CN105699276A - 一种超分辨成像装置及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种超分辨显微成像的装置及方法，该装置包括蓝光LED光源、凸透镜L₁、滤光片O1、分光镜、编码器、滤光片O2、凸透镜L₂、CCD相机和计算机,蓝光LED光源发出的蓝光依次经凸透镜L₁、滤光片O1、分光镜、编码器，照射到被测样品上，被测样品产生的发射光依次经编码器、分光镜、滤光片O2、凸透镜L₂，再由CCD相机送入计算机。所述的编码器采用随机纳米粒子编码器。该显微装置及其方法，特点是采用传统光学显微镜的原理，解码完全通过计算机实现，结构简单；光源采用LED光源激发样品，无需激光照射，活体细胞受损程度小。

Description

一种超分辨成像装置及方法

技术领域

本发明涉及一种显微成像装置及方法，特别涉及一种突破光学显微镜的衍射极限，达到纳米级别的分辨率，对活体细胞进行显微成像的装置及方法。

背景技术

现代生物学的发展对微观结构研究提出了越来越高的分辨率要求，希望从分子水平揭示生命过程的物理本质。然而，受光学衍射极限的限制，普通光学显微镜的横向分辨率一般只能达到200nm，纵向分辨率达到500nm，其无法研究亚细胞结构及其内部物质的相互作用。尽管电子显微镜和原子力显微镜可以达到纳米级别的分辨率，但其只针对非活性离体细胞样品观测的缺点限制了其在生物领域的广泛应用。因此，如何突破传统光学显微镜的分辨率极限，对活体细胞进行纳米级别显微成像，成为光学显微成像技术迫切需要解决的一个问题。

近年来，随着计算机和光学器件的不断发展，相继出现了能够突破传统光学显微镜衍射极限的超分辨显微成像技术，解决了电子显微镜和原子力显微镜不能对活性离体细胞样品进行观测的缺点，实现1-100nm分辨率的显微成像。其核心思想是通过建立时间带宽信息从而换取高空间分辨图像，具体表现为由时间序列的低空间分辨图像得到一幅高空间分辨图像。常用的超分辨技术主要有以下方法：1)4Pi显微技术：该技术能实现纳米分辨率，活体测量，但是需要使用干涉方法，以及双物镜的复杂结构；2)受激发射损耗显微技术：该技术可以突破光学衍射的远场光学显微，得到超分辨图像，但是此技术需要采用超连续激光器且长时间的激光照射会破坏活体细胞；3)光激活定位显微技术：该技术可以观察到纳米级别的分子活动，但需要用特定波长的光，重复的激发以及漂白荧光分子，结构复杂，测量效率极低。

发明内容

本发明的目的是提供一种超分辨成像装置，本发明装置特点是结构简单，光源采用LED光源，对被观察的活体细胞损伤小。

本发明的另一目的是利用超分辨成像装置进行成像的方法。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

超分辨显微成像的装置，包括蓝光LED光源、凸透镜L₁、滤光片O₁、分光镜、编码器、滤光片O₂、凸透镜L₂、CCD相机和计算机,蓝光LED光源发出的蓝光依次经凸透镜L₁、滤光片O₁、分光镜、编码器，照射到被测样品上，被测样品产生的发射光依次经编码器、分光镜、滤光片O₂、凸透镜L₂，再由CCD相机送入计算机。

进一步地，所述的编码器采用随机纳米粒子编码器。

利用超分辨显微成像的装置进行显微成像的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)、蓝光LED光源发射蓝光经过凸透镜L₁准直，低通滤光片O₁、分光棱镜激发被测样品产生发射光s(x,y)；

2)、编码器通过纳米粒子产生时变随机编码f(x,y,t)，对被测样品的发射光s(x,y)进行编码，经分光棱镜、高通滤光片O₂以及凸透镜L₂后聚焦到CCD相机的像平面上；

3)计算机根据时变随机编码产生时变解码f′(x,y,t)：

${\∫}_0^{t}f(x^{\′},y^{\′},t)\·f^{\′}(x,y,t)dt=\mathrm{\δ}(x-x^{\′},y-y^{\′})+c,$

