CN105734056A - 水稻抽穗期主效qtl的分子标记及其应用 - Google Patents

水稻抽穗期主效qtl的分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了水稻抽穗期主效QTL的分子标记及其应用。所述分子标记是H70和301K，其中，H70引物对由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所述序列组成；301K引物对由SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示序列组成；这两个分子标记与抽穗期QTL紧密连锁，可用于鉴定和选育水稻抽穗期品种。本发明还公开了利用上述分子标记鉴定、选育水稻抽穗期的方法。本发明首次精细定位了位于第5染色体短臂上的控制抽穗期的主效QTL，并获得了紧密连锁的InDel标记H70和301K。只需检测这些标记的扩增条带特性，可以判断鉴定抽穗期主效QTL的变异存在与否，来预测水稻的抽穗期表型，用于指导水稻抽穗期改良的育种工作。

Description

水稻抽穗期主效QTL的分子标记及其应用
技术领域
本发明属于分子遗传育种领域，具体地，涉及水稻抽穗期主效QTL的分子标记及其应用。
背景技术
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全球有110多个国家和地区种植水稻，我国有近一半以上的人口以稻米为主食，水稻生产为保障我国粮食安全发挥了重要作用。但是，随着现代农业生产以及社会的发展，集约化、现代化的栽培技术对水稻的栽培特性特别是区域适应性提出了更高的要求，传统水稻品种已不能满足生产需要，培育高产、稳产、优质、广适性的新品种已成为水稻育种者共同追求的目标。抽穗期是水稻重要农艺性状之一，抽穗期长短(从萌发到始穗)直接反映了水稻品种生育期长短。水稻抽穗期长短不仅直接决定水稻品种的地域适应性和季节适应性，而且对水稻品种的高产、稳产起重要作用。在经历了长期的自然和人为选择后，水稻形成了丰富多样的光温反应类型，不同的光、温等环境因子及耕作习惯使得不同稻作区对水稻光温反应类型有特殊要求，适宜的生育期在维持水稻高产稳产中扮演着关键角色。因此，发掘利用新的抽穗期基因一直是研究的热点。
根据Gramene网站(http://www.gramene.org/qtl/)公布的数据，目前和水稻抽穗期相关的QTL有711个，分布于水稻各条染色体上。然而，在这些研究中，大多数QTLs仅初步定位，它们的高精密图谱仍然未知，限制了对其进行进一步图位克隆。现在主要利用染色体片段置换系(chromosomesegmentsubstitutionlines,CSSLs)和近等基因系(nearlyisogeniclines,NILs)进行QTL检测和分离。通过使用NIL的策略，至少13个抽穗期QTLs(Hd1,Hd2,Hd3a,Hd3b,Hd6,Hd8,Hd9,Ehd1、DTH8、Ghd7、DTH2、DTH12、Hd17)已经被精细定位，其中10个QTLs(Hd1,Hd3a,Hd6,Ehd1、DTH8、Hd17、Hd16、DTH2、Ghd7、DTH7)被成功克隆。但被克隆的抽穗期数目太少，极大地限制了水稻抽穗期在生产实践中的应用，因此，急需加强水稻抽穗期数量性状位点的分离工作。
水稻抽穗期是重要的农艺性状，与产量性状直接相关，因此发掘新的水稻抽穗期QTL位点并进行精细定位克隆研究，可为进一步阐明水稻抽穗期遗传机制及调控网络及高产、早熟、广适性水稻育种提供理论和实践支持。
占小登等以籼稻BG1为供体亲本、粳稻XLJ为受体亲本杂交构建了含269个家系的重组自交系用于QTL检测，并在第5染色体检测到主效抽穗期QTL，命名为qHD5。经过回交和分子辅助选择构建了BC4F2分离群体，将其初步定位在309kb范围内(占小登等，2015年发表于GENE)。对其进行精细定位研究、找到与抽穗期主效基因位点紧密连锁的分子标记，将大大提高水稻抽穗期鉴定选育效率、加快育种进展。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种可以提高水稻抽穗期鉴定选育效率、加快育种进展的水稻抽穗期主效QTL的分子标记。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
