CN105722396A - 分离的链霉菌属细菌 - Google Patents

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CN105722396A CN201480052752.0A CN201480052752A CN105722396A CN 105722396 A CN105722396 A CN 105722396A CN 201480052752 A CN201480052752 A CN 201480052752A CN 105722396 A CN105722396 A CN 105722396A
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F·阿蒂亚
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Abstract

本发明涉及一种具有称为16S rDNA的DNA序列的分离细菌，所述序列编码所述细菌的16S核糖体RNA，所述DNA序列与SEQ ID NO：1序列100％同源，所述分离细菌选自：?以编号I?4467登记和保藏在法国国立微生物保藏中心(CNCM)的细菌，和?在CNCM登记和保藏的所述I?4467细菌的突变体。

Description

分离的链霉菌属细菌
技术领域
本发明涉及从链霉菌属分离的新细菌，包括至少一种所述细菌的组合物和通过培养至少一种所述细菌获得的无细胞组合物。
背景技术
为了满足全球食品需求，需要开发强化农作物。这些强化作物需要使用能够优化感兴趣农作物营养、促进其生长和最小化不期望的植物和/或病原体的生长的物质。更具体地，使用优化植物营养的物质，保护植物不受病原生物体、尤其是易于影响植物优化生长的植物病原细菌和/或真菌侵害的物质。
化肥通常是固态形式和可稍溶于土壤，需要在肥料产品需要优化作物生长时期大量施加。被施加于土壤的且植物未吸收的过量固态肥料产品暂时留在土壤中并被雨水或灌溉用水逐渐溶解，这造成河道和含水层污染。
因此需要研发解决方法，用于改善土壤肥料的效用，而不会污染环境、特别是含水层，同时可利于植物生长。
发明内容
因此本发明的目的在于提供解决所述问题的方法。
而且，在植物培养过程中，可出现多种植物病原物质，其导致产量和植物产品质量降低。在所述植物病原物质中，发现大多数细菌例如疮痂病链霉菌(Streptomyces scabies)能够破坏土豆培育。还发现多种植物病原真菌例如大刀镰孢(Fusarium culmorum)、尤其造成灰霉病的灰色葡萄孢(Botrytis cinerae)或造成藤本植物疾病的终极腐霉(Pythiumultimum)、Phaeomoniella chlamydospora、Phaeomoniella aelophilum、Eutypalata或地中海嗜蓝孢孔菌(Fomitiporia mediterranea)。
本发明的目的还在于提供一种解决方法，用于保护植物对于植物病原体的一些细菌和/真菌生物体的保护作用。
为此，本发明涉及包含称为16S rDNA的DNA序列的分离细菌，所述序列编码所述细菌的16S核糖体RNA，所述DNA序列与SEQ ID NO：1序列100％同源，所述分离细菌选自：
所述SEQ ID NO：1序列描述如下：
在上述SEQ ID NO：1序列中，在SEQ ID NO：1序列的位置1036和1049处的符号“n”根据IUPAC(“国际纯粹与应用化学联合会”)指示四种核苷酸a、t、c或g的任意一种。而且，在位置1036处的核苷酸n选自核苷酸“a”、核苷酸“t”、核苷酸“g”和核苷酸“c”，以及与位置1036处的核苷酸相独立地，在位置1049处的核苷酸n选自核苷酸“a”、核苷酸“t”、核苷酸“g”和核苷酸“c”。
因此，本发明涉及包含SEQ ID NO：1的16S rDNA序列的分离细菌，所述分离细菌选自：
-以编号I-4467保藏登记在CNCM的细菌，和
-以编号I-4467保藏登记在CNCM的所述细菌的突变体。
本发明所述细菌为链霉菌属。
