CN105699700A - 使用扫描探针显微镜分析样品表面的方法和用于该方法的扫描探针显微镜 - Google Patents
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Abstract
提供用于使用包含细胞附着性探针的扫描探针显微镜分析样品表面的方法和用于该方法的扫描探针显微镜。
Description
相关申请
本申请要求2014年12月10日向韩国知识产权局提交的韩国专利申请No.10-2014-0177823的权益,其公开内容通过提述完整并入本文。
发明领域
本公开涉及使用扫描探针显微镜分析样品表面的方法和用于该方法的扫描探针显微镜。
发明背景
原子力显微术(AFM)是在工业和研究领域广泛使用以在超灵敏测量尖端的帮助下扫描表面的方法。测量尖端位于微机械悬臂(cantilever)的无支持端且对短程力(例如范德华力(vanderWaalsforce))起反应。AFM方法经常用于分子生物学、药理学、材料科学和纳米技术领域。此外,在小型化的背景和在高度集成电路的使用中,AFM一方面在工业上用于过程控制,且在另一方面用于研究起着越来越重要作用的新现象。由于其运行原理,已知的AFM方法不提供关于表面的化学或电子信息。
因此,尽管存在相关技术,但仍需要新的AFM方法。
发明概述
一个方面提供使用扫描探针显微镜(scanningprobemicroscope)分析样品表面的方法。
另一个方面提供扫描探针显微镜。
一个方面提供使用扫描探针显微镜分析样品表面的方法,包括以下步骤:提供具有表面的样品;通过扫描器相对于所述样品表面移动探针(probe)以允许该样品表面和该探针之间的相互作用;自偏转传感器(deflectionsensor)测量该探针的偏转距离;自偏转距离测定该探针和该表面之间的相互作用力;和比较测定的相互作用力和预确定的相互作用力,其中所述扫描探针显微镜包含用于检测关于所述样品表面的信息的探针,用于相对于所述样品移动该探针以允许该探针扫描所述样品表面的扫描器,和用于检测该探针的偏转的偏转传感器,且该探针的一端连接于扫描器而其另一端是从扫描器延伸的细胞附着性悬臂(cell-attachedcantilever),且所述偏转传感器包含放置以对该探针照射光的光源和放置以检测从该探针反射的光的位置敏感性光检测器(position-sensitivephotodetector)。
在该方法中,所述扫描探针显微镜包含用于检测关于样品表面的信息的探针,用于相对于所述样品移动该探针以允许该探针扫描所述样品表面的扫描器,和用于检测该探针的偏转的偏转传感器,其中该探针的一端连接于所述扫描器而其另一端是从所述扫描器延伸的细胞附着性悬臂,且所述偏转传感器包含放置以对该探针照射光的光源和放置以检测从该探针反射的光的位置敏感性光检测器。所述扫描探针显微镜可以是原子力显微镜(atomicforcemicroscope,AFM)。
所述悬臂可以是具有弹性的物质。悬臂可以具有0.001N/m至1N/m的弹簧常量。悬臂可由硅或氮化硅(Si3N4)制备。悬臂可具有1nm至100nm的厚度。悬臂可具有125μm的长度。悬臂可在典型AFM的探针的末端处没有尖端,即其可具有无尖端末端(tiplessend)。悬臂可根据由光源产生的光束排列(Thecantilevermaybearrangedbyalightbeamproducedbythelightsource)。
偏转传感器可以是悬臂偏转传感器(cantileverdeflectionsensor)。在悬臂偏转传感器中,光源可以是激光(laser)。位置敏感性光检测器可以是***式光电二极管(splitphotodiode)。可将从悬臂背部反射的激光束导向到检测悬臂偏转中的小变化的***式光电二极管上。
扫描器可包含能够将探针或样品表面相对彼此移动的工具。扫描器可包含压电元件(piezo-electricelement)。该压电元件可以是扩大型元件(expansionelement)。
图1是显示扫描探针显微镜的例示性实施方案的图。如图1中显示的,扫描探针显微镜10可以具有一系列组件,其对应于AFM的那些。将具有表面42的样品放置并支持在基底40上。基底40可以是光学透明或半透明的物质,如玻璃或塑料。扫描探针显微镜10包含悬臂12,其具有连接于悬臂体(cantileverbody)22的一端16,悬臂体22连接于悬臂支持物(cantileversupport)24。悬臂支持物24继而连接于扩大型元件26,如压电元件。开动该压电元件以扩大或收缩以便沿z轴,例如垂直地移动悬臂支持物24或其他连接的组件。悬臂12的另一端14附着有细胞,如此充当探针。在扫描探针显微镜中,扫描器可包含悬臂体22、悬臂支持物24、和扩大型元件26。探针可包含悬臂12及其两端14、16。
