CN105708870A

CN105708870A - 可用于改善皮肤屏障功能的荷荷巴提取物

Info

Publication number: CN105708870A
Application number: CN201610028168.2A
Authority: CN
Inventors: 伊天尼·苏丹特; 伊拉娜·卡奇科-切尔涅茨基; 法比安·哈瓦斯; 奥尔加·本-齐特里特; 利亚-凡奥本-比撒列; 伊诺·费里; 亚历克斯·亚里鲁科
Original assignee: IBR Israeli Biotechnology Research Ltd
Current assignee: IBR Ltd
Priority date: 2011-11-30
Filing date: 2012-11-28
Publication date: 2016-06-29
Also published as: JP6482274B2; ES2871250T3; US9949918B2; KR20140098806A; CN103957884A; HK1222802A1; JP2018027965A; BR112014012858B1; KR102020691B1; BR112014012858A2; US20140308372A1; JP2015502942A; EP2785322A4; WO2013080205A8; AU2012345458B2; AU2012345458A1; EP2785322B1; WO2013080205A1; EP2785322A1

Abstract

本发明涉及可用于改善皮肤屏障功能的荷荷巴提取物。本发明提供了包含极性溶剂中的荷荷巴(加州希蒙得木(Simmondsia chinensis))提取物的组合物，所述组合物有效促进皮肤的屏障功能，可用于改善皮肤完整性、健康和外观及作为抗老化剂。

Description

可用于改善皮肤屏障功能的荷荷巴提取物

本申请是申请日为2012年11月28日，申请号为201280059319.0，发明名称为“可用于改善皮肤屏障功能的荷荷巴提取物”的申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及皮肤护理领域，特别地涉及有效促进皮肤的屏障功能、可用于改善皮肤完整性、结构和强度及作为皮肤抗老化剂的荷荷巴(Jojoba)(加州希蒙得木(Simmondsiachinensis))的提取物。

发明背景

皮肤提供了许多功能，但它的主要功能是作为保护层或保护屏障。皮肤对于陆生动物的最重要的作用是保护富含水分的内部器官(internalorgan)免于干燥的外部环境。此外，皮肤保护内部组织(internaltissue)免受有害的化学力和物理力并免受病原体的侵入。

皮肤是结构上复杂的厚膜。皮肤由表皮、真皮、皮下组织(hypodermis)、和附件结构(表皮附属物)组成。表皮，皮肤的最外层上皮组织，本身是由数层-角质层、颗粒层、棘层、和基底层组成。表皮主要由角质形成细胞构成，并且处于不断的自我更新(self-replacement)状态。在底层，角质形成细胞干细胞(keratinocytestemcell)***为被向外移行(diaplace)的子细胞，且其通过连续覆盖的层分化进入角质层。然后，角质形成细胞经历凋亡和死亡，且它们的细胞的细胞器和细胞质在分化的最后过程中消失。

皮肤的不透水性功能存在于角质层(SC)上部最薄的层(在人类中约10-20μ)，相比活的生物体的其它膜，具有约3个数量级(magnitudesoforder)更高的耐水性。

角质层的水合状态对其屏障功能，以及对皮肤的健康和紧实的外观(firmappearance)是重要的。角质层水合和经皮水分流失(transepidermalwaterloss，TEWL)是用于其表征的两个关键指示物，通常呈反比关系。高TEWL值，作为受干扰的皮肤屏障功能的标志物，经常与角质层的低水合相关。受损的屏障功能可由尤其是用肥皂和清洁剂的皮肤清洁引起或由皮肤的多种疾病引起。例如，电子显微术和侵入研究已经证实了特应性皮炎(atopicdermatitis)中的皮肤屏障受损，且损伤的特应性皮炎显示了高TEWL值。角质层水合和经皮水分流失的这种相互影响的机制尚未被详尽地研究。然而，表明了受干扰的皮肤屏障功能导致表皮分化的变化。

组织的完整性高度依赖于通过细胞与细胞连接结构(Cell-to-CellJunction)进行的适当的细胞与细胞的粘附(celltocelladhesion)。细胞与细胞连接结构是包括跨膜粘附蛋白的复合体，且它们的形态和分布可根据组织类型而变化。在皮肤中，主要的连接结构是桥粒、紧密连接结构和间隙连接结构。

桥粒是紧密地连接相邻细胞的细胞间连接结构。蛋白桥粒斑蛋白(desmoplakin)是功能性桥粒的必要组分，其锚定中间丝状体(intermediatefilament)至桥粒斑。

紧密连接结构(TJ)是连接邻近的细胞、控制分子的旁细胞通路(“屏障功能”)并将顶端部分与细胞膜的基底外侧部分分开(“栅栏功能”)的细胞-细胞连接结构。紧密连接结构的组成显示对其在表皮中的屏障功能是非常重要的。某些蛋白的下调以及过表达扰乱了这种屏障。紧密连接结构的损害与皮肤水分流失、干燥和敏感皮肤相关并与数种皮肤疾患包括寻常型银屑病、扁平苔癣、胆管炎和鱼鳞癣包括寻常型鱼鳞癣相关。

间隙连接结构是细胞膜中蛋白通道的有组织的集合，其允许离子和小分子在相邻的细胞间通过。构成间隙连接结构的蛋白通道由两个被称为连接子的六边形阵列的跨膜蛋白组成。一个连接子存在于一个细胞的膜中。它对齐并连接相邻细胞的连接子，形成连续的水通路，离子和小分子借以可从一个细胞自由地(被动)通过至另一个。

一些合成的化合物以及植物提取物已被证明影响皮肤屏障功能。例如，美国专利号8,101,214公开了以一定植物提取物比的数种中草药的草药提取物的复合物，相比通过提取每一种单独的草药获得的提取物，其在促进皮肤角质形成细胞的分化、恢复受损的皮肤屏障功能和提高皮肤保湿方面是优越的。

美国专利号8,168,197公开了用于缓解皮肤干燥症状的皮肤外用组合物及其用于皮肤保湿化妆品的用途，其包含北玄参(ScrophulariabuergerianaMiq.)提取物作为主要组分，并且还包含茯苓(PoriacocosWolf)提取物。该组合物包含北玄参提取物和茯苓提取物作为活性成分，这两种提取物通过使用水、乙醇、甲醇、己烷、乙酸乙酯或丁醇单独提取每一种而制备。

美国专利申请公开号20040156818公开了包括印度楝种子细胞发酵液及一种或多种另外的植物成分或石榴果实提取物，和任选地除了其它的以外在减少皮肤脆弱、改善皮肤屏障修复和/或功能和改善皮肤保湿中有用的一种或多种另外的植物成分的混合物。

国际(PCT)专利申请公布号WO2008/148694公开了包含由4至10个单糖单元组成且具有至少一个果糖残基的半乳寡糖(galacto-oilgosaccharide)的保湿化妆品组合物。该半乳寡糖可从归属于唇形科(Lamiaceaefamily)植物群的植物获得。来自该植物的提取物显示出改善的皮肤保湿效果而不粘稠，以及与多元醇的协同保湿效果。

国际(PCT)专利申请公布号WO2009/106934公开了由于涉及刺激水通道蛋白-3、纤连蛋白和包膜蛋白丝聚蛋白和外皮蛋白表达的机制，作为皮肤屏障保护剂和保湿剂是有用的阿根廷落腺豆木(Angico-Branco)(阿根廷孔雀豆木(Piptadeniacolubrina))提取物。该发明还涉及包含该提取物的用于特定皮肤变化诸如皮肤干燥、皲裂、脱屑、脱皮或涉及皮肤屏障受损的任何干扰的面部或身体护理的化妆品和皮肤病学制剂。

基于植物提取物的可用于促进皮肤屏障功能的已在市场上可获得的产品的示例性列表包括PhytoCellTecAlpRoseofMibelleIndustries,Switzerland和PhytoglycolipidIIofBarnetProducts,U.S.A。

