CN105709708B - 一种脯氨酸衍生化杯[4]芳烃键合硅胶固定相及其制备方法与应用 - Google Patents

一种脯氨酸衍生化杯[4]芳烃键合硅胶固定相及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种脯氨酸衍生化杯[4]芳烃键合硅胶固定相及其制备方法和应用。本发明的制备方法包括：硅胶的活化；γ‑缩水甘油醚氧丙基键合硅胶的制备；脯氨酸衍生化杯[4]芳烃的合成；脯氨酸衍生化杯[4]芳烃键合硅胶固定相的制备。本发明所制备的固定相可与溶质发生亲水、包结、π‑π、氢键作用等，作用位点丰富，可以用于分离极性较强的化合物，如核苷、磺胺、黄酮类化合物等。该固定相制备方法简单、重现性好、柱压低且稳定、柱效较高，具有很好的应用前景。

Description

一种脯氨酸衍生化杯[4]芳烃键合硅胶固定相及其制备方法 与应用
技术领域
本发明属于功能材料合成技术，适用于高效液相色谱法等分离科学技术领域，具体涉及一种脯氨酸衍生化杯[4]芳烃键合硅胶固定相及其制备方法与应用。
背景技术
高效液相色谱以其高选择性、优越的重现性等特点，在食品、医药、天然产物等行业中扮演着非常重要的角色。但传统的反相液相色谱（RPLC）只适合于弱极性和中等极性化合物的分离分析，对于一些强极性化合物，反相色谱往往不能提供合适的保留和分离选择性。亲水作用色谱（HILIC）作为一种新型的色谱分离手段，采用极性固定相和水-水溶性有机溶剂为流动相，它克服了反相色谱在极性化合物分离过程中的不足，同时能够提供与反相色谱截然不同的分离选择性。
杯芳烃具有三维空腔和苯环骨架结构，能够与客体分子发生包结、吸附和π-π等作用，独特的结构特点使其在分离复杂样品时具有潜在的优势。但由于杯芳烃本身结构的疏水性，目前主要应用于RPLC方面，关于其在HILIC方面的研究还未见报道。L-脯氨酸是合成人体蛋白质的重要氨基酸之一, 极易溶于水。通过曼尼希反应合成上缘脯氨酸取代的杯芳烃，通过一定方式将其键合到硅胶上，可以制备出符合亲水作用机理的固定相，该固定相在高有机相下显现出极强的亲水性，适合分析一些极性生物化合物，具有良好的应用前景。
发明内容
综上所述，本发明的技术方案是：
一种脯氨酸衍生化杯[4]芳烃键合硅胶固定相，其结构式为：
本发明的脯氨酸衍生化杯[4]芳烃固定相通过下式所述的反应过程得到：
一种脯氨酸衍生化杯[4]芳烃键合硅胶固定相的制备方法，包括如下步骤：
①硅胶的活化：称取多孔硅胶，把多孔硅胶浸入体积比为1︰3（HCl︰H2O）的盐酸水溶液中，浸泡24～36 h，硅胶重量（g）︰盐酸水溶液（mL）为1︰25, 然后机械搅拌下回流10～12h除去金属离子，再用G5砂芯漏斗过滤，用高纯水反复洗至中性，在145～160 ℃下干燥10～12 h脱去表面水,即得活化硅胶，储于干燥器中备用；
②γ-缩水甘油醚氧丙基键合硅胶的制备：取γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷于三口圆底烧瓶中，加入无水甲苯，然后在磁力搅拌下，加入活化硅胶并滴加两滴三乙胺，γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷（mL）︰无水甲苯（mL）︰活化硅胶(g)为1︰10︰1，在氮气保护下回流10～12h停止反应，用砂芯漏斗过滤，依次用甲苯和丙酮洗涤，在75～85℃下真空干燥8～10h，即得γ-缩水甘油醚氧丙基键合硅胶，
③脯氨酸衍生化杯[4]芳烃的合成：取脱叔丁基杯[4]芳烃于烧瓶中，磁力搅拌下加入四氢呋喃溶解,再依次加入L-脯氨酸，冰醋酸以及浓度为37%甲醛水溶液，脱叔丁基杯[4]芳烃（g）︰四氢呋喃（mL）︰L-脯氨酸（g）︰冰醋酸（mL）︰甲醛水溶液(mL)为︰0.8︰60︰1︰2︰1,室温下反应36～48h；过滤，用四氢呋喃洗涤数次的产物再利用甲醇和水重结晶，然后真空干燥得到白色产物脯氨酸衍生化杯[4]芳烃；
④脯氨酸衍生化杯[4]芳烃键合硅胶固定相的制备：取制备好的γ-缩水甘油醚氧丙基键合硅胶于三口瓶中，机械搅拌下加入无水N,N-二甲基甲酰胺，另取制备好的脯氨酸衍生化杯[4]芳烃溶于其中，γ-缩水甘油醚氧丙基键合硅胶（g）︰无水N,N-二甲基甲酰胺（mL）︰脯氨酸衍生化杯[4]芳烃（g）为3︰200︰1,然后滴加高氯酸，氮气保护下回流反应10～12h，用G5砂芯漏斗过滤，依次用无水N,N-二甲基甲酰胺，高纯水，丙酮，甲醇各洗涤三次，75～85℃下真空干燥10～12h，得浅红色固体产物脯氨酸衍生化杯[4]芳烃键合硅胶固定相。
进一步，所述的多孔硅胶的粒径为5μm，孔径为100Å，比表面积为300m2/g。
一种脯氨酸衍生化杯[4]芳烃键合硅胶固定相在高效液相色谱中的应用。
本发明的有益效果：
（1）本发明所制备的固定相可与溶质发生亲水、包结、π-π、氢键作用等，作用位点丰富，可以用于分离极性较强的化合物，如核苷、磺胺、黄酮类化合物等。
