CN105717028A - 粒子计数用微流控装置 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种粒子计数用微流控装置，用于实施自动粒子计数。所述微流控装置包含入口、微通道、出口、多条分支通道和检查通道。所述微通道具有多条环道。每条分支通道与至少两条邻接的环道相互连接。当流体中的粒子经过所述检查通道时所述粒子向所述微通道的内侧通道壁面迁移。所述检查通道包含阶梯形状的狭缝图案，用于对经过所述检查通道的所述粒子进行光学粒子计数。
Description
技术领域
本发明涉及用于实施自动粒子计数的微流控装置。微流控装置可以是蛛网螺旋(web-spiral)的微流控装置，根据尺寸来分离粒子并将微气泡捕获至分支通道中。
背景技术
作为实现个性化医疗的有前途的机制，床旁照护(Point-of-care)广泛地被全球健康保健共同体认可，能否成功实行床旁照护取决于能否得到低成本、易操作且精准的、适合床旁照护诊疗的医疗装备。特别是，在床旁照护的情况下，对于临床分析，重要的是用于分离、过滤或计数微粒子的装置。然而目前，床旁照护形式的医疗装置在高通量的方式下无法满足分离、过滤和计数的要求。
无膜分离技术如电泳、声波分离和离心法所需要的分析时间长，从而在样品体积大时不宜选择。这些技术还需要外加场(externalfield)，其有可能潜在性地损伤细胞和生物分子。
发明内容
本发明涉及快速粒子计数用的微流控装置。该微流控装置包含：入口、微通道、出口、多条分支通道和检查通道。该入口用于接收流体样品。该流体样品含有粒子，其包含多个第一粒子。该微通道具有多条环道。每条分支通道至少与两个邻接的环道相互连接。该出口用于输出流体样品。当该第一粒子通过该出口时，该第一粒子向该微通道的内侧通道壁面迁移。该检查通道用于接收来自该微通道的流体样品。该检查通道包含用于对穿过检查通道的第一粒子进行光学粒子计数的狭缝图案(slitpattern)。
本发明还涉及快速粒子计数的方法。该方法包含下述步骤：将流体样品以一定流量供给至微通道中，将该微通道配置成多条环道；将流体样品的微气泡捕获至多条分支通道中，每条分支通道与多条环道中的两条环道相互连接；当第一粒子离开该微通道并经过具有狭缝图案的检查通道时，根据流量和环道，将流体样品中的多个第一粒子引导至第一平衡位置；以及收集来自第一粒子的穿过狭缝图案传输的光学信号以对流体样品中的第一粒子计数。
本发明还涉及粒子检测用装置。该装置包括微通道、多条分支通道和检查通道。该微通道具有多条环道，以便流体连续不断地流过该微通道的环道。每条分支通道至少与两条环道相互连接。该检查通道具有狭缝图案，所述狭缝图案用于接收来自微通道的流体，并用于传输来自流体中的粒子的穿过狭缝图案的光学信号。
附图说明
图1表示蛛网螺旋微流控装置的一个例子。
图2示出因粘贴于通道壁上的微气泡所导致的细胞位置偏离的例子。
图3示出在分支通道捕获的微气泡的例子。
图4包含一系列图像，表示微气泡结构由于分支通道的存在而破坏，从而导致微气泡消失的过程。
图5表示对经过微通道的粒子作用的力。
图6表示在***分形成的狭缝图案。
图7表示通过光电检测器收集的轨道依赖性散射信号。
图8示出白细胞的累积强度(accumulativeintensity)的直方图。
图9表示使用蛛网螺旋微流控装置的快速粒子计数的流程图。
具体实施方式
