CN105708789B - 一种载药纳米纤维微球/水凝胶复合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种载药纳米纤维微球/水凝胶复合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开的一种载药纳米纤维微球/水凝胶复合物及制备方法和应用，该复合物是先将聚乳酸‑泊洛沙姆F68‑聚乳酸多嵌段聚合物和微管抑制类药物采用低温冷冻/相分离的方法制备载药纳米纤维微球，然后再将其分散于由聚乳酸‑反式泊洛沙姆‑聚乳酸多嵌段聚合物配置形成的水凝胶中。该复合物中的载药纳米纤维微球的含量为5～35wt％，粒径为20～200μm，实际载药量为7.45～17.32％，包封率为86.64～93.17％；而溶胶中聚乳酸‑反式泊洛沙姆‑聚乳酸多嵌段聚合物的含量至少10wt％，其敏感温度≥25℃。本发明不仅可使损伤部位药物量增加，作用时间延长，显著减少给药次数，且能有效解决微球在植入部位存在的移位与崩解的问题。

Description

一种载药纳米纤维微球/水凝胶复合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于医药用高分子材料及其制备和应用技术领域，具体涉及一种载药纳米纤维微球/水凝胶复合物及其制备方法和应用。
背景技术
脊髓损伤具有致残率高、病死率低、社会负担重等特点，是医学界目前急需解决的世界性难题之一。据不完全统计，全美有250000人受到脊髓损伤的影响，不仅如此，每年还有13400例新发脊髓损伤病例。脊髓损伤可以分为原发性损伤和继发性损伤两个过程。在原发性损伤过程中，因损伤因素，如脊柱的骨折、屈曲、旋转、脱位、压迫等会破坏细胞膜的完整性而导致大量的钙离子内流进入细胞内，这个过程触发了包括炎症、氧自由基的释放、细胞凋亡等一系列的继发性生物效应，从而损伤由最初受伤部位向邻近组织蔓延，导致邻近组织的损害。目前脊髓损伤的治疗方案包括手术治疗、药物治疗、康复治疗等，这些方法旨在控制继发性损伤的产生，保护残存的神经功能，但其治疗效果都比较有限。
脊髓损伤修复的两大障碍是纤维变性胶质瘢痕的形成和机体自身的轴突自主再生能力较差。近期有文献报道，脊髓损伤修复的这两大障碍受微管动力学的控制(RuschelJ,Hellal F,Flynn KC,et al.Axonal regeneration.Systemic administration ofepothilone B promotes axon regeneration after spinal cordinjury.Science.2015；348(6232):347-52.)。脊髓损伤后转化生长因子-β(TGF-β)的表达显著增加，TGF-β通过调控下游信号因子Smad 2的核转导来促进胶质瘢痕形成相关蛋白如层连蛋白和纤连蛋白的表达，从而促进瘢痕的形成。而脊髓损伤部位的瘢痕会释放轴突生长抑制因子，促进硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPGs)的表达，进而抑制轴突再生。然而正常机体内，脊髓部位的Smad 2可通过驱动蛋白(Kinesin-1)与微管结合，从而减少胶质瘢痕形成相关蛋白的表达。研究发现，小剂量的微管抑制剂紫杉醇(商品名：泰素)可使Smad 2与微管的结合更加牢固，通过减少胶质瘢痕的形成以及促进轴突的再生来发挥促进脊髓损伤修复的效果(Hellal F,Hurtado A,Ruschel J,et al.Microtubule stabilization reducesscarring and causes axon regeneration after spinal cord injury.Science.2011；331(6019):928-931)。
然而，上述研究采用的给药方式是脊髓损伤部位原位注射药物溶液的方式给药，由于纯药物在脊髓损伤部位的代谢速度较快，生物利用度低，因而需要频繁给药，从而导致患者顺应性变差，且增加了治疗成本。因此引入药剂学方法来制备具有缓释控释效应的药物传输载体，不仅可以减少给药次数，还能提高药物的生物利用度，降低毒副作用，提高治疗效果。可降解载药微球是一种应用非常广泛的药物传递***，它是药物溶解或者分散在高分子材料基质中形成的微小球状实体，与传统剂型相比具有以下优点：(1)可大大降低给药剂量和频率，提高患者的顺应性；(2)缓释时间长，可延长半衰期较短药物的作用时间，使体内血药浓度稳定，保证治疗效果；(3)毒副作用小；(4)具有靶向性；(5)提高药物稳定性，保护多肽及蛋白质免受酸和酶的破坏。如用载药微球原位化疗，因具有缓释效应，可减少给药次数，提高疗效并且显著降低不良反应。
虽然微球给药剂型具有诸多优点，且目前属于高分子材料类微球中的多孔/介孔微球，因其比表面积更大、稳定性好、可控性强和表面渗透能力强等特点，在材料科学、生物工程、医学研究等领域均有着广泛的应用。而以碳酸钠、碳酸氢钠等盐类化合物作为致孔剂的致孔效果还不错，但是因有部分盐离子会留在微球中，故而根据微球的应用过程中的要求还需要进行后续处理，这不仅要导致制备工序增加，且还不能保证完全除去【戴平望，可降解聚乳酸多孔微球的制备探究[J].应用化工,2014,43(3),449-452.】，虽然碳酸氢铵在分解过程中能直接分解成氨气和二氧化碳，利于微球孔的形成，但所得的微球表面上的介孔实际上是一种极小的针孔状结构，且分布不均匀，也没有达到贯穿整个微球体的效果。另外，单纯的PLA均聚物虽有较高的熔点和黏度，但流动性和热稳定性较差，大分子链中不含可反应活性基团，因此导致亲水性差、降解速度慢、不利于细胞在材料表面黏附和生长。且单独采用微球作为注射植入药物传递***，由于注射入体内的微球分散面积大，随着身体的运动等原因很容易造成微球的崩解和移位等问题(蒋国强，林莹，孙佳丽，等。微球/温敏凝胶复合植入给药***的释药特征及模型[J].中国科技论文,2012,7(3),224-229)。崩解和移位现象的存在会使微球的缓控制释放受到影响，从而导致病灶部位实际作用的药量不足。而且给药初期微球骨架的崩解将引起药物的突释，而药物的突释有可能导致血药浓度接近或超过中毒水平，产生明显的毒副作用，且突释现象会影响缓释剂在后期的药物释放速率和释放周期，不能达到预期的治疗效果。(Wang Y,et al.Triblock copolymer F127sustains insulin release and reduces initial burst ofmicrospheres—in vitro and in vivo study.Colloid Polym Sci(2006)285:233–238.)
