CN105722983A

CN105722983A - 植物调控元件及其使用方法

Info

Publication number: CN105722983A
Application number: CN201480061267.XA
Authority: CN
Inventors: S.迪伊恩; A.L.卢; C.西蒙斯
Original assignee: Pioneer Hi Bred International Inc; EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: Pioneer Hi Bred International Inc; EIDP Inc
Priority date: 2013-09-11
Filing date: 2014-09-10
Publication date: 2016-06-29
Also published as: EA201690560A1; WO2015038622A1; BR112016005541A2; US20160201073A1; CA2923629A1

Abstract

本公开提供了用于调控异源核苷酸序列在植物中的表达的组合物和方法。所述组合物包含来自碧冬茄脉明病毒的调控元件的新型核苷酸序列。本公开还提供了使用本文公开的调控元件序列在植物中表达异源核苷酸序列的方法。所述方法包括用可操作地连接至本公开调控元件之一的核苷酸序列转化植物或植物细胞。

Description

植物调控元件及其使用方法

以电子方式递交的序列表的引用

创建于2013年8月26日、大小为4千字节的文件名为“4195USPSP_sequence_listing.txt”的序列表以计算机可读形式与本说明书同时提交。该序列表是本说明书的一部分，并且全文以引用的方式并入本文。

技术领域

本公开涉及植物分子生物学领域，更具体地，涉及植物中基因表达的调控。

背景技术

异源DNA序列在植物宿主中的表达取决于该植物宿主中存在有功能的可操作地连接的调控元件。选择的调控元件序列将决定异源DNA序列在生物体内表达的时间和位置。如果期望在特定的组织或器官中表达，则可使用组织偏好的调控元件。如果期望基因响应刺激而表达，则诱导型调控元件是首选调控元件。相比之下，如果期望在植物细胞中各处连续表达，则采用组成型启动子。可以在转化载体的表达构建体中包含位于核心调控元件序列上游和/或下游的附加调控序列，以便引起异源核苷酸序列在转基因植物中以不同水平表达。

本领域时常期望在植物中以组成型方式表达DNA序列。例如，可通过遗传操纵植物基因组，使其包含可操作地连接至异源病原体抗性基因的组成型调控元件，使得所需的植物组织中产生病原体抗性蛋白，从而使植物对土源和空气源病原体感染的抗性增强。

另选地，可能需要抑制植物组织内天然DNA序列的表达以实现所需的表型。在这种情况下，可采用下述方式实现这种抑制：转化植物，使其包含可操作地连接至反义核苷酸序列的组成型启动子，使得反义序列表达，产生干扰天然DNA序列的mRNA翻译的RNA转录物。

通过使用基因工程技术遗传地改变植物并且因此产生具有有用性状的植物，这要求可获得多种启动子。在掌握大量启动子的基础上，研究人员可设计出能在细胞中期望的位置以所需水平表达的重组DNA分子。因此，组成型启动子集合在一起，便可使新性状以所需水平在期望的组织中表达。

要实现这一点，需分离组成型调控元件并加以表征，用于对植物进行遗传操纵，其中这些组成型调控元件可充当以实测组成型方式表达感兴趣的异源核苷酸序列的调控区。

发明内容

本公开提供了用于调控感兴趣的异源核苷酸序列在植物或植物细胞中表达的组合物和方法。还提供了包含引发转录的调控元件的新型核苷酸序列的DNA分子。在一些实施方案中，这种调控元件具有在植物细胞中引发转录的启动子活性。本公开的实施方案包括下列序列：以SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3示出的核酸序列或它们的互补序列；包含SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3中至少20个连续核苷酸的核苷酸序列，其中所述序列在植物细胞中引发转录；以及与以SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3示出的序列具有至少85％序列同一性的核苷酸序列，其中所述序列在植物细胞中引发转录。

本公开提供了一种用于在植物或植物细胞中表达异源核苷酸序列的方法。该方法包括将表达盒引入植物或植物细胞，该表达盒包含可操作地连接至本公开的调控元件之一的感兴趣的异源核苷酸序列。以此方式，调控元件序列可用于控制可操作地连接的异源核苷酸序列的表达。在具体方法中，感兴趣的异源核苷酸序列以组成型方式表达。

本公开还提供了一种在植物中以组成型方式表达感兴趣的核苷酸序列的方法。该方法包括将表达盒引入植物细胞，该表达盒包含本公开的可操作地连接至感兴趣的异源核苷酸序列的调控元件。

感兴趣的核苷酸序列的表达可以提供对植物表型的修饰。这种修饰包括调节内源产物的生成(数量、相对分布等方面)或者外源表达产物的生成，以在植物中提供新功能或者产物。在特定的方法和组合物中，感兴趣的异源核苷酸序列包含的基因产物赋予除草剂抗性、病原体抗性、昆虫抗性，和/或对盐、寒冷或干旱改变的耐受性。

本公开还提供了表达盒，所述表达盒包含本公开的可操作地连接至感兴趣的异源核苷酸序列的启动子序列。还另外提供了转化的植物细胞、植物组织、种子和植物。

附图说明

图1示出了碧冬茄脉明病毒基因组中长基因间区域(LIR)相对ORF1的结构。只含369个碱基对的调控区(TR)是含1049个碱基对的调控区(FL)的截短版。复制该截短调控元件中含280个碱基对的一部分(以水平框示出)，产生包含重复区段的序列(含649个碱基对)。推定的TATA框以竖直框示出。

图2示出了含369个碱基对的截短调控元件的核酸序列(SEQIDNO：1)。该调控元件中含280个碱基的那部分带下划线。推定的TATA框加阴影。

图3示出了含1049个碱基对的调控元件的核酸序列(SEQIDNO：2)。该调控元件中含280个碱基的那部分带下划线。推定的TATA框加阴影。

图4示出了含649个碱基对的重复调控元件的核酸序列(SEQIDNO：3)。该调控元件中第一个含280个碱基的部分带下划线。该调控元件中重复的第二个含280个碱基的部分以斜体示出。推定的TATA框加阴影。

具体实施方式

本公开涉及针对植物启动子的组合物和方法以及它们的应用方法。本公开的组合物包含碧冬茄脉明病毒(PVCV)调控区的核苷酸序列。本公开的组合物还包含DNA构建体，这些DNA构建体包含的PVCV调控区的核苷酸序列可操作地连接至感兴趣的异源核苷酸序列。具体地，本公开提供了分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含以SEQIDNO：1示出的核苷酸序列及其片段、变体和互补序列。

本公开的PVCV调控元件序列包括可以在植物中引发转录的核苷酸构建体。在特定实施方案中，PVCV调控元件序列允许以组成型方式引发转录。本公开的这种构建体包括与植物发育调控相关的受调控的转录起始区域。因此，本公开的组合物包含DNA构建体，这些DNA构建体包含的感兴趣的核苷酸序列可操作地连接至PVCV调控元件序列。PVCV调控区序列的一个来源以SEOIDNO：1示出。

本公开的组合物包含PVCV调控元件的核苷酸序列及其片段和变体。在特定实施方案中，本公开的调控元件序列可用于以组成型方式表达感兴趣的序列。本公开的核苷酸序列还可用于构建表达载体，这些表达载体后续用于在感兴趣的植物中表达异源核苷酸序列，或用作探针，来分离其他PVCV样调控元件。

调控元件

调控元件是具有基因调控活性的核酸分子，也就是能够影响可操作地连接的可转录多核苷酸分子的转录和/或翻译的核酸分子。因此，术语“基因调控活性”是指通过影响可操作地连接的可转录多核苷酸分子的转录和/或翻译，而影响这种可操作地连接的可转录多核苷酸分子表达的能力。基因调控活性可为阳性和/或阴性，并且所述影响可通过其下列特性来表征：时间、空间、发育、组织、环境、生理、病理、细胞周期和/或化学响应等，还可通过定量指示或定性指示来表征。

调控元件(诸如启动子、前导序列、内含子和转录终止区)是具有基因调控活性的核酸分子，也是活细胞基因整体表达不可缺少的一部分。术语“调控元件”是指具有基因调控活性的核酸分子，也就是能够影响可操作地连接的可转录多核苷酸分子的转录和/或翻译的核酸分子。因此，可通过基因工程方法，使用在植物中起作用的分离的调控元件(诸如启动子和前导序列)来改变植物表型。

调控元件可通过其表达模式来表征，即，被表征为组成型，并且/或者通过其下列特性来表征：时间、空间、发育、组织、环境、生理、病理、细胞周期和/或化学响应表达模式以及这些特性的任意组合，还可通过定量指示或定性指示来表征。启动子可用作调控元件，用来调控可操作地连接的可转录多核苷酸分子的表达。

如本文所用，“基因表达模式”为可操作地连接的核酸分子转录成转录的RNA分子的任何模式。表达可通过其下列特性来表征：时间、空间、发育、组织、环境、生理、病理、细胞周期和/或化学响应等，还可通过定量指示或定性指示来表征。转录的RNA分子可被翻译生成蛋白质分子，或可形成反义RNA分子或其他调控RNA分子，诸如dsRNA、tRNA、rRNA、miRNA等。

如本文所用，术语“蛋白质表达”为转录的RNA分子翻译成蛋白质分子的任何模式。蛋白质表达可通过其下列特性来表征：时间、空间、发育或形态等，还可通过定量指示或定性指示来表征。

如本文所用，术语“启动子”一般是指参与识别并结合RNA聚合酶II和其他蛋白质(反式作用转录因子)以引发转录的核酸分子。启动子最初可从基因的基因组拷贝的5′非翻译区(5′UTR)分离。另选地，启动子可为人工合成的DNA分子或受操纵DNA分子。启动子也可为嵌合启动子，也就是通过融合两个或两个以上异源DNA分子而产生的启动子。

在一个实施方案中，提供了本文所公开启动子序列的片段。启动子片段可表现启动子活性，并且可单独用于、或与其他启动子和启动子片段结合用于(诸如)构建嵌合启动子。在特定实施方案中，提供了启动子的多个片段，这些片段包含本文所公开的具有启动子活性的多核苷酸分子中的至少约50、95、150、250、500或750个连续核苷酸。这些片段与参考序列最佳比对时，可与参考序列具有至少约85％、约90％、约95％、约98％、约99％或更高的同一性。

也可分析启动子或启动子片段中是否存在已知的启动子元件，也就是DNA序列特性，诸如TATA-框和其他已知的转录因子结合位点基序。本领域技术人员可使用鉴定出的这些已知的启动子元件，来设计与原始启动子具有相似表达模式的启动子变体。

