CN105750311A - 一种铅镉复合污染土壤综合生物修复方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种铅镉复合污染土壤综合生物修复方法，针对铅镉复合污染的土壤，以超累积植物修复为主，辅以能够提高植物修复效果的微生物修复和动物修复，增强土壤中铅、镉的生物有效性并由此促进植物的生长和吸收，提高污染土壤修复的综合效率。本发明顺利实现了对土壤的原位生物修复，具有明显的效果，而且不对环境产生二次污染，是未来的重金属污染土壤修复领域的发展方向。

Description

一种铅镉复合污染土壤综合生物修复方法

技术领域

本发明涉及土壤污染的生物修复，尤其是一种铅镉复合污染土壤的综合生物修复技术。

背景技术

土壤是人类赖以生存和发展的最基本、最重要的自然资源之一，也是人类生态环境的重要组成部分和过滤器，然而我国的土壤污染形势严峻。随着我国工业化和城市化进程的加快，多种含重金属的污染物通过各种途径进入土壤，造成土壤重金属污染日益严重。据我国农业部进行的全国污灌区调查,在约140万hm²的污灌区中,遭受重金属污染的土地面积占污灌区总面积的64.8%,其中轻度污染的占46.7%,中度污染的占9.7%,严重污染的占8.4%（陈志良,2002）。目前，全国重金属污染的耕地面积达2000万hm²，约占耕地总面积的1/5，导致每年有1200万t粮食的重金属含量超标，而且导致粮食减产1000万t，两者直接经济损失达200多亿元(谷赵，2008)。此外，我国还有大量工矿区土地和城市土地等非耕地受重金属的污染（王志楼，2010）。

河北省土壤重金属污染形势不容乐观，铅、镉污染问题突出。据2004年河北省环境状况公报报道，全省污水灌溉面积为53277公顷，重点集中在子牙河水系的滹沱河、洨河、牛尾河、汪洋沟、滏阳河、沧浪渠、北排河等7条河流，主要涉及石家庄、邢台、邯郸、衡水、沧州5市。王元仲等2005年对河北省15县20.53万hm²小麦、玉米主产区农田的1535个土壤样品中重金属的污染现状的调查结果表明：河北省玉米主产区的8种重金属在河北省玉米主产区均存在不同程度的污染累积现象;全省总污染面积占到了监测总面积的12.0%。孟凡乔等2004年对河北省的洨河污灌区和府河污灌区的研究表明，经过20年的污灌，府河、洨河两大排污区的土壤中Cd超过我国《土壤环境质量标准》的二级标准，有明显的污染。栾文楼等2009年对石家庄市污灌区上、中、下游3条剖面中的农田表层土壤重金属元素含量、污染状况、形态等进行了调查与研究。结果发现：研究区表层土壤中的重金属（除As外）在污灌区上、中、下游均有不同程度的富集，其中Hg、Cd含量较高，下游表层土壤中重金属平均含量均高于上、中游，下游Cd平均含量为河北省土壤背景值的8.51倍，为全国土壤背景值的8.25倍。

重金属污染土壤的修复治理是当今国际的研究热点，也是我国当前急需解决的重要问题。土壤一旦被重金属污染，便具有不可逆性、隐蔽性和后果的严重性等特点，不仅可导致作物产量和质量的下降,更可以通过食物链进入人体而给人类健康带来严重危害（Nabulo,G.,2006；马智宏,2007）。污染土壤环境的重金属主要是指生物毒性显著的镉、汞、铅以及类金属砷。国际癌症研究署(IARC)把镉归类为第一类人类致癌物（李兆辉，2010）。铅主要是通过毒害人体的中枢神经，对身体造成***的、肝脾等多器官的损伤，尤其是对祖国的下一代青少年儿童危害更甚（罗雅，2012；武倩倩，2014）。因此，重金属污染土壤的修复治理是当今国内外的研究热点。尤其是我国加入WTO之后，由农产品的重金属超标问题导致的贸易壁垒将对我国农业产生更的大冲击，土壤重金属污染的治理是我国当前急需解决的重要问题。