不断增长的产品列表和试图改善皮肤屏障功能的技术显示，普遍有用的解决方案尚不可得。

荷荷巴(加州希蒙得木)是原产于亚利桑那州、加利福尼亚州和墨西哥的索诺拉和莫哈韦沙漠的灌木。它是被放置在石竹目中的希蒙得木科的唯一种。它还被称为山羊果(goatnut)、鹿果(deernut)、猪果(pignut)、野生榛子、奎宁果(quinine)、咖啡果、和灰色黄杨灌木。荷荷巴因其油，一种存在于种子中的液体蜡酯，在商业上被种植。荷荷巴油被用作鲸油和其衍生物诸如鲸蜡醇的替代物。在1971年禁止向美国进口鲸油导致了荷荷巴油应用于化妆品和其它行业中的许多方面是优越的发现。荷荷巴油还是杀真菌剂，并可被用于控制霉菌。像蔗糖聚酯一样，荷荷巴油是可食用的，但是是无热量且不可消化的。已开发荷荷巴生物柴油作为可用作石化柴油替代物的便宜的、可持续的燃料。

先前仅公开了利用荷荷巴膳食特别是榨油后保留的膳食，荷荷巴的亲水性提取物用于皮肤美白和去角质的用途。膳食主要被用作与一种或多种羟基酸组合的机械皮(mechanicalpeel)(美国专利号6,890,566、7,025,957、7,029,709、7,097,866)。

如上文所述的，促进屏障功能以及后续保持皮肤完整性对于改善皮肤外观和健康包括治疗和/或减轻各种皮肤疾患是重要的。具有有效促进皮肤屏障功能的组合物和方法特别是源自植物的已知不具有有害作用的组合物是高度期望的并将是有利的。

发明概述

本发明涉及荷荷巴植物提取物，特别地涉及可用于改善皮肤结构、强度和内聚力(cohesion)以及促进皮肤屏障功能的植物地上部分的提取物。

本发明部分基于以下出乎意料的发现：在极性溶剂特别是水中提取荷荷巴的叶片部分，导致有效保持和/或促进皮肤屏障功能的提取物。特别地，本发明的提取物显著增强了桥粒斑蛋白I、桥粒斑蛋白II和细胞角蛋白5的编码基因以及一些其它角蛋白编码基因的表达。不希望受到任何特定理论或作用机制的束缚，促进皮肤完整性可因此是由于功能桥粒的一种必要组分，桥粒斑蛋白的存在以及已知对简单和分层的上皮组织的适当分化是必需的数种类型的角蛋白，包括细胞角蛋白5、细胞角蛋白2A和细胞角蛋白1的存在。本发明的提取物因此可被用于保持皮肤完整性并维持和/或促进皮肤屏障功能。

因此，根据一方面，本发明提供了用于保持和/或促进皮肤结构、强度、内聚力或其任意组合的方法，所述方法包括向受试者的皮肤施用包括极性溶剂中的荷荷巴(加州希蒙得木)植物或其任意部分的提取物作为活性成分的组合物，从而保持或促进皮肤屏障功能。

根据某些实施方案，组合物包含荷荷巴提取物作为唯一的活性成分。根据其它实施方案，组合物还包含至少一种另外的活性剂。

根据某些实施方案，保持或促进皮肤屏障功能包括保持或减少皮肤的脱水率、保持或促进皮肤水合值(hydrationvalue)、保持或促进保护免受环境危害和其任意组合中的至少一种。

根据其它实施方案，本发明的方法有效改善皮肤健康、皮肤完整性、皮肤紧实度、皮肤延展性、皮肤弹性、美化皮肤整体外观和其任意组合中的至少一种。每种可能性都代表本发明单独的实施方案。

根据某些实施方案，改善皮肤健康包括但不限于，减轻湿疹和/或皮肤病特别是寻常型银屑病、扁平苔癣、胆管炎和鱼鳞癣，包括寻常型鱼鳞癣、鱼鳞癣的症状；预防起泡性疾患(例如寻常型天疱疮)；保持正常皮肤动态平衡；促进皮肤伤口愈合；及其任意组合。每种可能性都代表本发明单独的实施方案。

皮肤水合/脱水值可通过如本领域技术人员已知的任何方法测量。根据一些实施方案，预定阈值是施用本发明的提取物之前测量的值。根据其它实施方案，预定阈值是获自具有健康皮肤的个体的平均值。根据又另外的实施方案，预定阈值是获自具有受干扰的皮肤的个体的平均值。

皮肤参数可通过如本领域技术人员已知的任何方法测量。用于确定皮肤屏障功能状态的常用方法包括通过测量经皮水分流失(TEWL)值检查皮肤脱水，和/或通过测量皮肤的保湿指数(％或任意单位)检查皮肤水合。

根据某些实施方案，提取荷荷巴植物或其部分的极性溶剂选自由以下构成的组：水、乙醇、丙二醇、丁二醇、甲醇、甘油、丙醇、丁醇、二丙二醇、戊二醇、己二醇、二甲基甲酰胺、乙腈、二甲基亚砜、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、甲酸、乙酸和丙酮或其任意组合。每种可能性都代表本发明单独的实施方案。

根据某些典型的实施方案，极性溶剂是水。根据其它实施方案，用水和至少一种另外的极性溶剂获得提取物。根据某些实施方案，提取介质包括30-90％的水和10-70％的极性溶剂。

根据某些实施方案，提取物获自任一原始荷荷巴植物部分，包括根、茎、叶、种子、果实和其任意组合。根据一些实施方案，提取物获自荷荷巴植物的地上部分。根据目前典型的实施方案，提取物获自叶和茎。根据某些实施方案，叶的颜色是绿色至棕色。根据其它实施方案，茎的直径是1-5mm，通常约2mm。作为雌雄异株的荷荷巴植物，植物部分可取自雌株以及取自雄株植物并可处于任何发育时间。

根据某些实施方案，采集新鲜的荷荷巴植物部分用于提取。根据其它实施方案，植物部分在提取前被部分地或完全干燥。

根据某些实施方案，将采摘的植物或其部分原样加入提取溶剂。根据其它实施方案，在溶剂加入前，将植物或其部分切成碎片。根据又另外的实施方案，在溶剂加入前，研磨植物或其部分。

被明确理解的是，在根据本发明的教导被提取之前，荷荷巴植物材料，除了被干燥或被切割的选择之外不经受任何处理。因此，根据本发明的教导使用的荷荷巴植物部分被称为“原始植物材料”，如下文定义的。

根据某些实施方案，组合物包含以相对于组合物的总重量的从0.003％至30％的重量与重量比(w/w)浓度的荷荷巴提取物。根据一些实施方案，荷荷巴提取物在0.3％至10％的范围内。根据典型的实施方案，组合物中荷荷巴提取物的浓度为相对于组合物的总重量的从1％至3％(w/w)。

根据某些实施方案，组合物是化妆品或药学组合物，其还包含化妆品学上或药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。

根据一些实施方案，化妆品或药学组合物还包含可用于化妆品和/或皮肤病学领域的添加剂，包括但不限于，脂肪、乳化剂和辅助乳化剂、亲水性或亲脂性胶凝剂、防腐剂、溶剂、芳香剂、填充剂、亲水性和亲脂性的过滤剂(filter)、着色剂、中和剂、渗透增强剂和聚合物。这些不同添加剂的量是那些在化妆品和皮肤病学制品(preparation)中常规使用的，如本领域技术人员已知的。每种可能性都代表本发明单独的实施方案。

根据某些典型的实施方案，至少一种添加剂选自但不限于由以下构成的组：抗坏血酸、其衍生物和相应的盐、甘油、柠檬酸、乙酸、亚硫酸盐、苯氧乙醇、EDTA、苹果酸二乙酯、叔丁基氢醌、氨基胍、烟酸(nicotinicacid)/尼克酸(Niacin)、烟酰胺、氯化亚锡、葡萄糖氧化酶、聚乙烯聚吡咯烷酮、磷酸和化妆品学上/药学上可接受的碱。每种可能性都代表本发明单独的实施方案。