如本文所用，术语“增强子”或“增强子元件”是指顺式作用转录调控元件，亦称顺式元件，其赋予整体表达模式的一个方面，但单靠其通常不足以驱动可操作地连接的多核苷酸序列转录。增强子元件与启动子不同，通常不包含转录起始位点(TSS)和TATA框。天然的启动子可包含一个或多个增强子元件，这些增强子元件影响可操作地连接的多核苷酸序列转录。分离的增强子元件还可与启动子融合，以产生嵌合启动子顺式元件，该元件赋予整体调控基因表达的一个方面。启动子或启动子片段可包含一个或多个增强子元件，这些增强子元件影响可操作地连接的基因转录。据信，许多启动子增强子元件结合DNA结合蛋白并/或影响DNA拓扑结构，从而产生局部构象，选择性地允许或限制RNA聚合酶接近DNA模板，或有利于在转录起始位点处选择性打开双螺旋。增强子元件可结合调控转录的转录因子。有些增强子元件不止结合一种转录因子，而且转录因子可以不同的亲和力与不止一个增强子结构域相互作用。可采用多种技术鉴定增强子元件，包括：缺失分析，也就是从启动子5′端或内部缺失一个或多个核苷酸；使用DNasel足印法、甲基化干扰、电泳迁移率改变测定、通过连接介导PCR执行的体内基因组足印法和其他常规测定进行DNA结合蛋白分析；或者使用已知的顺式元件基序或增强子元件作为靶标序列或靶标基序，采用常规DNA序列比较方法(诸如BLAST)进行DNA序列相似性分析。增强子结构域的精细结构可通过一个或多个核苷酸的诱变(或置换)或通过其他常规方法进一步研究。增强子元件可通过化学合成获得，或从包含这种元件的调控元件中分离获得；并且增强子元件可与另外的含有可用限制性酶切位点的侧翼核苷酸一起合成，以便后续操纵。因此，本公开涵盖根据本文所公开的方法设计、构建和使用增强子元件，用于调控可操作地连接的可转录多核苷酸分子的表达。

如本文所用，术语“前导序列”是指从基因的基因组拷贝的5′非翻译区(5′UTR)分离的DNA分子，并且通常被定义为位于转录起始位点(TSS)和蛋白质编码序列起始位点之间的核苷酸区段。另选地，前导序列可为人工合成的DNA元件或受操纵DNA元件。前导序列可用作5′调控元件，用来调控可操作地连接的可转录多核苷酸分子的表达。前导序列分子可与异源启动子或其天然启动子一同使用。因此，本公开的启动子分子能够可操作地连接至其天然前导序列，或能够可操作地连接至异源前导序列。如本文所用，术语“嵌合”是指通过将第一个DNA分子与第二个DNA分子融合而生成的单个DNA分子，其中，第一个DNA分子和第二个DNA分子通常都不会以该构型(也就是与另一个DNA分子融合的构型)存在。因此，嵌合DNA分子为通常原本不会天然存在的全新DNA分子。如本文所用，术语“嵌合启动子”是指将DNA分子这样操纵而产生的启动子。嵌合启动子可结合两个或两个以上DNA片段；示例为由启动子与增强子元件融合而成的嵌合启动子。因此，本公开涵盖根据本文所公开的方法设计、构建和使用嵌合启动子，用于调控可操作地连接的可转录多核苷酸分子的表达。

应理解，位于编码区序列的内含子内或编码区序列3′的核苷酸序列也可有助于调控感兴趣的编码区的表达。合适的内含子的示例包括但不限于玉蜀黍IVS6内含子，或玉蜀黍肌动蛋白内含子。调控元件还可包括那些位于转录起始位点的下游(3′)的元件，或者位于被转录的区域内的元件，或者同时以上两种情况。在本公开的上下文中，转录后调控元件可包括在转录起始之后有活性的元件，例如翻译和转录增强子、翻译和转录阻遏子以及mRNA稳定性决定子。

可将本公开的调控元件或其变体或片段与异源调控元件或启动子可操作地关联，以便调控异源调控元件的活性。这种调控包括增强或抑制异源调控元件的转录活性、调控转录后事件、或者增强或抑制异源调控元件的转录活性并调控转录后事件。例如，可将本公开的一个或多个调控元件或其片段与组成型、诱导型或组织特异性启动子或其片段可操作地关联，以调控这种启动子在植物细胞中的所需组织内的活性。

本公开涵盖分离的或重组的核酸组合物。“分离的”或“重组的”核酸分子(或DNA)在本文用来指不再处于其天然环境中，例如处于体外的或异源重组细菌或植物宿主细胞中的核酸序列(或DNA)。分离的或重组的核酸分子或其生物活性部分，当通过重组技术产生时基本上不含其他细胞材料或培养基，或者当用化学法合成时基本上不含化学前体或其他化学物质。分离的或重组的核酸不含在衍生该核酸的生物体的基因组DNA中天然处于该核酸旁侧的序列(也就是位于该核酸5′和3′端的序列)(最典型地是蛋白质编码序列)。例如，在多个实施方案中，分离的核酸分子可含有少于约5kb、4kb、3kb、2kb、lkb、0.5kb或0.1kb的在该核酸的来源细胞的基因组DNA中天然处于该核酸分子旁侧的核苷酸序列。本公开的PVCV调控元件序列可从处于它们各自的转录起始位点旁侧的5′非翻译区分离。

本公开还涵盖所公开的启动子核苷酸序列的片段和变体。具体地，可在本公开的DNA构建体中使用SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3所示PVCV调控元件序列的片段和变体。如本文所用，术语“片段”是指核酸序列的一部分。PVCV调控元件序列的片段可保留引发转录的生物活性，更具体地，以组成型方式驱动转录的生物活性。另选地，可用作杂交探针的核苷酸序列片段可以不必保留生物活性。PVCV调控区核苷酸序列的片段范围可从至少约20个核苷酸、约50个核苷酸、约100个核苷酸，最多至本公开的基因启动子区的全长核苷酸序列。

PVCV调控元件的生物活性部分可通过分离本公开PVCV调控元件序列的一部分，随后评估该部分的启动子活性来制备。作为PVCV调控元件核苷酸序列的片段的核酸分子，包含至少约16、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900或1000个核苷酸，或者最多至本文所公开全长PVCV调控元件序列中存在的核苷酸数(例如，SEQIDNO：2中的1049个核苷酸)。

对于核苷酸序列，变体包含在天然多核苷酸中的一个或多个内部位点处的一个或多个核苷酸的缺失和/或添加，和/或在天然多核苷酸中的一个或多个位点处的一个或多个核苷酸的置换。如本文所用，“天然”或“基因组”核苷酸序列包括天然存在的核苷酸序列。就核苷酸序列来说，可使用本领域熟知的分子生物学技术来鉴定天然存在的变体，例如，用下文概述的聚合酶链反应(PCR)和杂交技术来鉴定。核苷酸序列变体还包括人工合成的核苷酸序列，比如那些采用定点诱变技术产生的核苷酸序列。一般来讲，本公开的特定核苷酸序列的变体与这种特定核苷酸序列具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，这通过本文别处描述的序列比对程序和参数确定。本公开的核苷酸序列的生物活性变体与该序列不同的核酸残基数可能只有1至15个，只有1至10个(诸如6至10个)，只有5个，只有4、3、2个，或甚至只有1个。

在一些实施方案中，编码调控区的核酸分子是“非基因组核酸序列”。如本文所用，“非基因组核酸序列”是指与天然或基因组核酸序列相比，在核酸序列中具有一个或多个改变的核酸分子。

核苷酸序列变体还涵盖由诱变和引起重组的工序(诸如DNA改组)产生的序列。采用这种工序时，可操纵PVCV调控元件核苷酸序列，生成全新的PVCV调控元件。以此方式，从一组相关的多核苷酸序列产生重组多核苷酸的文库，所述相关的多核苷酸序列包含具有实质的序列同一性且可以在体外或体内同源重组的序列区域。这种DNA改组的策略是本领域已知的。参见例如Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：10747-10751；Stemmer(1994)Nature370：389-391；Crameri等人(1997)NatureBiotech.15：436-438；Moore等人(1997)J.Mol.Biol.272：336-347；Zhang等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94：4504-4509；Crameri等人(1998)Nature391：288-291；以及美国专利5,605,793和5,837,458。

本公开的核苷酸序列可用于分离来自其他生物，尤其其他植物，更具体地，其他单子叶植物的相应序列。按此方式，可使用诸如PCR、杂交等之类的方法，基于这类序列与本文所示序列的序列同一性来鉴定这类序列。因此，本公开涵盖以与本文所示的完整PVCV调控元件序列或其片段的序列同一性为基础分离的序列。

在PCR方法中，可以设计寡核苷酸引物用于PCR反应，以便从提取自任何感兴趣的植物的基因组DNA中扩增出相应DNA序列。设计PCR引物和PCR克隆的方法是本领域公知的，在下列文献中公开：Sambrook等人(1989)MolecularCloning：ALaboratoryManual(第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress，Plainview，NewYork)，下文称“Sambrook”。还可参见Innis等人编辑(1990)PCRProtocols：AGuidetoMethodsandApplications(AcademicPress，NewYork)；Innis和Gelfand编辑(1995)PCRStrategies(AcademicPress，NewYork)；Innis和Gelfand编辑(1999)PCRMethodsManual(AcademicPress，NewYork)。已知的PCR方法包括但不限于利用成对引物、巢式引物、单一特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。

在杂交技术中，将已知核苷酸序列的全部或一部分用作探针，所述探针与来自所选生物体的一组克隆的基因组DNA片段中存在的其他相应核苷酸序列选择性杂交。杂交探针可以用可检测基团(诸如32P)或任何其他可检测标记物标记。因此，例如，杂交用探针可通过在本公开的PVCV调控元件序列基础上，对合成的寡核苷酸进行标记来制备。制备杂交用探针和构建基因组文库的方法是本领域公知的，并且在Sambrook中有公开。

例如，本文所公开的完整PVCV调控元件序列或其一个或多个部分，可用作能够与相应的PVCV调控元件序列和信使RNA特异性杂交的探针。要在多种条件下实现特异性杂交，此类探针包含的序列是PVCV调控元件序列中独一无二的，并且其长度为至少约10个核苷酸或者其长度为至少约20个核苷酸。可采用PCR，用此类探针由选择的植物扩增相应的PVCV调控元件序列。这项技术可以用于来从所需生物体分离另外的编码序列，或者用作诊断测定法以确定编码序列在生物体中的存在。杂交技术包括杂交筛选铺板的DNA文库(噬菌斑或菌落；参见例如，Sambrook)。

此类序列的杂交可在严格条件下进行。术语“严格条件”或“严格杂交条件”意指探针与其靶标序列杂交的程度比其与其他序列杂交的程度可检测地更高(例如比背景高至少2倍)的条件。严格条件是序列依赖性的，在不同的情况中将会不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定与探针100％互补的靶标序列(同源探测)。另选地，可以调节严格性条件以允许序列中的一些错配，使得检测到较低程度的相似性(异源探测)。探针长度通常小于约1000个核苷酸，最佳地，其长度小于500个核苷酸。