在此，公开了一种实时诊断用的与蛛网螺旋微流控装置组合的光学编码微流控装置。该技术可广泛地用于体积大的流体样品中的细胞计数。例如，腹膜水(peritonealfluid)20mL中的加标白细胞样品(～10,000细胞)可以首先用蛛网螺旋装置用高通量的方式浓缩。可在多种范围内操作流量，如0.5～3mL/min、1～2mL/min、1～3mL/min、1.5～4mL/min、3～5mL/min、4～7mL/min、5～9mL/min或4～10mL/min。流量取决于粒子尺寸。粒子越大，要在更高的流量下到达它们的平衡位置。
蛛网螺旋装置能够通过改变升力与迪恩力(Deanforce)之间的平衡，使所关注的尺寸的细胞向内侧通道壁面引导。另一方面，与邻接的环道连接的分支通道能够有效地捕获微气泡。捕获微气泡提高细胞平衡位置的精准性。利用在接近出口的下游通道设置的光学编码技术来检查聚集的细胞。借助特殊的光学编码图案，所定制的运算法则可以提高信噪比，并使得分析的敏感度和精确性更佳。
蛛网螺旋微流控装置
参照附图，特别是图1，示出了基于至少一个实施方式的蛛网螺旋微流控装置。蛛网螺旋微流控装置100基于尺寸来分离微粒子，进而根据特定的范围内的尺寸来对微粒子进行计数。蛛网螺旋微流控装置100包括：用于接收流体样品的入口102、具有多条环道105A-105E的微通道104、多条分支通道110、出口106和***分120。微通道104和分支通道110可使用微细加工技术如光刻技术来形成于基板130(未图示)上。这样的装置可称为芯片实验室(LoC)***。微通道104和分支通道110可使用塑性材料(如聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、环状烯烃共聚物(COC)、丙烯腈丁二烯苯乙烯(PBS)、聚氯乙烯(PVC))或玻璃来形成。
在一个实施方式中，微流控装置由聚二甲基硅氧烷(PDMS)形成。就微通道而言，尺寸规格可为500μm宽、50μm高且约40cm长，使用软平版印刷方法来形成，所述软平版印刷方法使用50μm厚的SU-8光致抗蚀剂层作为模具或使用带有设计图案的经蚀刻的硅作为模具。在有些实施方式中，微通道的直径可为300μm至600μm、500μm至800μm、700μm至1000μm、900μm至1500μm、1400μm至1800μm或1600μm至2000μm。微通道的直径可取决于粒子尺寸。微通道的直径和形状以使特定尺寸范围的粒子在合理的时间范围内能够到达平衡位置的方式设计。***分的截面的尺寸规格为250μm宽、50μm高且200μm长。显影SU-8抗蚀剂后，将PDMS预聚物和固化剂以10:1的混合比浇注在SU-8模具上。将聚合物混合物在65℃固化4小时，并从模具剥离PDMS层。通过氧等离子体处理，将PDMS层与玻璃片结合，以完成微流控装置。
将***分120与微通道104接合，以使样品流体可流过微通道104到达***分120。在有些实施方式中，***分120是从微通道104延伸出的检查通道。在***分的玻璃片(glassslide)上，狭缝图案125通过沉积不透明的材料如Ti/Au的金属膜或进行黑色印刷来形成。为了对细胞计数，激光源通过具有狭缝图案的玻璃片传播，以确定在微通道内的细胞。流动细胞的前向散射信号通过置于与光束呈约0.5～5度、2～5度、3～6度、5～9度、8～13度、0.5～15度的Si光二极管进行检测。光学编码技术对持有移动的细胞的空间位置和速度信息的前向散射信号进行编码。借助数字信号处理，能够显著地提高信号的信噪比。
在有些实施方式中，狭缝图案125的位置是可调节的。粒子的平衡位置可根据待检测的粒子的平均尺寸而不同。可基于粒子平衡位置沿着检查区来调节狭缝图案125。