根据另外的实施方案，化妆品或药物组合物还包含至少一种另外的植物提取物和/或微藻类提取物。

根据某些目前典型的实施方案，组合物包含荷荷巴的水提取物和选自由以下构成的组的至少一种另外的活性成分：具有短期或长期保湿效果的剂，包括但不限于，透明质酸盐；自由基清除剂和/或抗氧化剂，包括但不限于生育酚、Co-Q10、抗坏血酸及其衍生物和类胡萝卜素；UV过滤剂，包括但不限于，阿伏苯宗(丁基甲氧基二苯甲酰基甲烷)、二氧化钛、氧化锌和类胡萝卜素；以及抗皱剂，包括但不限于，夏雪片莲(Leucojumaestivum)提取物。

根据某些实施方案，组合物用于局部施用(topicaladministration)。可使用如本领域已知的任何局部制剂，只要该制剂保持了提取物活性。根据某些实施方案，组合物以选自由以下构成的组的形式被施用：水溶液、霜剂、洗剂、乳剂包括油包水或水包油乳剂、微乳剂或纳米乳剂、凝胶、浆液和乳液。

根据另外的实施方案，组合物包含通过包括以下步骤的方法制备的荷荷巴提取物：

(a)将荷荷巴植物或其任意部分与至少一种极性溶剂混合；

(b)持续足以形成液体提取物的时间段孵育混合物；

(c)除去荷荷巴植物或其部分，并收集液体提取物；

(d)过滤液体提取物；和

(e)收集滤液。

根据某些实施方案，孵育混合物包括持续从10min至24h、通常从40min至12h、更通常从40min至2h的时间段的孵育。

根据另外的实施方案，孵育温度在20-120℃的范围内、通常为60-120℃、更通常为80-110℃。

根据某些实施方案，步骤(c)包括用于去除荷荷巴植物部分的离心。根据其它实施方案，步骤(d)包括通过滤网过滤液体提取物。根据又另外的实施方案，该方法还包括通过具有小于1.5μm的孔径的过滤器过滤步骤(e)的滤液。

本发明提供了以下内容：

项目1.一种用于保持和/或促进皮肤结构、强度、内聚力或其任意组合的方法，所述方法包括向受试者的皮肤施用包括极性溶剂中的荷荷巴(加州希蒙得木(Simmondsiachinensis))植物或其部分的提取物作为活性成分的组合物，从而保持或促进皮肤屏障功能。

项目2.根据项目1的方法，其中保持或促进所述皮肤屏障功能包括保持或减少皮肤脱水率；保持或促进皮肤水合值；保持或促进保护免受环境危害和其任意组合中的至少一种。

项目3.根据项目1的方法，所述方法在保持或改善皮肤健康、皮肤完整性、皮肤紧实度、皮肤延展性、皮肤弹性、皮肤整体外观和其任意组合中的至少一种中是有效的。

项目4.根据项目3的方法，其中改善所述皮肤健康包括减轻湿疹、皮肤病、寻常型银屑病、扁平苔癣、鱼鳞癣、寻常型鱼鳞癣和胆管炎的症状；预防起泡性疾患；保持正常皮肤动态平衡；促进皮肤伤口愈合及其任意组合中的至少一种。

项目5.根据项目3的方法，其中促进所述皮肤整体外观包括预防老化和风化的皮肤的可见征象，包括皱纹和细纹；使皮肤表面光滑；减少皮肤毛孔大小或其任意组合中的至少一种。

项目6.根据项目1的方法，其中促进或保持皮肤结构、强度、内聚力或屏障功能是与预定阈值相比而确定的。

项目7.根据项目6的方法，其中所述预定阈值是在将所述组合物施用至所述皮肤之前测量的值。

项目8.根据项目6的方法，其中所述预定阈值是获自具有健康皮肤的个体的平均值。

项目9.根据项目6的方法，其中所述预定阈值是获自具有受干扰的皮肤的个体的平均值。

项目10.根据项目1的方法，其中所述极性溶剂选自由以下构成的组：水、乙醇、丙二醇、丁二醇、甲醇、甘油、丙醇、丁醇、二丙二醇、戊二醇、己二醇、二甲基甲酰胺、乙腈、二甲基亚砜、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、甲酸、乙酸、丙酮和其任意组合。

项目11.根据项目10的方法，其中所述极性溶剂是水。

项目12.根据项目10的方法，其中所述极性溶剂是水以及乙醇、丙二醇、丁二醇、甲醇、甘油和丙酮中的至少一种。

项目13.根据项目1的方法，其中所述组合物是化妆品或药物组合物，还包含化妆品学上或药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。

项目14.根据项目13的方法，其中所述化妆品或药物组合物被配制用于局部应用。

项目15.根据项目1的方法，其中所述组合物还包括至少一种另外的活性成分。

项目16.根据项目1的方法，其中所述荷荷巴的提取物由包括以下步骤的方法制备：

a.将荷荷巴植物或其任意部分与至少一种极性溶剂混合；

b.持续足以形成液体提取物的时间段孵育所述混合物；

c.去除所述荷荷巴植物或其部分，并收集所述液体提取物；

d.过滤所述液体提取物；和

e.收集滤液。

项目17.根据项目16的方法，其中所述孵育的温度在20℃-120℃的范围之内。

项目18.根据项目16的方法，其中步骤(e)的滤液通过具有小于1.5μ的孔径的过滤器被进一步过滤。

项目19.根据项目16的方法，其中所述荷荷巴植物部分选自由以下构成的组：根、茎、叶、种子、果实或其任意组合。

项目20.根据项目16的方法，其中所述植物部分是叶。

项目21.根据项目16的方法，其中所述荷荷巴植物或其部分呈选自由以下构成的组的形式：新鲜的、部分干燥的或完全干燥的形式。

本发明的其它目的、特征和优势从以下的描述和附图将变得清楚。

附图说明

图1显示了对照(图1A)和处理(图1B)的角质形成细胞中检查的基因的表达。膜上的基因模式如表1中所示。

图2显示了用荷荷巴提取物处理24h后角质形成细胞中RNA的质量(quality)和数量(quantity)的对照。图2A：对照：RNA浓度：2.45μg/μl；RNA数量：36.75μg。图2B：用0.03％荷荷巴提取物处理的培养物：RNA浓度：1.97μg/μl；RNA数量：29.55μg。

图3展示了包括了3％荷荷巴提取物的组合物对皮肤缓解的视觉效果。

发明详述

本发明公开了可用于改善皮肤结构、强度和内聚力并从而促进皮肤屏障功能的荷荷巴植物提取物。本发明的提取物是从浸入至少一种极性溶剂特别是水中的植物部分制备的。

出乎意料地，本发明现在显示了，荷荷巴的水和/或另外的极性溶剂的提取物在保持和/或促进皮肤结构和屏障功能方面是高度有效的。不希望受到任何特定理论或作用机制的束缚，这种改善可归因于皮肤管理***中的关键组分的激活。特别地，本发明的提取物显著增强了参与适当屏障功能机制的主要基因包括尤其是编码桥粒斑蛋白I和II、多配体聚糖1、外皮蛋白和纤连蛋白的基因，以及参与角质形成细胞分化的基因包括编码细胞角蛋白5、细胞角蛋白2E/A和细胞角蛋白1和细胞角蛋白10的基因的表达。

因此，本发明的提取物的显著优势是其激活有助于适当的皮肤结构和屏障功能的皮肤组织的内在机制的能力。保持和/或促进皮肤结构和屏障功能影响大量的对皮肤健康和年轻的外观(juvenileappearance)具有正面影响的参数。

因此，根据一个方面，本发明提供了用于保持和/或促进皮肤屏障功能的方法，所述方法包括向皮肤施用包含极性溶剂中的荷荷巴或其任意部分的提取物的组合物，从而保持或促进皮肤屏障功能。

如本文所用的，术语“原始荷荷巴植物材料”或“原始植物材料”是指新鲜或干燥的荷荷巴植物的任何部分，其被采集用于用至少一种极性溶剂提取。任选地，在其被添加至溶剂之前，将原始材料切成碎片、切碎或研磨原始材料。被明确理解的是，该术语不包括在用至少一种极性溶剂提取之前经受以下任一项的荷荷巴植物材料：超临界CO₂(SCCO2)萃取、水解、油级分去除或其任意组合。