本发明在qHD5初步定位的基础上，进一步扩大定位群体，采用对BC4F2群体中杂合单株进行自交的方法，得到了BC4F3群体用于精细定位qHD5；并将其定位在了80kb的区域内，找到了两个与其紧密连锁的分子标记H70和301K。此区间没有过抽穗期基因的任何报道，我们暂时命名该主效抽穗期QTL为DTH5。其中，H70引物对由SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所述序列组成；301K引物对由SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示序列组成。
本发明还提供了利用上述分子标记鉴定、选育水稻抽穗期的方法，包括如下步骤：
(1)PCR扩增体系的建立：采用H70、301K引物对中的任一对或两对，以待测水稻单株全基因组DNA为模板，进行PCR扩增；
(2)扩增DNA片段检测分析：如果H70引物对能扩增出171bp片段，则该单株基因型为DTH5，其表型是晚抽穗的；如果能扩增出165bp片段，则该单株基因型为dth5，其表型是早抽穗的；如果能扩增出杂合带型，则该单株基因型为DTH5dth5,抽穗期介于两者之间；如果301K引物对能扩增出178bp片段，则该单株基因型为DTH5，其表型是晚抽穗的；如果能扩增出169bp片段，则该单株基因型为dth5，其表型是早抽穗的；如果能扩增出杂合带型，则该单株基因型为DTH5dth5，抽穗期介于两者之间。
本发明还提供了上述水稻抽穗期主效QTL的分子标记在水稻抽穗期鉴定、选育中的应用。
本发明首次精细定位了位于水稻第5染色体短臂上的控制抽穗期主效QTL(DTH5)新位点，并获得了紧密连锁的InDel标记H70和301K。只需要检测这些标记的扩增条带特性，可以判断抽穗期主效位点的增效变异是否存在，来预测水稻的抽穗期表型，用于指导水稻抽穗期改良的育种工作。分子标记不仅在苗期就能区别水稻品种的基因型，而且能够方便、快捷、直接地实现目标基因在水稻种质资源以及育种后代中的鉴定，极大的降低了劳动成本、节约时间且不受环境及人为因素的影响。
附图说明
上述仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，以下结合附图与具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
图1是含DTH5和dth5的水稻表型对比图；
图2为抽穗期分布图；
图3为水稻抽穗期QTL位点的定位分析过程，其中DTH5定位于H70和301K之间的80kb的区域；
图4为分子标记301K对分离群体BC4F3代群体单株扩增的部分效果。
具体实施方式
下述实施例中涉及的分离群体、下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1与抽穗期主效基因紧密连锁的分子标记的获得
(一)定位群体与试验方法
1、定位群体
占小登等将qHD5初步定位在分子标记RM17788和RM5374之间。在此基础上，本发明进一步扩大定位群体，采用对BC4F2群体中杂合单株进行自交的方法，得到了BC4F3高世代分离群体。
本发明利用BC4F3分离群体首先对qHD5进行遗传分析，如图2所示，早抽穗与晚抽穗分离比符合1:3(χ2＝1.0159,P＝0.3135>0.05)的分离比，说明该基因受到单孟德尔因子控制，且晚抽穗对早抽穗为显性。图1所示是含DTH5和dth5的水稻表型对比图。
本发明利用BC4F3高世代分离群体中的2000多极端隐性单株将位于第5染色体的抽穗期主效QTL精细定位。
2、试验方法(DNA提取与PCR扩增)
单株取幼嫩叶片，用CTAB法提取个体DNA。PCR反应：1μLDNA(100ng),1μL引物(10mmol,0.5μL前引物和0.5μL后引物),1μL10×Taqbuffer(20mMMg2+),0.2μLdNTPs(10mM),0.2μLTaqpolymerase(2U/μL)和6.6μLddH2O.PCR反应程序为：95℃预变性4分钟(95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共32个循环)，最后72℃延伸10分钟。在PCR仪上进行PCR扩增，扩增产物在8％聚丙烯酰氨凝胶上进行电泳分离。
(二)分子标记开发(在初步定位的目标区域设计新的InDel标记)
