存、便于运输以及可方便复活使用的小球藻保存方法极为重要。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种保存效果好、时间长，并且在常温下能够保存、便于运输以及可方便复活的小球藻保存方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种小球藻的保存方法，所述的保存方法为：

常温(20～30℃)下，将小球藻浓缩液与无菌水按体积比1～3：1混合，然后添加甘油、茶叶提取物、山梨酸钾进行保存；所述甘油的质量终浓度为1％～4％、所述茶叶提取物的质量终浓度为1％～4％、所述山梨酸钾的质量终浓度为0.04％～0.08％；

特别优选的，所述甘油的质量终浓度为2％、茶叶提取物的质量终浓度为2％、山梨酸钾的质量终浓度为0.06％；

所述的茶叶提取物按如下方法制备得到：

取干燥茶叶粉碎，过60～100目筛，得到茶粉，将所得茶粉与水按料液比1：30～50混合，在温度20～40℃、超声波功率20～40KHz条件下提取20～40min，之后离心，收集上清液，滤渣同样条件下二次提取，合并两次上清液，浓缩至固形物含量为20wt％～30wt％，然后冷冻干燥，即得所述的茶叶提取物，备用。

本发明所述的茶叶为山茶科(Theaceae)、山茶属(Camellia)植物的叶子，为了降低成本，可选取粗老茶叶，所述的粗老茶叶通常指夏季从茶树采摘的粗老叶片，口感苦涩，多为低档茶叶。

本发明所述的小球藻浓缩液按如下方法制备得到：

在温度为28℃，光照为65μmol·m-2·s-1，光照周期为14h/d条件下，将市面商购获得的小球藻先用BG11固体培养基进行培养8～12天，然后从BG11固体培养基中挑取一环小球藻接入BG11液体培养基，在温度为33℃，光照为65μmol·m-2·s-1，光照周期为14h/d，转速为150rpm/min摇床中进行培养8～16天，之后经离心，弃去上清液，即得所述的小球藻浓缩液；所得到的小球藻浓缩液中小球藻的浓度为0.15～0.3g/100mL。

所述的BG11固体培养基、BG11液体培养基均为本领域常用的培养基；

通常，所述的BG11固体培养基的终浓度组成为：1.5g/LNaNO₃、0.04g/LK₂HPO₄、0.075g/LMgSO₄·7H₂O、0.036g/LCaCl₂·7H₂O、0.02g/LNa₂CO₃、0.006g/L柠檬酸、0.006g/L柠檬酸铁、1ml/L微量元素溶液、20.0g/L琼脂；初始pH值为6.5～7.5，溶剂为蒸馏水；

所述的BG11液体培养基的终浓度组成为：1.5g/LNaNO₃、0.04g/LK₂HPO₄、0.075g/LMgSO₄·7H₂O、0.036g/LCaCl₂·7H₂O、0.02g/LNa₂CO₃、0.006g/L柠檬酸、0.006g/L柠檬酸铁、1ml/L微量元素溶液；初始pH值为6.5～7.5，溶剂为蒸馏水；

所述的BG11固体培养基、BG11液体培养基中，所述微量元素溶液的组成均为：每1000mL微量元素溶液中，含有2.86gH₃BO₄、1.81gMnCl₂·4H₂O、0.222gZnSO₄、0.39gNa₂MoO₄、0.079gCuSO₄·5H₂O、49.4gCo(NO₃)₂·6H₂O，溶剂为蒸馏水。

与现有工艺相比，本发明的优势体现在：

(1)针对小球藻在保存过程当中极易因操作不当受到污染，复活后小球藻生物量、叶绿素及活性多糖等重要指标快速下降等问题，通过安全高效保护剂的筛选复配，可有效避免上述问题，且可在常温下进行贮藏与运输，避免低温耗能与运输不便。