根据本发明的某些实施方案，原始植物材料包括荷荷巴植物的地上部分。

如本文所用的，当提及荷荷巴植物时的术语“地上部分”是指在地面以上的所有植物部分，包括茎、叶、花、种子、果实、芽等。根据某些目前典型的实施方案，本发明的提取物制备自荷荷巴茎和/或叶。根据某些实施方案，植物原始植物材料不包括种子。

荷荷巴是一种雌雄异株类型的植物，即雄性器官和雌性器官位于不同的植株上。本发明的提取物可制备自可被采集用于提取的处于任何发育阶段的所有类型的植物和植物部分。

根据某些实施方案，本发明的提取物制备自荷荷巴雌性植株或其部分。根据其它实施方案，本发明的提取物制备自荷荷巴雄性植株或其部分。根据某些典型的实施方案，提取物制备自雌性和雄性植株或其部分的组合。

根据某些实施方案，采集新鲜的荷荷巴植物部分用于提取。根据其它实施方案，提取之前植物部分被部分或完全干燥。

如本领域技术人员已知的任何方法都可被用于在提取之前干燥植物材料。例如，植物材料可被烘干、晒干、或在环境条件下在黑暗中干燥。如本文所用的，术语“部分干燥”指的是包含约5％至80％的初始含水量的植物材料。通常，部分干燥的材料含有约10％或更少的水。当关于植物材料被使用时的术语“完全干燥”，指的是其中在干燥条件下当进一步孵育时没有检测到进一步的重量损失的状态。

不管干燥状态如何，在被置于提取溶剂中之前，荷荷巴植物的部分可被采集作为整体、切成各种大小的碎片、或研磨成粉末用于提取。

然后，将植物或其部分置于极性溶剂中。如本文使用的术语“极性溶剂”是指具有约5或更大的介电常数的溶剂。根据某些实施方案，本发明的提取物是用水作为溶剂而制备。根据其它实施方案，用于提取的溶剂选自但不限于由以下构成的组：乙醇、丙二醇、丁二醇、甲醇、甘油、丙醇、丁醇、二丙二醇、戊二醇、己二醇、二甲基甲酰胺、乙腈、二甲基亚砜、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、甲酸、乙酸和丙酮。每种可能性都代表本发明单独的实施方案。根据又另外的实施方案，用至少两种极性溶剂的组合进行提取。根据某些实施方案，用水和至少一种另外的极性溶剂进行提取。

极性溶剂中植物部分的孵育时间可取决于所用的植物部分、其大小和干燥状态而不同。根据某些实施方案，孵育时间的范围为10min至24h。

来自荷荷巴植物材料的极性物质进入溶剂的提取任选地可通过加热、施加超声波、微波及如本领域已知的其它方法被增强。被明确理解的是，尽管使用极性溶剂提取极性物质是目前被用于制备本发明的提取物的方法，通过如本领域已知的任何其它方法例如冷压植物部分提取的极性物质也包括在本发明的范围之内。

涉及哺乳动物的皮肤屏障功能的变量包括经皮水分流失、角质层水分(stratumcorneummoisture)、皮肤表面pH、和皮肤温度。

水对于皮肤的功能极为重要，且皮肤最上层中水的比例显著影响其外观。除了维持有活力的表皮层中所有转运及其它生理功能之外，水在表皮角质层(角质层)中也是非常重要的。存在于角质层中的酶仅在一定的水合度和pH值下才能充分发挥其活性。不足的含水量和酶活性导致皮肤干燥、鳞片状外观，其变得脆弱和敏感且具有瘙痒的倾向。总而言之，皮肤外观差，有细纹和褶皱。

保持皮肤含水量并防止皮肤干燥可通过保持皮肤组织的完整性和/或其恢复能力以减少由针对皮肤的保护屏障的外部侵袭所造成的导致对皮肤的细胞内分子和***的进一步损害以及通过皮肤的进一步水分流失被主要地实现。

根据本发明的教导，如本领域已知的用于评价皮肤屏障功能的任何方法都可被使用。表征皮肤屏障功能的技术包括测量水分含量和经皮肤表面的流失的许多非侵入性的方法。这些测量之一是使用被称为角质测量术(corneometry)的方法测定皮肤水合(HYDR)。由于皮肤如同电介质的行为，这种技术测定了皮肤的电容，并评价了10-20-μm的角质层厚度。虽然这是皮肤含水量的测量，其仅是屏障功能的间接测量。尽管如此，其可与各种生理条件下HYDR响应损伤、代谢现象、或局部治疗的程度相关。报道的人皮肤评价值取决于所研究的身体部位而不同。尽管如此，一组人类受试者中个体或平均HYDR评分中的变化可作为皮肤健康的指示物，具有更高的值通常被认为是更期望的。

另一种方法是针对非显性水分流失评价皮肤屏障完整性。这种技术通过测量通过皮肤表面的经皮水分流失(TEWL)被执行。TEWL值是通过皮肤的水分流失速率的测量(以g/h·m²计)，并且是皮肤保水能力的评价。该方法基于建立在皮肤表面之上10mm层中的水蒸汽密度梯度的测量。其是皮肤的水屏障功能的可能损害的程度的指示物。因为通过皮肤的水分流失通常通过被动扩散穿过表皮而发生，较高的TEWL值指示较大的水分流失，并且与角质层的屏障功能的增加的损害诸如在刺激性暴露或特应性皮炎期间可发生的角质层的屏障功能的增加的损害相一致。

如下文例证的，本发明现在显示，应用包含本发明的荷荷巴提取物的组合物至前臂皮肤，导致了TEWL值显著减少。因此清楚地证明，本发明的组合物有效促进皮肤屏障功能。

本发明的组合物对皮肤结构、强度和屏障功能的影响可通过检查皮肤的生物力学性能被进一步测定。流变学评价是本领域技术人员已知的用于体内非侵入性测量通过活性剂的局部应用(topicalapplication)诱导的变化的目前优选的方法。皮肤具有两个流变学特征：具有高弹性的粘弹性特性和取决于区域而变化的自然张力。由皮肤中张力线(tensionline)形成的网络被称为Langer网络。连接组织(conjunctivetissue)的流变学特性起源于其基本上是胶原蛋白和弹性蛋白纤维的三维网络的结构。该方法能够评价浅表皮肤层的生物延展性和弹性中的变化，且通常使用皮肤粘弹性测量仪(Cutometer)进行。原则上，皮肤持续设定的时间长度通过恒定的真空压力被吸入探针的孔。皮肤侵入探针的深度由位于探针的孔的开口的两个光学棱镜被测量，以消除摩擦力和机械应变的影响。基于所获得的结果，可分析以下生物力学参数：张力、紧实度、健壮(tone)(如果残余伸长降低，皮肤则更健壮)、及柔软度(如果即时伸长增加，皮肤则更柔软)。

皮肤强度，特别是角质层的强度和屏障功能，可使用轻敲剥离方法(tapstrippingprotocol)进一步被评价。根据该试验的原理，贴片被快速(以在几秒的范围内)应用于志愿者。然后，贴片被慢慢去除并分析以定量去除的SC的量。可以通过去除的SC重量、蛋白的量和/或视觉成像进行分析(Dreher,F等人，1998.ActaDermVenereol78:186–189)。

如下文例证的，本发明的组合物是非过敏的且是皮肤高度耐受的。此外，组合物已展示了显著平滑和张量(tensor)作用。不希望受到任何特定理论或作用机理的束缚，这些平滑和抗衰老效果可归因于组合物提高皮肤屏障功能的能力。

伤口愈合是由多种细胞粘附分子表达间接地调控的过程。已知的是，细胞粘附分子的缺乏延迟了伤口愈合。因此，伤口的愈合可证明细胞粘附蛋白的刺激。因此，本发明的组合物可有助于细胞单层培养物中伤口的愈合，或细胞迁移穿过多孔膜的能力。伤口愈合的发展可通过划痕试验被评价。该试验针对原生细胞或经转染的细胞进行，以研究特定蛋白过表达(或敲低)对细胞迁移的影响。