在扫描探针显微镜的运行期间,作为开动扩大型元件26的结果,向下移动悬臂支持物24。最终,使得悬臂的末端14接近样品并与样品的表面相互作用。当排斥力或粘附力起作用时,末端14以相对于水平面的特定角度α倾斜。悬臂的偏转程度使用光源32和光检测器36检测。光源32作为激光执行,其发射光束34,使该光束聚焦于悬臂12的上表面上。光束34向光检测器36反射并以激光光斑(laserspot)冲击光检测器36。悬臂12的偏转移动光检测器36上激光光斑的位置。光检测器36可以连接于数据处理器54、存储器52和显示设备50。还涵盖用于检测悬臂12的偏转的其他机械装置(mechanism)。例如,可以使用干扰检测器元件(interference-detectorelement)检测悬臂12的弯曲,所述干扰检测器元件检测反射的光束和原始光束之间的干扰程度。再举一例,可将压阻元件(piezo-resistiveelement)或压电元件纳入悬臂12内或连接于悬臂12以检测悬臂12的弯曲程度。
如图1中例示的,扫描探针显微镜10可以包含控制器和数据处理器54,其连接于扫描探针显微镜10的多个组件且用来指导那些组件的运行。控制器和数据处理器54连接于显示设备50,其为扫描探针显微镜10的用户产生视觉指示。控制器和数据处理器54还可以连接于存储器44,其存储计算机代码或可执行指令,用于实施多种数据检索和操作运行。存储器44还可以存储与样品的失败或通过基础有关的数据。
图2是悬臂偏转传感器的放大图。如图2中例示的,悬臂偏转传感器包括光源32和光检测器36。使从光源32发射的光束聚焦于悬臂14的末端,其被悬臂14的末端和样品表面之间的相互作用偏转。该偏转通过光检测器上的激光光斑A或B检测。激光光斑的差异或总和代表悬臂的偏转程度。
在所述方法中,细胞可通过静电结合固定化在探针的表面上,该探针用阳离子聚电解质例如聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(poly(diallyldimethylammoniumchloride))(polyDADMAC)包被。细胞可以是细菌或哺乳动物细胞。细菌可以是革兰氏阳性或革兰氏阴性的。细菌可以是例如大肠杆菌(E.coli)、沙门氏菌(salmonella)或假单胞菌(pseudomonas)。细胞可以以活细胞或生理学活性细胞固定化在探针上。
在所述方法中,扫描探针显微镜包含检测关于彼此不同的样品表面的信息的多个探针和检测多个探针中每个的偏转的一组偏转传感器,且上述步骤可以对于样品表面上的多个位置同时进行。将多个可以彼此不同的探针固定在扫描器的同一基底的表面上,如此允许同时从样品表面的不同位置移动。在该情况下,对样品表面的分析可以是具有时效性的(time-efficient)。偏转传感器可以包含一个或多个光源,其可以布置为或调整以布置为将光照射到悬臂14上。光源的数目可以是复数个,例如2个或更多、3个或更多或4个或更多。
在所述方法中,扫描探针显微镜中的多个探针可以预确定间隔排列在基底上。样品表面可通过以预确定间隔排列各个探针而统一分析。
所述方法包括提供具有表面的样品的步骤。样品包括任意物质,只要其具有表面。样品可以是具有平表面的实体物质。样品可以是手机、家庭日用品(householditem)、或具有塑料显示表面的车辆。样品可以具有其上附着或不附着抗生物污着材料(anti-biofoulingmaterial)的表面。在本发明中,“抗生物污着材料”和附着于探针的细胞之间的粘附力可以小于预确定的值,或者其之间的排斥力可以大于预确定的值。“预确定的值”可以是已知抗生物污着材料和附着于探针的细胞之间或在包被前样品表面和附着于探针的细胞之间的粘附力或排斥力。细胞可以是细菌、酵母、藤壶(barnacles)、苔藓虫类(bryozoans)、软体动物(mollusks)、多毛目环节动物(polychaetes)或斑马贻贝(zebramussels)。细胞可以是海草、水螅虫、藻类、或其组合。细胞可以是革兰氏阴性细菌。抗生物污着材料可以是例如抗生素或掺入抗生素的材料(例如掺入抗生素的塑料材料)、生物杀灭剂(biocide)或掺入生物杀灭剂的材料(例如掺入生物杀灭剂的丙烯酸铜自抛光共聚物(biocide-incorporatedcopperacrylateself-polishingcopolymer))、银纳米材料或用银纳米材料包被的材料、自组装的嵌段共聚物或氟化嵌段共聚物。另外,抗生物污着材料可具有低摩擦力和低表面能。该材料允许表面为疏水性的。疏水性表面可以创造能预防微生物粘附的平滑表面。所述抗生物污着材料可以是防指纹有机化合物。抗生物污着材料可以是含氟聚合物和硅氧烷。硅氧烷可以是聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane)(PDMS)。含氟聚合物可以包括聚四氟乙烯(PTFE)、聚氟乙烯、聚偏二氟乙烯(polyvinylidenefluoride)、氟化的乙烯丙烯、全氟聚醚(PFPE)等。