通常，严格条件为下列条件：盐浓度低于约1.5M钠离子(通常为约0.01至1.0M钠离子浓度(或其他盐))，pH为7.0至8.3，对于短探针(例如10至50个核苷酸)的温度为至少约30℃，对于长探针(例如超过50个核苷酸)的温度为至少约60℃。严格条件还可以通过添加去稳定剂诸如甲酰胺来实现。示例性的低严格条件包括用30％至35％甲酰胺、1MNaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液在37℃下杂交，然后在50至55℃下用1倍至2倍SSC(20倍SSC＝3.0MNaCl/0.3M柠檬酸三钠)洗涤。示例性的中等严格条件包括在40％至45％甲酰胺、1.0MNaCl、1％SDS中在37℃下杂交，然后在55至60℃下用0.5倍至1倍SSC洗涤。示例性的高严格条件包括在50％甲酰胺、1MNaCl、1％SDS中在37℃下杂交，最后在60至65℃下用0.1倍SSC至少洗涤30分钟。杂交持续时间通常少于约24小时，一般约4至约12小时。洗涤的持续时间将为至少足以达到平衡的时间长度。

特异性通常随杂交后的洗涤条件而变化，关键因素为最终洗涤溶液的离子强度和温度。就DNA-DNA杂交体来说，可根据Meinkoth和Wahl(1984)Anal.Biochem.138：267-284中提出的方程Tm＝81.5℃+16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L来计算Tm(热解链温度)；其中M为单价阳离子的摩尔浓度，％GC为DNA中鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form为杂交溶液中甲酰胺的百分比，并且L为杂交体的长度(单位为碱基对)。Tm为50％的互补靶标序列与完美匹配的探针杂交时的温度(在确定的离子强度和pH下)。错配率每增加1％，Tm下降约1℃；因此，可通过调节Tm、杂交条件和/或洗涤条件，来与具有所需同一性的序列杂交。例如，如果寻求同一性＞90％的序列，则Tm可降低10℃。通常情况下，将严格条件选择为比特定序列及其互补序列在确定的离子强度和pH下的Tm低约5℃。然而，极严格条件可以利用比Tm低1、2、3或4℃的杂交和/或洗涤；中等严格条件可以利用比Tm低6、7、8、9或10℃的杂交和/或洗涤；低严格条件可以利用比Tm低11、12、13、14、15或20℃的杂交和/或洗涤。利用所述公式，杂交和洗涤组成以及所需的Tm，普通技术人员将认识到，杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化固有地得到了描述。如果所需的错配程度导致Tm低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，则优选增大SSC浓度，以便可使用较高的温度。有关核酸杂交的详尽指导参见Tijssen(1993)LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-HybridizationwithNucleicAcidProbes,第1部分，第2章(Elsevier，NewYork)；和Ausubel等人编辑(1995)CurrentProtocolsinMolecularBiology，第2章(GreenePublishingandWiley-Interscience，NewYork)。另参见“Sambrook”。

因此，本公开涵盖具有组成型启动子活性的分离序列，这种分离序列在严格条件下与本文所公开的PVCV调控元件序列或其片段杂交。

下列术语用来描述两条或更多条核酸或多核苷酸之间的序列关系：(a)“参考序列”，(b)“比较窗口”，(c)“序列同一性”，(d)“序列同一性百分比”，(e)“实质同一性”。

(a)本文所用的“参考序列”是用作序列比较的基础的确定的序列。参考序列可以是指定序列的子集或全部；例如，为全长cDNA或基因序列的区段或完整的cDNA或基因序列。

(b)本文所用的“比较窗口”是指多核苷酸序列的连续的且指定的区段，其中该比较窗口中的多核苷酸序列相比于参考序列(不包含添加或缺失)可包含添加或缺失(即空位)，以便两条序列进行最佳比对。通常，比较窗口长度为至少20个连续的核苷酸，并且任选地可为30、40、50、100个或更长。本领域技术人员认识到，为避免由于在多核苷酸序列中加入空位所致的与参考序列的高度相似性，通常引入空位罚分并从匹配数扣除空位罚分。

将序列比对以作比较的方法是本领域公知的。因此，任何两条序列之间的序列同一性百分比的确定可使用数学算法来完成。此类数学算法的非限制性示例是Myers和Miller的算法(Myers和Miller(1988)CABIOS4：11-17)；Smith等人的局部比对算法(Smith等人(1981)Adv.Appl.Math.2：482)；Needleman和Wunsch的全局比对算法(Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443-453)；Pearson和Lipman的搜索局部比对方法(Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444-2448)；Karlin和Altschul的算法(Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA872264，该算法在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：5873-5877中进行了修改)。

这些数学算法的计算机执行可以用来比较序列以确定序列同一性。此类执行包括但不限于：PC/Gene程序(可从Intelligenetics(MountainView，California)购买)中的CLUSTAL；GCGWisconsinGeneticsSoftware版本10(可从Accelrys有限公司(9685ScrantonRoad，SanDiego，California，USA)购买)中的ALIGN程序(版本2.0)和GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。使用这些程序的比对可用默认参数执行。以下文献对CLUSTAL程序进行了详细描述：Higgins等人(1988)Gene73：237-244(1988)；Higgins等人(1989)CABIOS5：151-153；Corpet等人(1988)NucleicAcidsRes.16：10881-90；Huang等人(1992)CABIOS8：155-65；Pearson等人(1994)Meth.Mol.Biol.24：307-331。ALIGN程序是基于Myers和Miller(1988)(出处同上)的算法。当比较氨基酸序列时，ALIGN程序可使用PAMl20加权残基表(weightresiduetable)、空位长度罚分12和空位罚分4。Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403中提出的BLAST程序基于上文Karlin和Altschul(1990)中的算法。BLAST核苷酸搜索可用BLASTN程序，得分＝100，字长＝12来进行，以获得与编码本公开蛋白质的核苷酸序列同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可以用BLASTX程序，得分＝50，字长＝3来进行，以获得与本公开蛋白质或多肽同源的氨基酸序列。为获得空位比对结果进行比较，可按Altschul等人(1997)NucleicAcidsRes.25：3389中所述，利用空位BLAST(BLAST2.0)。另选地，可使用PSI-BLAST(BLAST2.0)执行迭代搜索，检测分子间的远源关系。参见Altschul等人，(1997)，出处同上。当采用BLAST、GappedBLAST、PSI-BLAST时，可以使用各个程序的默认参数(例如BLASTN用于核苷酸序列，BLASTX用于蛋白质)。参见美国国家生物技术信息中心的网站。还可依靠手动检查，来完成序列比对。

除非另外指明，否则本文提供的序列同一性/相似性值是指使用采用以下参数的GAP版本10或其任何等同程序获得的值：核苷酸序列的％同一性和％相似性采用GAP权重50和长度权重3以及nwsgapdna.cmp评分矩阵；氨基酸序列的％同一性和％相似性采用GAP权重8和长度权重2以及BLOSUM62评分矩阵。所谓“等同程序”意指任何序列比较程序，所述程序对于所考虑的任何两个序列，与GAP版本10所产生的相应比对结果相比时，产生具有相同核苷酸残基或氨基酸残基匹配和相同序列同一性百分比的比对结果。

GAP使用Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443-453中的算法，以找到两个完全序列的比对，该比对能使匹配数最大、空位数最小。GAP考虑所有可能的比对和空位位置，并产生具有最大数目的匹配碱基和最少的空位的比对。它使得可以提供以匹配碱基数为单位的空位产生罚分和空位延伸罚分。GAP对于其***的每个空位，必须利用匹配的空位产生罚分数。如果选择大于零的空位延伸罚分，GAP对于每个***的空位必须另外利用空位长度乘以空位延伸罚分。对于蛋白质序列，GCGWisconsinGeneticsSoftwarePackage的版本10中的默认空位产生罚分值和空位延伸罚分值分别为8和2。对于核苷酸序列，默认空位产生罚分为50，而默认空位延伸罚分为3。空位产生罚分和空位延伸罚分可以以选自0至200的整数来表示。因此，例如，空位产生罚分和空位延伸罚分可以为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或更大。

GAP给出该家族中的具有最佳比对的一个成员。可能存在这个家族的许多成员，但其他成员没有更好的品质。GAP显示用于比对的四个优值因素：品质、比率、同一性和相似性。品质是为了将序列进行比对而最大化的指标(metric)。比率是品质除以较短区段中的碱基数。同一性百分比是实际匹配的符号的百分比。相似性百分比是相似的符号的百分比。将相应于空位的符号忽略。当一对符号的评分矩阵值大于或等于0.50(相似性阈值)时，评定为相似性。GCGWisconsinGeneticsSoftwarePackage的版本10中使用的评分矩阵为BLOSUM62(参见Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10915)。

(c)在两条核酸或多肽序列的情形中，本文所用的“序列同一性”或“同一性”是指在指定的比较窗口范围为获得最大对应而比对时这两条序列中相同的残基。当序列同一性百分比针对蛋白使用时，认识到不相同的残基位置往往差别在于保守氨基酸置换，其中氨基酸残基由具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基置换，因此不会改变分子的功能性质。当序列差别在于保守置换，则可以上调序列同一性百分比以校正置换的保守性质。差别在于这种保守置换的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。作出这个调整的手段是本领域技术人员公知的。通常，这涉及将保守置换评定为部分错配而不是完全错配，从而增加序列同一性百分比。因此，例如，如果相同的氨基酸给予1分，非保守置换给予0分，则保守置换给予0至1之间的分数。保守置换的评分是例如在程序PC/GENE(Intelligenetics，MountainView，California)中所执行那样进行计算。

(d)本文所用的“序列同一性百分比”意指通过在比较窗口范围内比较两个最佳比对的序列所确定的数值，其中与参考序列(不包含添加或缺失)相比，多核苷酸序列在比较窗口中的部分可包含添加或缺失(即空位)，以便最佳比对两个序列。通过以下方式计算所述百分比：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以比较窗口中位置的总数目，然后将结果乘以100以得到序列同一性百分比。

(e)术语多核苷酸序列的“实质同一性”意指某多核苷酸序列与参考序列相比，具有至少70％、80％、90％、95％的序列同一性，所述百分比是用所述比对程序之一，采用标准参数得到的。

两条核苷酸序列实质上相同的另一指示是两个分子在严格条件下彼此杂交。通常，将严格条件选择为比特定序列在确定的离子强度和pH下的Tm低约5℃。但是，严格条件涵盖在比Tm低约1℃至约20℃的范围内的温度，取决于本文另外限定的所需严格程度。

如本文所用，术语“植物”包括植物细胞、植物原生质体、从中可再生出植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、以及在植物或植物部分中完好的植物块和植物细胞诸如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、仁、穗、穗轴、壳、茎、根、根尖、花粉囊等。籽粒意在表示由商业种植者出于栽培或繁殖物种之外的目的所培育的成熟种子。再生的植物的子代、变体和突变体也包括在本公开的范围内，前提条件是这些部分包含引入的多核苷酸。