体外划痕试验是测量体外细胞迁移的简单的、低成本和充分开发的方法。基本步骤包括在细胞单层中创建“划痕”、在开始以及在细胞迁移以封闭划痕的过程中定期捕获图像、并比较用具有或不具有本发明的组合物获得的图像以定量细胞的迁移速率。与其它方法相比，体外划痕试验特别适于研究细胞-基质和细胞-细胞相互作用对细胞迁移的影响、模拟体内伤口愈合过程中的细胞迁移，并且如果需要在迁移期间与活细胞成像兼容以监控细胞内事件。除了监控同质的细胞群的迁移，该方法还被用于测量划痕前缘中单个细胞的迁移。

本发明的提取物对皮肤屏障功能的影响还可通过如本领域技术人员已知的任何方法，被离体或体外评价。例如，可测量重建的人皮肤的经皮电阻(TEER)，以评价细胞层的紧密性。TEER皮肤屏障功能的直接测量；它反映了由其自己的厚度以及由其自己的结构给出的组织的全部的总体电阻。其反映了处于紧密连接结构水平的细胞间接触、对抗外来化合物的渗透的二层脂质结构(bilaminarlipidicstructure)的完整性。TEER与体内测量的经皮水分流失的测量的TEWL成反比；TEWL越高，屏障功能的损害越高，而TEER越高，屏障功能的损害越低。关于TEER测量，检查的重建皮肤被***具有小体积生理缓冲液(PBS)的室中，并且另外体积的缓冲液被应用到组织的顶面。含有顶电极的室盖被***，并且测量了电阻。使用Millipore-ERS伏特/欧姆表测定TEER值(典型处理的和非处理的组织)。TEER通常表示为TEER50，即TEER降低50％的时间。

采用另外的方法，使用免疫组织化学染色通过体外皮肤模型/重建的人表皮的形态分析定量丝聚蛋白和/或桥粒芯蛋白1和/或封闭蛋白1的表达。重建的人表皮或离体皮肤活检/经皮的可被用于使用例如Franz型扩散池或使用室***测定参考分子/染料的渗透动力学。重建的人表皮也可被用于谷氨酰胺转移酶活性试验。此外，皮肤样品中关键基因的表达谱也可作为皮肤屏障状态的指示物。

细胞-细胞粘附是形态发生过程中的重要过程。其确保相邻细胞间的紧密接触，这是细胞分离并且是不同组织的形态和功能分化所必需的。细胞-细胞粘附在健康组织的动态平衡中起重要作用，并在保持皮肤组织的完整性中起特别显著的作用。

皮肤外层中的重要结构物质包括称为角蛋白的纤维状结构蛋白家族。角蛋白单体组装成束以形成牢固且不可溶的中间丝状体，并形成可见于爬行动物、鸟类、两栖动物、和哺乳动物中的强壮的非矿化组织。

如下文示例的，本发明现在显示了本发明的提取物增强了编码参与细胞与细胞粘附及角质形成细胞分化的多肽的数个关键基因的表达。不希望受到任何特定理论或作用机制的束缚，皮肤屏障功能的保持和/或促进可归因于这些基因的表达。

桥粒斑蛋白是高分子量(约332kDa)的(在人类中)由DSP基因编码的同型二聚体蛋白。桥粒斑蛋白是锚定中间丝状体至桥粒斑的功能桥粒的必需组分。桥粒斑蛋白的N-末端对其在桥粒中的定位和与斑菲素蛋白1和斑珠蛋白的N-末端区域相互作用是必需的。N-末端被进一步细分为称为“血小板溶素结构域”、由称为血影蛋白重复的重复结构域构成的区域。血小板溶素结构域的部分的晶体结构已被解析，同时整个血小板溶素结构域使用小角X射线散射已被阐明，其揭示了非线形结构，考虑到血影蛋白重复在线性方向被观察到，这是一个出乎意料的结果。桥粒斑蛋白的C-末端与中间丝状体结合。在桥粒斑蛋白的中间区域，卷曲-卷曲杆状结构域负责其同源二聚化。这个基因中的突变是数种心肌病和皮肤角化病、以及自身免疫性疾病副肿瘤性天疱疮的原因。桥粒斑蛋白已被证明与斑珠蛋白、波形蛋白、角蛋白1结蛋白、PKP1和PKP2相互作用。

角蛋白5，还被称为II型细胞骨架5角蛋白(K5；CK5；KRT5)和角蛋白2A，还被称为角蛋白2E或角蛋白2，是II型细胞角蛋白。II型细胞角蛋白由排列在简单和分层的上皮组织分化过程中成对共表达的异型(heterotypic)角蛋白链中的碱性或中性蛋白组成。II型细胞角蛋白基因聚集在染色体12q12-q13区域。

在人类中，角蛋白5由KRT5基因编码，并与该家族成员KRT14一起在表皮的基底层中特异性表达，以形成角蛋白中间丝状体。这些丝状体组装成强大的网络，导致角质形成细胞附着，以及锚定表皮至皮肤底层。角蛋白中间丝状体网络提供了皮肤的强度和弹性，及保护其免受摩擦力和其它日常物理应力的损坏。

已表明角蛋白5也可在转运黑色素体中起作用，其是产生被称为黑色素的色素的细胞结构。将这些结构转运至角质形成细胞对正常皮肤的着色(色素沉着)是重要的。

角蛋白2A在人类中由KRT2A基因编码。其在来自大多数身体部位的正常成人表皮组织的上部棘层和颗粒基底上层(granularsuprabasallayer)特别表达。

角蛋白1也是角蛋白家族的成员。它与家族成员角蛋白10一起在表皮的棘层和颗粒层中特异性表达。角蛋白1中的突变与先天性大疱性鱼鳞病样红皮病的变种相关，其中手掌和足底受到影响。角蛋白10，也被称为I型细胞骨架角蛋白10、细胞角蛋白-10(CK-10)或角蛋白-10(K10)，在人类中由KRT10基因编码。角蛋白-10是I型(酸性)细胞角蛋白家族成员，其属于中间丝状体(IF)蛋白超家族。

多配体聚糖1是在人类中由SDC1基因编码的蛋白。由该基因编码的蛋白是跨膜(I型)硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，并且是多配体聚糖蛋白聚糖家族的成员。多配体聚糖介导细胞结合、细胞信号传导、和细胞骨架组织，且多配体聚糖受体是HIV-1tat蛋白的内化必需的。多配体聚糖-1蛋白行使内在膜蛋白(integralmembraneprotein)的功能，并参与细胞增殖、细胞迁移和通过其针对细胞外基质蛋白的受体参与细胞-基质相互作用。改变的多配体聚糖-1的表达已在数种不同类型的肿瘤中被检测到。尽管可存在关于该基因的数个转录变体，迄今只有两个变体的全长性质被描述。这两个代表该基因的主要变体，并且两者编码相同的蛋白。

已表明细胞基质粘附调节物(CMAR)基因是影响细胞粘附至胶原蛋白的信号转导分子，并且通过这一点，其可能参与肿瘤抑制。

外皮蛋白是在人类中由IVL基因编码的蛋白。该基因被定位到1q21，1q21中有依钙蛋白I轻链、毛透明蛋白、丝聚合蛋白原、兜甲蛋白和钙周期蛋白。外皮蛋白是存在于表皮和其它复层鳞状上皮的角质形成细胞中的高度反应性的、可溶的、谷氨酰胺转移酶底物蛋白。其首先出现在细胞胞质中，但最终通过谷氨酰胺转移酶变成交联至膜蛋白的，因此有助于在质膜的下方形成不溶性包膜，在角质化包膜的组装过程中行使谷氨酰基供体的功能。外皮蛋白在棘层中合成，并在颗粒层中通过谷氨酰胺转移酶被交联，使得其高度稳定。因此，它提供了对细胞的结构支撑，从而使细胞能够抵御微生物的入侵。