申请人已于2011年4月7日将根据本发明第一变化形式的细菌菌株以以编号I-4467保藏登记于巴斯德研究所国立微生物保藏中心(CNCM)(地址为25，rue du Docteur Roux，75724 Paris cedex 15)，其具有符合布达佩斯条约的国际保藏单位资格。因此，本发明的细菌以编号I-4467保藏登记在CNCM。
根据本发明第一变化形式，所述细菌为从任何天然环境分离、即从任何初始天然环境分离获得的细菌。从已存在细菌的初始天然环境分离细菌。
在第二变化形式中，本发明涉及根据第一变化形式的以编号I-4467保藏在CNCM的细菌的突变细菌、即通过根据本发明第一变化形式细菌的突变获得的细菌。本发明的突变细菌还包括与SEQ ID NO：1序列同源的16S rDNA序列。
用任何诱变方法处理根据本发明第一变化形式的细菌得到所述突变细菌，所述诱变方法尤其选自随机诱变方法和定点诱变方法。
进行随机诱变处理，其中用选自物理诱变剂-尤其将例如本发明细菌暴露于紫外线或电离辐射-和化学诱变剂的至少一种诱变剂处理根据本发明第一变化形式的细菌。
突变细菌具有与以编号I-4467保藏在CNCM的根据本发明第一变化形式的细菌不同的DNA序列。所述DNA序列差异可能影响不同于本发明细菌的16S rDNA序列的DNA序列。
有利地和根据本发明，所述分离细菌具有与SEQ ID NO：4同源的编码RNA聚合酶β亚基(polB)的DNA序列。因此所述分离细菌具有编码RNA聚合酶β亚基(polB)的SEQ ID NO：4序列。
有利地和根据本发明，所述分离细菌具有与SEQ ID NO：5同源的编码旋转酶(gyrB)的DNA序列。因此所述分离细菌具有编码旋转酶(gyrB)的SEQ ID NO：5序列。有利地和根据本发明，所述分离细菌具有与SEQ ID NO：6同源的编码重组酶(RecA)的DNA序列。因此所述分离细菌具有编码重组酶(RecA)的SEQ ID NO：6序列。
有利地和根据本发明，所述分离细菌具有与SEQ ID NO：7同源的编码色氨酸合酶β亚基(trpB)的DNA序列。因此所述分离细菌具有编码色氨酸合酶(trpB)的SEQ ID NO：7序列。
有利地和根据本发明，所述分离细菌具有与SEQ ID NO：8同源的编码ATP合酶β亚基(AtpB)的DNA序列。因此所述分离细菌具有编码ATP合酶β亚基(AtpB)的SEQ ID NO：8序列。
有利地和根据本发明，所述分离细菌具有SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8序列中的至少一个。有利地和根据本发明，所述分离细菌具有SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8序列的每一个。
有利地，本发明的细菌能够减缓至少一种微生物即靶微生物的生长，所述微生物选自藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、灰色葡萄孢、大刀镰孢、终极腐霉、Phaeomoniella chlamydospora、Phaeomoniella aelophilum、Eutypa lata、地中海嗜蓝孢孔菌和Botryosphaeria obtusa。
本发明的细菌特征在于如下全部或部分特征：
-其对人类来说是非病原性的(无害)；
-其为革兰氏阳性菌；
-其为腐生的，即能够降解土壤有机质。
本发明涵盖用根据本发明第一变化形式的细菌通过技术方法产生的且包括与SEQ ID NO：1序列100％同源的DNA序列任何细菌。将“技术方法”理解为任何细菌培养、细菌选择、分离、克隆和/或修饰-尤其通过诱变-修饰细菌遗传物质的方法。
本发明还涵盖包括本发明至少一种细菌的菌株。
根据本发明的菌株特征在于如下全部或部分特征：
-在ISP-2培养基或固体Bennett培养基上培养时，其具有菌丝体，即基质菌丝体，分支在固体培养基厚度上生长，颜色基于固体培养基组成从黄棕色变至灰褐色；
-在ISP-2培养基或固体Bennett培养基上培养时，具有气生菌丝体，气生菌丝体在气体/固体界面上生长，白色；