设置入口102以接收含有不同尺寸的粒子的样品流体。例如，样品流体可为含有生物粒子(例如白细胞)和其他粒子的腹膜水。白细胞的直径可为6μm～30μm。入口102可以与例如注射筒那样的其他装置的端口连接以接收样品流体并使其进入微通道104，进而基于尺寸来分离粒子。在所描述的实施方式中，蛛网螺旋微流控装置100仅具有一个入口102和一个出口106。在其他实施方式中，蛛网螺旋微流控装置可具有多个入口和/或多个出口。
将微通道104配置成多条环道105A-105E。微通道104的截面可呈长方形，具有两个水平向壁面和两个垂直向壁面。入口102和出口106位于微通道104的相对的两端。***分120位于微通道104与出口106之间。设置***分以在粒子从微通道104流出并即将到达出口106时，对粒子进行检测和计数。
蛛网螺旋微流控装置100的尺寸规格和参数有助于实现在多个粒子尺寸之间进行分离。较小的粒子由于迪恩力而在样品流体内颠倒(transpose)。较大的粒子由于惯性升力和迪恩曳力(Deandragforce)之间的平衡而到达接近内侧壁面的平衡位置。当在微通道104的环道中分离不同尺寸的粒子时，基于粒子尺寸形成不同的粒子流并且可基于它们的位置来进行控制或分析。
分支通道110可捕获可能在用户操作装置时导入的微气泡。微气泡通常是软的，并且容易粘贴于通道壁面上。微气泡在粘贴于壁面上时，难以除掉，并且这些微气泡根据微气泡尺寸而改变流线。流线的改变会导致细胞位置从平衡位置偏离。结果，通道下游的检查区无法检测出适当的尺寸的细胞。图2中，将用高速摄像机在入口附近的区域记录的图像叠加，示出因粘贴于通道壁面上的微气泡所导致的细胞位置偏离的例子。微气泡的存在对下游的细胞的平衡位置带来影响。据此，分支通道110捕获微气泡以避免粒子的位置从平衡位置偏离。分支通道具有各种不同的形状如直线形状、曲线形状、锯齿形状或其他形状。分支通道的尺寸规格也可以不同。例如，分支通道末端的直径可小于分支通道的中心的直径。
在一个实施方式中，分支通道110的截面的直径可为10μm甚至小于10μm。直径以下述方式选择：流动阻抗足够大以避免大量的样品流体流过分支通道110。微气泡的直径可为6～50μm，但微气泡体积在液压下可压缩。据此，分支通道的直径仍然大至足以捕获微气泡。图3中，直径为25μm的微气泡被分支通道110捕获，没有到达下游的壁面。这是证明上游分支通道有助于捕获微气泡，并能够使惯性升力和迪恩曳力这两种液压力的功效发挥的证据。
在有些其他的实施方式中，当微气泡的尺寸规格为至少比分支通道直径大10倍时，分支通道可用于损坏微气泡结构。例如，图4包含一系列的快照，示出在蛛网螺旋装置中流动的微气泡。微气泡直径为约180μm，被第一位置上的分支通道捕获。在短期间内，微气泡贯穿分支通道并分成两个以上的微气泡。通过分割而生成的更小的微气泡容易被流体流冲去。在没有分支通道的情况下，微气泡会粘附在侧壁面上并对细胞的平衡位置产生影响。
在有些实施方式中，蛛网螺旋微流控装置100可进一步包括光电检测器，用于收集来自流体的粒子的穿过狭缝图案传输的光学信号。光电检测器具有适合经过检查通道的粒子的频率的带宽。
虽然所描述的实施方式包含具有多条环道的螺旋微通道，但在有些其他实施方式中，微通道可具有其他形状，并可具有带有各种不同的设计的部分。分支通道与微通道的不同的部分相互连接以捕获微气泡。
粒子平衡