纤连蛋白是高分子量(～440kDa)的细胞外基质的糖蛋白，其结合被称为整合素的跨膜受体蛋白。除了整合素，纤连蛋白还结合细胞外基质组分诸如胶原蛋白、纤维蛋白、和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(例如多配体聚糖)。纤连蛋白作为蛋白二聚体存在，由通过一对二硫键连接的两个几乎相同的单体组成。纤连蛋白的蛋白由单基因产生，但其前体mRNA的可变剪接导致数个同种型的产生。两种类型的纤连蛋白存在于脊椎动物中：可溶性血浆纤连蛋白(以前称为“冷不溶性球蛋白”或CIg)是血浆的主要蛋白组分(300μg/ml)，并在肝脏中由肝细胞产生；和不溶性细胞纤连蛋白，其是细胞外基质的主要组分。它由多种细胞主要是成纤维细胞分泌作为可溶性蛋白二聚体，并且随后在复杂的细胞介导的过程中被组装成不溶性基质。纤连蛋白在细胞粘附、生长、迁移、和分化中起重要作用，且其对诸如伤口愈合和胚胎发育的过程是重要的。改变的纤连蛋白的表达、降解和组织与许多病理包括癌症和纤维化相关联。

本发明的组合物可被配制成任何化妆品学上和/或药学上，通常地皮肤病学上合适的形式，如本领域技术人员已知的。根据某些实施方案，制剂呈洗剂、凝胶或膏剂的形式，呈软膏或油基形式，以及呈可喷射的液体形式。本发明的组合物的其它合适的化妆品产品形式包括，例如，乳剂、摩丝、唇膏、唇彩、洗剂、面膜、软膏、发膏、溶液、浆液或喷雾。

如本文所述的，除了荷荷巴提取物作为活性剂，本发明的组合物可包含合适的药学上或化妆品学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂构成的助剂，其有助于将活性化合物加工成可在药学上或化妆品学上使用的制品。在Remington'sPharmaceuticalSciences(MackPublishingCo.；Easton,Pa.)的最新版本中提供了关于制剂和施用的技术的进一步的详细描述。含有本发明的荷荷巴提取物的组合物可以以本领域已知的方式，例如，通过常规的混合、溶解、制粒、制锭、磨细、乳化、包封、包埋或冻干过程被制造。

根据某些实施方案，本发明的组合物还包含一种或多种相容的化妆品学上或药学上可接受的添加剂，包括但不限于脂肪、乳化剂和辅助乳化剂、亲水性或亲脂性胶凝剂、着色剂、芳香剂、软化剂、湿润剂、防腐剂、维生素、螯合剂、增稠剂、填料、溶剂、亲水性和亲脂性的过滤剂、染料、中和剂、渗透增强剂聚合物等等，以及其它植物性药材诸如芦荟、甘菊等等。

根据某些实施方案，添加剂选自由以下构成的组：抗坏血酸、其衍生物和相应的盐、甘油、柠檬酸、乙酸、亚硫酸盐、苯氧乙醇、EDTA、苹果酸二乙酯、叔丁基氢醌、氨基胍、烟酸/尼克酸、烟酰胺、氯化亚锡、葡萄糖氧化酶、聚乙烯聚吡咯烷酮、磷酸和化妆品学上/药学上可接受的碱。每种可能性都代表本发明单独的实施方案。

根据某些典型的实施方案，组合物被局部应用。

本领域技术人员能够确定包含荷荷巴提取物的组合物的有效剂量或量以及应用方案。有效剂量和方案是指保持或促进皮肤的皮肤屏障功能所需的剂量和方案，如通过例如测量TEWL或如本文所述的以及如本领域技术人员已知的任何方法可被测量的。

根据某些实施方案，本发明的组合物包含相对于组合物的总重量的从0.003％至30％的重量与重量比(w/w)浓度的荷荷巴提取物。根据一些实施方案，荷荷巴提取物在0.3％至10％的范围内。根据典型的实施方案，组合物中荷荷巴提取物的浓度为相对于组合物的总重量的从1％至3％(w/w)。

确切的剂量将由从业者根据与需要治疗的个体相关的某些因素，包括个体特定状态的严重程度、个体的一般健康状况、年龄、体重、和个体的性别、饮食、施用的时间和频率、药物组合、反应敏感性和对治疗的耐受性/反应来确定。作为一般的指导，取决于特定制剂的半衰期和清除率，长效的化妆品组合物可每日一次、每2至4天一次、每周一次、或每两周一次被施用。如本领域技术人员熟知的，这些剂量水平的变化可使用用于优化的标准的经验惯例被调整。关于特定剂量和递送方法的指导在文献中提供，并且是本领域的从业者通常可得的。

根据又另一方面，本发明提供了包含荷荷巴提取物的有效保持和/或促进皮肤结构、强度、内聚力、或其任意组合的组合物，从而保持或促进皮肤屏障功能，该提取物由以下步骤制备：

(a)将荷荷巴植物或其任意部分与至少一种极性溶剂混合；

(b)持续足以形成液体提取物的时间段孵育混合物；

(c)去除荷荷巴植物或其部分，并收集液体提取物；

(d)过滤液体；和

(e)收集滤液。

根据某些实施方案，孵育混合物包括持续从10min至24h、通常从40min至12h、更通常从40min至2h的时间段的孵育。根据另外的实施方案，孵育温度在20-120℃的范围内、通常为60-120℃，更通常为80-110℃。

呈现以下的实施例以更充分地说明本发明的一些实施方案。然而，它们不应以任何方式被解释为限制本发明的宽范围。本领域技术人员可以容易地设计出本文公开的原理的许多变化形式和修改而不脱离本发明的范围。

实施例

实施例1：制造荷荷巴提取物

生命力强的且未被污染的荷荷巴植物具有深绿色至褐色的颜色。因此，针对它们的颜色检查了采集用于提取的植物部分。去除了黄亮色的叶或出现斑点特别是白色斑点的植物部位。然后，植物部分被部分或完全干燥。在室温下，将干燥的植物部分以1:2至1:5的比、通常以1:2的比(植物部分：水)加入水中。在100℃持续2小时加热混合物，并将其过夜冷却。通过在4500rpm离心30min(SigmaLaborzentrifugen3-103645g)去除固体。收集上清液，并通过1.2微米的过滤器，然后通过0.45微米的过滤器并且最后通过0.22微米的过滤器过滤上清液，并收集滤液。向滤液中加入1％的抗坏血酸1％和50％的甘油以形成最终的组合物。

组合物规格如下：干重：36-41mg/g；pH-4-4.3，Trolox当量(TAA)120mM。多酚值：22200mg/L；没食子酸当量(GAE)，清澈溶液，棕色。

实施例2：荷荷巴提取物对角质形成细胞基因表达谱的影响

用0.03％的荷荷巴提取物(hBA15m-NHEK批次15/10/07，如上文实施例1中所述的以叶：水比为1:2制备；苯酚含量7617.7mg/L没食子酸当量；Trolox当量108.6mM；不添加防腐剂)进行了cDNA阵列基因表达研究。用试验培养基进行源提取物(sourceextract)的稀释(见下文)。

材料和方法

生物模型

细胞类型：正常人表皮角质形成细胞(NHEK)

使用第3次传代的K₀₇₄

培养条件：37℃、5％CO₂

培养基：补充了表皮生长因子(EGF)0.25ng/ml–垂体提取物(PE)25μg/ml(Invitrogen3700015)、庆大霉素25μg/ml(SigmaG1397)的角质形成细胞-SFM(Invitrogen17005-034)

试验培养基：补充了庆大霉素25μg/ml(SigmaG1397)的角质形成细胞-SFM(Invitrogen17005-034)

初步细胞毒性试验

-平板规格：96孔

-细胞/孔：20000NHEK，角质形成细胞-SFM-EGF-PE培养基

-重复：6

-浓度范围：见表2

-细胞/化合物接触：24小时

-评价参数：MTT还原试验及用显微镜(物镜x10)的形态学观察

培养和处理

将正常人表皮角质形成细胞(NHEK)的细胞接种于12孔板中的培养基中直到汇合，且然后，置于试验培养基中。然后，将荷荷巴提取物加入到测试孔中，并将细胞在37℃和5％CO₂下培养24小时。在单独的试验培养基中培养的细胞被用作对照。以n＝3进行每个条件(测试/对照)。