本公开可用于任何植物物种(包括但不限于单子叶植物和双子叶植物)的转化。植物物种的示例包括：玉米(Zeamays)；芸苔属(Brassica)物种(例如甘蓝型油菜(B.napus)、芜菁(B.rapa)、芥菜(B.juncea))，特别是可用作种子油来源的那些芸苔属物种；苜蓿(Medicagosativa)、稻(Oryzasativa)、黑麦(Secalecereale)、高粱(Sorghumbicolor，Sorghumvulgare)、粟(例如珍珠粟(Pennisetumglaucum)、黄米(Panicummiliaceum)、谷子(Setariaitalica)、龙爪稷(Eleusinecoracana))；向日葵(Helianthusannuus)；红花(Carthamustinctorius)；小麦(Triticumaestivum)、大豆(Glycinemax)、烟草(Nicotianatabacum)、马铃薯(Solanumtuberosum)、落花生(Arachishypogaea)、棉花(海岛棉(Gossypiumbarbadense)、陆地棉(Gossypiumhirsutum))；甘薯(Ipomoeabatatus)；木薯(Manihotesculenta)；咖啡(Coffeaspp.)；椰子(Cocosnucifera)；菠萝(Ananascomosus)；柑橘树(Citrusspp.)；可可(Theobromacacao)；茶(Camelliasinensis)；香蕉(Musaspp.)；鳄梨(Perseaamericana)；无花果(Ficuscasica)；番石榴(Psidiumguajava)；芒果(Mangiferaindica)；橄榄(Oleaeuropaea)；木瓜(Caricapapaya)；腰果(Anacardiumoccidentale)；澳洲坚果(Macadamiaintegrifolia)；杏树(Prunusamygdalus)；糖用甜菜(Betavulgaris)；甘蔗(Saccharumspp.)；燕麦；大麦；蔬菜；观赏植物和针叶树。

蔬菜包括番茄(Lycopersiconesculentum)、莴苣(例如Lactucasativa)、青豆(Phaseolusvulgaris)、利马豆(Phaseoluslimensis)、豌豆(香豌豆属(Lathyrus)物种)和黄瓜属(Cucumis)的成员诸如黄瓜(C.sativus)、香瓜(C.cantalupensis)和甜瓜(C.melo)。观赏植物包括杜鹃(杜鹃花属(Rhododendron)物种)、八仙花(Macrophyllahydrangea)、朱槿(Hibiscusrosasanensis)、玫瑰(蔷薇属(Rosa)物种)、郁金香(郁金香属(Tulipa)物种)、水仙(水仙属(Narcissus)物种)、矮牵牛(Petuniahybrida)、康乃馨(Dianthuscaryophyllus)、一品红(Euphorbiapulcherrima)和菊花。

可用于实施本公开的针叶树包括(例如)松树诸如火炬松(Pinustaeda)、湿地松(Pinuselliotii)、西黄松(Pinusponderosa)、黑松(Pinuscontorta)和辐射松(Pinusradiata)；花旗松(Pseudotsugamenziesii)；西部铁杉(Tsugacanadensis)；北美云杉(Piceaglauca)；红杉(Sequoiasempervirens)；枞树(truefirs)诸如银枞(Abiesamabilis)和胶枞(Abiesbalsamea)；以及雪松诸如西方红雪松(Thujaplicata)和阿拉斯加黄雪松(Chamaecyparisnootkatensis)。在特定实施方案中，本公开的植物是作物植物(例如玉米、苜蓿、向日葵、芸苔属植物、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、粟、烟草等)。在其他实施方案中，玉米和大豆植物是最佳的，在另外其他实施方案中，玉米植物是最佳的。

其他感兴趣的植物包括提供感兴趣的种子的谷物类植物、油料种子植物和豆科植物。感兴趣的种子包括谷物种子，诸如玉米、小麦、大麦、稻、高粱、黑麦等。油料种子植物包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔、玉蜀黍、苜蓿、棕榈、椰子等。豆科植物包括豆类和豌豆。豆类包括瓜尔豆、槐豆、胡芦巴、大豆、四季豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆等。

如本文所用，术语“可转录多核苷酸分子”是指任何能够被转录为RNA分子的DNA分子，包括但不限于那些具有蛋白质编码序列的DNA分子，和那些具有可用于抑制基因的序列的DNA分子。“转基因”是指与宿主细胞异源的可转录多核苷酸分子和/或被人为掺入宿主细胞基因组的可转录多核苷酸分子。

本发明的调控元件能够可操作地连接至相对调控分子为异源的可转录多核苷酸分子。如本文所用，术语“异源”是指两个或两个以上多核苷酸分子的组合，这种组合通常不存在于自然界。举例来说，这两个分子可源自不同物种，并且/或者这两个分子可源自不同基因(例如，源自相同物种的不同基因，或源自不同物种的相同基因)。因此，如果这种组合通常不存在于自然界，则调控元件相对于可操作地连接的可转录多核苷酸分子是异源的，即，所述可转录多核苷酸分子不会天然与所述调控元件分子以可操作地连接方式组合在一起。

可转录多核苷酸分子通常可为表达RNA转录物所需的任何DNA分子。RNA转录物的这种表达可导致得到的mRNA分子翻译，因而导致蛋白质表达。另选地，可将可转录多核苷酸分子设计成最终导致特定基因或蛋白质的表达降低。这一点可通过使用以反义方向取向的可转录多核苷酸分子来实现。本领域的普通技术人员很熟悉这种反义技术的步骤。简言之，在转录可转录的反义多核苷酸分子时，RNA产物在细胞内与互补RNA分子杂交，并将互补RNA分子隔离。这种双螺旋RNA分子不能通过细胞的翻译机制翻译为蛋白质，随后在细胞内降解。可采用这种方式负调控任一种基因。

因此，本发明的一个实施方案是本发明的调控元件，诸如SEQIDNO：1至3示出的那些调控元件，这些调控元件可操作地连接至可转录多核苷酸分子，这样一来，一旦所述构建体被引入植物细胞，这些调控元件便可按期望水平或按期望模式调控可转录多核苷酸分子的转录。在一个实施方案中，可转录多核苷酸分子包含基因的蛋白质编码区，并且启动子影响RNA分子转录，继而影响RNA分子被翻译和表达为蛋白质产物。在另一个实施方案中，可转录多核苷酸分子包含基因的反义区域，并且启动子影响反义RNA分子或其他相似的抑制性RNA分子的转录，从而抑制靶标宿主细胞中感兴趣的特定RNA分子的表达。

由本公开的PVCV调控元件表达的可转录多核苷酸分子可用于改变植物的表型。表型的各种变化值得关注，包括更改基因的表达、改变植物对病原体或昆虫的防御机制、提高植物在植物中对除草剂的耐受性、改变根发育以应对环境胁迫、调节植物对盐、温度(热和寒冷)、干旱的响应等等。这些结果可通过表达包含适当基因产物的感兴趣的异源核苷酸序列来获得。在特定实施方案中，感兴趣的异源核苷酸序列是在植物或植物部分中表达水平提升的植物内源序列。另选地，这些结果可以通过引起植物中一种或多种内源基因产物，尤其酶、转运蛋白或辅因子的表达降低或者通过影响植物中营养物摄取来实现。这些改变导致转化植物的表型变化。

农学上感兴趣的基因

可转录多核苷酸分子可以是农学上感兴趣的基因。如本文所用，术语“农学上感兴趣的基因”是指当在特定的植物组织、细胞或细胞类型中表达时，提供与植物形态、生理、生长、发育、产量、产物、营养分布、疾病或害虫抗性和/或环境或化学耐受性相关的所需特征的可转录多核苷酸分子。农学上感兴趣的基因包括但不限于：编码产量蛋白、应激抗性蛋白、发育控制蛋白、组织分化蛋白、分生组织蛋白、环境响应蛋白、衰老蛋白、激素响应蛋白、脱落蛋白、来源蛋白、SINK蛋白、花控制蛋白、种子蛋白、除草剂抗性蛋白、疾病抗性蛋白、脂肪酸生物合成酶、生育酚生物合成酶、氨基酸生物合成酶、杀虫蛋白或任何其他试剂(诸如靶向抑制特定基因的反义或RNAi分子)的那些基因。农学上感兴趣的基因的产物可在植物体内起作用，影响植物的生理或代谢；或可充当杀虫剂，杀灭以植物为食的害虫。

在一个实施方案中，将本公开的调控元件掺入构建体，使该调控元件可操作地连接至作为农学上感兴趣的基因的可转录多核苷酸分子。为赋予植物农学有益性状，期望农学上感兴趣的基因表达。有益农学性状可以例如是但不限于：除草剂耐受性、昆虫防治、产量改良、真菌疾病抗性、病毒抗性、线虫抗性、细菌疾病抗性、植物生长和发育、产生淀粉、油产量改良、高油产量、脂肪酸含量改良、高蛋白质产量、果实成熟、动物和人类营养提高、产生生物聚合物、环境压力抗性、产生药用肽类和可分泌肽类、加工性状改良、可消化性改良、产生酶、产生香气、固氮性、杂交制种、产生纤维、产生生物燃料。

昆虫抗性基因可以编码针对严重影响产量的害虫的抗性，所述害虫诸如是根虫、切根虫、欧洲玉蜀黍螟等。这类基因包括(例如)苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)毒性蛋白基因(美国专利5,366,892、5,747,450、5,736,514、5,723,756、5,593,881；和Geiser等人(1986)Gene48：109)等等。

编码抗病性性状的基因包括解毒基因，诸如对伏马菌素解毒的那些基因(美国专利5,792,931)；无毒力(avr)基因和抗病性(R)基因(Jones等人(1994)Science266：789；Martin等人(1993)Science262：1432；和Mindrinos等人(1994)Cell78：1089)等等。

除草剂抗性性状可以包括编码针对起到抑制乙酰乳酸合酶(ALS)之作用的除草剂的抗性的基因，特别是磺酰脲型除草剂(例如含有导致这种抗性的突变特别是S4和/或Hra突变的乙酰乳酸合酶(ALS)基因)；编码对能抑制谷氨酰胺合酶的作用的除草剂的抗性的基因，诸如草胺膦或basta(例如bar基因)；草甘磷(如，EPSPS基因和GAT基因；参见(例如)美国专利公布20040082770和WO03/092360)或本领域已知的其他此类基因。bar基因编码针对除草剂basta的抗性，nptII基因编码针对抗生素卡那霉素和遗传霉素的抗性，并且ALS基因突变体编码针对除草剂氯磺隆的抗性。

草甘磷抗性由突变的5-烯醇式丙酮酰-3-磷酸莽草酸合酶(EPSP)基因和aroA基因赋予。参见(例如)Shah等人的美国专利4,940,835，其公开了EPSPS形式的能赋予草甘磷抗性的核苷酸序列。Barry等人的美国专利5,627,061也描述了编码EPSPS酶的基因。还可参见美国专利6,248,876B1、6,040,497、5,804,425、5,633,435、5,145,783、4,971,908、5,312,910、5,188,642、4,940,835、5,866,775、6,225,114B1、6,130,366、5,310,667、4,535,060、4,769,061、5,633,448、5,510,471、Re.36,449、RE37,287E和5,491,288；以及国际公布WO97/04103、WO97/04114、WO00/66746、WO01/66704、WO00/66747和WO00/66748，出于此目的将这些专利以引用方式并入本文。草甘磷抗性也被赋予表达编码草甘磷氧化还原酶的基因的植物，如美国专利5,776,760和5,463,175中更完全地描述，出于此目的将这两份专利以引用方式并入本文。另外，可通过过量表达编码草甘磷N-乙酰转移酶的基因，来赋予植物草甘磷抗性。参见(例如)美国专利7,714,188和7,462,481。