-具有的最佳生长温度在12℃-37℃、优选在28℃-30℃；
-具有的最佳生长pH值在6-8；
-能够使用D-葡萄糖、甘露醇、乳糖、蔗糖、麦芽糖和糊精作为碳源；
-其不能够优先使用半乳糖、肌醇、山梨糖、果糖、***糖、棉子糖、鼠李糖或纤维素作为唯一碳源；
-其能够使用氨基酸、硝酸盐和铵盐作为氮源；
-其能够将硝酸盐还原成亚硝酸盐、降解腺嘌呤、吐温20和乙酸钠；
-其不能水解淀粉和使用其水解产物。
本发明还旨在提供包括本发明细菌的组合物。因此本发明还旨在提供包括至少一种细菌的组合物，所述细菌包含与SEQ ID NO：1序列100％同源的DNA序列。本发明的组合物可具有或不具有本发明细菌之外的其它细菌。本发明的组合物包含至少一种以编号I-4467保藏在CNCM的菌株细菌和/或保藏在CNCM的所述菌株的、且包含与SEQ ID NO：1序列100％同源的DNA序列的突变细菌。
本发明的组合物可包括本发明的细菌，本发明的所述细菌可为活菌(即能够在合适的营养培养基上生长和繁殖)或死菌(即无活性细菌且不能生长和繁殖)。通过本领域技术人员已知的微生物灭活处理、尤其通过变性本发明细菌蛋白质的热处理(例如将本发明的细胞在15分钟加热到90℃的温度)得到所述死菌。
有利地，本发明的组合物包含包括与SEQ ID NO：1序列100％同源的DNA序列的核苷酸。
有利地，本发明的组合物可同时包括活菌和死菌。
有利地和根据本发明，所述组合物包括至少一种适于保存和培养其所包含的细菌的培养基。
本发明的组合物可为液态组合物，包括在液态培养基中的本发明细菌。有利地，液态培养基为水性培养基。
根据本发明第一变化形式的液态组合物特征在于如下全部或部分特征：
-液态组合物包括处于营养生长期的细菌，即呈现活性代谢和/或通过细胞***繁殖。因此其为处于营养生长阶段或稳定阶段的活菌；
-所述液态培养基为水性培养基，尤其选自包含本发明细菌生长所需的所有所有矿物元素和有机前体、更具体地为碳源、氮源、磷源、维生素和微量元素的完全培养基和丰富培养基；
-所述液态培养基包括D-葡萄糖、酵母提取物、磷酸氢二钾、硫酸铵、氯化钾和甘油。
可与前述变化形式组合的本发明第二变化形式的液态组合物特征在于如下全部或部分特征：
-液态组合物包括孢子形式的本发明细菌。在本发明的细菌-例如根据本发明第一变化形式的以编号I-4467保藏在CNCM的细菌、或根据本发明第二变化形式的以编号I-4467保藏在CNCM的所述细菌的突变体-形成在空气/固体界面上生长的初生菌丝体并开始气生时，观察到孢子形成。无分支气生菌丝或“菌丝体”自初生菌丝体开始生长并在其端部具有孢子前体分割结构。因此其为孢子形式的活菌；
-所述孢子包括与SEQ ID NO：1序列100％同源的DNA序列；
-所述孢子是平滑的且成“S”型螺旋链状，平滑孢子链具有平均10到50个孢子；
-液态培养基包括作为应激诱导物的D-葡萄糖、酵母提取物、蛋白胨、碳酸钙(CaCO3)。
通过在易于生成细菌应激的培养基、尤其是碳和/或氮和/或磷和/或维生素和/或微量元素有限或不足的液体培养基上培养本发明的细菌来促进获得本发明细菌的孢子，例如根据本发明第一变化形式的以编号I-4467保藏在CNCM的细菌或根据本发明第二变化形式的以编号I-4467保藏在CNCM的所述细菌的突变体。
有利地，所述孢子易于被安置在营养和再水化培养基中以形成处于营养期的本发明细菌的细菌群体。
本发明的液态组合物可包括处于营养期的本发明的细菌和孢子形式的本发明细菌。在任何情况下，本发明的营养形式和孢子具有与SEQ IDNO：1序列100％同源的16S rDNA序列。
本发明的组合物可为包括至少一种本发明细菌的固态组合物。
在第一种变化形式中，本发明的固态组合物包括至少一种本发明的细菌和固态培养基，尤其包含一定琼脂-琼脂比例的固态培养基(E406)。
在第二种变化形式中，本发明的固态组合物包括至少一种本发明的细菌，其在温度低于-20℃、特别是-80℃或在接近液氮温度的温度下的细菌保存培养基中。因此本发明涉及包含至少一种本发明细菌的保存培养基，尤其是包含甘油和/或聚乙二醇的保存培养基。