（2）该固定相制备方法简单、重现性好、柱压低且稳定、柱效较高，具有很好的应用前景。
附图说明
图1为本发明应用实施例六种核苷的色谱分离图。
图2为本发明应用实施例七种磺胺的色谱分离图。
图3为本发明应用实施例五种黄酮的色谱分离图。
图4为本发明应用实施例四种杂环胺类的色谱分离图。
图5为本发明应用实施例酚类异构体的色谱分离图。
具体实施方式
下面将结合具体实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
制备实施例
一种脯氨酸衍生化杯[4]芳烃键合硅胶固定相的制备方法，包括如下步骤：
①硅胶的活化：称取10 g多孔硅胶(粒径5 μm，孔径100 Å，比表面积300 m2/g)浸入到250 mL 盐酸水溶液（其中HCl:H2O的体积比为1:3）中浸泡24 h，然后机械搅拌下回流10 h除去金属离子，再用G5砂芯漏斗过滤，用高纯水反复洗至中性，在160 ℃下干燥10 h脱去表面水,即得活化硅胶，储于干燥器中备用。
②γ-缩水甘油醚氧丙基键合硅胶的制备：取10.0 mL硅烷化试剂γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷于250 mL三口圆底烧瓶中，加入100 mL无水甲苯，然后在磁力搅拌下，加入8 g活化硅胶并滴加0.2 mL三乙胺，N2保护下回流12 h, 停止反应，用G5砂芯漏斗过滤，依次用甲苯和丙酮洗涤，在80℃下真空干燥8 h, 即得γ-缩水甘油醚氧丙基键合硅胶。
③脯氨酸衍生化杯[4]芳烃的合成：取0.8 g脱叔丁基杯[4]芳烃于50 mL圆底烧瓶中，磁力搅拌下加入20 mL 四氢呋喃溶解,再依次加入1 g L-脯氨酸，2 mL 冰醋酸以及1mL 37% 甲醛水溶液, 室温下反应36 h, 过滤, 用四氢呋喃洗涤数次的产物再利用甲醇和水重结晶，真空干燥得到白色产物。
④脯氨酸衍生化杯[4]芳烃键合硅胶固定相的制备：取3 g γ-缩水甘油醚氧丙基键合硅胶于500 mL三口瓶中，机械搅拌下加入200 mL无水N,N-二甲基甲酰胺，另取0.8 g脯氨酸衍生化杯[4]芳烃溶于其中，然后滴加2滴高氯酸，氮气保护下回流反应12 h，用G5砂芯漏斗过滤，依次用N,N-二甲基甲酰胺，高纯水，丙酮，甲醇洗涤数次，80℃下真空干燥12 h，得浅红色固体产物脯氨酸衍生化杯[4]芳烃键合硅胶固定相。
本发明脯氨酸衍生化杯[4]芳烃键合硅胶固定相的元素分析结果
产物脯氨酸衍生化杯[4]芳烃中的C含量明显增加，说明脯氨酸衍生化杯[4]芳烃成功键合到了γ-缩水甘油醚氧丙基键合硅胶上。
表1 元素分析结果
C(%) H(%)
KH-560硅胶 7.19 1.29
固定相 9.97 1.44
应用实施例
一种脯氨酸衍生化杯[4]芳烃键合硅胶固定相应用于高效液相色谱的分离填充料：
1、色谱柱的装填
所制备的固定相以四氯化碳作为匀浆液，甲醇作为顶替液，装柱压力为45 MPa，将固定相装入150×4.6 mm i.d.清洗干净的不锈钢管柱中，20 min后，缓慢地降压，停泵。将填满填料的柱子装上滤片和柱接头，标上柱方向、填料、柱尺寸和装柱日期。在0.2 mL/min的流速下用甲醇冲洗一天，使用前再用流动相平衡。
2、对不同种类化合物的分离
①应用为六种核苷的分离。色谱分离条件：流动相为乙腈：水=93:7，流速为1 mL/min，检测波长为254 nm，柱温为30℃。色谱峰：1，4,6-二氯嘧啶；2，尿嘧啶；3，2-氨基-6-氯嘌呤； 4，2-氨基腺苷；5，无环鸟苷；6，6-氯-嘌呤核苷。
②六种核苷的分离
色谱分离条件：流动相为乙腈：水=93:7，流速为1 mL/min，检测波长为254 nm，柱温为30℃。色谱峰：1，4,6-二氯嘧啶；2，尿嘧啶；3，2-氨基-6-氯嘌呤； 4，2-氨基腺苷；5，无环鸟苷；6，6-氯-嘌呤核苷。
③七种磺胺的分离
色谱分离条件：流动相为乙腈：水=85:15，流速为1.5 mL/min，检测波长为270 nm，柱温为30 ℃。色谱峰：1，磺胺嘧啶；2，磺胺二甲嘧啶；3，磺胺甲嘧啶；4，磺胺邻二甲氧嘧啶；5，磺胺间二甲氧嘧啶；6，磺胺二甲异嘧啶；7，磺胺间甲氧嘧啶。
④五种黄酮的分离
色谱分离条件：流动相为乙腈：水=87:13，流速为1 mL/min，检测波长为254 nm，柱温为30 ℃。色谱峰：1，桔皮素；2，淫羊藿苷；3，柚皮苷二氢查尔酮；4，白杨素；5，染料木素。
⑤四种杂环胺类的分离
色谱分离条件：流动相为乙腈：水=89:11，流速为1 mL/min，检测波长为254 nm，柱温为30 ℃。色谱峰：1，MeAαC；2， Glu-P-2；3，PhIP；4，IQ。
⑥酚类异构体的分离
色谱分离条件：流动相为乙腈：水=85:15，流速为1.5 mL/min，检测波长为254 nm，柱温为30 ℃。色谱峰：1，间硝基苯酚；2，邻硝基苯酚；3，对硝基苯酚。