监管批准的农学上感兴趣的基因是本领域技术人员熟知的，可见于环境风险评估中心(cera-gmc.org/？action＝gm_crop_database，可使用www前缀对其进行访问)和国际农业生物技术应用服务组织(InternationalServicefortheAcquisitionofAgri-BiotechApplications)(isaaa.org/gmapprovaldatabase/default.asp，可使用www前缀对其进行访问)。

外源产物包括植物酶和植物产物，以及来自包括原核生物和其他真核生物在内的其他来源的那些产物。这类产物包括酶、辅因子、激素等。

其他适用基因及其相关表型的示例包括编码病毒外壳蛋白和/或RNA的基因或者赋予病毒抗性的其他病毒基因或者植物基因；赋予真菌抗性的基因；促进产量提高的基因；以及提供针对胁迫的抗性的基因，所述胁迫诸如为寒冷、因干旱、热和盐度引起的脱水、有毒金属或者痕量元素等。

如上所述，与本文公开的PVCV调控元件可操作地连接的异源核苷酸序列可以是靶向基因的反义序列。因此，本文所公开的启动子序列可以可操作地连接至反义DNA序列，以降低或抑制植物根中天然蛋白的表达。

“RNAi”是指用于降低基因表达的一系列相关技术(参见例如美国专利6,506,559)。由其他名称所指的较老技术现在据认为基于相同的机制，不过在文献中被赋予不同的名称。这些名称包括“反义抑制”，即产生能够抑制目标蛋白质的表达的反义RNA转录物，以及“共抑制”或“正义抑制”，指产生能够抑制相同的或者实质上相似的外来基因或者内源基因的表达的正义RNA转录物(美国专利5,231,020，以引用方式并入本文)。这种技术依赖于使用能导致积累这样的双链RNA的构建体，该双链RNA中的一条链与要沉默的靶标基因互补。各实施方案的PVCV调控元件可用来驱动将会导致RNA干扰的构建体(包括微RNA和siRNA)表达。

本公开的调控元件序列或其变体或片段可操作地连接至感兴趣的异源核苷酸序列时，可驱动该异源核苷酸序列在表达该构建体的植物中以组成型方式表达。“异源核苷酸序列”是不与本公开的调控元件序列一同天然存在的序列。虽然这种核苷酸序列对调控元件序列来说是异源的，但相对植物宿主可以是同源的或者说天然的，也可以是异源的或者说外来的。

可对本公开的分离的调控元件序列进行修饰，使所述异源核苷酸序列以一系列水平表达。因此，可利用完整调控元件区域的一部分，且驱动感兴趣的核苷酸序列表达的能力得到保持。应认识到，可采用不同方式缺失掉调控元件序列的一部分，来改变mRNA的表达水平。如果(例如)在截短过程中移除(阻遏蛋白的)负调控元件，则因调控元件缺失，mRNA表达水平可能降低，或者另选地，其表达可能增加。通常，使用至少约20个核苷酸的分离的调控元件序列来驱动核苷酸序列表达。

应认识到，为提高转录水平，可将增强子与本公开的调控元件区域结合使用。增强子是起增加调控元件区域表达的作用的核苷酸序列。增强子是本领域已知的，包括SV40增强子区、35S增强子元件等。我们还知道，有些增强子可改变调控元件正常的表达模式，例如通过引起调控元件以组成型方式表达，没有该增强子时，同一调控元件只在一个特定组织或一些特定组织中表达。

对本公开的分离的调控元件序列进行修饰，可使异源核苷酸序列以一系列水平表达。因此，可将这些调控元件序列修饰为弱启动子或强启动子。通常，“弱启动子”是指以低水平驱动编码序列的表达的启动子。“低水平”表达意指以约1/10,000个转录物至约1/100,000个转录物至约1/500,000个转录物的水平表达。相反地，强启动子以高水平或者说以约1/10个转录物至约1/100个转录物至约1/1,000个转录物的水平驱动编码序列的表达。

已经认识到，本公开的PVCV调控元件可用来增加或减少表达，从而导致转化植物的表型改变。这种表型变化可能进一步影响已转化植物的组织中金属离子水平的增加或减少。

本公开的核苷酸序列以及其变体和片段可用于对植物进行遗传操纵。PVCV调控元件序列在与待控制其表达以实现所需表型响应的异源核苷酸序列可操作地连接时，可用于这个方面。术语“可操作地连接的”，意指异源核苷酸序列的转录或翻译受调控元件序列的影响。以此方式，可将本公开的调控元件的核苷酸序列与感兴趣的异源核苷酸序列一同在表达盒中提供，以便在感兴趣的植物中，更具体地，在植物的根中表达。

本公开实施方案的调控序列在DNA构建体中提供，用于在感兴趣的生物体内表达。如本文所用，“表达盒”意指包含本公开实施方案的调控元件序列的DNA构建体，其中该调控元件序列可操作地连接至编码感兴趣的多肽的异源多核苷酸。这种表达盒包含转录起始区，该转录起始区包含可操作地连接至异源核苷酸序列的本公开的调控元件核苷酸序列之一或其变体或片段。这种表达盒可具有多个限制位点，用于使***该核苷酸序列的过程受调控区的转录调控。表达盒可另外含有选择性标记基因以及3′终止区。

表达盒在转录的5′-3′方向上可包含转录起始区(即本公开的启动子或其变体或片段)、翻译起始区、感兴趣的异源核苷酸序列、翻译终止区，并且任选地包含在宿主生物中有功能的转录终止区。本公开实施方案的调控区(即启动子、转录调控区和翻译终止区)和/或多核苷酸对于宿主细胞来说或彼此间可以是天然的/同功的。另选地，本公开实施方案的调控区和/或多核苷酸对于宿主细胞来说或彼此间可以是异源的。如本文所用，与序列有关的“异源”，是指该序列源于外来物种，或者，如果源于同一物种的话，则是通过蓄意人为干预对其天然形式在组成和/或基因座方面进行实质性修饰得到的序列。例如，可操作地连接至异源多核苷酸的启动子来自与得到该多核苷酸的物种不同的物种，或者，如果来自相同/类似的物种，那么一方或双方大体上由它们的原来形式和/或基因组位点修饰得到，或者该启动子不是被可操作地连接的多核苷酸的天然启动子。

终止区对于转录起始区可为天然的，对于可操作地连接的感兴趣的DNA序列可为天然的，对于植物宿主可为天然的，或者可能源自另一来源(即，对启动子、被表达的DNA序列、植物宿主或它们的任何组合来说为外来的或异源的)。易得的终止区可获自根瘤农杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒，诸如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。还可参见Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet.262：141-144；Proudfoot(1991)Cell64：671-674；Sanfacon等人(1991)GenesDev.5：141-149；Mogen等人(1990)PlantCell2：1261-1272；Munroe等人(1990)Gene91：151-158；Ballas等人(1989)NucleicAcidsRes.17：7891-7903；和Joshi等人(1987)NucleicAcidRes.15：9627-9639。

包含本公开的序列的表达盒还可含有要共转化到该生物体中的基因的至少一条另外的核苷酸序列。另选地，所述一条或多条另外的核苷酸序列可以在另一表达盒中提供。

在适当的情况下，可以优化其表达待处于本公开的组成型启动子序列控制下的核苷酸序列和任何另外的一条或多条核苷酸序列，以便在转化的植物中增加表达。也就是说，可使用植物偏好的密码子来合成这些核苷酸序列，从而改进表达。有关宿主偏好的密码子使用的讨论，参见例如Campbell和Gowri(1990)PlantPhysiol.92：1-11。合成植物偏好基因的方法是本领域现成的。参见例如美国专利5,380,831和5,436,391，以及Murray等人(1989)NucleicAcidsRes.17：477-498，这些专利和文献以引用方式并入本文。

已知有另外的序列修饰能增强细胞宿主中的基因表达。这些序列修饰包括消除以下序列：编码假多腺苷酸化信号、外显子-内含子剪接位点信号、转座子样重复的序列，以及其他此类得到充分表征的可能对基因表达有害的序列。可以将异源核苷酸序列的G-C含量调整至给定细胞宿主的平均水平，所述平均水平通过参考该宿主细胞中表达的已知基因来计算。当可能时，修饰序列以避免可预见的发夹二级mRNA结构。

表达盒可以另外含有5′前导序列。此类前导序列可以起到增强翻译的作用。翻译前导序列是本领域已知的并且包括小核糖核酸病毒前导序列，例如EMCV前导序列(脑心肌炎5′非编码区)(Elroy-Stein等人(1989)Proc.Nat.Acad.Sci.USA86：61266130)；马铃薯Y病毒前导序列，例如TEV前导序列(烟草蚀纹病毒)(Allison等人(1986)Virology154：920)；MDMV前导序列(玉蜀黍矮花叶病毒)；人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak等人(1991)Nature353：9094)；来自苜蓿花叶病毒的外壳蛋白mRNA(AMVRNA4)的非翻译前导序列(Jobling等人(1987)Nature325：622625)；烟草花叶病毒前导序列(TMV)(Gallie等人(1989)MolecularBiologyofRNA，第237256页)；以及玉蜀黍褪绿斑驳病毒前导序列(MCMV)(Lommel等人(1991)Virology81：382385)。还可参见DellaCioppa等人(1987)PlantPhysiology84：965968。也可采用已知的用来提高mRNA稳定性的方法，例如内含子，诸如玉蜀黍泛素内含子(Christensen和Quail(1996)TransgenicRes.5：213-218；Christensen等人(1992)PlantMolecularBiology18：675-689)或者玉蜀黍AdhI内含子(Kyozuka等人(1991)Mol.Gen.Genet.228：40-48；Kyozuka等人(1990)Maydica35：353-357)等等。

在制备表达盒时，可对各种DNA片段进行操纵，以便提供处于正确取向的DNA序列，并且适当时提供处于正确的阅读框的DNA序列。为此目的，可应用衔接子或接头将DNA片段连接在一起，或者可涉及其他的操纵以提供便利的限制性位点、去除多余的DNA、去除限制性位点等。为此目的，可能涉及到体外诱变、引物修复、限制、复性、再置换，例如转换和颠换。

可以在表达盒中包含报告基因或者选择性标记基因。本领域已知的合适报告基因的示例可以见于(例如)以下文献：Jefferson等人(1991)，PlantMolecularBiologyManual，Gelvin等人编辑(KluwerAcademicPublishers)，第1-33页；DeWet等人(1987)Mol.Cell.Biol.7：725-737；Goff等人(1990)EMBOJ.9：2517-2522；Kain等人(1995)BioTechniques19：650-655；和Chiu等人(1996)CurrentBiology6：325-330。