(2)以小球藻复活后的生物量、叶绿素含量、多糖含量、多糖抑菌活性等多指标筛选小球藻的保存方法，确保筛选方法的可靠性。

(3)选取甘油、山梨酸钾与粗老茶叶提取物为保护剂，在单因素实验基础上通过正交试验优选出最佳保护剂使用浓度为：甘油浓度2％，山梨酸钾浓度0.06％，茶叶提取物浓度2％。小球藻浓缩液在此复配剂保存条件下，28℃保存30d，小球藻生物量由保存前的0.362±0.031g/L下降为0.335±0.027g/L，下降率仅为7.46％；多糖含量由保存前的35.61％±2.11％下降为31.21％±2.05％，下降率仅为12.36％；叶绿素含量由保存前的20.32％±0.23％下降为19.35％±0.18％，下降率仅为4.77％。在此保存条件下保存30d后小球藻恢复培养，其生长率达0.184±0.015g/d。不加保护剂小球藻相比，在28℃保存30d，小球藻胶球已部分发生霉变。与单一保护剂相比，单独使用2％茶叶提取物时，保存30d生物量下降率达25.92％，多糖含量下降率达22.86％，叶绿素下降率达9.5％；单独使用0.06％山梨酸钾时，保存30d生物量下降率达18.52％，多糖含量下降率达20.96％，叶绿素下降率达4.96％；单独使用2％甘油时，保存30d生物量下降率达33.33％，多糖含量下降率达15.89％，叶绿素下降率达9.14％。且本发明保存工艺简单，易放大生产。

(四)附图说明

图1为实施例1第4.1节中生物量标准曲线；

图2为实施例1第4.1节中多糖标准曲线；

图3为实施例1第4.2.1节中温度对小球藻保存的生物量影响；

图4为实施例1第4.2.1节中温度对小球藻保存的多糖含量影响；

图5为实施例1第4.2.1节中温度对小球藻保存的单位藻体叶绿素含量影响；

图6为实施例1第4.2.2节中保存15d线虫培养120h时多糖对沙门氏菌的抑制效果；

图7为实施例1第4.2.2节中保存30d线虫培养84h时多糖对沙门氏菌的抑制效果；

图8为实施例1第4.2.3节中温度对小球藻保存后生长速率影响；

图9为实施例1第4.3.1节中不同茶叶提取物浓度下的生物量变化；

图10为实施例1第4.3.1节中不同茶叶提取物浓度下的多糖变化；

图11为实施例1第4.3.1节中不同茶叶提取物浓度下的藻体叶绿素含量变化；

图12为实施例1第4.3.2节中保存15d线虫培养72h时多糖对沙门氏菌的抑制效果；

图13为实施例1第4.3.2节中保存30d线虫培养84h时多糖对沙门氏菌的抑制效果；

图14为实施例1第4.3.3节中茶叶提取物对生长速率影响；

图15为实施例1第4.4.1节中山梨酸钾对小球藻生物量影响；

图16为实施例1第4.4.1节中山梨酸钾对小球藻多糖含量影响；

图17为实施例1第4.4.1节中山梨酸钾对小球藻叶绿素含量影响；

图18为实施例1第4.4.2节中第15天培养120h多糖对沙门氏菌的抑制效果；

图19为实施例1第4.4.2节中第30天培养72h多糖对沙门氏菌的抑制效果；

图20为实施例1第4.4.3节中山梨酸钾对小球藻保存后的生长速度影响；

图21为实施例1第4.5.1节中甘油对生物量影响；

图22为实施例1第4.5.1节中甘油对多糖含量影响；

图23为实施例1第4.5.2节中甘油对小球藻叶绿素含量的影响；

图24为实施例1第4.5.3节中第15天培养72h多糖对沙门氏菌的抑制效果；

图25为实施例1第4.5.3节中第30天培养144h多糖对沙门氏菌的抑制效果；

图26为实施例1第4.5.4节中甘油对保存后的小球藻生长速率影响。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1

1.实验材料与仪器

小球藻由杭州华丹农产品有限公司提供；

粗老绿茶由杭州龙冠实业有限公司提供；

秀丽隐杆线虫是由浙江大学动物科学学院提供，经定期继代到新鲜NGM培养基中培养以备用；

智能生化培养箱(SPX-250型)、紫外可见分光光度计、生物解剖镜(JS26型)、立式压力蒸汽灭菌锅(YSQ-LS-50A型)、洁净工作台(VS-840K-U型)、光照摇床(TS-2102摇床改造)。