智能型水凝胶是一种能显著地溶胀于水但在水中并不能溶解的三维网络或互穿网络，它能对外界刺激如：温度、pH值、磁场、电场、溶剂、光、化学物质等会发生响应，产生不连续的体积变化。由于智能型水凝胶的这种独特的响应性，其在药物控制释放、传感器、记忆元件开关、组织工程等方面都具有很好的应用前景(Yu L,Ding JD.Injectablehydrogels as unique biomedical materials.Chem Soc Rev.2008；37(8):1473-1481)。其中以生物可降解性嵌段聚合物材料制备的凝胶，因其生物可降解性及良好的生物相容性，更有着良好的发展前景，尤其是温度敏感型凝胶。这类凝胶为通过非共价键连结形成的物理凝胶，即可逆凝胶，它能随温度变化发生胶-溶的转变。因此，很多研究将载药的可降解载药微球分散在这种凝胶中，形成微球/凝胶复合释药***，以有效防止微球在注射部位的移位现象和防止由于微球的崩解而造成的药物突释等问题(Lee J,Tan CY,Lee SK,etal.Controlled delivery of heat shock protein using an injectable microsphere/hydrogel combination system for the treatment of myocardial infarction[J].Journal of Controlled Release,2009,137(3):196-202；Wang Y,Gao JQ,Li F,etal.Triblock copolymer F127sustains insulin release and reducesinitial burst of microspheres-in vitro and in vivo study.Colloid PolymerScience,2006,285(2):233-238)。
为了综合水凝胶和微球的优势，昝佳等人将载有5-氟尿嘧啶的聚羟基丁酸酯微球分散在壳聚糖凝胶中，形成了适合原位注射植入，并具有缓慢释放药物的微球/凝胶释药体系(昝佳,朱德权,谭丰苹,等.聚羟基丁酸酯缓释微粒作用下的埋植给药***.J Tsingh uaUniv(Sci&Tech),2005,45(9)，1258-1262.)；而赵名艳等人通过在海藻酸钠水凝胶中负载具有控释功能的壳聚糖微球，并通过壳聚糖的降解调控包载在其内的生长因子的释放速率(赵名艳，李立华，周长忍，周炬光.载荷壳聚糖微球的海藻酸钠水凝胶的制备.Progress inModern Biomedicine.2011,11(11),2006-2010.)，但因该壳聚糖水凝胶降解速度快，且降解速度难以控制，而海藻酸钠很不稳定，在生产、应用过程中都存在严重的降解，加之海藻酸钠是一种高聚合度的多糖类物质，其凝胶性强、黏度大、水溶性较差、不易被吸收，因此限制了海藻酸钠在许多其他方面的应用(吴海歌，张玉娟，罗福文,等.海藻酸钠降解菌的筛选及其发酵条件的优化.食品科技，2014，39(8)，31-36.)。
为了解决以上壳聚糖和海藻酸钠凝胶存在的问题，CN 101255235B公开了一种PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物，该共聚物在正常条件下是固体或粘稠液体，可溶于水，具有温度敏感性，可以作为温度敏感性水凝胶使用，但是其合成方法复杂。首先需以辛酸亚锡为催化剂，并采用MPEG在130-150℃加热反应3～12小时引发己内酯开环聚合，得到MPEG-PCL二嵌段共聚物；然后再将上述步骤制得的MPEG-PCL二嵌段共聚物用异佛尔酮二异氰酸酯作交联偶联剂继续反应0.5～2小时，才能得到PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物。由于其中还加有具有一定毒性的二异氰酸酯作为交联偶联剂，且又没有提及如何去除具有毒性的偶联剂，使得其具有一定的毒性残留危险，且合成方法复杂也不利于放大生产。
泊洛沙姆(商品名Pluronic)是一类由聚氧乙烯和聚氧丙烯组成的非离子型三嵌段聚合物(PEO-PPO-PEO)，具有实用性、生物相容性、无毒性以及逆转肿瘤多药耐药性(MDR)等一系列优点。美国药典28版共收载5种不同规格的泊洛沙姆(124，188，237，338，407)，其中泊洛沙姆188已在国外上市品种中作为静脉注射剂的乳化剂使用，其它规格的泊洛沙姆均已用于口服或外用制剂中。具有相反序列的另外一种三嵌段聚合物是PPO-PEO-PPO(商品名Pluronic-R)也是一种非离子型嵌段聚合物(25R8，25R4，10R5，17R4等)，也被广泛应用于医药等领域(Wang QQ,Li L,Jiang SP.Effects of a PPO-PEO-PPO triblock copolymeron micellization and gelation of a PEO-PPO-PEO triblock copolymer in aqueoussolution.Langmuir 2005,21,9068-9075)。但是，由于泊洛沙姆类的聚合物临界凝胶浓度较高，如其中的反式泊洛沙姆10R5即便在浓度大于90％以上时都依然不能形成凝胶，因而使用这种材料制备凝胶无疑会大大增加原料的使用量，从而会大大增加制备成本。另外由于PPO链段疏水性较小，导致泊洛沙姆通常具有较高的临界胶束浓度，从而还会使其在注射入人体后容易遭到破坏。故采用单纯的泊洛沙姆材料是很难以水凝胶的形式与微球形成复合释药***。
发明内容
本发明目的在于针对现有技术存在的不足，首先提供一种载药纳米纤维微球/水凝胶复合物的制备方法。
本发明另一目的是提供一种由上述方法制备的载药纳米纤维微球/水凝胶复合物。
本发明的再一目的是提供一种上述载药纳米纤维微球/水凝胶复合物的应用。
本发明提供的载药纳米纤维微球/水凝胶复合物的制备方法，该方法的工艺步骤和条件如下：