本发明还提供了一种无细胞组合物，通过如下方法可获得：
-在能够允许本发明细菌生长的培养基中接种和培养至少一种本发明的细菌，大于24小时且温度在12℃-37℃，然后；
-从培养基中提取细菌或使细菌失活，以形成无细胞组合物。
本发明还旨在提供包含至少一个多核苷酸的无细胞组合物，所述多核苷酸包括与SEQ ID NO：1序列100％同源的DNA序列。更具体地，所述无细胞组合物为能够使本发明细菌生长但基本不含所述细菌的培养基。所述无细胞组合物可具有或不具有包括与SEQ ID NO：1序列100％同源的序列的DNA。
通过在反相柱上进行的HPLC分析，在培养本发明菌株24小时后获得的本发明所述无细胞组合物可呈现多个峰(P24，i)，在下表1中列出峰的保留时间(ti)。
表1
P24，i ti(分钟)
P24，1 3.30-3.60
P24，2 3.90-4.0
P24，3 5.90-6.38
P24，4 10.1-10.20
P24，5 13.5-13.9
P24，6 21.4-21.7
通过在反相柱上进行的HPLC分析，在培养本发明菌株3天(72小时)后获得的本发明所述无细胞组合物可呈现多个峰(P72，i)，在下表2中列出峰的保留时间(ti)和表示为所述峰(P72，i)相对值的面积(A72，i)。
表2
P72，i ti(分钟) A72，i(％)
P72，1 3.93 3.45
P72，2 5.30 2.02
P72，3 6.59 5.05
P72，4 8.83 1.45
P72，5 9.63 3.13
P72，6 11.925 9.07
P72，7 12.39 1.92
P72，8 12.87 1.24
P72，9 13.76 1.82
P72，10 15.93 2.68
P72，11 16.27 2.07
P72，12 18.41 1.98
P72，13 19.38 3.15
P72，14 20.04 6.59
用HPLC分析通过利用乙酸乙酯提取本发明的菌株培养基得到的提取物，干燥所述乙酸乙酯溶液并在甲醇中溶解提取物。HPLC色谱法在尺寸25cm/4.6mm/5μm的XBridge柱(Waters，Guyancourt，France)上进行。用水中20％到95％的乙腈梯度、流速0.8mL/min进行洗脱。在254nm波长上实施检测。
有利地和根据本发明，无细胞组合物由细菌培养基形成且在尺寸25cm/4.6mm/5μm的XBridge色谱柱上用水中20％-95％的乙腈梯度以流速0.8mL/min获得的HPLC色谱具有在11.925min的保留时间处的第一主信号和在20.04min的保留时间处的第二主信号。
在上面提及的提取和分析条件下，有利地和根据本发明，在培养本发明菌株3天(72小时)后获得的无细胞组合物具有的HPLC色谱具有在11.925min的保留时间处的第一主信号(P72，6)和在20.04min的保留时间处的第二主信号(P72，14)。
在上面提及的分析条件下，有利地和根据本发明，在培养本发明菌株3天(72小时)后获得的无细胞组合物呈现的HPLC色谱在3.93min、5.30min、6.59min、8.83min、9.63min、12.39min、12.87min、13.76min、13.76min、15.93min、16.27min、18.41min和19.38min的保留时间处具有称为次要信号的信号。
本发明还旨在提供由具有如下HPLC色谱的细菌培养基形成的组合物，所述HPLC色谱具有在11.925min的保留时间处的第一主信号和在20.04min的保留时间处的第二主信号。有利地，所述HPLC色谱在3.93min、5.30min、6.59min、8.83min、9.63min、12.39min、12.87min、13.76min、13.76min、15.93min、16.27min、18.41min和19.38min的保留时间处具有称为次要信号的信号。
本发明人已经证实通过接触根据本发明至少一种细菌获得所述无细胞组合物，但其可至少基本无根据本发明的细菌和/或其可具有或不具有包括与SEQ ID NO：1序列100％同源的DNA序列，具有对培养植物生长的刺激作用，植物为向日葵、玉米、油菜、小麦和番茄且还在藤叶上呈现抗真菌活性-尤其针对灰色葡萄孢-。