2.实验试剂及配制

(1)BG11培养基(包括BG11固体培养基、BG11液体培养基)

BG11固体培养基的配方为：每1000mL蒸馏水中，含有1.5gNaNO₃，0.04gK₂HPO₄，0.075gMgSO₄.7H₂O，0.036gCaCl₂.7H₂O，0.02gNa₂CO₃，0.006g柠檬酸，0.006g柠檬酸铁，1ml微量元素溶液(每1000mL微量元素溶液的组成为：2.86gH₃BO₄，1.81gMnCl₂.4H₂O，0.222gZnSO₄，0.39gNa₂MoO₄，0.079gCuSO₄.5H₂O，49.4gCo(NO₃)₂.6H₂O，溶剂为蒸馏水)，20.0g琼脂，pH值7.0，倒入6cm培养皿后备用。

BG11液体培养基的配方为：每1000mL蒸馏水中，含有1.5gNaNO₃，0.04gK₂HPO₄，0.075gMgSO₄.7H₂O，0.036gCaCl₂.7H₂O，0.02gNa₂CO₃，0.006g柠檬酸，0.006g柠檬酸铁，1ml微量元素溶液(每1000mL微量元素溶液的组成为：2.86gH₃BO₄，1.81gMnCl₂.4H₂O，0.222gZnSO₄，0.39gNa₂MoO₄，0.079gCuSO₄.5H₂O，49.4gCo(NO₃)₂.6H₂O，溶剂为蒸馏水)，pH值7.0。

两者均为本领域常用的培养基。

(2)其他试剂和药品：甘油；山梨酸钾；无水乙醇；95％乙醇；4％氢氧化钠；硫酸；液氮；5％苯酚等。

3.方法

3.1小球藻的培养

小球藻培养的基本条件：在温度为28℃，光照为65μmol·m-2·s-1，光照周期为14h/d条件下，将小球藻先用BG11固体培养基进行培养10天，然后从BG11固体培养基中挑取一环小球藻接入BG11液体培养基，在温度为33℃，光照为65μmol·m-2·s-1，光照周期为14h/d，转速为150rpm/min条件下进行培养12天，得到处于快速生长期的藻液。

3.2实验因素设计

3.2.1温度对小球藻保存效果的影响设计

保存实验：取处于快速生长期的藻液(500mL，其中小球藻浓度为0.60g/L，浓缩至100mL)，按照每瓶藻液和无菌水、保护剂总体积为150mL藻液，分别以甘油浓度4％、山梨酸钾浓度0.04％、茶叶提取物浓度4％添加到250ml锥形瓶内，用牛皮纸封口，分别在4℃、28℃、37℃避光保存30d。

恢复培养实验：将保存30d后的各组实验样品离心(8000r/min，10min)，弃去上清，用无菌水清洗2～3次后，接种到新鲜BG11液体培养基中，校正所有组别OD₆₆₇为定值(0.3-0.4)，按照3.1的条件进行培养。

3.2.2茶叶提取物对小球藻保存效果的影响设计

茶叶提取物：取干燥粗老茶叶粉碎，过60～100目筛，获得茶粉；所述粗老茶叶属山茶科(Theaceae)、山茶属(Camellia)植物，通常指夏季从茶树采摘的粗老叶片，口感苦涩，多为低档茶叶，未加工；将茶粉加水，在提取温度20℃、提取时间30min、超声波功率30KHz、料水比1：40条件下提取，之后离心，滤渣同样条件下二次提取，合并两次上清液，浓缩后冷冻干燥备用。

保存实验：取处于快速生长期的藻液(500mL，其中小球藻浓度为0.60g/L，浓缩至100mL)，按照每瓶藻液和保护剂以及无菌水总体积为150mL，分别根据2％、4％、6％、8％、10％的茶叶提取物浓度添加到250ml锥形瓶内，用牛皮纸封口，在28℃培养箱避光保存30d。