(1)将46～340份的聚乳酸-泊洛沙姆F68-聚乳酸多嵌段聚合物和以聚乳酸-泊洛沙姆F68-聚乳酸多嵌段聚合物的质量份计8～20％的微管抑制类药物加入50～70℃、2500～20000份有机溶剂中，搅拌使其充分溶解，得到澄清溶液A；将以溶液A的体积计3～6倍的溶剂B于水浴中预热至50～70℃，然后加入按溶剂B的体积计0.1～0.3％的分散剂，形成混合溶液C；在搅拌条件下，将混合溶剂C缓慢加入到澄清溶液A中，加完后继续搅拌10～30min倒入液氮中，静置20～40min得到冷冻物；以冷冻物体积计向其中加入≥1倍体积的冰水混合物，进行溶剂交换24～48h后用蒸馏水洗涤3～6遍，冷冻干燥后于20℃以下保存，即制得载药的纳米纤维微球；
(2)将聚乳酸-反式泊洛沙姆-聚乳酸多嵌段聚合物按配置后浓度至少10wt％的量加入生理盐水中混合均匀，然后升温至50～60℃搅拌形成聚乳酸-反式泊洛沙姆-聚乳酸多嵌段聚合物溶液；
(3)将所得载药纳米纤维微球按5～30wt％加入所制备的聚乳酸-反式泊洛沙姆-聚乳酸多嵌段聚合物溶液中，于50～60℃下搅拌混合均匀，然后于4℃处理24h即可。
以上方法中步骤(1)所用的聚乳酸-泊洛沙姆F68-聚乳酸(PLA-F68-PLA)多嵌段聚合物，其理论数均分子量为1.5～3.0×104。该多嵌段聚合物是由以下方法制备而成的：该方法是将质量比为0.786～2.57的L-丙交酯、泊洛沙姆F68及按照L-丙交酯与泊洛沙姆F68的总质量计0.3％的辛酸亚锡作为催化剂加入到反应容器中，于氮气流保护下，将反应物加热至140-180℃，搅拌反应15-24h，冷却至室温，然后按照常规的方法提纯(李资玲，熊向源，龚妍春，李玉萍.包埋紫杉醇的Pluronic P85/聚乳酸纳米粒子制备及体外释放行为考察.中国实验方剂学杂志.2014.20,1-4.)，即用二氯甲烷先溶解反应所得物，再加入以二氯甲烷体积计10倍量的甲醇中，有白色物质析出后，过滤，用二氯甲烷溶解白色沉淀物后再放入以二氯甲烷体积计10倍量的***中，过滤，干燥，即得聚乳酸-泊洛沙姆-聚乳酸多嵌段聚合物。
以上方法中步骤(1)所用的有机溶剂为三氯甲烷、丙酮、乙醇、已腈或四氢呋喃中的至少一种，优选丙酮和四氢呋喃。
以上方法中步骤(1)所用的溶剂B为丙三醇、相对分子质量为200-600的聚乙二醇和季戊四醇中的至少一种。
以上方法中步骤(1)所用的微管抑制类药物为多烯紫杉醇(Docetaxol，缩写DOC)或卡巴多赛。
以上方法中步骤(1)所用的分散剂为反式泊洛沙姆10R5或反式泊洛沙姆17R4。
以上方法中步骤(1)所制备的多嵌段聚合物纳米纤维载药微球，该微球是由纳米纤维丝自然交织构成的中空微球，其粒径为20～200μm，微球表面的纳米纤维丝直径为400～1200nm，理论载药量为8～20％，实际载药量7.45～17.32，包封率至少为86.64～93.17％。
以上方法中步骤(2)所用的聚乳酸-反式泊洛沙姆-聚乳酸多嵌段聚合物是按照以下方法制备：在惰性气体保护下，将L-丙交酯、反式泊洛沙姆按质量比0.185～1.4与以反式泊洛沙姆与L-丙交酯的总质量计0.3％的辛酸亚锡催化剂混合，并于130-160℃加热反应5-12h，冷却，然后加入溶剂溶解反应所得物后再放入-20℃的石油醚中沉淀，过滤，反复操作2～3次后干燥、提纯即得聚乳酸-反式泊洛沙姆-聚乳酸多嵌段聚合物。其中，所用的反式泊洛沙姆为反式泊洛沙姆10R5(Mn＝2000)或反式泊洛沙姆17R4(Mn＝2700)，优选反式泊洛沙姆10R5，且L-丙交酯与反式泊洛沙姆10R5的质量比为0.25～1.4，L-丙交酯与反式泊洛沙姆17R4的质量比为0.185～1.185；具体所用的提纯方法是：将干燥所得物溶于去离子水中，然后使用透析袋透析除去小分子单体及过量的催化剂，透析后所得多嵌段聚合物冷冻干燥后密封保存。
以上方法中步骤(2)所制得的聚乳酸-反式泊洛沙姆10R5-聚乳酸多嵌段聚合物的理论数均分子量为2.5～4.8×103，所制得的聚乳酸-反式泊洛沙姆17R4-聚乳酸多嵌段聚合物的理论数均分子量为3.2～5.9×103。
以上方法中步骤(2)所制得的聚乳酸-反式泊洛沙姆-聚乳酸多嵌段聚合物溶液形成水凝胶的临界凝胶浓度(CGC)优选10～50wt％，更优选10～35wt％，临界凝胶温度(CGC)为25～35℃。
本发明提供的由上述方法制备的载药纳米纤维微球/水凝胶复合物，该复合物是由溶胶和均匀分散在其中的载药纳米纤维微球组成，载药纳米纤维微球的含量为5～35wt％，该微球是由纳米纤维丝自然交织构成的中空微球，其粒径为20～200μm，理论载药量为8～20％，实际载药量为7.45～17.32％，包封率为86.64～93.17％；溶胶中聚乳酸-反式泊洛沙姆-聚乳酸多嵌段聚合物的含量至少10wt％，优选10～50wt％，更优选10～35wt％，其敏感温度≥25℃，优选25～35℃。
本发明提供的载药纳米纤维微球/水凝胶复合物的应用是在用于急性脊髓损伤修复的应用。
本发明与现有技术相比，具有以下优点：
1、由于本发明将装载有治疗急性脊髓损伤修复药物——微管抑制类药物的纳米纤维微球创造性地与能够形成水凝胶的聚乳酸-反式泊洛沙姆-聚乳酸多嵌段聚合物溶液结合在一起，制备了一种载药纳米纤维微球/水凝胶复合物，该复合物可直接注射于脊髓损伤部位，进行区域性缓释化疗，因而不仅可使损伤部位药物量增加，作用时间延长，显著减少给药次数，且能有效解决微球在植入部位存在的移位与崩解的问题。
2、由于本发明提供的复合物中的纳米纤维微球是以多嵌段聚合物PLA-F68-PLA为基体材料，采用低温冷冻/相分离的方法，在无表面活性剂存在的条件下制备出来的，不仅制备方法简单，且所得的纳米纤维微球是由纳米纤维丝自然交织构成的中空微球，比表面积大，能够增加药物在微球纳米纤维外壳中的均匀分散程度，包覆率高，能有效控制药物的释放，降低毒副作用，达到良好的治疗效果。
3、由于本发明提供的复合物中的水凝胶是由PLA-10R5-PLA或PLA-17R4-PLA多嵌段聚合物制备的温度敏感性水凝胶，其不仅可增加凝胶的强度，也可方便使用，加上其生物相容性好、可在体内自行降解，因而不仅具有良好的生物安全性，且还改变了泊洛沙姆类的聚合物的临界凝胶浓度较高，甚至不能形成凝胶的状况。