根据Gramene(http://www.gramene.org)中公布的粳稻日本晴和籼稻93-11的全基因组序列，使用BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)比对日本晴和93-11的基因组序列，寻找***/缺失位点(InDel)，利用PrimerPremiers5.0软件设计InDel分子标记(引物由上海英潍捷基贸易有限公司合成)，并进行多态性筛选，PCR反应体系和反应程序同上述的PCR扩增体系，获得7对多态性标记，用于基因的精细定位。
(三)定位结果
定位结果如图3所示，最后将基因定位在H70和301K之间，H70和301K均有1个交换单株。H70和301K引物序列见表1。根据RAP-DBPrimer-Blast的结果，H70和301K之间在粳稻品种日本晴上物理距离为80kb,与qHD5之间的遗传距离很近，可用于分子标记辅助选择育种。以分子标记301K对分离群体BC4F3代群体部分单株进行扩增，扩增效果如图4所示。
表1
(四)结果与分析
以分子标记H70和301K筛选了20个杂合单株，种成家系后，每个株系均出现了抽穗期分离，其筛选准确度达到100％。
实施例2(利用紧密连锁的分子标记H70和301K鉴定、选育水稻合适抽穗期品种的方法)
具体步骤如下：
(1)DNA的提取：取水稻幼嫩叶片，CTAB法提取基因组DNA；
(2)标准PCR扩增体系的建立：以H70和301K中的任意一对或两对标记引物，对待测水稻单株全基因组DNA为模板，进行PCR扩增；
(3)扩增DNA片段检测分析：PCR产物经过8％的聚丙烯酰氨凝胶电泳检测，如果标记H70能扩增出171bp片段，说明该单株基因型为DTH5，其表型是晚抽穗的；如果能扩增出165bp片段，说明该单株基因型为dth5，其表型是早抽穗的；如果能扩增出杂合带型，说明该单株基因型为DTH5dth5；抽穗期介于之间。用301K扩增出178bp片段，说明该单株基因型为DTH5，其表型是晚抽穗的如果能扩增出169bp片段，说明该单株基因型为dth5，其表型是早抽穗的；如果能扩增出杂合带型，说明该单株基因型为DTH5dth5，抽穗期介于之间。
上述分子标记及方法，主要于水稻品种抽穗期的分子标记辅助改良、分子标记辅助的育种和种质资源的利用。通过检测与抽穗期主效基因位点连锁的分子标记，可以确定有无控制抽穗期的主效基因位点导入到育种品系中，提高了水稻抽穗期适应性改良的目的性与有效性，提高了该品种的选择效率、加快了育种进度。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，本领域技术人员利用上述揭示的技术内容做出些许简单修改、等同变化或修饰，均落在本发明的保护范围内。
。

Claims (3)

1.水稻抽穗期主效QTL的分子标记，其特征在于，采用H70引物对或301K引物对；
所述H70引物对由SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所述序列组成；所述301K引物对由SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示序列组成。
2.利用权利要求1所述分子标记鉴定、选育水稻抽穗期的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)PCR扩增体系的建立：
采用H70、301K引物对中的任一对或两对，以待测水稻单株全基因组DNA为模板，进行PCR扩增；
(2)扩增DNA片段检测分析：
如果H70引物对能扩增出171bp片段，则该单株基因型为DTH5，其表型是晚抽穗的；如果能扩增出165bp片段，则该单株基因型为dth5，其表型是早抽穗的；如果能扩增出杂合带型，则该单株基因型为DTH5dth5,抽穗期介于两者之间；
如果301K引物对能扩增出178bp片段，则该单株基因型为DTH5，其表型是晚抽穗的；如果能扩增出169bp片段，则该单株基因型为dth5，其表型是早抽穗的；如果能扩增出杂合带型，则该单株基因型为DTH5dth5，抽穗期介于两者之间。
3.权利要求1所述的水稻抽穗期主效QTL的分子标记在水稻抽穗期鉴定、选育中的应用。
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