3.2.3山梨酸钾对小球藻保存效果的影响设计

保存实验：取处于快速生长期的藻液(500mL，其中小球藻浓度为0.60g/L，浓缩至100mL)，分装于250ml锥形瓶内，每瓶藻液和保护剂以及无菌水总体积为150mL，分别以0.02％、0.04％、0.06％、0.08％、0.1％的山梨酸钾浓度添加到藻液当中，用牛皮纸封口，在28℃避光条件下保存30d。

3.2.4甘油对小球藻保存效果的影响设计

保存实验：取处于快速生长期的藻液(500mL，其中小球藻浓度为0.60g/L，浓缩至100mL)，按照每瓶藻液和保护剂以及无菌水总体积为150mL，分别根据2％、4％、6％、8％、10％的甘油浓度添加到250ml锥形瓶内，用牛皮纸封口，在28℃培养箱避光保存30d。

3.2.5正交实验设计

根据单因子实验结果，在茶叶提取物、山梨酸钾、甘油三种保护剂对小球藻保存效果最佳添加量的附近各设置3个水平，通过3因素3水平的正交表设计，在最合适温度下进行保存实验。

3.3指标测定

(1)保存时期：于1d，15d，30d取样，测其生物量，多糖含量，多糖活性和叶绿素含量。

(2)恢复培养时期：每隔2d取样，检测生长速率。

(3)生物量标准曲线制作：量取了5个不同生长阶段的藻液各200mL测量OD₆₆₇，8000r/min，10min离心收集藻泥后于80℃烘箱中干燥至恒重后称量，绘制干重与吸光值之间标准曲线。

(4)葡萄糖标准曲线制作：按照苯酚硫酸法绘制。

(5)生物量测定方法：取5mL量的胶球，加入5mL的5％柠檬酸钠，涡旋2～3min至藻珠全部溶解，离心(8000r/min，5min)弃去上清液，加入适量纯水重悬，清洗数遍。将藻泥重新定容至5mL，测其A667值，计算其生物量；比生长率：Kx＝ln(Ax/Ax-1)，K＝Average(K1,K2,…Kx)。

(6)多糖含量：取1ml藻液，先用水稀释10倍，再使用苯酚硫酸法测多糖，按照标准曲线计算多糖含量。

(7)多糖活性：取50ml藻液，离心(4000rpm，10min)，吸干水分，反复冻融多次，碱提法(4％的NaOH10mL，超声1h；调节pH＝7.0，80℃水浴1h；2000rpm，10min离心取上清；加入95％酒精40mL，醇沉；洗净，低温保存)获得多糖，用秀丽隐杆线虫抑菌模型检测其抑菌能力。

(8)叶绿素含量：取5ml藻液，0.45μm滤膜抽滤，吸干水分，用少量无水乙醇洗下，研磨至无水乙醇挥发，继续用液氮研磨10min，用无水乙醇定容至5ml，避光静置于4℃冰箱。24h后将提取液在4000rpm，10min离心，取上清液测定A645、A663，计算叶绿素含量。

按照公式计算C_a+b＝20.3A₆₄₅+8.04A₆₆₃

公式中A₆₄₅、A₆₆₃分别代表在波长为645nm、663nm下的OD值。

3.4秀丽隐杆线虫抑菌模型的建立

(1)秀丽隐杆线虫培养

取少量大肠杆菌OP50菌液，用生理盐水稀释其OD₆₀₀为1.0-1.2，吸取100μL菌液滴加在NGM平板上并涂抹均匀(涂抹面积约占总表面积的50％-60％，涂布菌边缘距离平板壁20mm左右)，37℃培养12h后，4℃贮存备用。线虫野生型-N2的培养：采用Brenne方法在NGM培养基上继代培养，选择线虫较多且生长正常的平板，用解剖刀切取带有线虫较多的一块琼脂，将其倒扣于涂有大肠杆菌OP50的NGM培养基上，置于16℃生化培养箱中培养3天后，即可见培养基上有大量成虫和幼虫。

