CN105754943B - 一种裸鼹鼠海马神经元培养方法 - Google Patents

一种裸鼹鼠海马神经元培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及细胞生物学技术领域，特别涉及一种裸鼹鼠海马神经元的分离纯化和培养方法。本发明综合使用多种培养基从新生裸鼹鼠大脑皮层分离并纯化培养海马神经元，摸索出了适于变温的啮齿类哺乳动物裸鼹鼠海马神经元的合理培养方法。本发明方法能够简便、高效、经济的获得大量功能活性正常的裸鼹鼠海马神经元，低氧条件下的培养能够保证这种细胞在离体环境中依然能够保持在体状态下的生物学特性，从而便于直接在纯净的体外细胞培养模型中进一步研究裸鼹鼠海马神经元的特殊生理功能，从而为探索其中的生物学机制并应用于临床相关领域提供重要的理论依据。

Description

一种裸鼹鼠海马神经元培养方法
技术领域：
本发明涉及细胞生物学技术领域，具体涉及一种细胞的分离纯化及培养方法，特别涉及一种裸鼹鼠海马神经元的分离纯化和培养方法。
背景技术：
空间认知、学习记忆能力是人类和其他动物生存所必须的重要能力之一。海马是边缘***的一个重要组成部分，在机体多种功能中发挥着举足轻重的作用，特别是记忆的采集采集与整合、学习能力的获得以及空间导航等过程中(Memory systems of thebrain:a brief history and current perspective.Squire LR.Neurobiol LearnMem.2004Nov；82(3):171-7.；Place cells,grid cells,and the brain's spatialrepresentation system.Moser EI,Kropff E,Moser MB Annu Rev Neurosci.2008；31():69-89.)。研究发现，多种神经退行性疾病和神经***发育过程中出现的疾病都在一定程度上与海马的结构及功能异常有这一定程度的联系，并且海马结构和功能的异常可能最终会加剧神经***疾病的发生发展。因此，深入揭示海马神经元生理学功能及特点将有利于阐明海马的功能以及其在神经***疾病发生发展中的作用。
裸鼹鼠是一种变温哺乳动物，在氧气浓度仅有6％左右的不通风洞穴中能够保持脑结构和功能的完整无损并进行正常的生命活动。而海马作为一种以海马神经元成分为主的结构，无论在个体清醒还是在睡眠过程中都时刻保持着高度活力，参与机体空间定位和各种信息的输入以及整合，对氧及其他营养物质需求量巨大，而其本身并没有储存能量的机制，只能及时从周围环境中摄取氧及其他养分以保证其正常生命活动(Theorganization and neural substrates of human memory.Squire LR Int JNeurol.1987-1988；21-22:218-22.；Cohen N.J.,Eichenbaum H.Memory,Amnesia,and theHippocampal System.Cambridge,Mass,USA:MIT Press；1993)。对普通的生活于地面上的动物来说，数秒的缺氧或者低氧都会导致海马神经元发生不可逆的死亡从而对集体学习记忆已经空间定位能力带来巨大的威胁。而裸鼹鼠能够在氧浓度仅有6％的地下洞穴中进行正常的洞穴挖掘、觅食、以及 交配繁殖等生命活动，并且保证机体为遭受任何伤害。因此，揭示裸鼹鼠海马神经元低氧条件下存活及其特殊的低氧耐受机制，将为解决缺血缺氧或者低氧环境给人类带来的病理性伤害的防御提供一定的策略，因此需要建立离体的裸鼹鼠海马神经元模型以弥补在体观察的缺陷。