其中，c为常数，δ(x,y)为二维单位脉冲函数；

4)对CCD相机采集到的图像进行时变解码如下：

$o_2(x,y,t)=\{\[s(x,y)\·f(x,y,t)\]\⊗p(x,y)\}\·f^{\′}(x,y,t),$

式中，p(x,y)为凸透镜L₂的点扩散函数；

5)对时变解码后的图像o₂(x,y,t)进行重构图像如下：

$\begin{array}{c}o(x,y)={\∫}_0^t{o}_2(x,y,t)dt\\ =p(0,0)\·s(x,y)+c\·\[s(x,y)\⊗p(x,y)\]\end{array}$

上式中,p(0,0)为点扩散函数中心点的值，o(x,y)即为原图像s(x,y)的超分辨重构图像。

本发明的有益效果：

本发明提出的这种随机编码超分辨成像显微装置及其方法，特点是采用传统光学显微镜的原理，解码完全通过计算机实现，结构简单；光源采用LED光源激发样品，无需激光照射，活体细胞受损程度小。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：

图1为本发明的结构示意图；

图2是被测样品原图像信息的分布图；

图3是随机纳米粒子编码的分布图；

图4是通过计算机解码后的超分辨图像；

图5是原图像，模糊图像和超分辨图像剖面图的对比组合图。

图中：1、蓝光LED光源；2、凸透镜L₁；3、滤光片O₁；4、分光镜；5、编码器；6、被测样品；7、滤光片O2；8、凸透镜L₂；9、CCD相机；10、计算机。

具体实施方式

如图1所示，一种超分辨显微成像的装置，包括蓝光LED光源1、凸透镜L₁2、滤光片O13、分光镜4、编码器5、滤光片O₂7、凸透镜L₂8、CCD相机9和计算机10,蓝光LED光源1发出的蓝光依次经凸透镜L₁2、滤光片O₁3、分光镜4、编码器5，照射到被测样品6上，被测样品6产生的发射光依次经编码器5、分光镜4、滤光片O₂7、凸透镜L₂8，再由CCD相机9送入计算机10。

所述的编码器5采用随机纳米粒子编码。

利用超分辨显微成像的装置进行显微成像的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)、照明光路部分：LuxemⅢRoyalblue型号的蓝光LED光源1发射波长范围为440nm～460nm的蓝光，经焦距为f_L1＝60mm的凸透镜L₁2准直后变为平行光，该平行光被470nm低通滤光片O₁3进行滤波，最后通过50:50分光镜4激发被测样品6产生样品发射光s(x,y)；

2)、成像光路部分：纳米粒子编码器5产生时变随机编码f(x,y,t)，对被测样品6的发射光s(x,y)进行随机编码，编码后的样品发射光以及蓝光激发光经分光镜4和470nm高通滤光片O₂7后，滤除蓝光激发光，得到只含有样品发射光的信息。计算机模拟的被测样品原图像信息的分布图(如图2所示)；计算机模拟的时变随机纳米粒子编码的分布图(如图3所示)。被测样品的发射光经焦距为f_L2＝150mm的凸透镜L₂8聚焦在像素为1392×1040的CCD9像平面上；

3)计算机根据时变随机编码产生时变解码f′(x,y,t)：

${\∫}_0^{t}f(x^{\′},y^{\′},t)\·f^{\′}(x,y,t)dt=\mathrm{\δ}(x-x^{\′},y-y^{\′})+c,$