4、由于本发明制备的纳米纤维微球/凝胶复合物可以冻干后以粉末形式保存、制备的凝胶不需要使用交联剂等优异的特征，因此在药物释放控制***及生物医用高分子材料等应用领域具有极好的应用前景。
5、由于本发明方法操作简便，产物得率高、凝胶强度可调、生物相容性好，可适用于大规模生产。
附图说明
图1为实施例4所制备的PLA-F68-PLA纳米纤维微球的扫描电镜图。表明制备的纳米纤维微球的表面都呈现出纳米纤维网状结构，大小在50μm左右。
图2实施例13所制备的纳米纤维微球/水凝胶复合体系冻干粉的扫描电镜图。从图中可以看出纳米纤维微球均匀镶嵌于水凝胶中，结构完整。
图3为所制备的Mn＝4.0×103的PLA-10R5-PLA多嵌段聚合物的FTIR图谱。图中1750cm-1和600-800cm-1处的吸收峰，说明多嵌段聚合物的成功合成。
图4为所制备的Mn＝4.0×103的PLA-10R5-PLA多嵌段聚合物的1H NMR图谱。图中5.20ppm处的峰代表了PLA链段中–CH(CH3)–CO–次甲基中的氢原子，3.35-3.70ppm处的峰代表Pluronic链段中–OCH2–CH2–和–OCH2–CH(CH3)–中的亚甲基中的氢原子，4.3-4.4ppm处的峰代表PLA-CO-OCH2-CH2-O-Pluronic片段中亚甲基中的氢原子。由此也证明了多嵌段聚合物的成功合成。
图5为所制备的Mn＝4.0×103的PLA-10R5-PLA多嵌段聚合物的GPC图谱。结果测得Mwc为6.12×103，Mnc为4.92×103。
图6为10R5(a)和所制备的PLA-10R5-PLA多嵌段聚合物(b)的DSC图谱。从图中可以看出，10R5的熔融峰位于-22℃，而PLA-10R5-PLA多嵌段聚合物的熔融峰则位于70℃左右。说明PLA修饰后的10R5的熔融温度升高，热稳定性提高。
图7为各个样品的XRD图谱。其中A为多烯紫杉醇，B为PLA-F68-PLA多嵌段聚合物空白微球，C为含有15％(w/w)多烯紫杉醇的纳米纤维微球，D为含有15％(w/w)多烯紫杉醇的纳米纤维微球/水凝胶复合体系。从图中可以看出含有15％(w/w)多烯紫杉醇与聚乳酸-泊洛沙姆F68-聚乳酸多嵌段聚合物的XRD曲线中有多烯紫杉醇的衍射峰，而在含有15％(w/w)多烯紫杉醇/聚乳酸-泊洛沙姆F68-聚乳酸多嵌段聚合物纳米纤维载药微球的XRD曲线中则看不到，说明药物是以非晶态的形式装载于纳米纤维微球中。
图8为各个样品的FTIR图谱。其中A为多烯紫杉醇，B为PLA-F68-PLA多嵌段聚合物空白微球，C为含有15％(w/w)多烯紫杉醇的纳米纤维微球，D为含有15％(w/w)多烯紫杉醇的纳米纤维微球/水凝胶复合体系。从图谱可见，在680-800cm-1位置，与曲线B相比，曲线C和D新出现的微小特征吸收峰，刚好对应曲线A中在680-800cm-1位置特征吸收峰，说明药物已成功装载于纳米纤维微球中。
图9为各样品的药物体外释放曲线。其中a为游离多烯紫杉醇的释放曲线，b为纳米纤维微球多烯紫杉醇的释放曲线，c为纳米纤维微球/水凝胶复合体系中多烯紫杉醇的释放曲线。从图中可以看出纳米纤维载药微球中的DOC的释放速度较游离DOC的释放速度显著减缓，说明该纳米纤维载药微球有较明显的缓释效果。而且纳米纤维微球/水凝胶复合体系中多烯紫杉醇的释放速度较纳米纤维载药微球中的DOC的释放速度慢。
图10为实施例13制备的载多烯紫杉醇纳米纤维微球/水凝胶复合体系在不同温度下的表观状态，从图中可以看出，该复合体系在37℃时为其凝胶状态，在4℃时为溶胶状态。
图11为不同时间点各组大鼠脊髓损伤模型的BBB评分，其中a为载多烯紫杉醇的纳米纤维微球/水凝胶复合体系组、b为PLA-10R5-PLA水凝胶组、c为载多烯紫杉醇的纳米纤维微球组、d为生理盐水组、e为假手术组。从图中可以看出，除术后1天以外，其余时间点负载有多烯紫杉醇的纳米纤维微球/水凝胶复合体系组的BBB评分明显高于其它各组，说明该载药体系有利于急性脊髓损伤修复。
图12为不同时间点各组大鼠脊髓损伤模型的HE染色。其中a为假手术组，b为负载多烯紫杉醇的纳米纤维微球/水凝胶复合体系组、c为PLA-10R5-PLA多嵌段聚合物水凝胶组、d为负载多烯紫杉醇的纳米纤维微球组、e为生理盐水组。从图中可以看出，除假手术组外，其余各治疗组在各时间点均有不同程度的白质、灰质完整性的破坏，但负载多烯紫杉醇的纳米纤维微球/水凝胶复合体系组在各时间点的白质、灰质完整性较其他治疗组好，胶质瘢痕也显著小于其他治疗组。
图13为大鼠半横断脊髓损伤模型治疗前后的磁共振照片。
图14为大鼠的主要器官HE染色切片，其中A-E分别为生理盐水组的心、肝、脾、肺、肾；F-J为负载多烯紫杉醇的纳米纤维微球/水凝胶复合体系组的心、肝、脾、肺、肾。从图中可以看出，给予负载多烯紫杉醇的纳米纤维微球/水凝胶复合体系后大鼠各主要脏器未见明显的病变。说明本发明中采用的负载多烯紫杉醇的纳米纤维微球/水凝胶复合体系在体内应用对于主要脏器是无毒的。
具体实施方式
下面给出实施例以对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段作出的各种替换或变更，均包括在本发明的范围内。
值得说明的是：1)以下实施例中所用的泊洛沙姆：poloxamer188，简称F68；R[(PPO)8(PEO)22(PPO)8]，简称10R5，R[(PPO)14(PEO)24(PPO)14]，简称17R4。2)以下实施例中所制备的多嵌段聚合物：聚乳酸-Pluronic F68-聚乳酸，简称PLA-F68-PLA；聚乳酸-R[(PPO)8(PEO)22(PPO)8]-聚乳酸，简称PLA-10R5-PLA。聚乳酸-R[(PPO)14(PEO)24(PPO)14]-聚乳酸，简称PLA-17R4-PLA。3)以下实施例所得的聚乳酸-泊洛沙姆-聚乳酸多嵌段聚合物和聚乳酸-反式泊洛沙姆-聚乳酸的重均分子量(Mwc)和数均分子量(Mnc)是采用凝胶渗透色谱仪(GPC)方法测得的，Mnb是根据1H-NMR计算所得，Mna则是根据投料比计算的理论值。4)以下实施例所得载药微球粒径的测定是采用马尔文激光粒度仪(马尔文2000，马尔文仪器有限公司，英国)。5)以下实施例中多嵌段聚合物纳米纤维载药微球中载药量的测定是采用反向高效液相色谱法测定，检测波长为230nm，流动相为乙腈：水(50:50)。6)以下实施例所得微球的载药量和包封率是按以下公式计算的：