本发明还涵盖通过在允许本发明细菌生长的培养基中培养本发明的至少一种细菌大于24小时的方法获得的无细胞组合物。
有利地和根据本发明，从培养基中去除所述细菌，以形成至少基本无细菌的无细胞组合物。
有利地和根据本发明，例如通过核酸酶处理无细胞组合物从无细胞组合物除去包含与SEQ ID NO：1序列100％同源的序列的DNA。
在变化形式中，有利地和根据本发明，不除去培养基中的细菌。
在变化形式中，有利地和根据本发明，不除去无细胞组合物中包含与SEQ ID NO：1序列100％同源的序列的DNA。
有利地，在培养基中并在足够允许它们生长的时间内、即在1-10天内、在12℃-37℃的温度、优选在28℃-30℃的温度、突变在30℃培养本发明的细菌，然后从培养基中提取细菌-例如通过离心培养基-或使细菌失活，以形成无细胞组合物。因此所述无细胞组合物为培养基，其不再包括本发明的所述细菌或其包括死菌，通过在培养基中在适于细菌生长的条件下接触和培养本发明的细菌获得。根据本发明的所述无细胞组合物呈现的性质、特别是抗真菌性质与本发明的细菌的性质特别是抗真菌性质如果不等同就是接近的。
本发明还涉及本发明的细菌或菌株或液态或固态组合物的应用，特别是在农业中。
本发明还涉及植物处理组合物在农业中的应用，所述组合物包含与SEQ ID NO：1序列100％同源的DNA序列。
更具体地，有利地和根据本发明，将植物与包含至少一种生物学物质的处理组合物接触，所述生物学物质选自：
-根据本发明的细菌；
-根据本发明的液态组合物；
-根据本发明的固态组合物；
-根据本发明的无细胞组合物。
本发明还涉及由上文或下文提及的全部或部分特征组合表征的细菌、细菌菌株、(液态或固态)细菌组合物和无细胞组合物。
附图说明
通过对如下的说明书、仅以非限性方式给出的示例和附图的阅读，本发明的其它目的、特征和优点将变得明显，其中：
-图1为藤叶对比照片(1a和1b)的再现，示出用本发明处理组合物针对处理灰色葡萄孢的保护/治疗作用；
-图2为Petri培养皿的照片再现，示出用本发明细菌对Phaeomoniella chlamydospora的生长抑制作用；
-图3为示意性示出本发明细菌溶解磷酸钙的照片再现；
-图4为示意性示出用本发明液态组合物处理葵花籽来刺激向日葵植株生长的照片再现；
-图5为示意性示出用本发明液态组合物处理玉米籽粒来刺激玉米植株生长的照片再现，和；
-图6a和6b为示意性示出用包含本发明细菌的液态组合物刺激油菜苗根生长的照片再现。
具体实施方式
从藤蔓根际样本和深根中分离根据本发明的细菌菌株。收集所述根际样本的深度在地面之下10cm和50cm之间，且除去收集样本的表层部分，然后在分离链霉菌菌株之前安置在无菌密封袋中并保存在+4℃。
所收集样本悬浮于蒸馏水中并将4g样本放置在36mL的水中以每分钟200转的速度磁性搅拌30分钟。接下来将所得悬浮液在50℃的温度下放置10min，然后在无菌蒸馏水稀释(×107)。将0.1mL所述稀释液涂布在添加有萘啶酸(10mg/L)或新生霉素(25mg/L)作为抗生素和/或抗真菌放线菌酮(40mg/L)的包含SEA(“Soil Extract Agar，土壤提取琼脂”)固态琼脂培养基的陪替氏培养皿中。接下来将陪替氏培养皿安放在30℃的保温箱中21天。
通过铺板分离放线菌菌株，用光学显微镜观察和确认其形态学特征。将分离和纯化的放线菌菌株转移到Bennett培养基上用于克隆。分离的菌落保持在4℃两个月，收集并悬浮在20％无菌甘油中，然后放置并保存在-20℃。
本发明细菌的16S rDNA测序
用本领域技术人员已知的方法分析细菌的16S rDNA序列。为此，在液态培养基中培养本发明的细菌，然后通过PCR(“聚合酶链反应”)提取其基因组DNA和选择性扩增16S rDNA序列，使用：
-如下SEQ ID NO：2序列的“27f”通用引物，
“agagtttgat cctggctcag”，和；
-如下SEQ ID NO：3序列的“1492r”通用引物，