国内外重金属修复研究领域发展进程以最初的理、化修复方法发展为生物修复，并向综合修复趋势发展。国内外专家相继开展了大量研究，其中早期以传统的化学和物理治理方法为主（Renella.G，2002），欧洲和北美的许多发达国家在20世纪80年代中期开展了生物修复技术的初步研究工作（Nabulo,G.,2006）,并完成了一些实用的处理工程。近年来生物修复(bioremediation)技术逐渐成为世界各国关注的一门新兴环境生物热点技术，广义的概念是指利用生物的生命代谢活动减少环境中有毒、有害物质的浓度或使其完全无害化，从而使污染了的环境能够部分地或完全地恢复到原始状态的过程（周启星,魏树和,2007）。狭义的生物修复，包括微生物修复和植物修复，它主要是指利用生物技术对进入土壤环境中的难降解物质如大分子有机污染物、重金属等进行治理（阎晓明,何金柱.,2002）。

综上所述，重金属污染土壤的修复是一个***工程,且在自然生态***中，重金属污染主要以复合污染存在（韩桂琪，徐卫红，2010），单一的修复技术很难达到预期效果（崔德杰,张玉龙，2004）。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的种种不足，提供一种高效、经济的铅镉复合污染土壤综合生物修复方法。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。

一种铅镉复合污染土壤综合生物修复方法，针对铅镉复合污染的土壤，以超累积植物修复为主，辅以能够提高植物修复效果的微生物修复和动物修复，增强土壤中铅、镉的生物有效性并由此促进植物的生长和吸收，提高污染土壤修复的综合效率。

作为本发明的一种优选技术方案，该方法采用植物修复加动物修复加微生物修复的联合修复方法。

作为本发明的一种优选技术方案，所述植物修复采用苏丹草，所述动物修复采用蚯蚓，所述微生物修复采用含有硫细菌、硝化菌、氨化细菌和固氮菌的复合菌剂；所述植物、动物、微生物、联合修复的操作步骤为：在苏丹草播种前，保持土壤湿度50%-70%将复合菌剂浅翻3-5cm混匀施入土壤；然后待苏丹草苗出齐后，温度在18-25℃且土壤湿度在50%-70%时投放蚯蚓。

作为本发明的一种优选技术方案，首先测定土壤的污染程度，并将土壤污染程度划定为轻度污染、中度污染或重度污染；如果土壤属于轻度污染，则采用植物修复方式或者采用植物修复加动物修复加微生物修复的联合修复方式；如果土壤属于中度污染，则采用植物修复方式或者采用植物修复加动物修复加微生物修复的联合修复方式；如果土壤属于重度污染，则采用植物修复加动物修复加微生物修复的联合修复方式。

作为本发明的一种优选技术方案，所述土壤污染程度的划定方法如下：对土壤中的铅含量进行测定，如果铅含量不超过300mg/kg，则划定为轻度污染，如果铅含量大于300mg/kg且不超过600mg/kg，则划定为中度污染，如果铅含量大于600mg/kg，则划定为重度污染。

作为本发明的一种优选技术方案，对土壤中的镉含量进行测定，如果镉含量不超过1.5mg/kg，则划定为轻度污染；如果镉含量大于1.5mg/kg且不超过6mg/kg，则划定为中度污染；如果镉含量大于6mg/kg，则划定为重度污染。

作为本发明的一种优选技术方案，所述植物修复采用苏丹草，所述动物修复采用蚯蚓，所述微生物修复采用含有硫细菌、硝化菌、氨化细菌和固氮菌的复合菌剂；所述植物、动物、微生物、联合修复的操作步骤为：在苏丹草播种前，保持土壤湿度50%-70%将复合菌剂浅翻3-5cm混匀施入土壤；然后待苏丹草苗出齐后，温度在18-25℃且土壤湿度在50%-70%时投放蚯蚓。