PFPE可以是例如,由DuPont制造的KRYTOX润滑剂家族(例如DupontTM 100或DupontTM 103),或全氟聚醚(PFPE)硅烷。PFPE可以具有约115°的水接触角(watercontactangle)和约0.1至约0.15的摩擦系数。“全氟化的(Perfluorinated)”基团代表一种基团或化合物,其中所有的C-H键都被C-F键替换。“醚”代表一种基团或化合物,其具有两个碳原子之间的氧基团。醚基团经常是二价基团如-CH2-O-CH2-或-CF2-O-CF2-。术语“聚醚”代表一种基团或化合物,其具有多个醚基团。全氟聚醚(PFPE)硅烷代表具有甲硅烷基(silyl)的全氟聚醚(PFPE),该甲硅烷基与含硅基底的表面反应以形成-Si-O-Si-键。全氟聚醚(PFPE)硅烷可以是例如具有以下化学式I和II的那些。
CF3O(CF2CF2O)m(CF2O)nCF2-CH2O-(CH2)p-Si(R1)3-x(R2)x(式I)
F(CF(CF3)CF2O)mCF(CF3)-CH2O-(CH2)p-Si(R1)3-x(R2)x(式II)
在式I和II中,R1是羟基或可水解基团,R2是不可水解基团,且变量X是0,1,或2。变量n或m是4至100,5至100,10至100,10至80,10至60,10至50,10至40,20至100,40至100,50至100,或60至100的整数。变量p是1至6,1至4,或1至3的整数。“可水解基团”代表能在pH1至10在大气压下与水反应的基团。当该可水解基团反应时,其通常转化为羟基基团。羟基基团进行另外的反应,如与含硅基底的反应。典型的可水解基团包括烷氧基、芳氧基、芳烷氧基(aralkyloxy)、酰氧基和卤代基团。
烷氧基R1可具有式-ORa,其中Ra是具有饱和的1至10个碳原子,例如1至6个碳原子、1至4个碳原子、1至3个碳原子、或1至2个碳原子的烷基基团。烷氧基基团的烷基部分可以是线性、分支或环状的,或其组合。
芳氧基R1可具有式–OAr,其中Ar是芳基基团。芳基基团是具有一或多个碳环状芳香环的单价基团。另外的碳环状环可融合于芳香环。任何另外的环可以是不饱和、部分饱和或饱和的。芳氧基基团的芳基部分可具有6至12个碳原子,例如6至10个碳原子。在许多具体的实施方案中,芳氧基基团可以是苯氧基。
芳烷氧基R1可具有式-ORb-Ar,其中Rb可以是具有1至10个碳原子,例如1至6个碳原子、或1至4个碳原子的二价亚烃基基团(即烷基的二价基),而Ar基团是具有一或多个碳环状芳香环的芳基基团。另外的碳环状环可融合于芳香环。任何另外的环可以是不饱和、部分饱和或饱和的。芳氧基基团的芳基部分可具有6至12个碳原子,例如6至10个碳原子。在许多具体的实施方案中,芳基基团可以是苯基。
酰氧基R1可具有式-O(CO)Rc,其中Rc是烷基、芳基或芳烷基,(CO)基团代表羰基基团。烷基Rc具有1至10个碳原子,例如1至6个碳原子。芳基Rc是碳环状且具有一或多个芳香环。另外的碳环状环可融合于芳香环。任何另外的环可以是不饱和、部分饱和或饱和的。芳基基团可具有6至12个碳原子,例如6至10个碳原子。在许多具体的实施方案中,芳基基团可以是苯基。芳烷基Rc可以是具有1至10个碳原子,例如1至6个碳原子、或1至4个碳原子的亚烃基基团(即烷基的二价基),和具有6至12个碳原子,例如6至10个碳原子的芳基基团。芳烷基基团的亚烃基部分可以是线性、分支或环状的,或其组合。芳烷基基团的芳基部分可具有一或多个碳环状芳香环。另外的碳环状环可融合于芳香环。任何另外的环可以是不饱和、部分饱和或饱和的。酰氧基基团的芳基基团可以是苯基。
卤代基团R1可以是溴、碘或氯基团。
在式I和II中,每个R2基团是不可水解基团。术语“不可水解基团”代表不与水在pH1至10在大气压下反应的基团。在一个具体的实施方案中,不可水解基团是烷基基团、芳基基团、或芳烷基基团。烷基R2可具有1至10个碳原子,例如1至6个碳原子、或1至4个碳原子。烷基基团可以是是线性、分支或环状的,或其组合。芳基R2是碳环状且具有一或多个芳香环。另外的碳环状环可融合于芳香环。任何另外的环可以是不饱和、部分饱和或饱和的。芳基基团可具有6至12个碳原子,例如6至10个碳原子。在许多具体的实施方案中,芳基基团可以是苯基。芳烷基R2可具有具有1至10个碳原子,例如1至6个碳原子、或1至4个碳原子的亚烃基基团(即烷基的二价基),和具有6至12个碳原子,例如6至10个碳原子的芳基基团。芳烷基基团的亚烃基部分可以是线性、分支或环状的,或其组合。芳烷基基团的芳基部分可具有一或多个碳环状芳香环。另外的碳环状环可融合于芳香环。任何另外的环可以是不饱和、部分饱和或饱和的。酰氧基基团的芳基基团可以是苯基。
所述抗生物污着材料可以由下式III的材料例示。
所述抗生物污着材料可具有100至150°,100至140°,100至130°,110至150°,或120至150°的水接触角。