用于选择转化细胞或者组织的选择性标记基因可以包括赋予抗生素抗性或除草剂抗性的基因。合适的选择性标记基因的示例包括但不限于：编码针对以下物质的抗性的基因：氯霉素(HerreraEstrella等人(1983)EMBOJ.2：987-992)；甲氨喋呤(HerreraEstrella等人(1983)Nature303：209-213；Meijer等人(1991)PlantMol.Biol.16：807-820)；潮霉素(waldron等人(1985)PlantMol.Biol.5：103-108；和Zhijian等人(1995)PlantScience108：219-227)；链霉素(Jones等人(1987)Mol.Gen.Genet.210：86-91)；壮观霉素(Bretagne-Sagnard等人(1996)TransgenicRes.5：131-137)；博来霉素(Hille等人(1990)PlantMol.Biol.7：171-176)；磺酰胺(Guerineau等人(1990)PlantMol.Biol.15：127-136)；溴苯腈(Stalker等人(1988)Science242：419-423)；草甘膦(Shaw等人(1986)Science233：478-481；以及美国专利申请序列号10/004,357和10/427,692)；草胺膦(DeBlock等人(1987)EMBOJ.6：2513-2518)。

可以在回收转基因事件中发挥作用但在最终产物中可能不需要的其他基因将包括但不限于诸如以下示例：GUS(β-葡糖醛酸酶；Jefferson(1987)PlantMol.Biol.Rep.5：387)，GFP(绿色荧光蛋白；Chalfie等人(1994)Science263：802)，荧光素酶(Riggs等人(1987)NucleicAcidsRes.15(19)：8115以及Luehrsen等人(1992)MethodsEnzymol.216：397-414)，以及编码花青素生产的玉蜀黍基因(Ludwig等人(1990)Science247：449)。

包含本公开的可操作地连接至感兴趣的核苷酸序列的PVCV调控元件的表达盒可用于转化任何植物。以此方式，可以获得基因修饰的植物、植物细胞、植物组织、种子、根等。

本公开的方法涉及将多肽或者多核苷酸引入到植物中。“引入”意在指以使得多核苷酸或多肽的序列得以进入植物细胞内部的方式，将多核苷酸或多肽呈送给植物。本公开的方法不取决于将序列引入植物中的具体方法，只要多核苷酸或多肽进入植物的至少一个细胞的内部即可。将多核苷酸或多肽引入植物的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒介导的方法。

“稳定转化”意在指被引入植物中的核苷酸构建体整合进植物的基因组中，并能够由其后代继承。“瞬时转化”意在指多核苷酸被引入植物中但没有整合进植物的基因组中，或者多肽被引入植物中。

转化方案以及将核苷酸序列引入植物的方案，可以视转化所靶向的植物或植物细胞的类型(即单子叶植物或双子叶植物)而不同。将核苷酸序列引入植物细胞中并随后***植物基因组中的合适方法包括：微量注射法(Crossway等人(1986)Biotechniques4：320334)、电穿孔法(Riggs等人(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA83：56025606)、农杆菌(Agrobacterium)介导的转化法(Townsend等人，美国专利5,563,055和Zhao等人，美国专利5,981,840)、直接基因转移法(Paszkowski等人(1984)EMBOJ.3：27172722)和弹道粒子加速法(参见例如美国专利4,945,050、5,879,918、5,886,244、5,932,782；Tomes等人(1995)，PlantCell，Tissue，andOrganCulture：FundamentalMethods，Gamborg和Phillips编辑(Springer-Verlag，Berlin)；McCabe等人(1988)Biotechnology6：923926)；以及Lecl转化法(WO00/28058)。还可参见Weissinger等人(1988)Ann.Rev.Genet.22：421477；Sanford等人(1987)ParticulateScienceandTechnology5：2737(洋葱)；Christou等人(1988)PlantPhysiol.87：671674(大豆)；McCabe等人(1988)Bio/Technology6：923926(大豆)；Finer和McMullen(1991)InVitroCellDev.Biol.27P：175-182(大豆)；Singh等人(1998)Theor.Appl.Genet.96：319-324(大豆)；Datta等人(1990)Biotechnology8：736740(稻)；Klein等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：43054309(玉蜀黍)；Klein等人(1988)Biotechnology6：559563(玉蜀黍)；美国专利5,240,855、5,322,783和5,324,646；Klein等人(1988)PlantPhysiol.91：440444(玉蜀黍)；Fromm等人(1990)Biotechnology8：833839(玉蜀黍)；Hooykaas-VanSlogteren等人，(1984)Nature(London)311：763-764；美国专利5,736,369(谷类)；Bytebier等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：5345-5349(百合科)；DeWet等人(1985)，TheExperimentalManipulationofOvuleTissues，Chapman等人编辑(Longman，NewYork)，第197-209页(花粉)；Kaeppler等人(1990)PlantCellReports9：415-418；和Kaeppler等人(1992)Theor.Appl.Genet.84：560-566(晶须介导的转化)；D′Halluin等人(1992)PlantCell4：1495-1505(电穿孔)；Li等人(1993)PlantCellReports12：250-255，以及Christou和Ford(1995)AnnalsofBotany75：407-413(稻)；Osjoda等人(1996)NatureBiotechnology14：745-750(通过根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)转化玉蜀黍)；所有这些文献与专利均以引用方式并入本文。

在特定实施方案中，可使用多种瞬时转化方法将包含本公开的调控元件序列的DNA构建体提供给植物。这类瞬时转化方法包括但不限于病毒载体***，和以阻止DNA后续释放的方式沉淀多核苷酸。因此，虽然仍可能从粒子结合的DNA开始转录，但这种DNA释出继而整合到基因组中的频率会大大降低。此类方法包括使用涂覆聚乙基亚胺的粒子(PEI；Sigma-Aldrich^TM#P3143)。

在其他实施方案中，可通过使植物与病毒或病毒核酸接触，来将本公开的多核苷酸引入植物。通常，这类方法涉及将本公开的核苷酸构建体掺入病毒DNA或RNA分子内。涉及病毒DNA或RNA分子的用于将多核苷酸引入植物中并表达其中所编码的蛋白质的方法是本领域已知的。参见例如美国专利5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367、5,316,931，以及Porta等人(1996)MolecularBiotechnology5：209-221；这些专利和文献均以引用方式并入本文。

用于在植物基因组中特定位置处靶向***多核苷酸的方法是本领域已知的。在一个实施方案中，在期望的基因组位置***多核苷酸是使用位点特异性重组***实现的。参见例如WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855和WO99/25853，这些专利全部以引用方式并入本文。简言之，可以在转移盒中包含本公开的多核苷酸，所述转移盒侧接两个不相同的重组位点。将转移盒引入植物，该植物的基因组中稳定掺入了靶位点，其中所述靶位点侧接两个与该转移盒的所述位点相对应的不相同重组位点。提供适当的重组酶，将转移盒整合在该靶标位点处。感兴趣的多核苷酸因而被整合在植物基因组中的特定染色***置处。

可依据常规方式将已转化的细胞培育成植株。参见例如McCormick等人(1986)PlantCellReports5：81-84。然后可以培育这些植株，用相同的转化株系或者不同的株系授粉，并鉴定出具有所需表型特征的组成型表达的所得杂交体。可以培育两代或更多代植株，确保所需表型特征的表达得到稳定保持和遗传，然后收获种子，确保已实现所需表型特征的表达。以此方式，本公开提供了基因组中稳定掺入了本公开的核苷酸构建体(例如本公开的表达盒)的转化种子(也称为“转基因种子”)。

本文所用的冠词“一个”和“一种”指一个(种)或多于一个(种)(即，指至少一个(种))所述冠词的语法对象。举例而言，“一个要素”意指一个或多个要素。

在本说明书通篇中，词语“包含”及其变体(诸如“包括”或“含有”)应被理解为暗示包括规定的要素、整数或步骤或者要素组、整数组或步骤组，但不排除任何其他要素、整数或步骤或者要素组、整数组或步骤组。

提供下列实施例是为了举例说明本公开且并非用于限制本公开的范围。

实验

实施例1：碧冬茄脉明病毒调控元件序列

SEQIDNO：2示出的调控元件是通过在GenBankGenomes中检索已测序并归属于花椰菜病毒科病毒家族的病毒基因组获得的。该检索基于公知的花椰菜花叶病毒35S(CaMV35S)启动子而开始。所述启动子驱动异源基因在大多数植物的大多数组织中的组成型表达。来自该病毒家族的其他调控元件(诸如玄参花叶病毒34S启动子)也在植物中引导组成型样表达。因此，源自花椰菜病毒科病毒家族的另外的调控元件也可以在植物中驱动组成型表达。花椰菜病毒科基因组的结构相当保守(图1)。该基因组的存在于所谓长基因间区域(LIR)中的区域通常含有为使启动子在植物中起作用而必需的调控序列。

碧冬茄脉明病毒(PVCV)基因组具有LIR，因此以该区域为靶标进行功能启动子分析。选择两个含有LIR的序列在植物中测试。最长的序列由1049bp组成(以SEQIDNO：2示出)，并在该序列的3’端上游65bp处具有推定的TATA框。整个1049bp序列被称为PVCV全长启动子(PVCVFL)。

第二个序列是该全长启动子的截短版本(参见图2和SEQIDNO：1)。它被称作PVCVTR启动子，长369bp，由该全长启动子的3’端组成。通过缺失掉该全长启动子5′端的680bp，由该截短启动子在植物中引导的表达模式可发生改变，从而提供对该调控区中的重要调控元件的认识。

重复调控元件区域也可改变表达模式，如果存在转录增强子的话，甚至可以增强由启动子引导的表达。现已证实重复CaMV35S启动子的上游区域可使表达增加大约十倍(Kay，R.等人，(1987)Science236：1299-1302)。为确定重复对PVCVTR调控元件造成的影响，我们将280bp截短调控元件置于369bp序列上游，产生在推定的TATA框上游具有重复的280bp区段的调控元件(PVCVDup；SEQIDNO：3，图4)。所有3个启动子序列都用合成法制备以供克隆到表达载体中。

实施例2：使用报道基因分析表达

将PVCVFL(SEQIDNO：2)调控元件、PVCVTR(SEQIDNO：1)调控元件和PVCVDup(SEQIDNO：3)调控元件在表达载体中，与/不与Adh1内含子1一起可操作地连接至B-葡糖醛酸酶(GUS)基因，来测试合成的DNA片段是否会引导表达。将Adhl内含子包括在内的目的是提高表达，因为已证实在谷类植物细胞中，存在一些5′近端内含子可增强转基因表达(参见Callis等人(1987)GenesandDevelopment1：1183-1200；Kyozuka等人(1990)Maydica35：353-357)。

在分析PVCV启动子时，使用来自玉蜀黍的Ubi-1启动子(使用其本身的内含子)作为阳性对照。还将其可操作地连接至B-葡糖醛酸酶(GUS)基因，这样，便可使用该启动子来比较3种PVCV启动子的表达模式和表达水平。Ubi-1启动子在玉蜀黍的大多数组织中是强组成型启动子。