作为本发明的一种优选技术方案，所述植物修复采用普通超累积植物品种或者采用转基因苏丹草品种。

作为本发明的一种优选技术方案，所述转基因苏丹草品种的制备步骤包括：

A、受体的制备：选取饱满整齐的苏丹草种子，用自来水冲洗干净，1%的NaCLO消毒10min,将种子摆放在经过高压灭菌且带有两层滤纸的直径90mm培养皿中，加7ml无菌水，在25℃条件下暗培养2-3d；当茎上的幼芽长度达到0.5cm时，用手术刀片削去胚芽鞘和部分叶片暴露出生长点后放入铺有干燥滤纸的平皿中，室温放置5min用灭过菌的滤纸条吸走茎尖溢出的水分后，室温再放置20min；

B、受体的侵染与共培养：将Takara公司合成的TCMT3基因DNA片段通过了中间载体pAHC25在TCMT3基因两端加上ubi-1启动子和nos终止子，然后再构建于含有T序列的质粒Pcambia0390中，最终转化到农杆菌菌株EHA105中；、设计检验外源基因TCMT3的特异引物对转化体进行检测，最后利用“微创伤芽生长点农杆菌转化技术”向苏丹草芽生长点导入外源基因TCMT3；用无菌Tip头挑取单菌落的农杆菌，接入含有抗生素的液体LB培养基中，于28℃、220rpm条件下培养至菌液浓度为OD600=0.6，4,000rpm、5min离心收集菌体，重新悬浮于原菌液体积的3倍侵染液中，此侵染液含100μmol/LAS、100mg/LF68，1/10MS盐，1%葡萄糖，4%麦芽糖，PH=5.6；用转基因刷蘸取侵染液对准生长点刺刷两到三次后，摆放在直径90mm的无菌培养皿中，此无菌培养皿加有灭菌滤纸2层、无菌水0.5ml，置于24-25℃条件下暗培养2-3d；

C、转化苗的培养与管理：共培养结束后，将受体转入装有蛭石土的培养钵内，于20℃、16h/d的光照培养箱中培养7d后移栽温室，成熟后单株收获，只收获主穗；

D、转化后代的筛选：将收获的材料每个主穗分别随机选取30粒种入培养钵中，放入温室；当幼苗长至一叶一心时，用20mg/LPPT涂抹叶片，7d后，拔除非抗性苗，将抗性苗移栽入花盆中，进一步对外源基因进行分子检测以确定转基因苗。

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：

目前发现的超积累植物大多只提取某种金属，而土壤的重金属污染往往是几种重金属的复合污染，并且前人研究发现的自然界中的绝大多数超积累植物生物量低、生长缓慢、植株矮小，限制了其对污染土壤重金属的移除效率，也不利于大面积的机械化操作。本发明以提高植物修复的综合效率为目的，经我们的研究发现，TcMT3为遏蓝菜属植物超累积重金属的主基因，通过转基因技术，导入超累积重金属特性基因（TcMT3）到本身具备一定重金属富集能力、生物量大、生长速度快的苏丹草体中，培育出超累积型转基因植物，并在此基础上，提出以植物修复为主，辅以动物、微生物及农业生态措施等手段，增强土壤中铅、镉的生物有效性，促进植物的生长和吸收，从而提高超累积植物的综合修复效率的有效措施；这是区别于以往单一修复方式的创新性技术。

本发明为结合植物、动物、微生物及农业生态措施于一体的生物综合修复技术，顺利实现了对土壤的原位生物修复，具有明显的效果，而且不对环境产生二次污染，是未来的重金属污染土壤修复领域的发展方向。本发明在修复效果上优于单一修复手段的综合修复技术：如：贾婵（西北农林科技大学；农业环境科学学报，2014年6期）苏丹草可以从镉-芘复合污染土壤中吸收镉,土壤中镉的植物去除率介于4.23%-17.88%之间,而本专利的修复效果从轻度到重度污染，镉的去除率都大于60%。本发明在环境友好方面优于物理化学等易带来二次污染的修复技术；对比添加羟基磷灰石、氯化钾、EDTA等表面修复剂和螯合剂等物理化学修复方法（王利，2015；董姗燕，2002），本发不会因为人为添加化学制品而带来土壤的二次污染，运用以植物提取为主，蚯蚓、微生物等本身对土壤有益的生物所分泌的物质以促进、提升植物修复效果为辅，为环境友好型修复途径。

