CN105713104A - 一种硒化葫芦巴多糖的合成及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种合成硒化葫芦巴多糖的方法，包括：葫芦巴多糖甲酰胺溶液的制备；离子液体的制备；离子液体对***的活化；硒化葫芦巴多糖的合成。本发明采用离子液体活化***，制备高活性硒化试剂，在温和条件下高效合成了具有生物活性的硒化葫芦巴多糖，硒含量达27554?29773 μg/g，所用试剂环保、制备简单，无需使用有毒的含硒中间体，无废液排放，有效缩短了反应所需时间，拓展了葫芦巴多糖作为天然活性物质的应用范围。活性试验表明，本发明合成的硒化葫芦巴多糖对HepG2肝癌细胞具有显著的体外抑制作用。

Description

一种硒化葫芦巴多糖的合成及其应用

技术领域

本发明属生物高分子及化学合成技术领域，涉及一种硒化葫芦巴多糖的合成方法；本发明同时还涉及硒化葫芦巴多糖的医药用途——作为HepG2肝癌细胞的抑制剂应用于制备抗癌药物中。

背景技术

硒（Se）是人体必不可少的微量元素，在生命免疫机能的提高、抗癌、抗氧化、防止营养性肝坏死等诸多方面发挥着重要作用。在生物代谢中，硒也是谷胱甘肽过氧化物酶的活性成分，因此，硒对人体的作用极为重要。但是，硒元素在地球分布不均匀，在中国大约有五分之三的地区缺硒，而普通食品中硒含量都是极低的，一般达不到补充硒的效果。在自然界，硒的存在形式主要包括无机硒和有机硒两种。与无机硒相比，有机硒是更安全、活性更高的含硒物质，在激发免疫反应上比无机硒更加显著。有机硒的主要来源是天然富硒生物和人工合成，在众多富含有机硒物质中，硒多糖受到了极大关注。硒多糖作为一种有机硒化合物，拥有硒与多糖二者的活性。硒多糖的生物活性普遍高于多糖和硒，毒性更小，且硒化后的多糖更易于被有机体吸收和利用。

硒多糖的制备方法包括天然含硒植物多糖，微生物富集培养代谢硒多糖和人工合成硒多糖。人工合成硒多糖是比较方便且可控的方法，目前国内外文献和专利主要采用以下三种方法制备硒多糖：温和条件下使用单体硒、***或***钠对多糖进行硒化修饰；利用化学性质活泼，具有酰氯结构的中间体作为硒化试剂进行修饰；将含硒的功能基因接枝到多糖分子上。梁淑轩等采用冰醋酸催化下硒酸钠与枸杞多糖反应，所得硒化枸杞多糖硒含量在606-3762μg/g（食品研究与开发，2011，3，160-164）；李志洲等利用化学合成法，以猪苓多糖和***钠为原料制备猪苓硒多糖，采用连续或超声波辅助化学合成工艺（食品与机械，2013，1，31-35，未报道硒含量）。专利CN1560088A公开了一种了硒化葡甘聚糖的制备方法，将硒单质在氧化剂作用下氧化成Se⁶⁺，在Se⁶⁺离子的水溶液中加入乙醇和盐酸，得到硒化反应液，将硒化反应液与葡甘聚糖进行反应，制成硒化葡甘聚糖，所得硒化葡甘聚糖硒含量比较低，为125.4-197.3μg/g，且衍生物中硒为Se⁶⁺；专利ZL88103347公开了一种硒化卡拉胶的制法，以硒粉为原料，用硝酸将其溶解制备成硒液，加入Kappa-角叉菜胶溶液进行硒化反应，但该方法所得产物硒含量较低（2500-15000ppm），且副产物硒化氢有毒。专利CN102653566A公开了一种有机法制备硒化黄芪多糖的方法，该方法将黄芪多糖粗品在酶降解作用下合成纯品黄芪多糖，再与氯化亚硒酰反应，得硒化的黄芪多糖含硒量为14305-24864μg/g，但该方法硒化时间长（12-48h），反应物氯化亚硒酰不易制备，毒性大，不适合大规模的工业化生产。专利ZL200910162003.4公开了一种有机法制备硒化沙蒿多糖或蕨麻多糖的方法，将蕨麻多糖或沙蒿多糖与亚硒酰氯反应得硒化的沙蒿多糖或蕨麻多糖，硒含量12000-26000μg/g。但该方法使用的亚硒酰氯合成困难且亚硒酰氯具有毒性，反应过程中，加入亚硒酰氯时暴露在空气中，亚硒酰氯会被氧化，得到的亚硒酰氯中可能含有硒酰氯等杂质。