实际载药量＝纳米纤维载药微球中药物量/纳米纤维载药微球总量×100％
包封率＝纳米纤维载药微球中药物量/投药量×100％
本发明实施例所用的主要试剂和仪器：
DL-丙交酯(DL-LA)，L-丙交酯(L-LA)购自湖北广水民族化工有限公司
Poloxamer188(F68,Mn＝8400)，R[(PPO)8(PEO)22(PPO)8](10R5，Mn＝2000，WPEG％＝50％)购自美国Sigma-Aldrich公司，分析纯。
辛酸亚锡(Stannous octoate，Sn(oct)2)，购自美国Sigma-Aldrich公司，分析纯。
本发明PLA-F68-PLA多嵌段聚合物的简要合成路线如下所示:
实施例1
在氮气流保护下，将质量比为2.57的L-丙交酯、泊洛沙姆F68和按照L-丙交酯与泊洛沙姆的总质量计0.3wt％辛酸亚锡加热至180℃搅拌反应24h，冷却至室温，然后加入二氯甲烷将反应所得物溶解，再放入以二氯甲烷体积计10倍量的甲醇中沉淀、过滤，用二氯甲烷溶解白色沉淀物后放入以二氯甲烷体积计10倍量的***中继续沉淀、过滤、干燥，即得理论分子量Mna为3.0×104聚乳酸-泊洛沙姆F68-聚乳酸多嵌段聚合物。由核磁计算出的Mnb为2.85×104，GPC结果测得Mwc为4.23×104，Mnc为3.02×104。
实施例2
在氮气流保护下，将质量比为0.786的L-丙交酯、泊洛沙姆F68和按照L-丙交酯与泊洛沙姆的总质量计0.3wt％辛酸亚锡加热至150℃搅拌反应15h，冷却至室温，然后加入二氯甲烷将反应所得物溶解，再放入以二氯甲烷体积计10倍量的甲醇中沉淀、过滤，用二氯甲烷溶解白色沉淀物后放入以二氯甲烷体积计10倍量的***中继续沉淀、过滤、干燥，即得理论分子量Mna为1.5×104聚乳酸-泊洛沙姆F68-聚乳酸多嵌段聚合物。由核磁计算出的Mnb为1.36×104，GPC结果测得Mwc为2.30×104，Mnc为1.52×104。
实施例3
根据上述合成路线，在氮气流保护下，将质量比为1.38的L-丙交酯、泊洛沙姆F68和按照泊洛沙姆与L-丙交酯的总质量计0.3wt％辛酸亚锡加热至140℃搅拌反应20h，冷却至室温，然后加入二氯甲烷将反应所得物溶解，再放入以二氯甲烷体积计10倍量的甲醇中沉淀、过滤，用二氯甲烷溶解白色沉淀物后放入以二氯甲烷体积计10倍量的***中继续沉淀、过滤、干燥，即得理论分子量Mna为2.5×104聚乳酸-泊洛沙姆F68-聚乳酸多嵌段聚合物。由核磁计算出的Mnb为2.56×104，GPC结果测得Mwc为3.74×104，Mnc为2.38×104。
实施例4
将46份实施例2所制得的聚乳酸-泊洛沙姆F68-聚乳酸多嵌段聚合物和以其质量计8％的多烯紫杉醇加入50℃、2500份丙酮与四氢呋喃(1:1，v/v)的混合有机溶剂中，搅拌使其充分溶解，得到澄清溶液A；先将以溶液A的体积计3倍的丙三醇和季戊四醇(2:1，v/v)组成的混合溶剂B于水浴中预热至50℃，然后加入按溶剂B的体积计0.1％的分散剂17R4，形成混合溶剂C；在搅拌条件下，将预热的混合溶剂C缓慢加入到澄清溶液A中，加完后继续搅拌10min倒入液氮中，静置20min得到冷冻物；以冷冻物体积计向其中加入≥1倍体积的冰水混合物，进行溶剂交换24h后用蒸馏水洗涤3～6遍，冷冻干燥后于20℃以下保存。
所得纳米纤维载药微球的粒径为50～150μm，表面的纳米纤维丝的直径为500～1000nm；实际载药量为7.45±0.15％，包封率为93.17±1.88％。
本发明对本实施例所得的纳米纤维载药微球首先进行了扫描电镜(SEM)(JSM-5900LV,JEOL,Tokyo,Japan)观察，结果见图1。从图1可见，制备的纳米纤维微球的表面都呈现出纳米纤维网状结构，大小在50μm左右，且该纳米纤维微球的一端有一个开放的孔洞，呈现中空结构。其次采用X射线衍射(XRD)(X’Pert Pro MPD DY1291,PHILIPS,Netherlands)对药物，空白纳米纤维微球及载药纳米纤维微球进行了分析，结果如图7所示。从该图可见，将药物装载在纳米纤维微球内部后，药物的结晶峰减弱甚至消失，说明药物已以无定型态的形式包裹在微球内部。。
实施例5
将135份实施例1所制得的聚乳酸-泊洛沙姆F68-聚乳酸多嵌段聚合物和以其的质量计10％的多烯紫杉醇加入55℃、7500份三氯甲烷与四氢呋喃(1:2，v/v)的混合有机溶剂中，搅拌使其充分溶解，得到澄清溶液A；先将以溶液A的体积计5倍的聚乙二醇(Mn＝200)溶剂B于水浴中预热至55℃，然后加入按溶剂B的体积计0.3％的分散剂10R5，形成混合溶剂C；在搅拌条件下，将预热的混合溶剂C缓慢加入到澄清溶液A中，加完后继续搅拌20min倒入液氮中，静置30min得到冷冻物；以冷冻物体积计向其中加入≥1倍体积的冰水混合物，进行溶剂交换36h后用蒸馏水洗涤3～6遍，冷冻干燥后于20℃以下保存。
所得纳米纤维载药微球的粒径为75～200μm，表面的纳米纤维丝的直径为700～1100nm；实际载药量为8.91±0.30％，包封率为88.94±3.02％。
实施例6
将340份实施例1所制得的聚乳酸-泊洛沙姆F68-聚乳酸多嵌段聚合物和以其的质量份计15％的多烯紫杉醇加入65℃、20000份四氢呋喃有机溶剂中，搅拌使其充分溶解，得到澄清溶液A；先将以溶液A的体积计6倍的丙三醇溶剂B于水浴中预热至65℃，然后加入按溶剂B的体积计0.3％的分散剂17R4，形成混合溶剂C；在搅拌条件下，将预热的混合溶剂C缓慢加入到澄清溶液A中，加完后继续搅拌20min倒入液氮中，静置40min得到冷冻物；以冷冻物体积计向其中加入≥1倍体积的冰水混合物，进行溶剂交换48h后用蒸馏水洗涤3～6遍，冷冻干燥后于20℃以下保存。