另外，本发明的分级和差异化处理技术，兼具高效和经济的双重优点，是本领域的开拓性创造。本发明的具体效果参数详见下文的试验例和实施例。

附图说明

图1是本发明研究试验的现场照片。

图2是实施例2轻度铅镉复合污染土壤生物修复的柱状效果图和苏丹草对Pb、Cd的吸收总量柱状图。

图3是实施例3中度铅镉复合污染土壤生物修复的柱状效果图和苏丹草对Pb、Cd的吸收总量柱状图。

图4是实施例4重度铅镉复合污染土壤生物修复的柱状效果图和苏丹草对Pb、Cd的吸收总量柱状图。

具体实施方式

以下实施例详细说明了本发明。本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。其中，苏丹草采用夏季生长品种，优选采用本发明的转基因品种“遏蓝-苏丹”。微生物采用复合菌剂组成：由硫细菌、硝化菌、氨化细菌、固氮菌等多种微生物菌群组成，采购自高标生物工程有限公司，产品型号：Unigrow微生物菌剂，施用密度：固体菌剂30~50kg/hm²或2~3.5kg/亩，使用方法：在播种以前，保持土壤湿度60%左右，浅翻3-5cm混匀。蚯蚓为常规市售品种，投放密度：6.7×10⁵条/亩幼虫（每立方米约投种1000条）,投放时间为出苗后2-3天，温度控制：18-25℃，土壤湿度控制：60%左右。腐植酸（与土壤的质量比为10%）：石家庄腐殖酸厂生产。

实施例1.铅镉复合污染土壤的生物修复试验设计

供试土壤的基础条件如下表所示：

表1供试土壤基本理化性质和重金属含量

土壤设计4个投加水平，分别为：CK、C1（铅200mg/kg、镉1mg/kg）、C2（铅400mg/kg、镉5mg/kg）C3（铅800mg/kg、镉10mg/kg）。把相应量的Pb（NO₃）₂、Cd（NO₃）₂配成不同浓度的溶液，与过2mm筛土壤反复混合均匀，每盆装土8kg，并施入底肥（每个处理施入量相同，N、P合30kg/ha，K合15kg/ha），种植的植物品种为：南非杂交苏丹草种子苏丹草（拉丁名(Sorghum×Sudan,Sorghumbicolor×S.sudanense)）。

试验共设96盆，四个重金属投加水平，三次重复，八个处理，分别为：

处理1（T1）：植物（相当于CK）；

处理2（T2）：植物+微生物；

处理3（T3）：植物+动物；

处理4（T4）：植物+腐植酸；

处理5（T5）：植物+微生物+动物；

处理6（T6）：植物+微生物+腐植酸；

处理7（T7）：植物+动物+腐植酸；

处理8（T8）：植物+微生物+动物+腐植酸。

种植夏季生长的苏丹草品种。播种后，生长10-15天，待苗出齐后，投放蚯蚓，植物生长期为95天，收获其地上部，同时洗出根系，在70度下烘干，称取地上部和根的干重。植株样品用HNO₃-HCLO₄消化然后用石墨炉-原子吸收光谱法测定镉含量；土壤全Pb、Cd用HCl-HNO₃-HClO₄-HF消解，然后高含量的用火焰-原子吸收光谱法、低含量的用石墨炉-原子吸收光谱法测定土壤中铅、镉含量，比较其修复差异。