(2)线虫抑菌模型建立

同期化：收集线虫生长良好的平板，用M9缓冲液将平板中全部线虫洗入EP管中；离心(3000rpm，1min)后，用0.25mlddH2O重悬虫体，加入0.15mL线虫裂解液(3.4mL双蒸水，0.6mL5％NaClO，1mL8mol/LNaOH，现用现配)，涡旋5min裂解后得到虫卵；用M9缓冲液清洗虫卵数次后，将虫卵置于空白NGM平板中于16℃培养箱中孵化过夜后可得到L1时期线虫；将其洗入涂布有OP50的NGM平板中于16℃培养箱生长48h后可得到同步化的L4时期线虫。

染毒：挑取线虫于EP管中，用M9缓冲液洗涤管中线虫数次后转移线虫至预先涂布有金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的NGM培养基上，培养12h。

治疗：挑取已染毒线虫于EP管中，洗涤数次后将线虫洗入空白NGM平板中，任其爬行2-3h；将线虫挑入事先涂布有待评价样品的涂布有OP50的NGM平板中，每12h记录存活线虫数目。

4结果

4.1生物量和葡萄糖标准曲线

按照绘制方法，得到标准曲线，如图1与图2。

4.2温度对小球藻保存效果的影响

4.2.1温度对小球藻保存期内生物量、多糖与叶绿素含量的影响

如图3，保存期间不同温度下小球藻生物量均呈下降趋势，其下降曲线是先快后慢。其中温度为4℃时小球藻生物量下降最少，从保存开始时的0.27g/L下降到了0.21g/L，其次为28℃降低到了0.20g/L，最后是37℃最终生物量为0.18g/L。

如图4，在保存期间，随着保存时间的延长，各温度组小球藻多糖含量明显下降。其中28℃时多糖含量由保存第1天的0.35g/L降低到了0.29g/L，下降最少，其次为4℃组0.28g/L以及37℃组0.27g/L。

如图5，在保存期间，各温度组小球藻叶绿素含量均随着保存时间的延长而下降。其中28℃时叶绿素下降量最少，由初始的18.7％仅下降到17％，37℃时叶绿素含量下降最多，由初始的18.7％下降到16.2％。

4.2.2温度对保存期间小球藻多糖抑菌活性的影响

如图6，以线虫为模式动物，考察各温度组小球藻多糖对沙门氏菌的抑制效果，抑菌效果越好，线虫的存活率越高。小球藻保存15d时提取的多糖样品，在线虫培养至120h时，不同温度保存的小球藻多糖均具有一定的抑制沙门氏菌效果，线虫存活率均大于空白组，其中28℃保存的小球藻多糖的抑菌效果最好。

如图7，小球藻保存30d时提取的多糖样品，在线虫培养至84h时，不同温度保存的小球藻多糖均具有一定的抑制沙门氏菌效果，线虫存活率均大于空白组，其中28℃和4℃保存的小球藻多糖的抑菌效果近似，均优于37℃。

4.2.3小球藻保存30d复苏后平均生长速率

如图8，不同温度下保存的小球藻在恢复培养后，其平均生长速率差异较大。其中28℃保存30d的小球藻恢复培养后，平均生长速率最大达0.1g/d，其次为37℃(0.08g/d)、4℃(0.04g/d)。

综合考虑以上温度对小球藻保存期内以及恢复培养后小球藻的生物量、多糖与叶绿素含量及多糖抑菌活性的影响，28℃条件下保存，各指标的效果最好，以下实验均选择在28℃条件下保存小球藻。

4.328℃下茶叶提取物对小球藻保存效果的影响

4.3.1茶叶提取物对小球藻保存期内生物量、多糖与叶绿素含量的影响

如图9，不同浓度的茶叶提取物对小球藻保存期内的生物量影响较大。保存期间各组都呈现下降的趋势，其中前期下降较快，后期下降速率有所减缓。茶叶提取物浓度为4％时，生物量降低最少，仅从初始的0.27g/L下降到30d后的0.21g/L。