任选地,所述方法包括在提供具有表面的样品的步骤之前,将样品表面用抗生物污着材料包被的步骤。该步骤通过使样品表面与抗生物污着材料反应以制备具有抗生物污着特性的样品表面。该反应包括在允许表面与抗生物污着材料接触的条件下将它们温育。该反应包括在将样品表面置于含有抗生物污着材料的容器中后将它们温育。
所述方法包括通过扫描器相对于所述样品表面移动探针以允许该样品表面和该探针的相互作用。通过扫描器将所述探针相对于样品表面的移动是相对于该表面使该探针,例如垂直地接近(approach)或回缩(retract)。另外,移动是在平面中,即在相对于表面的x和y方向移动探针。该相互作用包括通过粘附力的吸引或结合,或通过排斥力的回缩。
通过扫描器将所述探针相对于样品表面的移动可以不是在液体介质中,而是在空气或周围气氛下(不是液体)进行。可以实施移动以范围从0至500nm的距离相对于彼此移动探针和样品表面。
所述方法还包括自偏转传感器测量探针的偏转距离的步骤。从悬臂的背部或表面反射的激光束可导向到检测悬臂偏转中的小变化的***式光电二极管上,从而测量偏转距离。
所述方法包括自所述偏转距离测定探针和表面之间的相互作用力的步骤。相互作用力可以是附着于探针的细胞和表面之间的相互作用力。为了将偏转距离转化成力,需要限定悬臂的弹簧常量和力的零点(zeroofforce)。力的零点可以是细胞附着性探针和表面相隔太远,且如此偏转不依赖于位置例如压力位置的点。该力可通过以下等式(等式1)计算。
要测量的变量是电压,其由尖端的内在常数值和压电元件应答尖端的检测常数值校正(whichiscorrectedbytheintrinsicconstantvalueofthetipandthedetectionconstantvalueofthepiezo-electricelementrespondingtothetip),由此计算力。亦即,光检测器测量V值作为信号,且V被转化成悬臂偏转距离(nm),其被转化成力(nN)。
F=k*x=k*V*偏转灵敏性(等式1),其中F是力,k是弹簧常量,x测量为尖端的偏转距离,V是电压,且偏转灵敏性是就每个尖端而言SPM扫描器的压电元件的每伏特偏转距离(nm)(deflectionsensitivityisthedeflectiondistance(nm)pervoltageofthepiezo-electricelementofSPMscannerwithrespecttoeachtip)。
所述方法还包括比较测定的相互作用力和预确定的相互作用力的步骤。术语“预确定的相互作用力”可以是已知抗生物污着材料和附着于探针的细胞之间的粘附力或排斥力。所述粘附力或排斥力可通过上述方法测量。在比较测定的相互作用力和预确定的相互作用力的步骤中,预确定的相互作用力可以是在包被步骤之前就样品表面而言的相互作用力。
所述方法可以进一步包括当所述相互作用力是粘附力且该测定的相互作用力小于所述预确定的相互作用力时,识别所述样品表面具有抗生物污着特性的步骤;或当所述相互作用力是排斥力且该测定的相互作用力大于所述预确定的相互作用力时,识别所述样品表面具有抗生物污着特性的步骤。另外,所述方法可以进一步包括当所述相互作用力是粘附力且该测定的相互作用力大于所述预确定的相互作用力时,识别所述样品表面具有非抗生物污着特性的步骤;或当所述相互作用力是排斥力且该测定的相互作用力小于所述预确定的相互作用力时,识别所述样品表面具有非抗生物污着特性的步骤。在该情况下,该方法可进一步包括识别样品表面为有缺陷的步骤。亦即,分析是确定对产品的表面处理是否失败。
另一个方面提供扫描探针显微镜,其包含用于检测关于样品表面的信息的探针,用于相对于所述样品移动该探针以允许该探针扫描所述样品表面的扫描器,和用于检测该探针的偏转的偏转传感器,其中该探针的一端连接于所述扫描器而其另一端是从所述扫描器延伸的细胞附着性悬臂,所述偏转传感器包含放置以对该探针照射光的光源和放置以检测从该探针反射的光的位置敏感性光检测器,且所述扫描器包含连接于该探针的扩大型压电元件。
所述扫描探针显微镜可以是原子力显微镜(AFM)。细胞可以通过静电结合在探针上而固定化,所述探针用聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(polyDADMAC)包被。
所述扫描探针显微镜包含检测关于彼此不同的样品表面的信息的多个探针和用于分别检测多个探针中每个的偏转的一组偏转传感器。多个探针可以以预确定的间隔排放在基底上。
除非另外提述,扫描探针显微镜的元件具有与上述方法中引用的扫描探针显微镜的那些相同的含义。
样品表面可通过使用依照一个方面的扫描探针显微镜分析样品表面的方法有效分析。
依照另一个方面的扫描探针显微镜可在分析样品表面的方法中有效使用。
附图简述
这些和/或其他方面将从对例示实施方案连同所附附图的以下描述变得明显和更容易领会的。
图1是举例说明扫描探针显微镜的例示性实施方案的图;