实施例2.轻度铅镉复合污染土壤的生物修复试验

试验结果见附图2。由图2可以看出，经过95天的修复过程，土壤轻度污染处理中总Pb、Cd的含量下降较为显著（Alpha=0.05时）的是C1T1、C1T2、C1T3、C1T4、C1T5，该5种处理下Pb去除率分别为34.21%、31.02%、27.89%、32.12%、30.78%，Cd去除率分别为92.06%、92.46%、91.83%、91.90%、92.54%，该5种处理下修复后土壤中Pb、Cd含量差异不显著（Alpha=0.05时）。结合图2苏丹草对Pb、Cd吸收总量可见，C1T5处理下苏丹草对Pb吸收总量为1.14mg，显著高于其他7种处理（Alpha=0.05时），且对土壤中Pb去除量的贡献率为0.15%；苏丹草对Cd吸收总量在C1T1、C1T2、C1T3、C1T4、C1T5处理下显著高于其他处理，并在C1T5处理下Cd吸收总量达0.21mg，为各处理中的最大值，占土壤中Cd去除总量的0.22%。由上可见，C1T1处理经济有效，C1T5处理（即：植物+微生物+动物）为重金属轻度污染土壤的最佳修复组合。

实施例3.中度铅镉复合污染土壤的生物修复试验

试验结果见附图3。由图3可以看出，经过95天的修复过程，土壤中Pb修复效果在C2T4、C2T5处理下存在显著差异（Alpha=0.05时），修复后其余处理间土壤Pb含量无显著差异；且各处理下土壤中Cd含量差异不显著（Alpha=0.05时）。然而，修复后土壤中Pb、Cd均在C2T5处理下含量最低，去除率分别为26.28%、77.89%。由图3可见，不同处理间苏丹草对Pb、Cd的吸收总量无显著差异（Alpha=0.05时），其中C2T5处理下Pb、Cd吸收总量最大，分别为0.70mg、0.49mg，占土壤中Pb、Cd去除总量的0.07%、0.48%。因此，C2T1处理经济有效，C2T5处理（即：植物+微生物+动物）为重金属中度污染土壤的最佳修复组合。

实施例4.重度铅镉复合污染土壤的生物修复试验

试验结果见附图4。由图4可见，经过95天的修复过程，土壤重度污染下各处理间土壤中Pb含量最低的是C3T5处理，且显著低于其他处理，修复效果最佳，去除率为39.18%；重度污染土壤中Cd含量最低的是C3T1处理和C1T5处理，去除率分别为65.97%和64.51%，且两处理间无显著差异（Alpha=0.05时）。由图4可见，苏丹草对Pb、Cd吸收总量在不同处理间差异显著（Alpha=0.05时），最大吸收量与最小吸收量相差67%，其中C3T1处理下苏丹草对Pb吸收量显著高于其他处理；而苏丹草对Cd的吸收总量C3T1处理明显高于其他处理，为1.01mg，最大吸收量与最小吸收量相差66%。可见，C3T5处理能较好的降低重度污染土壤中Pb、Cd浓度，同时提高苏丹草对Pb、Cd的吸收效果。

上述描述仅作为本发明可实施的技术方案提出，不作为对其技术方案本身的单一限制条件。

Claims (9)

1.一种铅镉复合污染土壤综合生物修复方法，其特征在于：针对铅镉复合污染的土壤，以超累积植物修复为主，辅以能够提高植物修复效果的微生物修复和动物修复，增强土壤中铅、镉的生物有效性并由此促进植物的生长和吸收，提高污染土壤修复的综合效率。

2.根据权利要求１所述的铅镉复合污染土壤综合生物修复方法，其特征在于：该方法采用植物修复加动物修复加微生物修复的联合修复方法。

3.根据权利要求2所述的铅镉复合污染土壤综合生物修复方法，其特征在于：所述植物修复采用苏丹草，所述动物修复采用蚯蚓，所述微生物修复采用含有硫细菌、硝化菌、氨化细菌和固氮菌的复合菌剂；所述植物、动物、微生物、联合修复的操作步骤为：在苏丹草播种前，保持土壤湿度50%-70%将复合菌剂浅翻3-5cm混匀施入土壤；然后待苏丹草苗出齐后，温度在18-25℃且土壤湿度在50%-70%时投放蚯蚓。

4.根据权利要求1所述的铅镉复合污染土壤综合生物修复方法，其特征在于：首先测定土壤的污染程度，并将土壤污染程度划定为轻度污染、中度污染或重度污染；如果土壤属于轻度污染，则采用植物修复方式或者采用植物修复加动物修复加微生物修复的联合修复方式；如果土壤属于中度污染，则采用植物修复方式或者采用植物修复加动物修复加微生物修复的联合修复方式；如果土壤属于重度污染，则采用植物修复加动物修复加微生物修复的联合修复方式。