如图10，不同浓度的茶叶提取物对小球藻保存期内的多糖含量影响较大。保存期内多糖含量均呈下降趋势，各个浓度组的下降速率不同，浓度为2％、4％、8％时下降速率先快后慢，另外两组则相反。浓度为4％时多糖含量降低最少，从初始的35％下降到30d后的27％。

如图11，不同浓度的茶叶提取物对小球藻保存期内的叶绿素含量影响较大。保存期内小球藻在不同茶叶提取物浓度作用下其叶绿素含量的下降速率呈先快后慢的趋势。浓度为2％、4％与6％时，叶绿素含量下降越少，从初始的18.73％分别下降到30d后的16.95％、17.00％与16.96％。

4.3.2不同浓度茶叶提取物对保存期内小球藻多糖抑菌活性的影响

如图12，小球藻在不同浓度茶叶提取物下保存15d时，提取小球藻多糖，在线虫培养至72h时，不同浓度茶叶提取物保存的小球藻多糖均具有一定的抑制沙门氏菌效果，线虫存活率均大于空白组，其中浓度为6％和2％组线虫存活量最高。

如图13，小球藻在不同浓度茶叶提取物下保存30d时，提取小球藻多糖，在线虫培养至84h时，不同浓度茶叶提取物保存的小球藻多糖均具有一定的抑制沙门氏菌效果，线虫存活率均大于空白组，但优势不明显。

4.3.3小球藻保存30d复苏后平均生长速率

如图14，28℃保存30d的小球藻恢复培养后，在恢复培养时期，小球藻的平均生长速率随着茶叶提取物浓度的上升呈现先升高后下降的趋势。茶叶提取物浓度为4％时生长速率最大为0.087g/d，其次生长速率由高降低，其浓度依次为2％(0.078g/d)、6％(0.070g/d)、8％(0.021g/d)、10％(0.018g/d)。

4.428℃下山梨酸钾对小球藻保存效果的影响

4.4.1山梨酸钾对小球藻保存期内生物量、多糖与叶绿素含量的影响

如图15，不同浓度的山梨酸钾对小球藻保存期内的生物量影响较大。保存期间各组都呈现下降的趋势，其中前期下降较快，后期下降速率有所减缓。山梨酸钾浓度为0.06％时，生物量降低最少，仅从初始的0.27g/L下降到30d后的0.22g/L。

如图16，不同浓度的山梨酸钾对小球藻保存期内的多糖含量影响较大。保存期内多糖含量均呈下降趋势，各个浓度组的下降速率不同。浓度为0.06％与0.1％时，前半期下降速率快，后半期下降速率减缓，另外三组下降速率则是先慢后快。浓度为0.06％时多糖含量降低最少，从初始的35.02％下降到30d后的27.68％。

如图17，不同浓度的山梨酸钾对小球藻保存期内的叶绿素含量影响较大。保存期内叶绿素含量均呈下降趋势，各个浓度组的叶绿素含量下降速率不同。山梨酸钾浓度为0.06％时，叶绿素含量下降最少，仅从初始的18.53％下降到30d后的17.61g/L。

4.4.2不同浓度山梨酸钾对保存期内小球藻多糖抑菌活性的影响

如图18，小球藻在不同浓度山梨酸钾下保存15d时，提取小球藻多糖，在线虫培养至120h时，不同浓度山梨酸钾保存的小球藻多糖均具有一定的抑制沙门氏菌效果，线虫存活率均大于空白组，其中山梨酸钾浓度为0.02％和0.08％组线虫存活量最高。

如图19，小球藻在不同浓度山梨酸钾下保存30d时，提取小球藻多糖，在线虫培养至72h时，不同浓度山梨酸钾保存的小球藻多糖均具有一定的抑制沙门氏菌效果，线虫存活率均大于空白组，但优势不明显。