以上专利和文献中提到的多糖硒化修饰技术普遍存在含硒中间体制备复杂且毒性大、反应时间长、硒化多糖硒含量和收率低、副反应多、生物学效应不明等缺点。离子液体以其热稳定性好、效率高、环境友好且可回收重复利用等优点而广泛应用在各类有机合成反应中。通过查阅国内外文献及专利，均未报道以葫芦巴多糖为原料，离子液体作为催化剂合成高硒含量硒化葫芦巴多糖的方法及应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种硒化葫芦巴多糖的合成方法。

本发明的另一目的在于提供一种硒化葫芦巴多糖作为HepG2肝癌细胞的抑制剂用于制备抗癌药物。

一、硒化葫芦巴多糖的合成

1.葫芦巴多糖甲酰胺溶液的制备：

将葫芦巴多糖在60℃~80℃下300~500rpm的转速下搅拌2~5h溶解于甲酰胺中，得葫芦巴多糖的甲酰胺溶液。

上述葫芦巴多糖的重均分子量为2.303×10⁶Da，总糖含量为87.2%。葫芦巴多糖与甲酰胺的质量体积比为2.5~4mg/mL。

2.离子液体的制备

将浓硫酸在-10℃~0℃下以50~80滴/min的速度滴加到N-甲基吡咯烷酮中，300~800rpm搅拌反应10~18h，反应完毕后室温下用乙酸乙酯洗涤2~3遍，收集下层粘稠液体，真空干燥得离子液体。

其中：N-甲基吡咯烷酮与浓硫酸的体积比为2:1~2.5:1，乙酸乙酯和离子液体的体积比为0.5:1~1:1，真空干燥条件为真空度0.06~0.08MPa，干燥温度50~70℃，时间6~12h。

3.离子液体对***的活化

在60~80℃和N₂保护的条件下，将***加入到上述离子液体中反应1~3h得活化后的***。

上述***和离子液体的质量体积比为0.125~0.2g/mL。

4.硒化葫芦巴多糖的合成

将葫芦巴多糖的甲酰胺溶液用滴液漏斗以30~60滴/min的速度滴加到离子液体活化好的***中，在60~80℃和N₂保护的条件下反应2~4h，待反应完毕后在隔绝空气的条件下加入丙酮洗涤10~15次，将沉淀物装入截留分子量8000~14000Da的透析袋中流水透析24~48h，去离子水透析12~24h，透析完毕后袋内物减压浓缩至原体积的1/20~1/30，在浓缩液中加入无水乙醇（乙醇含量占总体积的70~80%）沉淀，离心收集下层沉淀物，冷冻干燥，得硒化葫芦巴多糖。

其中：葫芦巴多糖的甲酰胺溶液和活化的***的体积比为10~25，搅拌条件为300~800rpm，丙酮和反应液的体积比为2~3（v/v），减压浓缩温度为55~65℃、真空度0.06~0.08MPa，离心转速为4000~5000rpm/min、离心时间10~15min，冷冻干燥条件为温度-60~-50℃，真空度5~20Pa，干燥时间24~48h。

二、硒化葫芦巴多糖体外对HepG2肝癌细胞的抑制作用

取对数生长期的HepG-2细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，并用含15%新生牛血清的DMEM培养基制成浓度3×10⁵个/mL的单细胞悬液，不断摇动细胞悬液使细胞数均匀，以0.2ml/孔接种于96孔培养板（板边缘封无菌水，空白组加3孔不含细胞的培养基），置CO₂培养箱内在37℃、饱和湿度、5%CO₂条件下培养。

培养24h后细胞贴壁，换含药培养基，每孔加190μL培养基和10μL样品液（空白组和对照组加10μlPBS液），药物终浓度为20，50，100，200，500，1000，5000μg/mL，每浓度重复6孔，并设不加样品的对照组和空白调零组。置CO₂培养箱内，在37℃、饱和湿度、5%CO₂条件下培养。

样品处理48h后，每孔加入MTT溶液20μL，37℃下继续培养4h。小心弃去孔内上清液，并加入150μLDMSO，振荡10min，使紫色结晶完全溶解。用酶标仪在490nm处测吸光值，对照组以空白组调零，并按下列公式计算抑制率，并根据不同浓度样品的抑制率计算半数抑制浓度（IC₅₀）：