目前，研究人员已经建立出大鼠及小鼠海马神经元的培养方法(Peng Wang,LiWang,Shilei Wang,Shuhong Li,Yu Li,Lin Zhang.Effects of calcium-sensingreceptors on apoptosis in rat hippocampus during hypoxia/reoxygenationthrough the ERK1/2pathway.Int J Clin Exp Pathol.2015；8(9):10808–10815.；KonradA.Szychowski,Anna K.Wójtowicz.TBBPA causes neurotoxic and the apoptoticresponses in cultured mouse hippocampal neurons in vitro.PharmacolRep.2016Feb；68(1):20-6.)。中国专利CN201210023408.1，申请公布号为CN102533654A，公开了一种新生大鼠海马神经元原代培养的培养液及其制备方法和应用，所述的培养液是在基础培养液Neurobasalmedium中加入1、6二磷酸果糖、果糖和营养添加剂。
中国专利申请CN201410066557.5，申请公布号为CN103789267A，公开了一种改进的海马神经元原代培养方法，其培养基为DMEM/F12培养基加入胎牛血清、活性发酵滤液和双抗，所述活性发酵滤液是一种特有的青春双歧杆菌LJM-001发酵获得的；其细胞维持液为Neurobasal培养基加入B27和谷氨酰胺。
中国专利申请CN201510257025.4，申请公布号为CN104818251A，公开了成年大鼠海马神经元体外分离培养方法，所用的培养基为hibernate-A/B27。
中国专利申请CN201510420060.3，申请公布号为CN105087492A，公开了一种大鼠原代海马神经元的培养方法，所述的培养液分为第一培养液和第二培养液，第一培养液包括：78.5体积％的DMEM培养基、10体积％的胎牛血清、10体积％的马血清、1体积％的L-谷氨酰胺以及0.5体积％的青链霉素储备液；第二培养液包括：85.5体积％的DMEM培养基、10体积％的马血清、1体积％的N-2添加剂、2体积％的B-27添加剂、1体积％L-的谷氨酰胺以及0.5体积％的青链霉素和链霉素。
但是现有技术中无论小鼠还是大鼠的海马神经元分离纯化和培养方法均不适用于裸鼹鼠，目前国内外文献尚无有关裸鼹鼠海马神经元分离纯化 和培养方法的相关报道。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种裸鼹鼠海马神经元的分离纯化和培养方法，以便捷、高效的获得纯度高、状态好的裸鼹鼠海马神经元，为体外建立裸鼹鼠海马神经元提供技术支持，同时为体外研究裸鼹鼠海马神经元的活化、以及低氧耐受能力、以及裸鼹鼠海马神经元低氧耐受机制的阐述和相应治疗药物或靶分子的筛选提供强大的保障。
我们试用了目前小鼠、大鼠的海马神经元分离纯化和培养方法，结果发现均无法培养获得纯度高、状态好的裸鼹鼠海马神经元，而且裸鼹鼠海马神经元增殖的数量也较少。
关于裸鼹鼠海马神经元的培养尚没有建立出可行的实验方法，我们分析其原因，主要是：1)裸鼹鼠是一种变温动物，其体细胞离体培养的温度有待摸索，并且其不恒定的机体代谢速率导致其体细胞体外培养基区别于普通的大鼠或小鼠；2)裸鼹鼠生存在较为阴暗潮湿的环境中，其体细胞的培养对湿度有较高的要求；3)裸鼹鼠已经适应了外界低氧的环境，所以其体细胞离体培养环境中的氧气浓度区别于常氧环境中生活的动物，并且需要摸索。4)裸鼹鼠妊娠周期长达两个月以上，而大鼠及小鼠仅需3周，因此在选择胎鼠进行实验的时间需要仔细摸索。
因此，裸鼹鼠海马神经元的培养中最重要的摸索到合适的温度、湿度和氧气浓度，以及摸索到适合的妊娠周期和培养基。
为达到此目的，本发明的裸鼹鼠海马神经元的分离纯化方法包括以下步骤：
A、收集裸鼹鼠大脑海马混合神经细胞：