5.根据权利要求4所述的铅镉复合污染土壤综合生物修复方法，其特征在于：所述土壤污染程度的划定方法如下：对土壤中的铅含量进行测定，如果铅含量不超过300mg/kg，则划定为轻度污染，如果铅含量大于300mg/kg且不超过600mg/kg，则划定为中度污染，如果铅含量大于600mg/kg，则划定为重度污染。

6.根据权利要求4所述的铅镉复合污染土壤综合生物修复方法，其特征在于：对土壤中的镉含量进行测定，如果镉含量不超过1.5mg/kg，则划定为轻度污染；如果镉含量大于1.5mg/kg且不超过6mg/kg，则划定为中度污染；如果镉含量大于6mg/kg，则划定为重度污染。

7.根据权利要求5所述的铅镉复合污染土壤综合生物修复方法，其特征在于：所述植物修复采用苏丹草，所述动物修复采用蚯蚓，所述微生物修复采用含有硫细菌、硝化菌、氨化细菌和固氮菌的复合菌剂；所述植物、动物、微生物、联合修复的操作步骤为：在苏丹草播种前，保持土壤湿度50%-70%将复合菌剂浅翻3-5cm混匀施入土壤；然后待苏丹草苗出齐后，温度在18-25℃且土壤湿度在50%-70%时投放蚯蚓。

8.根据权利要求1-7任一项所述的铅镉复合污染土壤综合生物修复方法，其特征在于：所述植物修复采用普通超累积植物品种或者采用转基因苏丹草品种。

9.根据权利要求8所述的铅镉复合污染土壤综合生物修复方法，其特征在于：所述转基因苏丹草品种的制备步骤包括：

A、受体的制备：选取饱满整齐的苏丹草种子，用自来水冲洗干净，1%的NaCLO消毒10min,将种子摆放在经过高压灭菌且带有两层滤纸的直径90mm培养皿中，加7ml无菌水，在25℃条件下暗培养2-3d；当茎上的幼芽长度达到0.5cm时，用手术刀片削去胚芽鞘和部分叶片暴露出生长点后放入铺有干燥滤纸的平皿中，室温放置5min用灭过菌的滤纸条吸走茎尖溢出的水分后，室温再放置20min；

B、受体的侵染与共培养：将Takara公司合成的TCMT3基因DNA片段通过了中间载体pAHC25在TCMT3基因两端加上ubi-1启动子和nos终止子，然后再构建于含有T序列的质粒Pcambia0390中，最终转化到农杆菌菌株EHA105中；、设计检验外源基因TCMT3的特异引物对转化体进行检测，最后利用“微创伤芽生长点农杆菌转化技术”向苏丹草芽生长点导入外源基因TCMT3；用无菌Tip头挑取单菌落的农杆菌，接入含有抗生素的液体LB培养基中，于28℃、220rpm条件下培养至菌液浓度为OD600=0.6，4,000rpm、5min离心收集菌体，重新悬浮于原菌液体积的3倍侵染液中，此侵染液含100μmol/LAS、100mg/LF68，1/10MS盐，1%葡萄糖，4%麦芽糖，PH=5.6；用转基因刷蘸取侵染液对准生长点刺刷两到三次后，摆放在直径90mm的无菌培养皿中，此无菌培养皿加有灭菌滤纸2层、无菌水0.5ml，置于24-25℃条件下暗培养2-3d；

C、转化苗的培养与管理：共培养结束后，将受体转入装有蛭石土的培养钵内，于20℃、16h/d的光照培养箱中培养7d后移栽温室，成熟后单株收获，只收获主穗；

D、转化后代的筛选：将收获的材料每个主穗分别随机选取30粒种入培养钵中，放入温室；当幼苗长至一叶一心时，用20mg/LPPT涂抹叶片，7d后，拔除非抗性苗，将抗性苗移栽入花盆中，进一步对外源基因进行分子检测以确定转基因苗。