抑制率（%）=（1-实验组平均OD值/对照组平均OD值）×100%

对HepG2肝癌细胞的IC₅₀为527.4~1230.8μg/mL，具有显著的体外抑制HepG2细胞的作用，可作为HepG2肝癌细胞的抑制剂，用于开发抗癌药物。

本发明的有益效果：

1、本发明以葫芦巴多糖为原料，采用离子液体催化***合成硒化葫芦巴多糖，离子液体无毒、环保、制备简单，无需使用有毒的含硒中间体，无废液排放，有效缩短了反应所需时间，在温和的条件下得到高硒含量的硒化多糖。

2、制备了具有显著的体外抑制HepG2细胞活性的硒化葫芦巴多糖，拓展了葫芦巴多糖作为天然活性物质的应用范围；

3、本发明制备的硒化葫芦巴多糖的硒含量可以通过反应条件调节优化，以满足不同领域要求；

4、本发明不需要特殊设备，简单可控，成本低，适合推广应用。

附图说明

图1葫芦巴多糖及其硒化葫芦巴多糖的红外光谱图。

图2葫芦巴多糖及硒化葫芦巴多糖的X射线光电子能谱（XPS）图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明硒化葫芦巴多糖的合成方法作进一步的说明。

实施例1

（1）葫芦巴多糖甲酰胺溶液的制备：将200mg葫芦巴多糖在70℃下以500rpm的转速下搅拌2h溶解于60mL甲酰胺中，得葫芦巴多糖的甲酰胺溶液。

（2）离子液体的制备：将5mL浓硫酸在-10℃下以60滴/min的速度滴加到10mL的N-甲基吡咯烷酮中，800rpm搅拌反应12h，反应完毕后室温下用15mL乙酸乙酯洗涤2遍，收集下层粘稠液体，在真空度0.07MPa、60℃下真空干燥6h得离子液体。

（3）离子液体对***的活化：在80℃和N₂保护的条件下，将0.6g***加入到4mL离子液体中反应3h得活化后的***。

（4）硒化葫芦巴多糖的合成：将60mL葫芦巴多糖的甲酰胺溶液用滴液漏斗以40滴/min的速度滴加到4mL离子液体活化好的***中，在70℃和N₂保护的条件下反应4h，待反应完毕后在隔绝空气的条件下加入128mL丙酮，室温下洗涤10次，将沉淀物装入截留分子量8000~14000Da的透析袋中流水透析24h，去离子水透析18h，透析完毕后袋内物在0.08MPa、60℃下减压浓缩至原体积的1/30，在浓缩液中加入无水乙醇（乙醇含量占总体积的70%）沉淀，5000rpm下离心10min收集下层沉淀物，在5Pa、-55℃下冷冻干燥36h，得硒化葫芦巴多糖。

该硒化葫芦巴多糖为暗红色无定形粉末，总糖含量80.3%，在水中溶解度为18.5mg/mL（25℃），硒含量为28128μg/g，分子量为2.376×10⁶Da，对HepG2肝癌细胞的体外IC₅₀值为591.1μg/mL。

下面通过硒含量测定、红外光谱图、X射线光电子能谱分析（XPS）、分子量测定对本实施例1合成的硒化葫芦巴多糖的结构、活性进行分析，并作以说明：

1.硒含量的测定：采用荧光光度法对样品进行硒含量测定。

称取干燥的待测样品，加入混酸（HNO₃:H₂SO₄:HClO₄=1:1:4），静止过夜后在135℃中消解1～2小时，将消解液用蒸馏水稀释定容，取10mL加入0.2mol/L的EDTA-2Na溶液和0.5mol/L的盐酸羟胺各2～4mL，振荡均匀后静置5～10min，暗处加入0.1%的2,3-二氨基萘溶液2～4mL，沸水浴4～6min，取出冷却至室温后，加入环己烷5mL，充分振荡萃取，取环己烷层在荧光分光度计中测定荧光值（激发波长376nm，发射波长520nm），用工作曲线法计算硒含量。

2.红外光谱图分析

图1为葫芦巴多糖和本发明制备的硒化葫芦巴多糖的红外光谱图。图中葫芦巴多糖的红外光谱显示其具有多糖的特征峰：3400cm^-1左右极宽强的吸收峰为多糖羟基的O-H伸缩振动，2922.22cm^-1处为C-H键的伸缩振动。通过和葫芦巴多糖的红外光谱对比，可以看出硒化葫芦巴多糖除了多糖母体特征吸收峰外，在1149cm^-1处和669cm^-1处出现新的吸收峰，分别为Se=O的伸缩振动和C-O-Se的弯曲振动，说明葫芦巴多糖结构中的部分-OH被***基取代，已被硒化。