分离60-65天的胚胎裸鼹鼠大脑中的海马组织，将海马组织剪碎，加入组织消化液混匀之后，于35-37℃消化10-25分钟；然后用混合神经细胞培养基终止消化，离心去除上清之后，在混合神经细胞培养基中将沉淀重悬并吹打成单细胞悬液；将单细胞悬液种于无菌且预先包被有基质层的培养板中(较优的选择24孔板)；
所述的组织消化液，可以为常规的蛋白水解酶类消化液，例如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等，辅以DNA酶I以解除DNA片段粘连所致的细胞聚集。 优选的组织消化液：含有所述组织消化液为含有0.25％胰酶和0.05mg/ml DNA酶I的混合液。
所述的基质层，可以为常规的左旋多聚赖氨酸、右旋多聚赖氨酸等。优选的基质层为laminin。
B、裸鼹鼠大脑海马混合神经细胞的培养：
将步骤A得到的混合神经细胞，用混合神经细胞培养基培养于三气培养箱中培养10-15小时，待其完全贴壁之后，更换为神经元纯化培养基继续培养1-3天，然后再更换为神经元维持培养基培养1-3天，如此为一个循环，培养2-4个循环。
所述的混合神经细胞培养基可以为常规的含血清混合神经细胞培养液，例如低糖DMEM等。优选为含有体积百分数为10％胎牛血清的低糖DMEM。
所述的神经元纯化培养基为含有10μM 5-氟尿嘧啶的Nerobasal培养基并添加体积百分数为2％的N2。
所述的神经元维持培养基为含有体积分数为2％N2的Neurobasal培养基，同时添加100ng/ml NGF。
所述的三气培养箱的参数设置为：温度控制在35±2℃，氧浓度为5％，二氧化碳浓度为5±1％，湿度为96±2％。
进一步，步骤A中，分离60-65天的胚胎裸鼹鼠大脑中的海马组织的方法如下：取怀孕60-65天的雌性裸鼹鼠，将其在CO2中作窒息处理后立即将其浸泡于75％的乙醇中进行消毒，然后将其置于无菌玻璃平皿中，小心剖腹并将其含有胎鼠的子宫完整取出，剪开子宫膜并小心取出胎鼠。将胎鼠颅骨剪开，于体式显微镜下将左右大脑从正中线分成两半，然后小心剥离海马，并剥除海马表面的脑膜结构。
进一步，步骤A中，用显微剪将海马组织剪碎至1mm3，加入组织消化液混匀之后，于37℃消化15min。然后用3ml混合神经细胞培养基终止消化。
进一步，步骤B中，用混合神经细胞培养基培养12小时，待其完全贴壁之后，更换为神经元纯化培养基继续培养2天，再更换为神经元维持培养基培养2天，如此为一个循环，培养2个循环。
进一步，所述三气培养箱的参数设置为：温度控制在35℃，氧浓度为 5％，二氧化碳浓度为5％，湿度为96％。
中国专利申请201510420060.3，申请公布号为105087492A中公开了一种培养原代海马神经元的方法，其中海马神经元饲养培养基用于海马神经元的培养。但是考虑到从海马中获取的神经细胞包括海马神经元和多种胶质细胞，其中海马神经元体外无法增殖，而胶质细胞则增殖能力较强，所以我们筛选了神经元纯化培养基和神经元维持培养基的不同组合方式，并统计海马神经元的存活比例，结果如下表所示，我们发现将贴壁于混合神经细胞培养基中的细胞，先以神经元维持培养基培养2天，再以神经元纯化培养基培养2天，如此为一个循环，培养两个循环可以得到较高比例的海马神经元。神经元纯化培养基和维持培养基的基础成分均为添加体积分数为2％N2的Neurobasal，区别在前者添加有终浓度为10μM 5-氟尿嘧啶用于具有增殖能力的胶质细胞，后者添加终浓度为100ng/ml NGF用于维持神经元活力。
中国专利申请201510420060.3，申请公布号为105087492A中公开了一种培养原代海马神经元的方法，其中细胞取自新生一天的Wistar乳鼠。与大鼠相比，裸鼹鼠妊娠周期为70-80天，如何获得较高比例的海马神经元，我们也进行了摸索，如下表所示，我们发现利用上述培养基和培养方式，取自孕60天-65天裸鼹鼠胎鼠的细胞比例高于其他年龄段的胎鼠。