在此，关于图5，其表示对流过微通道104的粒子作用的力。流过微通道104的样品流体由于环道105A-105E而承受径向向外的离心加速度。通过离心加速度，形成两个反向旋转的迪恩漩涡(Deanvortices)510、512。漩涡510在通道的上半部，而漩涡512在通道的下半部。
迪恩漩涡中的流动取决于流体介质的密度、平均流体速度、流体粘度、微通道104的路径曲率半径。曲率越高，迪恩漩涡510和512中的迪恩流(Deanflow)越多。由于通过迪恩漩涡而导入的流动，样品流体中的粒子承受迪恩力，FD。根据尺寸，粒子沿迪恩漩涡循环并向内侧通道壁面520或外侧通道壁面522移动。
在微通道104中，粒子还承受压力和的惯性升力。由剪切力和壁面引起的惯性升力FL对粒子作用，并且引导粒子远离微通道104的中心。当粒子接近微通道壁面时，因壁面导致的惯性升力起主导作用。当粒子接近微通道的中心时，因剪切导致的惯性升力起主导作用。据此，粒子倾向于占据相反方向的升力取得平衡的平衡位置。
如图5所示，图5的粒子倾向于在迪恩漩涡510和512这两者中的一方中移动。由于迪恩力FD，在微通道104的顶部和底部的壁面附近流动的粒子承受横向运动。顶部壁面附近的粒子被推向内侧壁面520；而底部壁面附近的粒子被推向外侧壁面522。外侧壁面522附近的粒子沿相同的方向承受升力FL和迪恩力FD，因而无论粒子尺寸如何，都随着迪恩漩涡510或512继续流动。
内侧壁面520附近的粒子承受朝相反的方向作用的升力FL和迪恩曳力FD。根据粒子的尺寸(这样不同数量级的FL和FD)，粒子要么在接近内侧壁面520的位置取得平衡并形成稳定流，要么继续在迪恩漩涡中再次循环。与尺寸相关的迪恩力和惯性升力用于实现特定尺寸范围内粒子的稳定流。在该尺寸范围外的其他粒子继续在迪恩漩涡中循环。通过细心选择微通道104的几何图形，装置可使特定尺寸的粒子或细胞占据内侧壁面520附近的平衡位置。据此，该尺寸的粒子的流动从其他粒子分离，从而能够用于进一步的分析如粒子计数。
粒子检测和计数
一旦特定尺寸范围的粒子到达平衡位置，蛛网螺旋微流控装置100能够在***分120对粒子进行检测和计数。图6表示在***分120形成的狭缝图案615。狭缝图案615可通过例如沉积Ti/Au(100nm/200nm)金属层使用电子束蒸镀或溅射沉积以及金属玻璃处理来形成于玻璃片上。
激光源通过带有图案的玻璃片传播以检测通道内的细胞。所流动的细胞的前向散射信号通过Si光二极管进行检测。光学编码技术对持有移动细胞的空间位置和速度信息的前向散射信号进行编码。
如图6所示，狭缝图案具有阶梯形状的两个缝隙601和602。为了快速地有效地对细胞或粒子计数，这两个阶梯形状的狭缝图案持有各种不同的优势。在一个实施方式中，阶梯形状的缝隙601和602的较长一端的宽度为100μm，较短的一端的宽度为50μm。阶梯形状的缝隙601和602设有约25～50μm的间隔以形成如图6所示的检查图案。短的检查区宽度，使由同时在检查区内流动的两个以上的邻接的粒子引起的重叠的发生最小化。
此外，由于所聚集的粒子轨道的分离幅度大，阶梯形状的缝隙给予双重(Binary)输出。例如，来自第一缝隙的峰信号与来自第二缝隙的峰信号的宽度比可为0.5或2。该比例实现单纯的运算法则，其妥善地解决细胞数的计数并防止产生不清楚的结果。图7表示通过光电检测器收集的路径依赖性散射信号。不同的波形基线长度分别指不同的轨道，其能够用于分辨细胞的轨道信息。图8示出数字信号处理后的白细胞的累积强度的直方图。累积强度的分布窄，表示通过本发明，借助迪恩力和升力，在特定尺寸区的细胞大部分向检查区的内侧通道壁面迁移。本发明进而实现高通量以解决大体积样品的细胞计数。