在孵育时间结束时，用PBS溶液(Invitrogen14190094)洗涤细胞；加入300μl的TriReagent，并将细胞立即冷冻于-80℃。

通过微型芯片分析差异表达

使用致力于基因表达的研究且特别适用于筛选目的的标准的微型芯片(由BIOalternatives，France生产)进行基因表达分析。

使用BIOalternatives点样设备(非接触式点样器，piezzotechnology,Piezorray,PerkinElmer)和cDNA特异性目的标志物点样这些尼龙芯片(<3cm²)。使用允许当前使用的规格小型化以及有成本效益的分析的专有技术进行分析。其基于使用mRNA作为逆转录的模板和³³P标记(最佳灵敏度)。该实验中检查的基因的简述示于下文表1。

使用TriReagent(标准方法)提取每种培养物的mRNA。使用[³³P]-dATP和oligodT通过mRNA的直接逆转录制备多个³³P标记的cDNA靶。RNA的质量对照示于图2。

将这些标记的cDNA靶与共价地固定到微型芯片上的特异性cDNA探针杂交。充分洗涤后，通过PhosphorImaging显示与其探针杂交的每个特异性靶的相对量。

使用“Cyclone”PhosphorImager(Packardinstruments；72hexposition)和图像分析软件ImageQuantTL(AmershamBiosciences)通过斑点放射性的直接定量进行分析。

表1：用于评价荷荷巴提取物的作用的含164个基因(+对照和管家基因)的支持微型芯片的结构

定量RT-PCR

逆转录

-根据供应商建议使用Tri-reagent从每个样品提取总RNA。

-使用DNAfree体系(Ambionref1906)去除DNA的潜在污染痕迹。

-mRNA的逆转录在oligo(dT)和SuperscriptII逆转录酶(Invitrogen)的存在下进行。

实时PCR分析

按照供应商推荐的方法使用***(RocheMolecularSystemsInc.)一式三份进行PCR反应。该***在确定被测试的引物的分析条件后允许快速并强大的PCR反应。它由两个组件组成：

热循环仪：优化用于快速PCR应用；允许反应混合物中非常快速的热传递。

荧光计：允许嵌入染料SYBRGreenI的恒定荧光测量；在延伸循环过程中，与双链DNA特异性结合的染料(检测波长：521nm)。

实时(RT)PCR被用于在上述微型芯片试验中显示升高的表达的候选基因的定量分析。使用23kDa高碱性蛋白，还被指定为60S核糖体蛋白L13A(RPL13A，登录号NM_002423)作为内部标准对照，其扩增产生了483bp的片段。检查了三种基因：细胞角蛋白5、桥粒斑蛋白和去乙酰化酶1。

定量PCR数据管理

掺入扩增的DNA的荧光染料在PCR循环期间被连续地测量。结果被绘制成“荧光强度”对“PCR循环”图，允许评价每个标志物的相对表达(RE)值。

选择用于RE计算的值是荧光曲线的“输出点”。对于考虑的标志物，最高是循环次数且最低是mRNA的量。

根据下式以任意单位(AU)表示RE值：

(1/2^循环次数)x10⁶

数据管理

用Microsoft软件分析原始数据。

平均值标准误差(sem)根据平均值＝Sd/√n来计算

活力百分数(％)根据(OD样品/OD对照)×100测量

结果

细胞毒性的初步分析

表2总结了荷荷巴提取物对角质形成细胞培养物活力的影响。

表2：荷荷巴提取物对角质形成细胞活力的影响

+：正常群体；+/-：生长下降；(-)：毒性；0：细胞死亡；g：化合物颗粒；*形态改变；ag：凝集的细胞；sem：平均值标准误差

通过微型芯片分析基因表达

设计具有全部测试的基因的微型芯片示于上文表1。图1显示，相比用具有0.03％荷荷巴提取物处理24h的角质形成细胞(图1B)，对照角质形成细胞中测试的基因的表达(图1A)。

通过定量RT-PCR分析基因表达

使用了以下的基因表达分类：

相对表达(％对照)	作用的分类
		>150％和<200％	中度刺激，待确认
>200％	刺激
		>300％	强刺激
<65％和>50％	中度抑制
		<50％和>30％	抑制
<30％	强抑制

下列基因显示受到刺激：

细胞角蛋白5(K5；CK5)，还被指定为II型细胞骨架5角蛋白(KRT5)；58-kDa细胞角蛋白：229％的相对表达(＝刺激)；

桥粒斑蛋白I&II(DSP；DPI&DPII)：185％的相对表达(＝中度刺激)；

细胞角蛋白2E/A(K2E；CK2E)，还被指定为II型细胞骨架2表皮角蛋白(KRT2E；KRT2A)；(Siemens表皮大疱性鱼鳞癣)：160％的相对表达(＝中度刺激)；

细胞角蛋白1(K1；CK1)，还被指定为II型细胞骨架11角蛋白(KRT11)；67-kDa细胞角蛋白；头发α蛋白：156％的相对表达(＝中度刺激)；

多配体聚糖-1(SYND1；SDC1)，还被指定为CD138抗原：160％的相对表达(＝中度刺激)；

细胞基质粘附调节物(CMAR；CAR)：146％的相对表达(＝中度刺激)；

细胞角蛋白10(K10)，还被指定为I型细胞骨架10角蛋白：146％的相对表达(＝中度刺激)；

外皮蛋白：154％的相对表达(＝中度刺激)；

纤连蛋白(FN)：146％的相对表达(＝中度刺激)；

实施例3：荷荷巴提取物的毒性评价

通过持续48h向健康成人志愿者的背部皮肤单一应用在封闭的贴片下的该提取物测量皮肤对荷荷巴提取物的耐受性。

18-70岁、女性或男性、研究区域无皮肤病损伤、并能够满足研究语言的需要的24位志愿者参与了这项研究。按上文实施例1中描述(叶：水比为1:2，苯酚含量13,110mg/L没食子酸当量；Trolox当量92.5mM)制备的荷荷巴提取物被稀释了X2。在贴片下的0.02ml被应用到每位志愿者的背部皮肤。在临研究之前进行接触区的检查，以便应用产物至不受肉眼可见的刺激标记、疤痕或可能会干扰结果读取的任何异常的表面。平行地应用空的贴片作为阴性对照。

48小时后，去除贴片，且区域由皮肤科医生根据预定的量表如下评价：红斑；干燥/脱屑；水肿和水疱。

根据上述实验条件下，持续48h向24位健康志愿者单一应用在封闭的贴片下的0.02ml稀释至50％的荷荷巴提取物后，将提取物定义为关于其主要的皮肤耐受性是无刺激性的。

实施例4：经皮水分流失(TEWL)测量

在11位健康女性志愿者(43至67岁)的双盲试验中检查了经皮水分流失(TEWL)。使用(Courage&Khazaka)在首次应用之前(D0)和应用之后第28天(D28)测量了志愿者的前臂上的TEWL。在每只前臂进行两次测量，并计算平均值。以百分数计算D0和D28之间TEWL的变化。TEWL的减少代表皮肤屏障功能的改善。

每位志愿者都使用了试验产品(含有5％的荷荷巴提取物的凝胶，其规格显示在下文表3)与安慰剂(不含荷荷巴提取物的相同凝胶，用甘油和水代替荷荷巴提取物)。以随机化模式将每种产品应用到不同的前臂。

表3：试验产品的组成

在试验的28天期间由志愿者自己一天两次(在早晨和晚上)每天应用试验和安慰剂产品至指定区域。该区域在应用前被清洗；按摩产品直到完全的产品渗透；量是根据需要的量。

进行两次TEWL测量的平均值被保持为实验值。D0和D28之间的TEWL变化示于表4中(以％计)：

表4：为两种产品的TEWL变化(％)

志愿者编号	试验产品	安慰剂
			1	-9％	15％
2	5％	6％
			2	-27％	-20％
4	-11％	-20％
			6	-24％	-27％
7	-1％	12％
			8	-24％	-33％
9	9％	47％
			10	-5％	6％
11	-4％	-23％
			12	-38％	-32％
平均值	-12％	-6％
			Std	15％	25％
最大值	9％	47％
			最小值	-38％	-33％
学生t检验	2％	16％