其中，c为常数，δ(x,y)为二维单位脉冲函数；

4)对CCD相机采集到的图像(如图5所示)进行时变解码如下：

$o_2(x,y,t)=\{\[s(x,y)\·f(x,y,t)\]\⊗p(x,y)\}\·f^{\′}(x,y,t),$

式中，p(x,y)为凸透镜L₂8的点扩散函数；

5)对所有时刻的编码图像解码，可得超分辨重构图像(如图4所示)，具体来说，对时变解码后的图像o₂(x,y,t)进行重构图像如下：

$\begin{array}{c}o\left(x,y\right)={\∫}_0^t{o}_2\left(x,y,t\right)dt\\ ={\∫}_0^t\[\∫\∫s\left(x^{\′},y^{\′}\right)\·p\left(x-x^{\′},y-y^{\′}\right)\·f\left(x^{\′},y^{\′},t\right){\mathrm{dx}}^{\′}{\mathrm{dy}}^{\′}\]\·f^{\′}\left(x,y,t\right)dt\\ =\∫\∫s\left(x^{\′},y^{\′}\right)\·p\left(x-x^{\′},y-y^{\′}\right)\·\[\mathrm{\δ}\left(x-x^{\′},y-y^{\′}\right)\]{\mathrm{dx}}^{\′}{\mathrm{dy}}^{\′}\\ =p\left(0,0\right)\·s\left(x,y\right)+c\·\[s\left(x,y\right)\⊗p\left(x,y\right)\]\end{array},$

本例中积分上限t取1000。方程(4)中的p(0,0)为点扩散函数中心点的值，o(x,y)即为原图像s(x,y)的超分辨重构图像。

从实验结果图5中的对比组合图可以看出，原图像中的三个同心环因透镜点扩散函数而无法辨识；通过本专利的技术方案，可以突破衍射极限的限制，从模糊图像中重构出原图像。

本专利通过随机纳米粒子对图像进行分时复用编码、CCD相机对传统光学显微镜的宽场图像的采集，以及由计算机根据随机编码生成的解码，即可获得纳米分辨率的数字图像。

以上所述是本发明的优选实施方式而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的保护范围。

Claims (3)

1.一种超分辨显微成像的装置，包括蓝光LED光源(1)、凸透镜L₁(2)、滤光片O₁(3)、分光镜(4)、编码器(5)、滤光片O₂(7)、凸透镜L₂(8)、CCD相机(9)和计算机(10),蓝光LED光源(1)发出的蓝光依次经凸透镜L₁(2)、滤光片O₁(3)、分光镜(4)、编码器(5)，照射到被测样品(6)上，被测样品(6)产生的发射光依次经编码器(5)、分光镜(4)、滤光片O₂(7)、凸透镜L₂(8)，再由CCD相机(9)送入计算机(10)。

2.根据权利要求1所述的超分辨显微成像的装置，其特征在于：所述的编码器(5)采用随机纳米粒子编码器。

3.利用权利要求2所述的超分辨显微成像的装置进行显微成像的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)、蓝光LED光源(1)发射蓝光经过凸透镜L₁(2)准直，低通滤光片O₁(3)、分光棱镜(4)激发被测样品产生发射光s(x,y)；

2)、编码器(5)通过纳米粒子产生时变随机编码f(x,y,t)，对被测样品的发射光s(x,y)进行编码，经分光棱镜(4)、高通滤光片O₂(7)以及凸透镜L₂(8)后聚焦到CCD相机(9)的像平面上；

3)计算机根据时变随机编码产生时变解码f′(x,y,t)：

${\∫}_0^{t}f(x^{\′},y^{\′},t)\·f^{\′}(x,y,t)dt=\mathrm{\δ}(x-x^{\′},y-y^{\′})+c,$

其中，c为常数，δ(x,y)为二维单位脉冲函数；

4)对CCD相机采集到的图像进行时变解码如下：

$o_2(x,y,t)=\{\[s(x,y)\·f(x,y,t)\]\⊗p(x,y)\}\·f^{\′}(x,y,t),$

式中，p(x,y)为凸透镜L₂(8)的点扩散函数；

5)对时变解码后的图像o₂(x,y,t)进行重构图像如下：

$\begin{array}{c}o(x,y)={\∫}_0^t{o}_2(x,y,t)dt\\ =p(0,0)\·s(x,y)+c\·\[s(x,y)\⊗p(x,y)\]\end{array}$

上式中,p(0,0)为点扩散函数中心点的值，o(x,y)即为原图像s(x,y)的超分辨重构图像。