使用农杆菌方案产生稳定转化的植株(实施例3中详述)。对每个调控元件和调控元件x内含子的组合，再生出十棵植株。使各植株在温室条件下生长，直到它们达到V4至V6的生长阶段。由植株上的围绕叶(collaredleaves)数目确定营养生长期。因此，V6期的植株有6片完全围绕的叶子。从处于这个时期的每棵植株采集叶和根组织样品。然后让各植株生长至早期R1阶段，这是正好在花粉散出之前的时间，此时收集须和茎秆(节和节间)以及穗组织。最终，在植株开始散播花粉时收集花粉。使用组织化学染色、定量荧光测定和qRT-PCR的组合检查所述3个调控元件引导的表达模式和表达水平。

PVCV调控元件驱动茎、根、叶、穗和籽粒组织中的表达(表1和表2)。有ADHl内含子的茎中的表达水平最高。存在该内含子，通常也有利于根和穗中的表达。未在须中观察到表达，基本上也未在花粉中检测到表达。

表1：PVCV调控元件(无Adhl内含子1)在植物中表达的结果

数据以0-6标度表示，其中玉蜀黍Ubi-1启动子代表中值。

表2：PVCV调控元件(有Adhl内含子1)在植物中表达的结果

数据以0-6标度表示，其中玉蜀黍Ubi-1启动子代表中间值。

实施例3：农杆菌介导的玉蜀黍转化及转基因植物再生

为了用本公开的调控元件序列进行农杆菌介导的玉蜀黍转化，采用了Zhao提出的方法(参见美国专利5,981,840和PCT专利公布WO98/32326；这两份专利的内容据此以引用方式并入本文)。简言之，从玉蜀黍分离出未成熟胚，然后取这些未成熟胚在特定条件下接触农杆菌悬液，借此细菌能够将调控元件序列转移到至少一个未成熟胚的至少一个细胞中(步骤1：感染步骤)。在该步骤中，将未成熟胚浸泡在农杆菌悬液中，引发接种。使胚与农杆菌共培养一段时间(步骤2：共培养步骤)。在该感染步骤之后，将未成熟胚在固体培养基上进行培养。在该共培养期之后，进行任选的“静息”步骤。在这个静息步骤中，将胚在至少一种已知抑制农杆菌生长的抗生素存在下进行温育，不添加植物转化体的选择剂(步骤3：静息步骤)。接着，在含有选择剂的培养基上培养接种的胚，并且回收生长的转化愈伤组织(步骤4：选择步骤)。将未成熟胚置于含选择剂的固体培养基上培养，使转化细胞选择性生长。然后使愈伤组织再生成植株(步骤5：再生步骤)，并且在固体培养基上培养在选择性培养基上培育的愈伤组织以便再生植株。

实施例4：使用报道基因分析大豆中的表达

将PVCVFL调控元件可操作地连接至两个不同的杀昆虫基因Prm20和Prm21，测试其是否会在大豆植株中引导表达。使用生物射弹轰击方法产生了稳定转化的植株。使用qPCR筛选潮霉素抗性T0植株中***表达盒的情况。通过昆虫功效测试评估PVCV引导的表达水平。用摄食性昆虫侵染植株提供对蛋白质表达情况的快速评估，因为需要充分的水平以保护植株免于昆虫侵害。若表达不充分，会导致植株被摄食，继而毁损。除昆虫功效测试外，我们还测定了两个T0事件中单拷贝T1植株表达PRM21的水平。表3中的结果显示出PVCV调控元件在转基因T0和T1大豆植株的叶子中发挥作用，并能够以保护植株，使其免遭绒毛豆毛虫(VBC)和大豆尺蠖(SBL)影响的水平引导表达。

表3：PVCV调控元件在大豆中的功效和表达结果

功效值以保护叶子免遭摄食达＞90％的事件百分比表示

表达以两个T0事件中单拷贝T1植株的平均ppm表示；其他T0事件中的多拷贝T1植株的表达范围为0至812ppm。

CTP＝叶绿体转运肽

N/D＝未测定

实施例5：转基因大豆植株的转化和再生

培养条件

将大豆胚发生悬浮培养物(cv.Jack)在150rpm、26℃的旋转摇荡器上保持在35mL液体培养基SB196(参见下文配方)中，该旋转摇荡器具有冷白色荧光灯，光周期为16：8小时白天/黑夜，光强度为60-85μE/m2/s。每7天至两周，通过将大约35mg的组织接种到35ml的新鲜液体SB196中，对培养物进行分培(优选的分培间隔为每7天)。

以下实施例描述大豆胚发生悬浮培养物通过粒子枪轰击方法与质粒和DNA片段一起转化(Klein等人(1987)Nature，327：70)。

引发大豆胚发生悬浮培养物

每月两次对大豆培养物进行引发，每次引发之间间隔5-7天。

在种植45至55天后从可用的大豆植株挑取带有不成熟种子的豆荚，剥壳并放入无菌绛红色盒子中。将大豆种子在含有1滴象牙皂的5％Clorox溶液(95ml的高压灭菌蒸馏水加5mlClorox和1滴皂)中振摇15分钟，对其进行灭菌。用两个1升瓶子的无菌蒸馏水清洗种子，并且使用小于4mm的种子。切开每颗种子的小的一端，将子叶压出种皮，并且放在SBl99培养基的平板上。两周后，将子叶转移到含有SBl培养基的平板(每个平板25至30个子叶)。用纤维带包住平板。两至三周后，切取次生胚，并且放入SB196液体培养基中培养10天。

用于轰击的DNA的制备

将含有感兴趣的基因和选择性标记基因的完整质粒或者DNA质粒片段用于轰击。使用Promega^TM方案与应用指南，第二版(第106页)中描述的方法，或者使用Maxiprep试剂盒或Spinminiprep试剂盒，例行制备并纯化用于轰击的质粒DNA。

在每种情况下，将10μg质粒DNA放入150μL适用于感兴趣的片段的特定酶混合物中消化。将所得的DNA片段放在1％超纯琼脂糖(Invitrogen^TM)上进行凝胶电泳分离，从琼脂糖凝胶切取编码感兴趣的基因的DNA片段。使用凝胶提取试剂盒，按照生产商的方案从琼脂糖纯化DNA。

将含有3mg金粒子(3mg金)的50μL无菌蒸馏水等分试样加到5μL的1μg/μLDNA溶液(完整质粒或者如上所述制备的DNA片段)、50μL2.5MCaCl2和20μL的0.1M亚精胺。将混合物在涡旋摇荡器的水平3上振摇3分钟，并且在台式微量离心机中离心10秒钟。用400μl100％乙醇洗涤后，通过在40μl100％乙醇中进行超声处理使沉淀悬浮。向BiolisticPDS1000/HE仪器盘的每个飞碟(flyingdisk)分配5μLDNA悬液。每个5μl等分试样含有大约0.375mg金/次轰击(即每碟)。

组织制备和用DNA轰击

取大约150-200mg的7天龄胚悬浮培养物放在空的无菌60×15mm平皿中，并且用塑料网盖住平皿。每板的组织轰击1或2次，膜破裂压力设定为1100PSI，并且腔室抽真空至27-28英寸汞柱。将组织放在离阻滞网/停止网大约3.5英寸处。

选择转化胚

用潮霉素(使用磷酸转移酶HPT基因作为选择性标记时)或氯磺隆(使用乙酰乳酸合酶ALS基因作为选择性标记时)选择转化胚。

潮霉素(HPT)选择

在轰击后，将组织放入新鲜的SB196培养基中，如上所述进行培养。轰击后六天，将该SB196用含有30mg/L潮霉素选择剂的新鲜SB196更换。每周更换一次选择培养基。选择后四至六周，可观察到绿色的转化组织从未转化的坏死胚发生簇中生长出来。移取分离的绿色组织，并且接种到多孔板中，以产生新的克隆繁殖的转化胚发生悬浮培养物。

氯磺隆(ALS)选择

在轰击后，将组织在2个含有新鲜SB196培养基的烧瓶之间分配，并且如上所述进行培养。轰击后六至七天，将该SB196用含有100ng/ml氯磺隆选择剂的新鲜SB196更换。每周更换一次选择培养基。选择后四至六周，可观察到绿色的转化组织从未转化的坏死胚发生簇中生长出来。移取分离的绿色组织，并且接种到含有SB196的多孔板中，以产生新的克隆繁殖的转化胚发生悬浮培养物。

大豆体细胞胚再生成植株

为了从胚发生悬浮培养物获得整株植物，组织必须进行再生。

胚成熟

将胚在SB196中在冷白色荧光(PhillipscoolwhiteEconowattF40/CW/RS/EW)和Agro(PhillipsF40Agro)灯泡(40瓦)下于26℃培养4至6周，光周期为16：8小时，光强度为90至120μE/m2s。这段时间后，移取胚簇置于固体琼脂培养基SB166上，培养1至2周。然后将胚簇置于SB103培养基中，继代培养3周。在此期间，可从胚簇移取单独的胚并进行表型筛选。应指出的是，在这个阶段可筛选任何由感兴趣的基因表达产生的可检测表型。

胚干燥和萌发

取各个成熟的胚放入空的小培养皿(35×10mm)中，保持大约4至7天，使其变干。将各板用纤维带密封(产生小的湿度腔室)。将经干燥的胚种植到SB71-4培养基中，让它们在与如上所述相同的培养条件下萌发。从萌发培养基移取萌发的小植株，并且用水彻底清洗，然后种植在24孔托盘(packtray)内的中，用透明塑料罩盖住。2周后，撤掉塑料罩，让植物再生长一周，变得更强壮。如果小植株看起来强壮，则将其移栽到10英寸盆种，每个盆最多栽种3棵小植株。10至16周后，收获成熟的种子，破成碎片并分析蛋白质。

培养基配方

SB196-FNLite液体增殖培养基(每升)-

FNLite原液

原液#1000mL500mL

1MSFeEDTA100x原液

Na2EDTA*3.724g1.862g

FeS04-7H2O2.784g1.392g

*先加入，在深色瓶中溶解，同时搅拌

2MS硫酸盐100x原液

3FNLite卤化物100x原液

CaCl2-2H2O30.0g15.0g

KI0.083g0.0415g

CoCl2-6H2O0.0025g0.00125g

4FNLiteP，B，Mo100x原液

KH2PO418.5g9.25g

H3BO30.62g0.31g

Na2MoO4-2H2O0.025g0.0125g

SB1固体培养基(每升)包含：4.33gMS盐(PhytoTechLaboratories^TMM524)，1mLB5维生素1000x原液；31.15gD-葡萄糖(Sigma-Aldrich^TMG7021)，2mL2,4-D(20mg/L终浓度)；pH.5.8，和8gTC琼脂(PhytoTechLaboratories^TMA175)。