缝隙宽度取决于待检测的粒子的尺寸。就狭缝图案615中各个可传输光的部分，即，阶梯形状的缝隙601和602而言，其宽度如下决定：在检查区内移动的细胞或粒子的频率fcs在光电检测器Bpho的带宽内。将fcs定义为fcs＝Vcell/Lsens,其中，Vcell为细胞或粒子的移动速度，Lsens为狭缝图案(即，缝隙)的可传输光的部分的宽度。
用于粒子计数的方法例示
图9表示使用微流控装置进行快速粒子计数的流程图。处理过程900由步骤910开始，其中，以一定流量将流体样品供应至微通道中。将微通道配置成多条环道。
在步骤920，处理过程中将流体样品的微气泡捕获至多条分支通道中，以使至少有些微气泡无法到达出口。每条分支通道与该多条环道中的两条环道相互连接。
在步骤930，当第一粒子离开微通道并经过具有狭缝图案的检查通道时，该处理过程中根据流量和环道将流体样品中的多个第一粒子引导至第一平衡位置。设置狭缝图案的位置以使来自在第一平衡位置的第一粒子的光学信号能够通过。流体样品可进一步包含多个第二粒子，其平均直径可以小于多个第一粒子的平均直径。将微气泡捕获至分支通道中以免在第一粒子经过检查通道时因微气泡而导致第一粒子大幅度地从第一平衡位置偏离。
在步骤940，该处理过程中承受升力和迪恩力的平衡，以在第二粒子经过检查区时将第二粒子引导至与第一平衡位置不同的第二平衡位置。
在步骤950，该处理过程中使用光源照亮流体样品中的第一粒子。在步骤960，为了计入流体样品的第一粒子，该处理过程中收集来自第一粒子的穿过狭缝图案传输的光学信号。在步骤970，基于所收集的光学信号，该处理过程中利用光学编码方式对流体样品中的第一粒子进行计数。
本领域技术人员将认识到，对在图9中表示并在上述中所描述的方案可进行各种方式的更改。例如，可重新安排方案的顺序，可平行地进行次步骤，可包含其他方案等。
在此，本发明、以及制作和使用本发明的方法和程序，以这样全面、清楚、简明且准确的方式描述，以使任何有关领域的技术人员能够制作相同或使用相同的技术。应理解的是，在前描述的是本发明的优选实施方式，并且其中在不脱离权利要求中所陈列的本发明的范围的情况下，可以进行改变。为了特别指出并明确地要求保护被视为本发明的主体，以上述权利要求为本说明书的结论。
Claims (20)
1.一种快速粒子计数用微流控装置，包含：
用于接收流体样品的入口，其中，流体样品包含多个第一粒子；
具有多条环道的微通道，使所述流体样品从所述入口移动至所述微通道的所述环道；
多条分支通道，每条分支通道至少与所述多条环道中两条邻接的环道相互连接；以及
检查通道，所述检查通道包含狭缝图案，所述狭缝图案用于对来自微通道且经过检查通道的所述第一粒子进行光学粒子计数；其中，当第一粒子进入检查通道时，所述第一粒子向检查通道的内侧通道壁面迁移并对其进行光学计数。
2.如权利要求1所述的微流控装置，其中，所述流体样品进一步包含微气泡，并且分支通道捕获一些微气泡，并使到达检查通道的微气泡数减少。
3.如权利要求1所述的微流控装置，其中，所述分支通道捕获流体样品的微气泡以便在所述第一粒子经过所述检查通道时所述第一粒子到达接近内侧通道壁面的第一平衡位置。
4.如权利要求4所述的微流控装置，其中，所述流体样品进一步包含多个第二粒子，并且在第二粒子经过检查通道时第二粒子到达与所述第一平衡位置不同的第二平衡位置。
5.如权利要求5所述的微流控装置，其中，所述第一粒子的平均直径大于所述第二粒子的平均直径。