一天两次持续28天被应用至11名女性志愿者的含5％荷荷巴提取物的试验产品显示了皮肤屏障功能的统计学显著的改善，具有TEWL的12％的下降，而安慰剂凝胶的TEWL变化并不显著。

实施例5：荷荷巴提取物对皮肤内聚力和外观的影响

通过使用(EOTECH-France)体内检查皮肤缓解参数(cutaneousreliefparameter)评价荷荷巴提取物的抗衰老作用。皮肤缓解参数包括平均粗糙度(Ra)；最大幅度(Rt)；和平均缓解(Rz)。

试验基于计算来自具有干涉条纹投影图像的相位图。然后，该图像允许确定每个点的高度。采集软件允许获得2D和3D测量以及确定沿目的区域分布的50个垂直剖面的皮肤缓解的参数。重新定位的自动***允许测量区域的精确再鉴定。

二十六(26)位健康女性志愿者(46-64岁)参与了这项研究。应用方案如上文实施例4中描述的。试验产品是含有3％的荷荷巴提取物的凝胶(指定为其规格如下文表5中所示)和安慰剂(不含荷荷巴提取物的相同凝胶，以对应于活性凝胶中的提取物贡献的比例的水平，用水、甘油和焦亚硫酸钠代替荷荷巴提取物，并通过加入适当的FD&C着色剂以匹配活性产品的最终颜色)。

表5：试验产物IBR 的组成

所研究的参数是：

(1)Ra：平均粗糙度(以μm计)：该参数的减少表征平滑效果；(2)Rz：平均缓解(以μm计)：所有峰谷高度的平均值；(3)Rt：缓解幅度(以μm计)：5个最大峰谷高度的平均值。

这些参数(Rt和Rz)之一的减少表征了产品的张力作用。

在产品应用之前(D0)和之后(D28)测量所有参数。结果的综合示于下文表6。对皮肤的可视化效果示于图3。

表6：皮肤缓解参数的变化

在这些研究条件下，使用28天后，含荷荷巴提取物的试验产品引起了：

-平均粗糙度(Ra)的显著减少，平均为-2.1μm，即-6％；

-在65％的受试者中观察到平滑效果；

-平均缓解(Rz)的显著减少，平均为-8.6μm，即-8％。

-缓解幅度(Rt)的显著减少，平均为-18.0μm，即-9％；和

在65％至73％的受试者中观察到张力效果。

总之—观察到平均粗糙度的显著减少，表明活性产品的显著的平滑效果。发现平均缓解的显著减少和缓解幅度的显著减少，导致活性产品的显著张力作用。

实施例6：荷荷巴提取物对细胞内聚力的影响

通过分析用从前臂移除的皮肤样品评价荷荷巴提取物(在上文实施例5中描述的)对角质层内聚力的影响。使用控制应用期间施加的压力。

使用SkinImage与软件进行样品分析：以标准化的方式(35°)照射剥除的表面，并用连接至计算机的数码相机观察。所研究的区域是1cm²。

获得的数字化图象以灰度级被分析，以确定由移除的鳞屑(以mm²计)和脱屑指数(细胞层的占据的表面和厚度之间的比)占据的表面。

在前臂上界定了非常接近的区域。用采集第一个区域(t0)上的第一个样品，以界定鳞屑的基量。在应用试验产品(t1)后和在不同的动力学(ti)立即采集其它样品。

t1和t0之间的差异给出了关于由产品应用去除的鳞屑量的信息。

(ti-t0)和(t1-t0)之间的差异给出了关于归因于试验产品的角质层内聚力的信息：如果应用后2小时比紧邻应用后采样较少的鳞屑，这意味着产品增加了角质细胞之间的内聚力，其因此被留在皮肤上。

上文描述的特定实施方案将如此充分地揭示本发明的一般性质，以致其他人可通过应用现有知识，容易地修改和/或调整此类实施方案用于各种应用，而无需过度实验并且不脱离一般概念，并因此，这种调整和修改应当并且预期被理解为在本公开的实施方案的等同物的含义和范围内。被理解的是，本文使用的措辞或术语是为了描述的目的而不是限制的目的。用于实施各种公开的功能的装置、材料和步骤的可采取多种替代形式而不偏离本发明。

Claims

1.极性溶剂中的荷荷巴(加州希蒙得木(Simmondsiachinensis))植物或其部分的提取物在制备用于促进细胞与细胞的粘附从而保持和/或促进皮肤屏障功能的组合物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述组合物包含有效保持和/或促进皮肤结构、强度或其组合的量的所述荷荷巴的提取物。

3.根据权利要求1-2中任一项所述的用途，其中保持和/或促进皮肤屏障功能包括保持或减少皮肤脱水率；保持或促进皮肤水合值；保持或促进保护免受环境危害和其任意组合中的至少一种。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述组合物在保持或改善皮肤健康、皮肤完整性、皮肤紧实度、皮肤延展性、皮肤弹性、皮肤整体外观和其任意组合中的至少一种中是有效的。

5.根据权利要求4所述的用途，其中改善皮肤健康包括减轻湿疹、皮肤病、寻常型银屑病、扁平苔癣、鱼鳞癣、寻常型鱼鳞癣和胆管炎的症状；预防起泡性疾患；保持正常皮肤动态平衡；促进皮肤伤口愈合及其任意组合中的至少一种。

6.根据权利要求4所述的用途，其中促进皮肤整体外观包括预防老化和风化的皮肤的可见征象，包括皱纹和细纹；使皮肤表面光滑；减少皮肤毛孔大小或其任意组合中的至少一种。

7.根据权利要求1所述的用途，其中保持和/或促进皮肤屏障功能是与预定阈值相比而确定的。

8.根据权利要求2所述的用途，其中保持和/或促进皮肤结构、强度或其组合是与预定阈值相比而确定的。

9.根据权利要求7-8中任一项所述的用途，其中所述预定阈值是在将所述组合物施用至皮肤之前测量的值。

10.根据权利要求7-8中任一项所述的用途，其中所述预定阈值是获自具有健康皮肤的个体的平均值。

11.根据权利要求7-8中任一项所述的用途，其中所述预定阈值是获自具有受干扰的皮肤的个体的平均值。

12.根据权利要求1所述的用途，其中所述极性溶剂选自由以下构成的组：水、乙醇、丙二醇、丁二醇、甲醇、甘油、丙醇、丁醇、二丙二醇、戊二醇、己二醇、二甲基甲酰胺、乙腈、二甲基亚砜、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、甲酸、乙酸、丙酮和其任意组合。

13.根据权利要求12所述的用途，其中所述极性溶剂是水。

14.根据权利要求12所述的用途，其中所述极性溶剂是水以及乙醇、丙二醇、丁二醇、甲醇、甘油和丙酮中的至少一种。

15.根据权利要求1所述的用途，其中所述组合物是化妆品或药物组合物，所述化妆品或药物组合物还包含化妆品学上或药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。

16.根据权利要求15所述的用途，其中所述化妆品或药物组合物被配制用于局部应用。

17.根据权利要求1所述的用途，其中所述组合物还包含至少一种另外的活性成分。

18.根据权利要求1所述的用途，其中所述荷荷巴的提取物由包括以下步骤的方法制备：

a.将荷荷巴植物或其部分与至少一种极性溶剂混合，以形成混合物；

b.持续足以形成液体提取物的时间段孵育所述混合物；

c.去除所述荷荷巴植物或其部分，并收集所述液体提取物；

d.过滤所述液体提取物；和

e.收集滤液。

19.根据权利要求18所述的用途，其中所述孵育的温度在20℃-120℃的范围之内。

20.根据权利要求18所述的用途，其中步骤(e)的滤液通过具有小于1.5μm的孔径的过滤器被进一步过滤。

21.根据权利要求18所述的用途，其中所述荷荷巴植物的所述部分选自由以下构成的组：根、茎、叶、种子、果实或其任意组合。

22.根据权利要求18所述的用途，其中所述荷荷巴植物的所述部分是叶。

23.根据权利要求18所述的用途，其中所述荷荷巴植物或其部分呈选自由以下构成的组的形式：新鲜的、部分干燥的或完全干燥的形式。