3.XPS分析

图2是葫芦巴多糖和硒化葫芦巴多糖的XPS谱。葫芦巴多糖的Se3d谱中没有任何峰，而硒化葫芦巴多糖在58.1eV出现了很强的Se3d结合能峰，Se的价态为Se⁴⁺，说明葫芦巴多糖已被硒化，硒化葫芦巴多糖中的硒以***酯的形式出现。

4.分子量测定

采用凝胶色谱-动静态光散射联用测定，本发明中制备的硒化葫芦巴多糖的重均分子量为1.533×10⁶Da~2.616×10⁶Da。

实施例2

（1）葫芦巴多糖甲酰胺溶液的制备：将250mg葫芦巴多糖在80℃下以300rpm的转速下搅拌4h溶解于100mL甲酰胺中，得葫芦巴多糖的甲酰胺溶液。

（2）离子液体的制备：将4mL浓硫酸在0℃下以50滴/min的速度滴加到10mL的N-甲基吡咯烷酮中，600rpm搅拌反应18h，反应完毕后室温下用7mL乙酸乙酯洗涤3遍，收集下层粘稠液体，在真空度0.06MPa、70℃下真空干燥8h得离子液体。

（3）离子液体对***的活化：在60℃和N₂保护的条件下，将0.8g***加入到4mL离子液体中反应2h得活化后的***。

（4）硒化葫芦巴多糖的合成：将100mL葫芦巴多糖的甲酰胺溶液用滴液漏斗以60滴/min的速度滴加到4mL离子液体活化好的***中，在60℃和N₂保护的条件下反应2h，待反应完毕后在隔绝空气的条件下加入312mL丙酮，室温下洗涤12次，将沉淀物装入截留分子量8000~14000Da的透析袋中流水透析48h，去离子水透析12h，透析完毕后袋内物在0.06MPa、65℃下减压浓缩至原体积的1/25，在浓缩液中加入无水乙醇（乙醇含量占总体积的80%）沉淀，4000rpm下离心12min收集下层沉淀物，在20Pa、-60℃下冷冻干燥48h，得硒化葫芦巴多糖。

该硒化葫芦巴多糖为暗红色无定形粉末，总糖含量84.9%，在水中溶解度为23.6mg/mL（25℃），硒含量为27554μg/g，分子量为1.533×10⁶Da，对HepG2肝癌细胞的体外IC₅₀值为527.4μg/mL。

实施例3

（1）葫芦巴多糖甲酰胺溶液的制备：将160mg葫芦巴多糖在60℃下以400rpm的转速下搅拌5h溶解于40mL甲酰胺中，得葫芦巴多糖的甲酰胺溶液。

（2）离子液体的制备：将5mL浓硫酸在-5℃下以80滴/min的速度滴加到10mL的N-甲基吡咯烷酮中，300rpm搅拌反应10h，反应完毕后室温下用15mL乙酸乙酯洗涤3遍，收集下层粘稠液体，在真空度0.08MPa、50℃下真空干燥12h得离子液体。

（3）离子液体对***的活化：在70℃和N₂保护的条件下，将0.6g***加入到4mL离子液体中反应1h得活化后的***。

（4）硒化葫芦巴多糖的合成：将40mL葫芦巴多糖的甲酰胺溶液用滴液漏斗以30滴/min的速度滴加到4mL离子液体活化好的***中，在80℃和N₂保护的条件下反应3h，待反应完毕后在隔绝空气的条件下加入110mL丙酮，室温下洗涤15次，将沉淀物装入截留分子量8000~14000Da的透析袋中流水透析36h，去离子水透析24h，透析完毕后袋内物在0.07MPa、55℃下减压浓缩至原体积的1/20，在浓缩液中加入无水乙醇（乙醇含量占总体积的75%）沉淀，4500rpm下离心15min收集下层沉淀物，在15Pa、-50℃下冷冻干燥24h，得硒化葫芦巴多糖。

该硒化葫芦巴多糖为暗红色无定形粉末，总糖含量78.1%，在水中溶解度为20.2mg/mL（25℃），硒含量为29773μg/g，分子量为2.616×10⁶Da，对HepG2肝癌细胞的体外IC₅₀值为630.6μg/mL。