“ggttaccttg ttacgactt”。
为此，在100mL液态ISP-2培养基(“ISP Medium 2，InternationalStreptomyces Project Yeast Malt Extract Agar”)中在30℃搅拌5天培养本发明的细菌。通过离心分离所得到的菌丝体和培养基，用双蒸水清洗菌丝体两次。在500μl的裂解缓冲液(Tris-HC 400mM，EDTA 60mM，NaC150mM，SDS 1％，pH 8.0)中、在室温下裂解菌丝体10min。接下来向裂解液中加入150μL通过混合60mL的5M醋酸钾、11.5mL冰醋酸和28.5蒸馏水并剧烈搅拌得到的溶液(pH 4.8)。将获得的裂解液在10000g离心1min。收集上清液，在新步骤中在10000g离心1min。收集上清液并加入等体积异丙醇。搅拌后，在10000g离心2min。用300μL的70％乙醇清洗沉淀的DNA，离心后在空气中干燥并溶解于50μL无菌双蒸水中。
用试剂盒(InVitrogen)和根据热廊线进行PCR(“Techne Touch GenePCR Thermal Cycler”)：
-在98℃变性3min；
-加入“Taq DNA聚合酶”；
-扩增30个循环，包括：
■在94℃加热1min的阶段，然后；
■在52℃加热1min的阶段，然后；
■在72℃加热2min的阶段，然后；
-在72℃延伸10min。
在凝胶电泳上分析且通过在紫外线照射下的溴化乙锭显市PCR产物。本发明细菌16S rDNA的SEQ ID NO：1序列与用“NCBI Blast”软件在基因组数据库中的参考序列的对比显示在基因组数据库中没有任何与SEQ ID NO：1序列具有超过99％同源性的序列。
实施例1-产生本发明的细菌
在20体积的丰富培养基中接种一体积的本发明以保藏号I-4467保藏在CNCM的细菌种菌。用于产生生物量的所述丰富培养基例如包括D-葡萄糖、酵母提取物、磷酸氢二钾(K2HPO4)、硫酸铵((NH4)2SO4)、氯化钾(KCl)和甘油pH7.2。在30℃下保持培养5天。
在变化形式中，可分离本发明的细菌和培养基，以形成至少基本无本发明细菌的本发明的无细胞组合物。
实施例2-产生本发明的孢子
在20体积产孢培养基中接种一体积的本发明细菌种菌。例如，液态产孢培养基包括D-葡萄糖、酵母提取物、蛋白胨、碳酸钙(CaCO3)和蒸馏水pH7.2。
在30℃保持培养6天。所得到的根据本发明的组合物包括根据本发明的孢子。接下来，可通过任何液体/固体分离方法、例如用离心或过滤分离主要为本发明孢子形式的细菌与培养基。
实施例3-针对病原体的保护
包含本发明细菌的液态组合物具有抑制一些细菌生长的能力，所述细菌例如藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌和疮痂病链霉菌。
在藤叶上预先施用本发明的孢子能够抑制稍后施用于藤叶的灰色葡萄孢真菌孢子萌发和其生长。所述施用还能够防止/去除由于灰色葡萄孢真菌而在预处理藤叶上出现症状(叶片上的褐色斑点和由图1b上的灰色图案(1)表示)。图1示出感染灰色葡萄孢的用本发明细菌孢子组合物预处理藤叶(图1a)和未预处理藤叶(图1b)的照片重现。图1a的叶片不呈现由于灰色葡萄孢的感染症状和因此用本发明细菌孢子针对灰色葡萄孢提供了保护作用。
实施例4-抑制靶微生物生长
通过圆筒法(Bauer等，1996)确定和量化对靶微生物生长的抑制活性，其中将保藏于CNCM的细菌菌株接种到固态琼脂Bennett培养基上并将所述接种培养基在30℃下放置5天，以形成固态处理组合物。制备固态处理组合物的圆筒形片段、例如直径为6mm的圆筒形片段，并将所述圆筒形片段安置在用靶微生物、例如植物病原体靶微生物接种的培养基表面。靶微生物的培养基可例如为用于植物病原真菌的PDA培养基(“Potato Dextrose Agar，马铃薯葡萄糖琼脂”)和用于植物病原细菌的Bennett培养基。将圆筒形片段在4℃在靶微生物接种的培养基表面保持4小时，以能够将根据本发明的细菌培养基的化合物分散在用靶微生物接种的培养基中。