所得纳米纤维载药微球的粒径为40～150μm，表面的纳米纤维丝的直径为400～900nm；实际载药量为13.06±0.71％，包封率为87.04±4.77％。
实施例7
将200份实施例3所制得的聚乳酸-泊洛沙姆F68-聚乳酸多嵌段聚合物和以其的质量份计20％的卡巴他赛加入70℃、12000份乙腈有机溶剂中，搅拌使其充分溶解，得到澄清溶液A；先将以溶液A的体积计6倍的聚乙二醇(Mn＝400)和丙三醇(1:1，v/v)溶剂B于水浴中预热至70℃，然后加入按溶剂B的体积计0.2％的分散剂10R5，形成混合溶剂C；在搅拌条件下，将预热的混合溶剂C缓慢加入到澄清溶液A中，加完后继续搅拌30min倒入液氮中，静置40min得到冷冻物；以冷冻物体积计向其中加入≥1倍体积的冰水混合物，进行溶剂交换48h后用蒸馏水洗涤3～6遍，冷冻干燥后于20℃以下保存。
所得纳米纤维载药微球的粒径为20～160μm，表面的纳米纤维丝的直径为600～1200nm；实际载药量为13.06±0.71％，包封率为86.64±5.12％。
本发明PLA-10R5-PLA和PLA-17R4-PLA多嵌段聚合物的简要合成路线如下所示：
实施例8
将质量比为1的L-丙交酯，10R5和按照L-丙交酯及10R5总质量计0.3％的辛酸亚锡为催化剂，在氮气保护下，搅拌升温至140℃，反应10h小时后，冷却至室温，加入二氯甲烷溶解反应所得物，在-20℃的石油醚中沉淀，过滤，反复操作2～3次后，干燥。将上述PLA-10R5-PLA干燥所得物溶于去离子水中，使用透析袋透析除去小分子单体及过量的催化剂。透析后的多嵌段聚合物冷冻干燥后密封保存。
即得到理论分子量Mna为4.0×103的PLA-10R5-PLA多嵌段聚合物。
本发明对本实施例所得的纳米纤维载药微球用傅里叶红外光谱仪(Nicolet6700，Thermo)，采用KBr压片法对合成的多嵌段聚合物进行红外光谱(FTIR)分析，结果见图3，图中1750cm-1和600-800cm-1处呈现的吸收峰，说明L1400-R2000-L1400多嵌段聚合物的成功合成；还采用核磁共振仪(BRUKER AVANCE III400，BRUKER)，在400MHZ条件下，以CDCl3为溶剂，以四甲基硅烷为内标，对合成的多嵌段聚合物进行核磁波谱(1H-NMR)分析，结果见图4。图4中5.20ppm处的峰代表了PLA链段中–CH(CH3)–CO–次甲基中的氢原子，3.35-3.70ppm处的峰代表Pluronic链段中–OCH2–CH2–和–OCH2–CH(CH3)–中的亚甲基中的氢原子，4.3-4.4ppm处的峰代表PLA-CO-OCH2-CH2-O-Pluronic片段中亚甲基中的氢原子。由此也证明了L1400-R2000-L1400多嵌段聚合物的成功合成。另外还由核磁计算出的Mnb为4.02×103，又由GPC的(见图5)结果测得Mwc为6.12×103，Mnc为4.92×103。同时还用示差扫描量热法(DSC)(Netzsch 204,Netzsch Corp.,Germany)考察了PLA-10R5-PLA的热性能，见图6。从图6可以看出，10R5的熔融峰约为-23℃。而PLA-10R5-PLA的熔融峰则增加到了70℃左右。
实施例9
将质量比为0.25的L-丙交酯、10R5和按照L-丙交酯及10R5总质量计0.3％的辛酸亚锡为催化剂，在氮气保护下，搅拌升温至130℃，反应7h小时后，冷却至室温，加入四氢呋喃溶解反应所得物，在-20℃的石油醚中沉淀，过滤，反复操作2～3次，干燥。将上述PLA-10R5-PLA干燥所得物溶于去离子水中，使用透析袋透析除去小分子单体及过量的催化剂。透析后的多嵌段聚合物冷冻干燥后密封保存。
所得到多嵌段聚合物的理论分子量Mna为2.5×103的PLA-10R5-PLA。另外由核磁计算出的Mnb为2.66×103，GPC结果测得Mwc为3.76×103，Mnc为2.59×103。
实施例10
将质量比为1.4的L-丙交酯，10R5和按照L-丙交酯及10R5总质量计0.3％的辛酸亚锡为催化剂，在氮气保护下，搅拌升温至150℃，反应12h小时后，冷却至室温，加入三氯甲烷溶解反应所得物，在-20℃的石油醚中沉淀，过滤，反复操作2～3次，干燥。将上述PLA-10R5-PLA干燥所得物溶于去离子水中，使用透析袋透析除去小分子单体及过量的催化剂。透析后的多嵌段聚合物冷冻干燥后密封保存。
所得到多嵌段聚合物的理论分子量Mna为4.8×103的PLA-10R5-PLA多嵌段聚合物。另外由核磁计算出的Mnb为4.76×103，GPC结果测得Mwc为6.12×103，Mnc为4.92×103。
实施例11
将质量比为0.185的L-丙交酯，17R4和按照L-丙交酯及17R4总质量计0.3％的辛酸亚锡为催化剂，在氮气保护下，搅拌升温至145℃，反应5h小时后，冷却至室温，加入三氯甲烷和四氢呋喃(1:2，v:v)溶解反应所得物，在-20℃的石油醚中沉淀，过滤，反复操作2～3次，干燥。将上述PLA-17R4-PLA干燥所得物溶于去离子水中，使用透析袋透析除去小分子单体及过量的催化剂。透析后的多嵌段聚合物冷冻干燥后密封保存。
所得到多嵌段聚合物的理论分子量Mna为3.2×103的PLA-17R4-PLA多嵌段聚合物。另外由核磁计算出的Mnb为3.42×103，GPC结果测得Mwc为4.56×103，Mnc为3.37×103。
实施例12
将质量比为1.185的L-丙交酯，17R4和按照L-丙交酯及17R4总质量计0.3％的辛酸亚锡为催化剂，在氮气保护下，搅拌升温至160℃，反应12h小时后，冷却至室温，加入二氯甲烷和三氯甲烷(3:1，v:v)溶解反应所得物，在-20℃的石油醚中沉淀，过滤，反复操作2～3次，干燥。将上述PLA-17R4-PLA干燥所得物溶于去离子水中，使用透析袋透析除去小分子单体及过量的催化剂。透析后的多嵌段聚合物冷冻干燥后密封保存。
所得到多嵌段聚合物的理论分子量Mna为5.9×103的PLA-17R4-PLA多嵌段聚合物。另外由核磁计算出的Mnb为5.78×103，GPC结果测得Mwc为7.76×103，Mnc为5.69×103。
实施例13