Claims (3)

1.一种脯氨酸衍生化杯[4]芳烃键合硅胶固定相的制备方法，其特征在于，其结构式为：
所述制备方法包括如下步骤：
①硅胶的活化：称取多孔硅胶，把硅胶浸入体积比为盐酸︰水=1︰3的盐酸水溶液中，浸泡24～36h，其中，多孔硅胶︰盐酸水溶液为1g︰25ml，然后机械搅拌下回流10～12h除去金属离子，再用G5砂芯漏斗过滤，用高纯水反复洗至中性，在145～160 ℃下干燥10～12 h脱去表面水,即得活化硅胶，储于干燥器中备用；
②γ-缩水甘油醚氧丙基键合硅胶的制备：取γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷于三口圆底烧瓶中，加入无水甲苯，然后在磁力搅拌下，加入活化硅胶并滴加两滴三乙胺，γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷︰无水甲苯︰活化硅胶为1ml︰10ml︰1g，在氮气保护下回流10～12h停止反应，用砂芯漏斗过滤，依次用甲苯和丙酮洗涤，在75～85℃下真空干燥8～10h，即得γ-缩水甘油醚氧丙基键合硅胶；
③脯氨酸衍生化杯[4]芳烃的合成：取脱叔丁基杯[4]芳烃于烧瓶中，磁力搅拌下加入四氢呋喃溶解,再依次加入L-脯氨酸，冰醋酸以及浓度为37%甲醛水溶液，脱叔丁基杯[4]芳烃︰四氢呋喃︰L-脯氨酸︰冰醋酸︰甲醛水溶液为0.8g︰60ml︰1g︰2ml︰1ml，室温下反应36～48h；过滤，用四氢呋喃洗涤数次的产物再利用甲醇和水重结晶，真空干燥得到白色产物脯氨酸衍生化杯[4]芳烃；
④脯氨酸衍生化杯[4]芳烃键合硅胶固定相的制备：取制备好的γ-缩水甘油醚氧丙基键合硅胶于三口瓶中，机械搅拌下加入无水N,N-二甲基甲酰胺，另取制备好的脯氨酸衍生化杯[4]芳烃溶于其中，γ-缩水甘油醚氧丙基键合硅胶︰无水N,N-二甲基甲酰胺︰脯氨酸衍生化杯[4]芳烃为3g︰200ml︰1g，然后滴加高氯酸，氮气保护下回流反应10～12h，用G5砂芯漏斗过滤，依次用无水N,N-二甲基甲酰胺，高纯水，丙酮，甲醇各洗涤三次，75～85℃下真空干燥10～12h，得浅红色固体产物脯氨酸衍生化杯[4]芳烃键合硅胶固定相。
2.根据权利要求1所述的脯氨酸衍生化杯[4]芳烃键合硅胶固定相的制备方法，其特征在于，所述的多孔硅胶的粒径为5 μm，孔径为100 Å，比表面积为300 m2/g。
3.权利要求1所述制备方法制备的脯氨酸衍生化杯[4]芳烃键合硅胶固定相在高效液相色谱中的应用。
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