4.4.3小球藻保存30d复苏后平均生长速率

如图20，28℃保存30d的小球藻恢复培养后，在恢复培养时期，小球藻的平均生长速率随着山梨酸钾浓度的上升呈现先升高后下降的趋势。山梨酸钾浓度为0.06％时生长速率最大为0.071g/d，其次生长速率由高降低，其浓度依次为0.04％(0.063g/d)、0.02％(0.062g/d)、0.08％(0.061g/d)、0.10％(0.028g/d)。

4.528℃下甘油对小球藻保存效果的影响

4.5.128℃下甘油对小球藻生物量和多糖含量的影响

实验结果显示(如图21、图22)，在28℃下甘油对小球藻保存的生物量影响显著。在保存期间，小球藻的生物量曲线斜率呈先陡后平缓的趋势。其中甘油浓度为4％组生物量下降最少，从最初开始保存时的0.27g/L到结束时的0.21g/L。而其他依次为6％组(0.2g/L)，10％组(0.19g/L)，8％组(0.18g/L)和2％组(0.18g/L)。

由图可知，甘油对小球藻保存的多糖含量影响较大。在保存期间小球藻的多糖含量总体呈现先快速下降后下降减缓的趋势，并且不同甘油浓度组较为相近。在开始(多糖34.6％)保存到保存结束，甘油浓度为4％组多糖含量具有最大值29.5％，高于浓度为2％组29.1％，其他浓度组的多糖含量从高到低依次为8％、10％和6％。

4.5.228℃下甘油对小球藻叶绿素含量的影响

实验结果显示(如图23)，在28℃下甘油对小球藻保存的单位藻体叶绿素含量的影响显著。在保存期间，各浓度组的单位藻体叶绿素含量随着保存时间的延长而下降，且下降趋势为先快后慢。其中甘油浓度为4％时藻体叶绿素含量由最初的18.6％下降到17.4％，其余依次为2％组(16.9％)，6％组(16.7％)，8％(17.1％)，10％组(16.8％)。

4.5.328℃不同浓度甘油对保存的小球藻多糖抑菌活性的影响

实验结果显示(如图24、图25)，在28℃不同浓度甘油下保存的小球藻多糖对沙门氏菌的抑制效果明显(P<0.05)。在第15天的空白组线虫经过72h的培养从10条下降到了5条，而不同浓度甘油保护组最终线虫剩余数高出空白组2-3条，其中浓度为2％和10％组剩余线虫为8条。

而在第30天提取的小球藻多糖中，浓度为8％组对沙门氏菌的抑制效果最好，其剩余条数为6条，高于空白组3条，抑制效果明显。其他浓度组存活线虫数从高到低依次为4％和6％各5条，其次为10％，浓度2％存活量最少。

4.5.428℃保存30天后小球藻平均生长速率

实验结果显示(如图26)，在恢复培养时期，小球藻的平均生长速率随着甘油浓度的变化而变化，在浓度为4％时平均生长速率最高为0.068g/d，浓度降低或升高平均生长速率都降低。

4.6.正交实验结果

4.6.1直观分析表

根据单因素实验结果，设计正交实验水平如下表1。

表1正交实验因素水平

在此条件下保存30d后，小球藻生物量、多糖含量与叶绿素含量的检测结果如下表2，小球藻恢复培养10d内的平均生长速率亦见表2。

表2正交实验直观分析表

由上表可知，小球藻保存30d后，影响小球藻生物量与多糖含量的3个种保护剂因素中，影响因素由大到小依次均为：茶叶提取物浓度＞山梨酸钾浓度＞甘油浓度；影响小球藻叶绿素含量与平均生长速率的3个保护剂因素中，影响因素由大到小依次为：山梨酸钾浓度＞茶叶提取物浓度＞甘油浓度。由此可见，小球藻保存期间，对于小球藻生物量与多糖含量这两个指标，茶叶提取物对小球藻影响最大，甘油影响最小；对于小球藻叶绿素含量与平均生长速率这两个指标，山梨酸钾浓度影响最大，甘油影响最小。