本发明的有益效果在于：①综合使用多种培养基从裸鼹鼠胎鼠海马分离并纯化培养海马神经元，摸索出了适于变温的啮齿类哺乳动物裸鼹鼠海马神经元的合理培养方法。我们发现5％氧浓度条件下，细胞状态能够得到较好的保持，并能够保持增长；②操作方法简单，具有较高的可重复性； ③通过使用神经元纯化培养基，有效控制了海马混合神经细胞中胶质细胞的生长，保证了海马神经元的纯度能够达到98％以上(针对神经元特异性标记物Tuj1进行的免疫细胞化学染色结果)；④额外添加的生长因子种类少，只需要在神经元维持培养基中添加NGF以保证神经元较好的功能状态和活力。
综上所述，本发明方法能够简便、高效、经济的获得大量功能活性正常的裸鼹鼠海马神经元，低氧条件下的培养能够保证这种细胞在离体环境中依然能够保持在体状态下的生物学特性，从而便于直接在纯净的体外细胞培养模型中进一步研究裸鼹鼠海马神经元的特殊生理功能，从而为探索其中的生物学机制并应用于临床相关领域提供重要的理论依据。
附图说明：
图1为体外培养的海马神经元(普通光学显微镜)；
图2为体外培养的海马神经元(免疫细胞化学鉴定)。
具体实施方式：
以下结合附图和具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例1：裸鼹鼠海马神经元分离纯化及培养
1、实验材料
孕60-65天的清洁级裸鼹鼠由中国人民解放军第二军医大学实验动物中心提供。
DNA酶I购自Solarbio生物科技有限公司，NGF、5-氟尿嘧啶、胰蛋白酶、左旋多聚赖氨酸、青链霉素混合液等购自Sigma公司，DMEM、低糖DMEM、澳洲来源胎牛血清、Neurobasal培养基、N2无血清添加因子等购自Thermo Fisher Scientific公司，24孔培养板购自Corning公司。
混合神经细胞培养基成分为低糖DMEM培养基含有体积分数为10％的胎牛血清，海马神经元纯化培养基为Neurobasal+体积分数2％N2+终浓度10μM 5-氟尿嘧啶。海马神经元维持培养基为含有体积分数为2％N2的Neurobasal培养基，同时添加终浓度为100ng/ml的NGF。
2、裸鼹鼠海马神经元分离纯化及培养方法
①收集裸鼹鼠海马混合神经细胞：将其在CO2中作窒息处理后立即将其浸泡于75％的乙醇中进行消毒，然后将其置于无菌玻璃平皿中，并用青霉素100U/ml和0.1mg/ml链霉素混合液擦拭裸鼹鼠腹部皮肤，小心剖腹并将其含有胎鼠的子宫完整取出，剪开子宫膜并小心取出胎鼠。将台数颅骨剪开，于体式显微镜下将左右大脑从正中线分成两半，然后小心剥离海马，并剥除海马表面的脑膜结构。用显微剪将海马组织剪碎至1mm3，加入组织消化液混匀之后，于37℃消化15min。然后用混合神经细胞培养基终止消化，离心去除上清之后，在神经细胞混合培养基中将沉淀重悬并吹打成单细胞悬液。随后将单细胞悬液种于无菌的且预先包被有基质层的24孔板中。
②裸鼹鼠大脑海马混合神经细胞的培养：将①中得到的细胞，用混合神经细胞培养基中培养于三气培养箱中培养12小时，待其完全贴壁之后，换为神经元纯化培养基继续培养2天，然后将培养基更换为神经元维持培养基2天，如此为一个周期，培养一周。
三气培养箱的参数设置为：温度控制在35℃，氧浓度为5％，二氧化碳浓度为5％，湿度为96％。
实施例2：裸鼹鼠海马神经元的鉴定
采用实施例1所得的裸鼹鼠海马神经元的鉴定：利用4％多聚甲醛对处于无血清培养基中的海马神经元进行固定，并结合形态学鉴定、免疫细化化学等方法进行鉴定。
1、细胞形态学鉴定：
鉴定方法参考文献中所述(Lei Xianga,Yanping Ren,Xun Li,Wen Zhao,YijunSong.MicroRNA-204suppresses epileptiform discharges through regulating TrkB-ERK1/2-CREB signaling in cultured hippocampal neurons.Brain Res.2016,pii:S0006-8993(16)30104-4.)。