将用靶微生物接种的培养基在30℃放置48小时，然后测量靶微生物生长抑制区域的直径。
根据本发明的细菌具有细菌和/或真菌生长抑制活性。本发明的细菌对于微生物生长的活性谱示于下表3中，其中符号(-)对应缺少抑制活性，符号(+)对应10mm-15mm的抑制直径，符号(++)对应15mm-20mm的抑制直径，符号(+++)对应大于20mm的抑制直径。
表3
靶微生物 抑制活性
Phaeomoniella chlamydospora +++
Phaeomoniella aelophilum +++
地中海嗜蓝孢孔菌 ++
Eutypa lata +++
Botryosphaeria obtusa ++
Botryosphaeria dothidea ++
灰色葡萄孢 ++
大丽花轮枝孢(Verticillium dahliae) +++
大刀镰孢 +++
终极腐霉 ++
藤黄微球菌 +++
枯草芽孢杆菌 +++
荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens) -
在所述情况下，本发明菌株对于菌株灰色葡萄孢菌丝体生长的抑制直径为28mm，对于菌株大刀镰孢菌丝体生长的抑制直径为30mm，以及对于菌株终极腐霉菌丝体生长的抑制直径为26mm。
本发明的细菌有利地具有抑制藤蔓植物病原体例如Phaeomoniellachlamydospora、Phaeomoniella aelophilum、Eutypa lata、地中海嗜蓝孢孔菌和Botryosphaeria obtusa的生长的能力。
从图2可见，相对由不同于本发明菌株的菌株保藏中心的菌株3、4和5对于病原体菌丝体8的生长抑制，由本发明菌株细菌2对选择的作为藤本植物病原体的Phaeomoniella chlamydospora真菌菌丝体8的生长有大距离的抑制。注意到菌株7和8不抑制病原体菌丝体8的生长。根据本发明的细菌能够限制细菌或真菌植物病原体的生长。
实施例5-受精
根据本发明的细菌促进培养基固体营养物质-尤其是磷-的溶解。发明人观察到(图3)，在通过磷酸钙粉遮掩的固态琼脂培养基(9)上，围绕本发明细菌菌落(2)的半透明晕圈(10)的形成表明磷酸钙被细菌溶解。根据本发明的细菌能够提高所述植株不可吸收的固态肥料产品-在植物根际-的溶解度并改善植株营养。
实施例6-向日葵和玉米的生长刺激
制备包括根据本发明细菌的营养细胞和孢子的根据本发明的液态组合物，通过层压在葵花籽和玉米籽粒上施用所述液态组合物。所述液态组合物包括1g-2g细菌每升组合物，细菌的质量为湿菌的质量。平行进行未用本发明组合物处理的向日葵(图4a)和玉米(图5c)的籽粒播种和植株培养作为对照。发明人还观察到，向日葵植株(图4b)和玉米植株(图5d)的初始生长刺激。施用于籽粒上的本发明细菌能够刺激植物如向日葵和玉米的生长，特别是植物地上部分的生长。
实施例7-油菜苗根系生长的刺激
通过在60体积水中悬浮保藏于CNCM菌株的一体积预培养物制备包括本发明细菌的营养细胞和孢子的液态组合物。预培养物为稳定生长期的且在每升预培养物包括为10g(湿重)细菌的培养物。通过混合和匀浆16.4g油菜籽和490μl液态组合物(即在30升液态组合物中1吨的籽)将本发明的液态组合物应用在所述籽上，以在油菜籽上形成本发明液态组合物的包膜。液态组合物包含1g-2g细菌每升组合物，细菌质量为湿菌质量。在“Pikaw”培养基上播种用本发明组合物包覆的油菜籽。在幼苗生长期的8天后，收集和称重用本发明组合物处理的籽粒得到的12颗苗的根部。用本发明组合物处理的籽粒得到的油菜苗根部质量为85mg，大于作为对照的用不包含本发明细菌的组合物处理的籽粒得到的12颗苗根部的质量(59mg)。图6a和6b分别示出处理和未处理的油菜苗照片重现，示出用本发明组合物处理的12颗油菜苗的根部与作为对照的用不包含本发明细菌的组合物处理的11颗油菜苗的根部相比提高的生长。包含保藏于CNCM的本发明细菌的液态组合物刺激油菜苗的发芽和生长。
序列表
SEQ ID NO：1
SEQ ID NO：2
agagtttgat cctggctcag 20
SEQ ID NO：3