将实施例7制备的PLA-10R5-PLA多嵌段聚合物按配置后浓度25wt％的量加入生理盐水中混合均匀，然后升温至50℃搅拌形成溶液，将所得溶液于4℃处理24h即可作为水凝胶使用。水凝胶孔径较小的为1微米，较大的为20微米。将上述步骤制备的水凝胶与实施例6制备的纳米纤维微球在50℃下，按照纳米纤维微球与水凝胶质量比为15％，在搅拌下混合均匀，将所得溶液于4℃处理24h即可作为纳米纤维微球/水凝胶复合物使用。
图10为微球/水凝胶复合体系在4℃及37℃的照片。可以发现当温度低于体温(如4℃)时，多嵌段聚合物水溶液呈现透明状态，具有流动性；在温度为37℃时，多嵌段聚合物水溶液显透明固体状，失去流动性。温度的变化可使该复合物出现凝胶-溶胶转变。
实施例14
将实施例8制备的PLA-10R5-PLA多嵌段聚合物按配置后浓度50wt％的量加入生理盐水中混合均匀，然后升温至50℃搅拌形成溶液，将所得溶液于4℃处理24h即可作为水凝胶使用。水凝胶孔径较小的为1微米，较大的为20微米。将上述步骤制备的水凝胶与实施例4制备的纳米纤维微球在50℃下，按照纳米纤维微球与水凝胶质量比35％，在搅拌下混合均匀，将所得溶液于4℃处理24h即可作为纳米纤维微球/水凝胶复合物使用。
实施例15
将实施例8制备的PLA-10R5-PLA多嵌段聚合物按配置后浓度10wt％的量加入生理盐水中混合均匀，然后升温至60℃搅拌形成溶液，将所得溶液于4℃处理24h即可作为水凝胶使用。水凝胶孔径较小的为4微米，较大的为30微米。将上述步骤制备的水凝胶与实施例7制备的纳米纤维微球在60℃下，按照纳米纤维微球与水凝胶质量比5％，在搅拌下混合均匀，将所得溶液于4℃处理24h即可作为纳米纤维微球/水凝胶复合物使用。
实施例16
将实施例8制备的PLA-10R5-PLA多嵌段聚合物按配置后浓度35wt％的量加入生理盐水中混合均匀，然后升温至55℃搅拌形成溶液，将所得溶液于4℃处理24h即可作为水凝胶使用。水凝胶孔径较小的为2微米，较大的为25微米。将上述步骤制备的水凝胶与实施例5制备的纳米纤维微球在55℃下，按照纳米纤维微球与水凝胶质量比20％，在搅拌下混合均匀，将所得溶液于4℃处理24h即可作为纳米纤维微球/水凝胶复合物使用。
实施例17
取PLA-10R5-PLA及载药纳米纤维微球于10ml试管中，50℃下配制成40g/100ml的水溶液，体积为2ml，将体系温度降至37℃形成凝胶；然后向试管中加入pH＝7.4、温度37℃的磷酸盐缓冲溶液，检测药物的释放行为，结果见图9。图9中列出了药物的体外释放行为曲线。该实施例的结果表明药物在该复合体系中能够缓慢释放。
应用例
本应用例是将载药纳米纤维微球/水凝胶复合体系用于体内急性脊髓损伤修复效果实验
本应用例是载药纳米纤维微球/水凝胶复合体系用于SD大鼠脊髓半横断模型治疗实验的效果评价。以Mn为3.0×104的PLA-F68-PLA制备的纳米纤维微球与与Mn为4.0×103的PLA-10R5-PLA多嵌段聚合物25％水溶液复合体系为例。
具体方法是先按照实施例6和实施例13制备载药纳米纤维微球及纳米纤维微球/水凝胶复合体系，大鼠脊髓半横断模型构建手术后和手术后15天，在脊髓损伤部位原位给药，治疗一定时间后对治疗效果进行评价。
a.大鼠脊髓半横断模型的建立
10％水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔注射麻醉大鼠，胸背部手术区备皮、消毒，俯卧位固定于木板上，以胸背部棘突最明显处(约胸9、10节段)为中心做一长约3厘米后正中切口，钝性分离双侧皮下组织及椎旁肌，显露T9-T10棘突、椎板及横突，咬除胸9、10棘突，从胸10、11椎板间隙处小心咬除胸10双侧椎板，完全暴露脊髓，尖刀片垂直于脊髓切开右侧脊膜，弹簧剪紧贴脊髓后动脉半横断脊髓。此后大鼠被随机分成5组(每组18只)：假手术组、生理盐水组(control)、PLA-10R5-PLA水凝胶组、负载多烯紫杉醇的纳米纤维微球、负载多烯紫杉醇的纳米纤维微球/水凝胶复合体系组。
b.半横断脊髓损伤修复效果评价
负载多烯紫杉醇的纳米纤维微球、负载多烯紫杉醇的纳米纤维微球/水凝胶复合体系组每次给药时DOC量为1.8μg，于手术后和术后15天给药，共两次。采用BBB(BassonBeattle Bresnaha)运动功能评分法(BBB运动功能评价体系是1995年由Basson、Beattle和Bresnahan提出一种以3人姓氏首写字母命名为BBB的新评估体系,专用于评价脊髓损伤后后肢功能状态的恢复情况)，于术前1d及术后1、7、14、21、28天和3月分别对各实验组大鼠运动功能进行评分。BBB评分法根据动物髋，膝，踝，趾，前后肢协调运动等情况评定运动功能，分22级，最高21分，全瘫0分。评分过程由两人于早上9点依次双盲评分，观察时间为5分钟，两人的结果平均为最终结果。大鼠后肢运动BBB行为学评分标准如下表。
于术后7、14、28天、3月，牺牲处死大鼠，具体方法如下：用10％水合氯醛(3ml/100g)腹腔注射麻醉，开胸暴露心脏，经左心室插管，剪开右心房，0.9％生理盐水200毫升缓慢灌注，然后缓慢灌注4％多聚甲醛200毫升，以大鼠肌肉发硬为佳，以脊髓损伤处为中心，取长约4-5厘米脊髓放入4％多聚甲醛磷酸缓冲液中固定。将固定后的大鼠脊髓修剪成以病变为中心长约2厘米组织，然后梯度酒精脱水，石蜡包埋，切片，苏木精—伊红染色(HE染色)，以及免疫组织化学染色，封片后显微镜观察。再取给药后1个月的心、肝、脾、肺、肾组织，用4％多聚甲醛固定。然后进行同样标准步骤的梯度脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，封片，显微镜观察。