图2是悬臂偏转传感器的放大图;
图3(A)至3(D)显示用光学显微镜观察附着于用聚(二烯丙基二甲基氯化铵)包被的悬臂上的大肠杆菌的结果;
图4(A)至4(D)显示在用光学显微镜观察附着于悬臂上的大肠杆菌之后检查大肠杆菌大小的结果,其通过使用扫描电子显微镜(SEM)从而以相应放大率的高分辨率测量微生物的大小;
图5显示通过使用XPS(X射线光电子分光术)对于用抗微生物银纳米颗粒包被的塑料表面获得的测量结果;
图6A至6H显示在例示性实施方案中实施的实验规程;
图7显示多种表面的粘附力,其为使用不同探针用AFM测量的;
图8A至8H显示对应于图7的距离-力曲线;
图9是显示探针上的大肠杆菌和表面之间的强相互作用力的距离-力曲线,其中通过依照一个具体的实施方案使用探针测量表面来获得该曲线,所述探针包含附着于用聚(二烯丙基二甲基氯化铵)包被的悬臂的大肠杆菌;和
图10是显示探针上的大肠杆菌和表面之间的弱相互作用力的距离-力曲线,其中通过依照一个具体的实施方案使用探针测量表面来获得该曲线,所述探针包含附着于用聚(二烯丙基二甲基氯化铵)包被的悬臂的大肠杆菌。
发明详述
现将对例示实施方案进行具体提述,其例子在所附附图中示例,其中类似的参照编号贯穿全文指代类似的要素。在此方面,当前例示的实施方案可以具有不同的形式且不应理解为局限于本文中列出的描述。因此,仅在下文通过参照附图描述例示性实施方案来解释各方面。
下文中,本发明将参照例示实施方案更详细地描述。然而,本文中描述的例示性实施方案应仅视为描述性的而不是用于限制目的。
实施例:
(1)大肠杆菌培养
本实施例中使用的革兰氏阴性大肠杆菌是DH5αTM感受态细胞(LifeTechnologiesKoreaLLC)。将一管先前制备的DH5αTM感受态细胞解冻并在板上铺板,挑取几个克隆并悬浮于3mL的LuriaBertani(LB)培养基中,接着培养12~16小时。这里,细胞密度是每ml1x109个细胞(OD>1.8)。将该培养液在200ml的LuriaBertani新鲜培养基中传代培养直至OD600达到1.6~1.8。每次,使用培养到在约2-3次传代培养后OD600达到0.6-1的大肠杆菌。培养在37℃在有氧条件下进行。使用在对数阶段中期的大肠杆菌。
(2)在AFM中悬臂的末端包被大肠杆菌
本实施例中使用的AFM是DimensionIcon(Bruker),且对于通过探针的二维扫描的表面观察,使用峰值力轻叩模式(peakforcetappingmode)来重复一系列操作,包括对样品应用力和通过在垂直方向移动探针从其分离。由于每1个循环获得力曲线,其解译提供弹性或粘附力和动态特性以及表面形状的图谱分析(mapping)。
AFM的悬臂由Si3N4制备且其弹簧常量是0.05N/m。该弹簧常量用于计算力。悬臂是在另一端没有尖端的无头悬臂。悬臂具有4μm的厚度和125μm的长度。
首先,将悬臂的一端用具有式IV的聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(SigmaAldrich,货号26062-79-3)包被。
具体而言,将在水中35wt.%的聚(二烯丙基二甲基氯化铵)溶液(平均Mw<100,000)用水稀释2,000倍,并将10μl稀释溶液加载到悬臂上,其在室温温育30分钟至1小时以提供足够的时间使得尖端末端的稀释溶液充当微生物和SPM尖端之间的粘合剂。
接着,将悬臂用10ml蒸馏水清洗3次和然后干燥。
使用离心机沉淀在LB培养基中培养的大肠杆菌DH5αTM感受态细胞,弃去上清,仅收集细胞,并用蒸馏水清洗2至3次,然后制备为106个细胞/ml和105个细胞/ml的密度。将其10μl加载到上文获得的用聚(二烯丙基二甲基氯化铵)包被的悬臂的末端上,然后将其在室温温育30分钟至1小时以允许细胞结合粘附性聚(二烯丙基二甲基氯化铵)。将悬臂用10ml蒸馏水清洗3次。结果获得用大肠杆菌附接的、聚(二烯丙基二甲基氯化铵)包被的悬臂。采用相同的方案,也获得了用聚(二烯丙基二甲基氯化铵)包被但未附接大肠杆菌细胞的悬臂和仅用大肠杆菌细胞处理过的悬臂。通过使用光学显微镜观察这些用聚(二烯丙基二甲基氯化铵)包被的悬臂,且结果显示于图3。
图3显示通过光学显微镜观察大肠杆菌的结果,所述大肠杆菌附着在用聚(二烯丙基二甲基氯化铵)包被的悬臂上。它可以在不染色的情况下使用光学显微镜观察到。
图3显示为了检查每个浓度,即106个细胞/ml和105个细胞/ml,的大肠杆菌是否良好地附着在用聚(二烯丙基二甲基氯化铵)包被的悬臂上,在不染色的情况下使用光学显微镜通过调整两种不同的浓度水平对微生物的初步观察的结果。图3中,(A):106个细胞/ml,(B):106个细胞/ml,(C):105个细胞/ml,(D):无细胞。B是在不同角度从A所取的图像。