比较例1

（1）葫芦巴多糖甲酰胺溶液的制备：将250mg葫芦巴多糖在80℃下以300rpm的转速下搅拌4h溶解于100mL甲酰胺中，得葫芦巴多糖的甲酰胺溶液。

（2）硒化葫芦巴多糖的合成：将0.8g***加入到上述葫芦巴多糖的甲酰胺溶液中，在60℃和N₂保护的条件下反应2h，待反应完毕后在隔绝空气的条件下加入312mL丙酮，室温下洗涤12次，将沉淀物装入截留分子量8000~14000Da的透析袋中流水透析48h，去离子水透析12h，透析完毕后袋内物在0.06MPa、65℃下减压浓缩至原体积的1/25，在浓缩液中加入无水乙醇（乙醇含量占总体积的80%）沉淀，4000rpm下离心12min收集下层沉淀物，在20Pa、-60℃下冷冻干燥48h，得硒化葫芦巴多糖。

该硒化葫芦巴多糖为淡红色无定形粉末，总糖含量82.8%，在水中溶解度为16.6mg/mL（25℃），硒含量为4060μg/g，分子量为1.236×10⁶Da，对HepG2肝癌细胞的体外IC₅₀值为1230.8μg/mL。

该比较例的各参数与实施例2对应，二者的区别是：实施例2采用离子液体活化***后与葫芦巴多糖的甲酰胺溶液进行反应。

表1是本发明实施例1-3和比较例制备硒化葫芦巴多糖反应温度、反应时间和硒含量的一览表：

从表1可以看出：硒含量与***加入葫芦巴多糖的甲酰胺溶液中的反应温度和反应时间有关。

Claims (9)

1.一种硒化葫芦巴多糖的合成方法，包括以下工艺步骤：

（1）葫芦巴多糖甲酰胺溶液的制备：将葫芦巴多糖在60℃~80℃下，300~500rpm搅拌2~5h溶解于甲酰胺中，得葫芦巴多糖的甲酰胺溶液；

（2）离子液体的制备：将浓硫酸在-10℃~0℃下以50~80滴/min的速度滴加到N-甲基吡咯烷酮中，300~800rpm搅拌反应10~18h，反应完毕后室温下用乙酸乙酯洗涤2~3遍，收集下层粘稠液体，在0.06~0.08MPa、50~70℃下真空干燥6~12h得离子液体；

（3）离子液体对***的活化：在60~80℃和N₂保护的条件下，将***加入到上述（2）离子液体中反应1~3h得活化后的***；

（4）硒化葫芦巴多糖的合成：将（1）中得到的葫芦巴多糖的甲酰胺溶液用滴液漏斗以30~60滴/min的速度滴加到（3）中离子液体活化好的***中，在60~80℃和N₂保护的条件下，300~800rpm下反应2~4h，待反应完毕后，在隔绝空气的条件下加入丙酮洗涤10~15次，将沉淀物装入截留分子量8000~14000Da的透析袋中流水透析24~48h，去离子水透析12~24h，透析完毕后袋内物在真空度0.06~0.08MPa下、55~65℃减压浓缩至原体积的1/20~1/30，在浓缩液中加入无水乙醇沉淀，4000~5000rpm离心10~15min收集下层沉淀物，在5~20Pa、-60~-50℃下冷冻干燥24~48h，得硒化葫芦巴多糖。

2.如权利要求1所述硒化葫芦巴多糖的合成方法，其特征在于：步骤（1）中，葫芦巴多糖的重均分子量为2.303×10⁶Da，总糖含量为87.2%。

3.如权利要求1所述一种硒化葫芦巴多糖的合成方法，其特征在于：步骤（1）中，葫芦巴多糖与甲酰胺的质量体积比为2.5~4mg/mL。

4.如权利要求1所述一种硒化葫芦巴多糖的合成方法，其特征在于：步骤（2）中，N-甲基吡咯烷酮与浓硫酸的体积比为2:1~2.5:1。

5.如权利要求1所述一种硒化葫芦巴多糖的合成方法，其特征在于：步骤（2）中，乙酸乙酯和离子液体的体积比为0.5:1~1:1。

6.如权利要求1所述一种硒化葫芦巴多糖的合成方法，其特征在于：步骤（3）中，***和离子液体的质量体积比为0.125~0.2g/mL。

7.如权利要求1所述一种硒化葫芦巴多糖的合成方法，其特征在于：步骤（4）中，葫芦巴多糖的甲酰胺溶液和活化的***的体积比为10~25。

8.如权利要求1所述一种硒化葫芦巴多糖的合成方法，其特征在于：步骤（4）中，丙酮和反应液的体积比为2~3。

9.用权利要求1所述所述一种硒化葫芦巴多糖的合成方法制备的硒化葫芦巴多糖作为HepG2肝癌细胞的抑制剂应用在抗癌药物中。