ggttaccttg ttacgactt 19
SEQ ID NO：4
SEQ ID NO：5
SEQ ID NO：6
SEQ ID NO：7
SEQ ID NO：8
PCT/RO/134表

Claims (16)

1.一种包含称为16S rDNA的DNA序列的分离细菌，所述序列编码所述细菌的16S核糖体RNA，所述DNA序列与SEQ ID NO：1序列100％同源，所述分离细菌选自：
-以编号I-4467登记保藏在CNCM的细菌，和
-以编号I-4467登记保藏在CNCM的所述细菌的突变体。
2.根据权利要求1所述的细菌，其特征在于，所述细菌为链霉菌属(Streptomyces)。
3.根据权利要求1或2所述的细菌，其特征在于，所述细菌具有编码RNA聚合酶的β亚基(polB)、与SEQ ID NO：4同源的DNA序列。
4.根据权利要求1至3任一项所述的细菌，其特征在于，所述细菌具有编码旋转酶(gyrB)、与SEQ ID NO：5同源的DNA序列。
5.根据权利要求1至4任一项所述的细菌，其特征在于，所述细菌具有编码重组酶(RecA)、与SEQ ID NO：6同源的DNA序列。
6.根据权利要求1至5任一项所述的细菌，其特征在于，所述细菌具有编码色氨酸合酶的β亚基(trpB)、与SEQ ID NO：7同源的DNA序列。
7.根据权利要求1至6任一项所述的细菌，其特征在于，所述细菌具有编码ATP合酶的β亚基(AtpB)、与SEQ ID NO：8同源的DNA序列。
8.根据权利要求1至7任一项所述的细菌，其特征在于，所述细菌能够减缓至少一种称为靶微生物的微生物的生长，所述微生物选自灰色葡萄孢(Botrytis cinerae)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、终极腐霉(Pythium ultimum)、Phaeomoniella chlamydospora、Phaeomoniellaaelophilum、Eutypa lata、地中海嗜蓝孢孔菌(Fomitiporia mediterranea)和Botryosphaeria obtusa。
9.一种组合物，包括权利要求1至8任一项所述的至少一种细菌。
10.根据权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述组合物是在液态培养基中包含根据权利要求1至8任一项所述的细菌的液态组合物。
11.根据权利要求10所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含营养生长期的细菌。
12.根据权利要求9至11任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含孢子形式的细菌。
13.根据权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述组合物为固态的。
14.一种无细胞组合物，通过如下方法获得：
-在培养基中接种和培养根据权利要求1至8任一项所述的至少一种细菌，在大于24小时的时间内在12℃-37℃的温度下生长所述细菌，然后；
-从培养基中提取细菌或使细菌失活，以形成无细胞组合物。
15.根据权利要求14所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括至少一个多核苷酸，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1序列100％同源的DNA序列。
16.根据权利要求14或15所述的组合物，其由细菌培养基形成，其特征在于，所述组合物在尺寸25cm/4.6mm/5μm的XBridge色谱柱上用在水中20％到95％的乙腈梯度以流速0.8mL/min获得的HPLC色谱具有在11.925min的保留时间处的第一主信号和在20.04min的保留时间处的第二主信号。
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