SB166固体培养基(每升)包含：4.33gMS盐(PhytoTechLaboratories^TMM524)，1mLB5维生素1000x原液；31.15gD-(+)-麦芽糖一水合物(Sigma-Aldrich^TMM5895)，750mg无水MgCl2(Sigma-Aldrich^TMM0260)；5g活性炭(Sigma-Aldrich^TMC6209)；pH.5.7，和2.5g(Sigma-Aldrich^TMG1910)。

SB103固体培养基(每升)包含：4.33gMS盐(PhytoTechLaboratories^TMM524)，1mLB5维生素1000x原液；31.5gD-(+)-麦芽糖一水合物(Sigma-Aldrich^TMM5895)，750mg无水MgCl2(Sigma-Aldrich^TMM0260)；pH.5.7，和2.5g(Sigma-Aldrich^TMG1910)。

SBl99固体培养基(每升)包含：4.33gMS盐(PhytoTechLaboratories^TMM524)；1mlB5维生素1000×原液；30g蔗糖(Sigma-Aldrich^TMS5390)；4mL2,4-D(40mg/L终浓度)，pH7.0，2g(Sigma-Aldrich^TMG1910)。

SB71-4固体培养基(每升)包含：3.21gGamborgB5盐(PhytoTechLaboratories^TMG398)；20g蔗糖(Sigma-Aldrich^TMS5390)；pH5.7；和5gTC琼脂(PhytoTechLaboratories^TMA175)。

以等分试样形式在-20℃下保藏的B5维生素原液(每100mL)包含：10g肌醇；100mg烟酸；100mg盐酸吡哆醇；和1g硫胺素。如果溶液没有足够快地溶解，通过热搅拌板施加低水平的热量。氯磺隆原液是在0.01N氢氧化铵中包含1mg/mL。

实施例6：通过粒子轰击转化玉蜀黍及转基因植物再生

用含有可操作地连接至感兴趣的基因的调控元件的DNA分子轰击来自温室供体植株的未成熟玉蜀黍胚。在同一转化载体中提供选择性标记，或者另选地，该选择性标记基因在单独的DNA分子中提供。如下进行转化。培养基配方见下文。

靶标组织的制备

将穗去壳，置于30％Clorox^TM漂白剂加0.5％Micro洗涤剂中表面灭菌20分钟，并且用无菌水漂洗两次。将未成熟胚切下，并以胚轴一侧朝下(盾片一侧朝上)放置，每板25个胚，在560Y培养基上放置4小时，然后在2.5cm靶区内排成一行准备进行轰击。

DNA的制备

制备包含本公开实施方案的调控元件序列的质粒载体。该载体另外含有由CAMV35S启动子驱动的PAT选择性标记基因并包括CAMV35S终止子。任选地，该选择性标记可存在于单独的质粒上。采用下述CaCl2沉淀工序，将包含本公开实施方案的调控元件序列以及PAT选择性标记的DNA分子沉淀到1.1m(平均直径)钨丸上：

100μL制备的钨粒子水溶液

10μL(1μg)DNA/TrisEDTA缓冲液(1μg总DNA)

100μl2.5MCaCl2

10μl0.1M亚精胺

将钨粒子悬液保持在多管涡旋振荡器上，依次向其中加入每种试剂。将最终的混合物进行短暂超声处理，并且让其在恒定漩涡混合下温育10分钟。在沉淀期后，将各管进行短暂离心，除去液体，用500ml100％乙醇洗涤，并且离心30秒。再次移除液体并且将105μL100％乙醇加至最终的钨粒子小球。对于粒子枪轰击，将钨/DNA粒子进行短暂超声处理，并取10μL点滴到每个巨载体(macrocarrier)的中央上，让其干燥约2分钟后进行轰击。

粒子枪处理

将样品板在粒子枪#HE34-1或#HE34-2中以水平#4进行轰击。所有样品接受650PSI的单次射击，每管的制备粒子/DNA共取十个等分试样。

后续处理

轰击之后，将胚保持在560Y培养基上2天，然后转移到含有3mg/L双丙氨膦的560R选择培养基中，每2周继代一次。选择大约10周后，将抗选择的愈伤组织克隆转移到288J培养基，引发植株再生。待体细胞胚成熟后(2至4周)，将发育良好的体细胞胚转移到培养基中进行萌发并转移到有光照的培养室。大约7至10天后，将发育的小植株转移到管中的272V无激素培养基中培养7至10天，直到小植株完全长好。然后将植株转移到装有盆栽土的平板衬垫(insertsinflats)(相当于2.5英寸盆)，置于生长室中生长1周，随后置于温室中再生长1至2周，最后转移到常见的600型盆(1.6加仑)，生长至成熟。通过本领域已知的测定法，比如用能结合感兴趣的蛋白的抗体进行免疫测定和蛋白质印迹分析，监测植株并对表达进行评分。

轰击法和培养基

轰击培养基(560Y)包含4.0g/LN6基础盐(Sigma-Aldrich^TMC-1416)、1.0mL/LEriksson维生素混合物(1000xSIGMA-1511)、0.5mg/L盐酸硫胺、120.0g/L蔗糖、1.0mg/L2,4-D和2.88g/LL-脯氨酸(用KOH调至pH5.8后，用去离子水定容)；2.0g/L(用去离子水定容后加入)；及8.5mg/L硝酸银(将培养基灭菌并冷却到室温后加入)。选择培养基(560R)包含4.0g/LN6基础盐(Sigma-Aldrich^TMC-1416)、1.0mL/LEriksson维生素混合物(1000xSigma-Aldrich^TM-1511)、0.5mg/L盐酸硫胺、30.0g/L蔗糖和2.0mg/L2,4-D(用KOH调至pH5.8后，用去离子水定容)；3.0g/LGelrite^TM(用去离子水定容后加入)；及0.85mg/L硝酸银和3.0mg/L双丙氨膦(两者均在将培养基灭菌并冷却到室温后加入)。

植物再生培养基(288J)包含4.3g/LMS盐(GIBCO11117-074)、5.0mL/LMS维生素原液(0.100g烟酸、0.02g/L盐酸硫胺、0.10g/L盐酸吡哆辛和0.40g/L甘氨酸，用精制去离子水(polishedD-IH20)定容)(Murashige和Skoog(1962)Physiol.Plant.15：473)、100mg/L肌醇、0.5mg/L玉米素、60g/L蔗糖和1.0mL/L0.1mM脱落酸(在调至pH5.6后，用精制去离子水定容)；3.0g/LGelrite^TM(用去离子水定容后加入)；及1.0mg/L吲哚乙酸和3.0mg/L双丙氨膦(将培养基灭菌并冷却到60℃后加入)。无激素培养基(272V)包含4.3g/LMS盐(GIBCO11117-074)、5.0mL/LMS维生素母液(0.100g/L烟酸、0.02g/L盐酸硫胺素、0.10g/L盐酸吡哆辛和0.40g/L甘氨酸，用精制去离子水定容)、0.1g/L肌醇和40.0g/L蔗糖(在调至pH5.6后，用精制去离子水定容)；及6g/L细菌琼脂(用精制去离子水定容后加入)，灭菌并冷却至60℃。

本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请指示了本公开所属领域的技术人员的水平。所有出版物、专利和专利申请均以引用方式并入本文，所引用的程度就如同每个单独的出版物、专利或者专利申请被具体地和独立地指出以引用方式并入本文一样。

虽然为了清楚地理解而已经通过举例说明和实施例较详细地描述了上述公开内容，但显然可以在所附权利要求范围内实施一些改变和修改。

Claims

1.一种重组核酸分子；所述重组核酸分子包含选自下列的调控元件：

(a)与SEQIDNO：1所示的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸，

(b)SEQIDNO：1所示的多核苷酸，和

(c)SEQIDNO：1中具有启动子活性的片段。

2.根据权利要求1所述的重组核酸分子，其中所述多核苷酸与SEQIDNO：1所示的核酸序列具有至少90％的序列同一性。

3.根据权利要求1所述的重组核酸分子，其中所述多核苷酸与SEQIDNO：1所示的核酸序列具有至少95％的序列同一性。

4.根据权利要求1所述的重组核酸分子，其中所述多核苷酸包含选自下列的调控元件：

(a)与SEQIDNO：2所示的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸，

(b)SEQIDNO：2所示的多核苷酸，和

(c)SEQIDNO：2中具有启动子活性的片段。

5.根据权利要求1所述的重组核酸分子，其中所述调控元件包含SEQIDNO：1中第1至280位核苷酸的至少两个串联重复序列。

6.根据权利要求5所述的重组核酸分子，其中所述调控元件包含SEQIDNO：3所示的核酸序列。

7.一种DNA构建体；所述DNA构建体包含：

(a)选自下列的调控元件：

(i)与SEQIDNO：1所示的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸，

(ii)SEQIDNO：1所示的多核苷酸，和

(ii)SEQIDNO：1中具有启动子活性的片段；和

(b)可转录的异源多核苷酸分子，所述可转录的异源多核苷酸分子可操作地连接至所述调控元件。

8.根据权利要求7所述的DNA构建体，其中所述多核苷酸与SEQIDNO：1所示的核酸序列具有至少90％的序列同一性。

9.根据权利要求7所述的DNA构建体，其中所述多核苷酸与SEQIDNO：1所示的核酸序列具有至少95％的序列同一性。

10.根据权利要求7所述的DNA构建体，其中所述调控元件包含SEQIDNO：1中第1至280位碱基对的至少两个串联重复序列。

11.根据权利要求10所述的DNA构建体，其中所述调控元件包含SEQIDNO：3所示的核酸序列。

12.一种DNA构建体；所述DNA构建体包含：

(a)选自下列的调控元件：

(i)与SEQIDNO：2所示的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸，

(ii)SEQIDNO：2所示的多核苷酸，和

(ii)SEQIDNO：2中具有启动子活性的片段，和

13.根据权利要求12所述的DNA构建体，其中所述调控元件包含SEQIDNO：2中第681至960位核苷酸的至少两个串联重复序列。

14.根据权利要求7、8、9、10、11、12或13所述的DNA构建体，其中所述可转录的异源多核苷酸分子是农学上感兴趣的基因。

15.根据权利要求14所述的DNA构建体，其中所述可转录的异源多核苷酸分子是能够在植物中提供除草剂抗性的基因。

16.根据权利要求14所述的DNA构建体，其中所述可转录的异源多核苷酸分子是能够在植物中提供植物害虫防治的基因。

17.一种用权利要求1、2、3、4、5或6所述的核酸分子稳定转化的转基因植物。

18.根据权利要求17所述的转基因植物，其中所述转基因植物为单子叶植物细胞。

19.根据权利要求17所述的转基因植物，其中所述转基因植物为双子叶植物细胞。

20.一种用权利要求7、8、9、10、11、12、13、14、15或16所述的DNA构建体稳定转化的转基因植物。

21.一种权利要求19所述的转基因植物的植物部分，其中所述植物部分包含所述DNA构建体。

22.一种权利要求18所述的转基因植物的种子，其中所述种子包含所述DNA构建体。