图11-图13为大鼠急性脊髓损伤修复效果评价。图11为各实验组BBB评分统计图，从图中可以看出，除术后1天以外，其余时间点载多烯紫杉醇的纳米纤维微球/水凝胶复合体系组的BBB评分明显高于其它各组，说明该载药体系有利于急性脊髓损伤修复。图12为各实验组大鼠不同时间点的脊髓HE染色结果，除假手术组外，其余各治疗组在各时间点均有不同程度的白质、灰质完整性的破坏，但载多烯紫杉醇的纳米纤维微球/水凝胶复合体系组在各时间点的白质、灰质完整性较其他治疗组好，胶质瘢痕显著小于其他治疗组组。图13为大鼠半横断脊髓损伤模型治疗前后的磁共振照片。图14是给予生理盐水和载多烯紫杉醇的纳米纤维微球/水凝胶复合体系后1个月各主要脏器的HE染色切片图。两个组比较可以发现，给予载多烯紫杉醇的纳米纤维微球/水凝胶复合体系后大鼠各主要脏器未见明显的病变。说明本发明中采用的载多烯紫杉醇的纳米纤维微球/水凝胶复合体系体内应用对于主要脏器是无毒的。
本发明所制得的载药纳米纤维微球/水凝胶复合体系能够有效控制药物的缓慢释放，而生物可降解的高分子材料PLA-F68-PLA及PLA-10R5-PLA在体内可以自行降解，由于纳米纤维微球/水凝胶复合体系的局部给药使得多烯紫杉醇能缓慢持续释放，并直接与脊髓损伤部位作用，不仅显著减少了给药次数，也降低了毒副作用。

Claims (10)

1.一种载药纳米纤维微球/水凝胶复合物的制备方法，该方法的工艺步骤和条件如下：
(1)将46～340份的聚乳酸-泊洛沙姆F68-聚乳酸多嵌段聚合物和以聚乳酸-泊洛沙姆F68-聚乳酸多嵌段聚合物的质量份计8～20％的微管抑制类药物加入50～70℃、2500～20000份有机溶剂中，搅拌使其充分溶解，得到澄清溶液A；将以溶液A的体积计3～6倍的溶剂B于水浴中预热至50～70℃，然后加入按溶剂B的体积计0.1～0.3％的分散剂，形成混合溶液C；在搅拌条件下，将混合溶剂C缓慢加入到澄清溶液A中，加完后继续搅拌10～30min倒入液氮中，静置20～40min得到冷冻物；以冷冻物体积计向其中加入≥1倍体积的冰水混合物，进行溶剂交换24～48h后用蒸馏水洗涤3～6遍，冷冻干燥后于20℃以下保存，即制得载药的纳米纤维微球；
(2)将聚乳酸-反式泊洛沙姆-聚乳酸多嵌段聚合物按配置后浓度至少10wt％的量加入生理盐水中混合均匀，然后升温至50～60℃搅拌形成聚乳酸-反式泊洛沙姆-聚乳酸多嵌段聚合物溶液；
(3)将所得载药纳米纤维微球按5～35wt％加入所制备的聚乳酸-反式泊洛沙姆-聚乳酸多嵌段聚合物溶液中，于50～60℃下搅拌混合均匀，然后于4℃处理24h即可。
2.根据权利要求1所述的载药纳米纤维微球/水凝胶复合物的制备方法，该方法中步骤(1)所用的聚乳酸-泊洛沙姆F68-聚乳酸多嵌段聚合物，其理论数均分子量为1.5～3.0×104，且该多嵌段聚合物是由以下方法制备而成的：该方法是将质量比为0.786～2.57的L-丙交酯、泊洛沙姆F68及按照L-丙交酯与泊洛沙姆F68的总质量计0.3％的辛酸亚锡作为催化剂加入到反应容器中，于氮气流保护下，将反应物加热至140-180℃，搅拌反应15-24h，冷却至室温，然后按照常规的方法提纯。
3.根据权利要求1或2所述的载药纳米纤维微球/水凝胶复合物的制备方法，该方法中步骤(1)所用的有机溶剂为三氯甲烷、丙酮、乙醇、已腈和四氢呋喃中的至少一种；所用的溶剂B为丙三醇、相对分子质量为200-600的聚乙二醇和季戊四醇中的至少一种；所用的微管抑制类药物为多烯紫杉醇或卡巴多赛；所用的分散剂为反式泊洛沙姆10R5或反式泊洛沙姆17R4。
4.根据权利要求1或2所述的载药纳米纤维微球/水凝胶复合物的制备方法，该方法中步骤(2)所用的聚乳酸-反式泊洛沙姆-聚乳酸多嵌段聚合物是按照以下方法制备：在惰性气体保护下，将L-丙交酯、反式泊洛沙姆按质量比0.185～1.4与以反式泊洛沙姆与L-丙交酯的总质量计0.3％的辛酸亚锡催化剂混合，并于130-160℃加热反应5-12h，冷却，然后加入溶剂溶解反应所得物后再放入-20℃的石油醚中沉淀，过滤，反复操作2～3次后干燥、提纯即可。
5.根据权利要求3所述的载药纳米纤维微球/水凝胶复合物的制备方法，该方法中步骤(2)所用的聚乳酸-反式泊洛沙姆-聚乳酸多嵌段聚合物是按照以下方法制备：在惰性气体保护下，将L-丙交酯、反式泊洛沙姆按质量比0.185～1.4与以反式泊洛沙姆与L-丙交酯的总质量计0.3％的辛酸亚锡催化剂混合，并于130-160℃加热反应5-12h，冷却，然后加入溶剂溶解反应所得物后再放入-20℃的石油醚中沉淀，过滤，反复操作2～3次后干燥、提纯即可。
6.根据权利要求4所述的载药纳米纤维微球/水凝胶复合物的制备方法，该方法中步骤(2)所用的反式泊洛沙姆为Mn＝2000的反式泊洛沙姆10R5或Mn＝2700的反式泊洛沙姆17R4，且L-丙交酯与反式泊洛沙姆10R5的质量比为0.25～1.4，L-丙交酯与反式泊洛沙姆17R4的质量比为0.185～1.185；该聚乳酸-反式泊洛沙姆-聚乳酸多嵌段聚合物溶液形成水凝胶的临界凝胶浓度为10～50wt％，临界凝胶温度为25～35℃。
7.根据权利要求5所述的载药纳米纤维微球/水凝胶复合物的制备方法，该方法中步骤(2)所用的反式泊洛沙姆为Mn＝2000的反式泊洛沙姆10R5或Mn＝2700的反式泊洛沙姆17R4，且L-丙交酯与反式泊洛沙姆10R5的质量比为0.25～1.4，L-丙交酯与反式泊洛沙姆17R4的质量比为0.185～1.185；该聚乳酸-反式泊洛沙姆-聚乳酸多嵌段聚合物溶液形成水凝胶的临界凝胶浓度为10～50wt％，临界凝胶温度为25～35℃。
8.一种由权利要求1所述方法制备的载药纳米纤维微球/水凝胶复合物，该复合物是由溶胶和均匀分散在其中的载药纳米纤维微球组成，载药纳米纤维微球的含量为5～35wt％，该微球是由纳米纤维丝自然交织构成的中空微球，其粒径为20～200μm，理论载药量为8～20％，实际载药量为7.45～17.32％，包封率为86.64～93.17％；溶胶中聚乳酸-反式泊洛沙姆-聚乳酸多嵌段聚合物的含量至少10wt％，其敏感温度≥25℃。
9.根据权利要求8所述的载药纳米纤维微球/水凝胶复合物，该复合物溶胶中聚乳酸-反式泊洛沙姆-聚乳酸多嵌段聚合物的含量为10～50wt％，其敏感温度为25～35℃。
10.一种权利要求8所述载药纳米纤维微球/水凝胶复合物在制备急性脊髓损伤修复药物中的应用。
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