图4显示在用光学显微镜观察附着于悬臂上的大肠杆菌之后,为了以每个放大率以高分辨率测量微生物的大小通过使用扫描电子显微镜(SEM)检查大肠杆菌大小的结果。图4,(A),(B),(C)和(D)是对于2.5μmX1.04μm的区域分别为1,500X放大率(A,B和C)和30,000X放大率(D)的结果。
图5显示对于用抗微生物银纳米颗粒包被的塑料表面的XPS结果。XPS分析仪是Quantum2000(ULVAC-PHIInc.)(束源:Alkα(hν=1486.6eV)和光束大小:100μm)。
如图5中显示的,检测到F和Ag组分,表明表面具有抗生物污着特性。XPS仪可用于分析具有10nm或更少的表面的化学组分。由于每个元素具有一组独特的结合能,可通过分析结合能和每个峰的强度来鉴定关于组分和化学组成的信息。
在图5中,y轴代表任意单位(arbitraryunit)的电子计数,而x轴代表结合能(eV)。另外,黑色边界:仅表面上的Ag层和玻璃上的银纳米层移动窗口盖(onlyAglayeronthesurfaceandsilvernanolayermobilewindowcoveronglass),白色边界:仅表面上的AF层和玻璃上的直接用AF(氟烷基链)包被的表面移动窗口盖(onlyAFlayeronthesurfaceandsurfacemobilewindowcoverdirectlycoatedwithAF(Fluoro-alkylchain)onglass),对每种颜色实施测量。
图6显示在实施例中实施的实验规程。该规程可在环境条件下进行,包括非液体条件,如环境气氛或空气。在图6中,基底60的表面用银纳米材料62或抗污着材料66包被,或其用银纳米材料62包被然后其上用抗污着材料66包被,或者未包被。
在图6中,A显示对附着在用聚DADMAC18包被的探针(或悬臂12)末端处的大肠杆菌64和用银纳米材料62包被的基底之间的粘附力或排斥力的测量,所述用银纳米材料62包被的基底通过以10nm的厚度在玻璃基底60的表面上通过沉积用银纳米颗粒灌注的硅石层(silvernanoparticle-impregnatedsilicalayer)包被来获得。B显示对附着在用聚DADMAC18包被的探针12末端处的大肠杆菌64和表面66之间的粘附力或排斥力的测量,所述表面66通过以几nm的厚度在玻璃60的表面上通过沉积用导入硅烷的防指纹有机化合物、式III的全氟聚醚(PFPE)硅烷(asilane-introducedanti-fingerprintorganiccompound,perfluoropolyethersilane(PFPE)ofFormulaIII)(OPTOOLTM-UD502,Daikin)(水接触角115°,摩擦系数0.1至0.15)包被来获得。C显示对附着在用聚DADMAC18包被的探针12末端处的大肠杆菌64和表面之间的粘附力或排斥力的测量,所述表面通过以几nm的厚度在A的玻璃基底60的表面的银纳米材料层62上通过沉积用导入硅烷的防指纹有机化合物、式III的全氟聚醚(PFPE)硅烷(OPTOOLTM-UD502,Daikin)(水接触角115°,摩擦系数0.1至0.15)66包被来获得。在该情况中,银纳米材料层62和防指纹有机化合物层66的总厚度低于20nm。D显示对附着在用聚DADMAC18包被的探针12末端处的大肠杆菌64和没有银纳米材料层62且没有防指纹有机化合物层66的防护白玻璃(plainglass)表面66之间的粘附力或排斥力的测量。E显示对无大肠杆菌附着的用聚DADMAC18包被的探针12和没有银纳米材料层62且没有防指纹有机化合物层66的防护白玻璃表面66之间的粘附力或排斥力的测量。F显示对无大肠杆菌附着的用聚DADMAC18包被的探针12和在C的银纳米材料层62上包被的防指纹有机化合物层66之间的粘附力或排斥力的测量。G显示对附着在未用聚DADMAC18包被的探针12末端处的大肠杆菌64和在C的银纳米材料层62上包被的防指纹有机化合物层66之间的粘附力或排斥力的测量。H显示对无大肠杆菌64附着的、未用聚DADMAC18包被的探针12和在C的银纳米材料层62上包被的防指纹有机化合物层66之间的粘附力或排斥力的测量。
图7显示多种表面的粘附力,其通过使用不同探针的AFM来测量。在图7中,A,B,C,D,E,F,G和H代表分别依照图6的A,B,C,D,E,F,G和H规程测量的粘附力。实施对照实验来分别检查附着在探针末端处的微生物的影响、微生物和探针之间的接头的影响、以及接头和微生物的影响。