结果如图1所示，光镜下，裸鼹鼠海马神经元胞体较大，具有1个或数个较短的树突，另一端具有一个细长的轴突。
2、免疫细胞化学鉴定：
鉴定方法参考文献中所述(Lei Xianga,Yanping Ren,Xun Li,Wen Zhao,YijunSong.MicroRNA-204suppresses epileptiform discharges through regulating TrkB-ERK1/2-CREB signaling in cultured hippocampal neurons.Brain Res.2016,pii:S0006-8993(16)30104-4.)。结果如图2所示，将海马神 经元进行爬片实验，在增殖培养基中培养24小时后，利用4％多聚甲醛将细胞固定，然后利用神经元表面特异抗原Tuj1的抗体进行免疫细胞化学染色。结果显示，在无血清培养基中，细胞能够保持Tuj1阳性(红色荧光)。
根据上述实验结果，本发明分离纯化的裸鼹鼠海马神经元具备典型的海马神经元形态，胞体较大，具有1个或数个较短的树突，另一端具有一个细长的轴突，免疫细胞化学染色显示其呈Tuj1阳性，并在无血清培养基中能够保持良好的增殖状态。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (7)

1.一种裸鼹鼠海马神经元培养方法，包括以下步骤：
A、收集裸鼹鼠大脑海马混合神经细胞：
分离60-65天的胚胎裸鼹鼠大脑中的海马组织，将海马组织剪碎，加入组织消化液混匀之后，于35-37℃消化10-25分钟；然后用混合神经细胞培养基终止消化，离心去除上清之后，在混合神经细胞培养基中将沉淀重悬并吹打成单细胞悬液；将单细胞悬液种于无菌且预先包被有基质层的培养板中；
B、裸鼹鼠大脑海马混合神经细胞的培养：
将步骤A得到的混合神经细胞，用混合神经细胞培养基培养于三气培养箱中培养10-15小时，待其完全贴壁之后，更换为神经元纯化培养基继续培养1-3天，然后再更换为神经元维持培养基培养1-3天，如此为一个循环，培养2-4个循环；
所述的混合神经细胞培养基为含有体积百分数为10％胎牛血清的低糖DMEM；
所述的神经元纯化培养基为含有10μM 5-氟尿嘧啶的Nerobasal培养基并添加体积百分数为2％的N2；
所述的神经元维持培养基为含有体积分数为2％N2的Neurobasal培养基，同时添加100ng/ml NGF；
所述的三气培养箱的参数设置为：温度控制在35±2℃，氧浓度为5％，二氧化碳浓度为5±1％，湿度为96±2％。
2.根据权利要求1所述的一种裸鼹鼠海马神经元培养方法，其特征在于，步骤A中，所述的组织消化液为含有0.25％质量浓度的胰酶和浓度为0.05mg/ml DNA酶I的混合液。
3.根据权利要求1所述的一种裸鼹鼠海马神经元培养方法，其特征在于，步骤A中，所述的基质层为laminin。
4.根据权利要求1所述的一种裸鼹鼠海马神经元培养方法，其特征在于，步骤A中，用显微剪将海马组织剪碎至1mm3，加入组织消化液混匀之后，于37℃消化15min。
5.根据权利要求1所述的一种裸鼹鼠海马神经元培养方法，其特征在于，步骤A中，用3ml混合神经细胞培养基终止消化。
6.根据权利要求1所述的一种裸鼹鼠海马神经元培养方法，其特征在于，步骤B中，用混合神经细胞培养基培养12小时，待其完全贴壁之后，更换为神经元纯化培养基继续培养2天，再更换为神经元维持培养基培养2天，如此为一个循环，培养2个循环。
7.根据权利要求1所述的一种裸鼹鼠海马神经元培养方法，其特征在于，所述三气培养箱的参数设置为：温度控制在35℃，氧浓度为5％，二氧化碳浓度为5％，湿度为96％。
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