6.如权利要求1所述的微流控装置，其中，所述微通道的所述环道引起对流体样品中的粒子作用的升力和迪恩力，并且，由于所述升力和所述迪恩力的平衡，从而当所述第一粒子经过检查通道时第一粒子到达接近内侧通道壁面的第一平衡位置。
7.如权利要求1所述的微流控装置，进一步包含：
照亮流体样品中的粒子的光源；
光电检测器，收集来自所述流体样品中的所述粒子且穿过狭缝图案传输的光学信号；以及
用于输出所述流体样品的出口。
8.如权利要求1所述的微流控装置，其中，所述流体样品进一步包含微气泡，并且所述分支通道将有些所述微气泡分成更小的微气泡。
9.一种方法，是使用权利要求1所述的微流控装置来进行粒子计数的方法，包含：
将包含多个第一粒子的流体样品以一定流量供应至具有多条环道的微通道中；
将流体样品的微气泡捕获至微流控装置的分支通道中，每条分支通道与多条环道中的两条环道相互连接；
使所述第一粒子经过与所述微通道结合的检查通道，所述检查通道具有狭缝图案；
根据流量和所述环道的尺寸规格，将所述第一粒子引导至第一平衡位置；以及
收集来自所述第一粒子且穿过狭缝图案传输的光学信号以对所述流体样品中的所述第一粒子进行计数。
10.如权利要求9所述的方法，其中，捕获步骤包含：
将微气泡捕获至分支通道中以使至少有些微气泡无法到达检查通道。
11.如权利要求9所述的方法，其中，捕获步骤包含：
将微气泡捕获至分支通道中以免在第一粒子经过检查通道时，微气泡使所述第一粒子大幅度地从第一平衡位置偏离。
12.如权利要求9所述的方法，其中，所述流体样品进一步包含多个第二粒子，其平均直径小于所述多个第一粒子的平均直径，并且通过升力与迪恩力的平衡将所述第二粒子引导至与第一平衡位置不同的第二平衡位置。
13.如权利要求9所述的方法，其中，设置所述狭缝图案的位置以使来自在所述第一平衡位置的所述第一粒子的光学信号能够穿过。
14.如权利要求9所述的方法，进一步包含：
使用光源来照亮所述流体样品中的所述第一粒子；以及
基于所收集的光学信号，利用光学编码方式对所述流体样品中的所述第一粒子进行计数。
15.如权利要求9所述的方法，其中，所述流量在0.5mL/min至10mL/min之间，并且取决于所述第一粒子的平均尺寸。
16.一种粒子检测装置，包含：
微通道，其具有多条环道，用于使流体连续不断地流过所述微通道的所述环道；
多条分支通道，每条分支通道至少与所述多条环道中两条环道相互连接；以及
具有狭缝图案的检查通道，用于接收来自微通道的流体并用于传输来自流体中的粒子的穿过狭缝图案的光学信号。
17.如权利要求16所述的装置，其中，所述分支通道从流体中捕获微气泡以免在所述粒子经过检查通道时所述微气泡使所述流体中的所述粒子大幅度地从平衡位置偏离。
18.如权利要求16所述的装置，其中，所述狭缝图案为阶梯形状的图案，包含多个光传输缝隙，所述光传输缝隙具有长度以减少由于邻接的粒子同时经过所述检查通道而导致的重叠的产生，并且，所述阶梯形状的图案对所收集光学信号生成双重输出。
19.如权利要求16所述的装置，进一步包含：
光电检测器，用于收集来自流体粒子的穿过狭缝图案传输的所述光学信号；
其中，所述光电检测器具有带宽，所述带宽适合于经过所述检查通道的粒子的频率，并且经过所述检查通道的粒子的频率取决于所述粒子的移动速度和所述检查通道的长度。
20.如权利要求16所述的装置，其中，所述微通道的平均内直径为300微米至2000微米。
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