A,B和C显示小粘附力(例如B和C的粘附力几乎为0nN),表明A,B和C的表面具有抗生物污着特性。亦即,当使微生物探针与表面接近(逼近)时,认为排斥力作用于表面以阻止微生物对表面的粘附。D至G显示52.2nN或更大的粘附力(其在检测范围以外),而H显示30nM或更大的粘附力。详细地,认为D显示无抗生物污着特性,因为未用抗生物污着材料包被的玻璃表面显示与大肠杆菌的强粘附力。根据E和F,聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(polyDADMAC)层显示对未用抗生物污着材料包被的玻璃表面和在银纳米材料层62上包被的防指纹有机化合物层66的强粘附力。因此,它们不适用于测定表面的抗生物污着特性。根据H,由氮化硅制备的悬臂12显示对在银纳米材料层62上包被的防指纹有机化合物层66的强粘附力,且因此其不适用于测定表面的抗生物污着特性。最后,根据G,当大肠杆菌附着于未用阳离子聚电解质聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(polyDADMAC)包被的探针的末端处时,其显示对在银纳米材料层62上包被的防指纹有机化合物层66的强粘附力。参照C(其中附着于用阳离子聚电解质聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(polyDADMAC)包被的探针的大肠杆菌对在银纳米材料层62上包被的防指纹有机化合物层66显示约0nM的粘附力),表明G的大肠杆菌重度粘附于探针12的表面。因此,作为探针材料的氮化硅被视为与在银纳米材料层62上包被的防指纹有机化合物层66相互作用,从而显示强粘附力。根据C,无大肠杆菌附着的探针12不适用于测定在银纳米材料层62上包被的防指纹有机化合物层66的抗生物污着特性。
图7中显示的粘附力是仅最高值的平均值,该最高值通过探针对每个基底的20个点重复接近和回缩来获得。
图8显示对应于图7的距离-力曲线。在图8中,水平轴代表距离(nm)且垂直轴代表粘附力(V)。图8的A,B,C,D,E,F,G和H分别是对应于图6的A,B,C,D,E,F,G和H的实验的结果。
在图8中,可通过以下等式1将粘附力变量伏特转化为单位nm。
F=k*x=k*V*偏转灵敏度(等式1),其中F是力,k是弹簧常量(0.05N/m),x测量为尖端的偏转距离(nm),V是电压,且偏转灵敏度(87nm/V)是对于每个尖端,SPM扫描器的压电元件的每伏特的偏转距离(nm)。
在图8中,水平轴代表高度,即在探针与表面接触后从自由空间返回的距离(μm)。它代表当探针在从左起始点-7μm移动到表面接触点0μm后返回时探针的行进距离,用以评估其对表面的粘附力。垂直轴代表伏特,即当探针与表面接触后回缩时的探针偏转,且还代表当通过光检测器检测探针的微移动时的电压。图8显示通过在每个测试中评估对表面的20或更多点的表面粘附力获得的值,且将这些值重叠并在单个图上给出。粘附力的强度可甚至通过图的形状来评估。
图9是显示探针上的大肠杆菌与表面之间的强相互作用力的距离-力曲线,其中通过使用包含附着于用聚(二烯丙基二甲基氯化铵)包被的悬臂的大肠杆菌的探针测量一个具体实施方案的表面获得该曲线。图9类似于图8的D至H。
图10是显示探针上的大肠杆菌与表面之间的弱相互作用力的距离-力曲线,其中通过使用包含附着于用聚(二烯丙基二甲基氯化铵)包被的悬臂的大肠杆菌的探针测量一个具体实施方案的表面获得该曲线。图10类似于图8的A至C。
在图9中,水平轴的高度传感器(μm)代表扫描探针显微镜的探针垂直移向基底表面的距离或相反距离(oppositedistance)。最远的距离是-7μm。最近的距离是0μm,即探针和基底的表面彼此接触。垂直轴的偏转误差(V)代表偏转程度,其在扫描探针显微镜的探针的垂直移动期间测量。
参照图9和10如下描述了距离-力关系。在图9中,虚线----代表电压(或力)随探针尖端从-7μm至0μm接近(即沿水平轴从左向右)的变化。实线代表电压(或力)随探针尖端从与基底表面的接触(距离0μm)至-7μm(即沿水平轴从右向左)的分离而变化。在图9中当探针尖端从与基底表面的接触起分离时,与接近时相比检测到高电压。如图9中的,当它们彼此分开时,电压为约-11V至-2V。因此图9指示探针和基底表面之间的强粘附力。在该情况中,探针对基底的接近和从其分离之间的电压差异,即当探针与基底接近时的电压曲线和当探针从其分离时的电压曲线之间的面积代表探针和基底之间的粘附力的强度。在图10中,当探针与基底接近时的电压曲线和当探针从其分离时的电压曲线之间没有差异。因此,图10指示探针和基底表面之间的弱粘附力。
当参照图9和10分析图8A至8H的结果时,图8A至8C显示当探针与基底接近时的电压曲线和当探针从其分离时的电压曲线之间的小面积,从而表明探针和基底之间的粘附力不强。相反,图8F和8H显示当探针与基底接近时的电压曲线和当探针从其分离时的电压曲线之间的大面积,从而表明探针和基底之间的粘附力较强。另外,图8D、8E和8G显示探针和基底之间的粘附力太强以致在探针与基底接近后难以从基底分离探针,从而表明探针和基底之间的非常强的粘附力。