对于小球藻生物量，3个保护剂最佳使用浓度为：A3B2C1；对于小球藻多糖含量，3个保护剂最佳使用浓度为：A1B2C1；对于小球藻叶绿素含量，3个保护剂最佳使用浓度为：A2B2C1；对于小球藻生长率，3个保护剂最佳使用浓度为：A1B1C2。其中A代表甘油浓度，B代表山梨酸钾浓度，C代表茶叶提取物浓度，由于A的影响因素最小，C的影响因素最大，综合考虑小球藻使用时希望多糖含量与生物量越大越好，故优选的最佳保护剂使用浓度为：A1B2C1，即甘油浓度2％，山梨酸钾浓度0.06％，茶叶提取物浓度2％，在此条件下小球保存30d。保存前小球藻生物量为0.362±0.031g/L，多糖含量为35.61％±2.11％，叶绿素含量为20.32％±0.23％。保存后小球藻生物量为0.335±0.027g/L，多糖含量为31.21％±2.05％，叶绿素含量为19.35％±0.18％；恢复培养后小球藻平均生长速率为0.184±0.015g/d。在此保存条件下，小球藻生物量下降率仅为7.46％，多糖含量仅下降率12.36％，叶绿素含量下降率仅为4.77％。不加任何保护剂时，小球存放30d后，部分胶球已发生霉变，不能使用。

Claims

1.一种小球藻的保存方法，其特征在于，所述的保存方法为：

常温下，将小球藻浓缩液与无菌水按体积比1～3：1混合，然后添加甘油、茶叶提取物、山梨酸钾进行保存；所述甘油的质量终浓度为1％～4％、所述茶叶提取物的质量终浓度为1％～4％、所述山梨酸钾的质量终浓度为0.04％～0.08％；

所述的小球藻浓缩液由市购获得的小球藻依次经BG11固体培养基培养，BG11液体培养基培养，离心得到，所得小球藻浓缩液中小球藻的浓度为0.15～0.3g/100mL；

所述的茶叶提取物按如下方法制备得到：取干燥茶叶粉碎，过60～100目筛，得到茶粉，将所得茶粉与水按料液比1：30～50混合，在温度20～40℃、超声波功率20～40KHz条件下提取20～40min，之后离心，收集上清液，滤渣同样条件下二次提取，合并两次上清液，浓缩至固形物含量为20wt％～30wt％，然后冷冻干燥，即得所述的茶叶提取物，备用。

2.如权利要求1所述的小球藻的保存方法，其特征在于，所述甘油的质量终浓度为2％、茶叶提取物的质量终浓度为2％、山梨酸钾的质量终浓度为0.06％。

3.如权利要求1所述的小球藻的保存方法，其特征在于，所述的茶叶选取粗老茶叶。

4.如权利要求1所述的小球藻的保存方法，其特征在于，所述的小球藻浓缩液按如下方法制备得到：

5.如权利要求4所述的小球藻的保存方法，其特征在于，所述的BG11固体培养基的终浓度组成为：1.5g/LNaNO₃、0.04g/LK₂HPO₄、0.075g/LMgSO₄·7H₂O、0.036g/LCaCl₂·7H₂O、0.02g/LNa₂CO₃、0.006g/L柠檬酸、0.006g/L柠檬酸铁、1ml/L微量元素溶液、20.0g/L琼脂；初始pH值为6.5～7.5，溶剂为蒸馏水；

6.一种用于小球藻保存的复配剂，其特征在于，所述的复配剂由如下重量份的组份组成：

甘油1～4份、茶叶提取物1～4份、山梨酸钾0.04～0.08份；

所述茶叶提取物按如下方法制备得到：取干燥茶叶粉碎，过60～100目筛，得到茶粉，将所得茶粉与水按料液比1：30～50混合，在温度20～40℃、超声波功率20～40KHz条件下提取20～40min，之后离心，收集上清液，滤渣同样条件下二次提取，合并两次上清液，浓缩至固形物含量为20wt％～30wt％，然后冷冻干燥，即得所述的茶叶提取物。

7.如权利要求6所述的用于小球藻保存的复配剂，其特征在于，所述的复配剂由如下重量份的组份组成：

甘油2份、茶叶提取物2份、山梨酸钾0.06份。