除非本文中另外指示或与上下文清楚地冲突,术语“一个/一种”和“该”及类似指代物在描述本发明的背景中(尤其在所附权利要求的背景中)的使用应理解为涵盖单数和复数。除非另外记载,术语“包含/包括”、“具有”和“含有”应理解为开放端术语(即意指“包括但不限于”)。除非另外指示,本文中值的范围的记载仅意图作为分别提述落入该范围内的每个单独值的速记方法,且每个单独的值均纳入说明书中,如其在本文中分别记载的。除非本文中另外指示或与上下文清楚地冲突,本文中描述的所有方法可以任何适宜的次序进行。除非另外主张,本文中提供的任何和所有例子或例示性语言(例如“如”)的使用仅意图更好地说明本发明,而不对本发明的范围施加限制。说明书的任何语言均不应理解为指示任何未主张的要素为对本发明实践必要的。
在本文中描述了本发明的优选实施方案,包括发明人已知的用于实施本发明最佳的模式。在阅读前述说明后,那些优选实施方案的变体对于本领域普通技术人员可能是明显的。发明人预期熟练的技术人员如适宜地采用这类变体,且发明人意图本发明以本文中具体描述的以外的方式实践。因此,本发明包括所附权利要求中记载的主题的所有修改和等同物,如适用法律所允许的。而且,除非本文中另外指示或与上下文清楚地冲突,上述要素在其所有可能变体中的任意组合均涵盖在本发明中。
Claims (20)
1.一种用于使用扫描探针显微镜分析样品表面的方法,所述方法包括:
提供具有表面的样品;
通过扫描器相对于所述样品表面移动探针以允许该样品表面和该探针之间的相互作用;
自偏转传感器测量该探针的偏转距离;
自所述偏转距离测定该探针和该表面之间的相互作用力;和
比较测定的相互作用力和预确定的相互作用力,其中所述扫描探针显微镜包含用于检测关于所述样品表面的信息的所述探针,用于相对于所述样品移动该探针以允许该探针扫描所述样品表面的所述扫描器,和用于检测该探针的偏转的所述偏转传感器,且该探针的一端连接于所述扫描器而其另一端是从所述扫描器延伸的细胞附着性悬臂,且所述偏转传感器包含放置以对该探针照射光的光源和放置以检测从该探针反射的光的位置敏感性光检测器。
2.权利要求1的方法,其进一步包括当所述相互作用力是粘附力且该测定的相互作用力小于所述预确定的相互作用力时,识别所述样品表面具有抗生物污着特性;或当所述相互作用力是排斥力且该测定的相互作用力大于所述预确定的相互作用力时,识别所述样品表面具有抗生物污着特性。
3.权利要求1或2的方法,包括在提供具有该表面的该样品之前,用抗生物污着材料包被所述样品表面。
4.权利要求3的方法,其中与所述样品表面相比,就所述细胞而言,所述抗生物污着材料显示较小的粘附力或较大的排斥力。
5.权利要求1的方法,其中将抗生物污着材料附着于所述样品的表面。
6.权利要求1的方法,其中通过扫描器将所述探针相对于所述样品表面移动是相对于该表面而言使探针接近或回缩。
7.权利要求1的方法,其中所述扫描器包含连接于该探针的扩大型压电元件。
8.权利要求3的方法,其中在比较所述测定的相互作用力与所述预确定的相互作用力中,所述预确定的相互作用力是在包被之前就所述样品表面而言的相互作用力。
9.权利要求1的方法,其中通过扫描器将所述探针相对于所述样品表面移动不是在液体介质中,而是在环境气氛如空气中进行。
10.权利要求1的方法,其中通过静电结合在用阳离子聚电解质包被的该探针上固定化所述细胞。
11.权利要求10的方法,其中所述阳离子聚电解质是聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(polyDADMAC)。
12.权利要求1的方法,其中所述细胞是活细胞。
13.权利要求1的方法,其中所述扫描探针显微镜是原子力显微镜(AFM)。
14.权利要求1的方法,其中所述扫描探针显微镜包含用于检测关于彼此不同的样品表面的信息的多个探针和用于检测多个探针中每个的偏转的一组偏转传感器,且所述方法对于所述样品表面上的多个位置进行。
15.权利要求14的方法,其中在所述扫描探针显微镜中,用于检测关于所述样品表面的信息的多个探针以预确定的间隔排列在探针支持物上。
16.一种扫描探针显微镜,其包含:
用于检测关于样品表面的信息的探针,
用于相对于所述样品移动该探针以允许该探针扫描所述样品表面的扫描器,和
用于检测该探针的偏转的偏转传感器,其中该探针的一端连接于所述扫描器而其另一端是从所述扫描器延伸的细胞附着性悬臂,所述偏转传感器包含放置以对该探针照射光的光源和放置以检测从该探针反射的光的位置敏感性光检测器,且所述扫描器包含连接于该探针的扩大型压电元件。
17.权利要求16的扫描探针显微镜,其中所述扫描探针显微镜是原子力显微镜(AFM)。
18.权利要求16的扫描探针显微镜,其中通过静电结合在用阳离子聚电解质包被的该探针上固定化所述细胞。
19.权利要求16的扫描探针显微镜,其中所述扫描探针显微镜包含用于检测关于彼此不同的样品表面的信息的多个探针和用于检测多个探针中每个的偏转的一组偏转传感器。
20.权利要求19的扫描探针显微镜,其中所述多个探针以预确定的间隔排列在探针支持物上。
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