CN105695414A - 一株稳定表达eml4-alk基因的肺癌细胞株及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一株稳定表达EML4-ALK融合基因的肺癌细胞株及其构建方法，通过应用慢病毒感染技术，利用LV5-EML4-ALK-GFP/Puro载体侵染A549细胞，建立稳定表达EML4-ALK融合基因的细胞株，再利用细胞免疫荧光、荧光定量PCR、Western Blot技术对细胞株进行检测，以证明细胞株构建成功。本发明构建的肺癌细胞株可以稳定表达EML4-ALK融合基因，为进一步研究EML4-ALK融合基因在肺癌发生、发展、治疗及后续耐药过程中提供基本且有力的研究工具。

Description

一株稳定表达EML4-ALK基因的肺癌细胞株及其构建方法
技术领域
本发明属于医学分子生物学技术领域，具体涉及一种稳定表达EML4-ALK4融合基因的肺癌细胞株的构建。
背景技术
肺癌是全世界最常见恶性肿瘤之一，死亡率居恶性肿瘤之首，我国肺癌发病率和死亡率也呈逐年上升趋势，其中非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer，NSCLC)约占肺癌的80％-85％，且多数患者确诊时已属晚期，失去了手术治疗的机会，而以铂类药物为基础的化疗效果也不甚理想，总有效率不到15％，2年生存率大约为12％。
近年来，随着基因组学的发展，分子靶向治疗成为肺癌治疗的研究热点，并显著提高了晚期NSCLC患者的无疾病进展生存期和总生存期。其中，棘皮动物微管相关蛋白样4-间变性淋巴瘤激酶(echinodermmicrotubule-associatedprotein-like4-anaplasticlymphomakinase，EML4-ALK)融合基因是新发现的一个肺癌靶向治疗相关基因。
间变淋巴瘤激酶(anaplasticlymphomakinase,ALK)是一个由细胞外配体结合区、跨膜区及胞内的酪氨酸激酶区组成的1,620个氨基酸的跨膜蛋白，属于胰岛素受体家族。于1994年首先发现于间变性大细胞淋巴瘤AMS3细胞株中。
棘皮动物微管相关样蛋白4(echinodermmicrotubule-associatedprotein-like4,EML4)属于棘皮动物微管相关样蛋白家族，由N末端碱基区(N-terminalbasicregion)、疏水的棘皮动物微管相关蛋白(hydrophobicechinodermmicrotubule-associatedprotein-likeprotein,HELP)区以及WD重复区(WD-repeatregion)3部分构成。WD重复区是一段通常以色氨酸-天冬氨酸结尾的氨基酸的序列，包含了4个-16个重复的单元，其所有的单元一起形成一个beta螺旋结构。WD重复区作为一个大家族广泛存在于真核生物中，负责细胞信号转导、细胞周期控制、细胞凋亡调控等。研究证明在EML4-ALK融合基因中，以上3个部分都与肿瘤的形成有关，其中N末端碱基区的作用最为重要。
EML4-ALK融合基因是由日本学者Soda等在1名62岁有吸烟史的男性腺癌患者的肿瘤组织中首次发现的。基因的重排发生在2号染色体短臂上的2区1带和2区3带，由ALK基因的3′端与EML4基因的5′倒位融合形成。EML4基因断裂后形成不同长度的外显子拼接片段，***位置相对保守的ALK基因的19号、20号外显子之间，从而形成有11个变体的EML4-ALK融合蛋白。融合基因大多都有致瘤性，其中变体1最常见，变体3a/3b次之。以最常见的变体1为例，EML4在WD重复区处断裂，形成一个由N末端碱基区、HELP区、部分WD重复区组成的片段与ALK的胞内区融合。融合基因中EML4的启动子位于ALK胞内酪氨酸激酶的上游，从而导致融合基因活化，表达EML4-ALK融合蛋白。通过EML4的胞外结构形成的二聚体使ALK在缺乏配体的情况下受体持续自磷酸化，进而持续激活下游细胞信号通路导致细胞恶性转化。
据文献报道，目前只有3株肺癌细胞系拥有EML4-ALK融合基因表达，分别是H2228(EML4-ALKvariant3a/b)，H3122(EML4-ALKvariant1)，DFC1032(EML4-ALKvariant1)。其中ATCC细胞库中有收录H2228细胞系，但截至目前为止在ATCC中关于H2228细胞系的资料记载中并没有显示其有EML4-ALK的融合基因突变，另外两株细胞系并没有被ATCC保藏，ML4-ALK融合基因突变阳性细胞系来源的局限性大大的限制了这一靶点相关的基础研究甚至是临床前研究。
发明内容
本发明为了解决上述问题，提供一株稳定表达EML4-ALK融合基因的肺癌细胞株及其构建，通过应用慢病毒感染技术，利用LV5-EML4-ALK-GFP/Puro载体侵染A549细胞，建立稳定表达EML4-ALK融合基因的细胞株，再利用细胞免疫荧光、荧光定量PCR、WesternBlot技术对细胞株进行检测，以证明细胞株构建成功，达到构建一株稳定表达EML4-ALK融合基因突变阳性的细胞系作为模型用于研究EML4-ALK融合基因在肺癌发生、发展、治疗及后续耐药过程中提供基本且有力的研究工具的目的。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供一株稳定表达EML4-ALK基因的肺癌细胞株，所述人肺癌细胞系A549/EML4-ALK保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNO:C2015193，保藏时间为2015年11月20日，保藏地址为中国武汉武汉大学。
本发明还提供上述稳定表达EML4-ALK基因的肺癌细胞株的构建方法，包括以下步骤：
步骤a，过表达载体的构建：利用化学合成方法合成EML4-ALK序列片段，然后将目的基因EML4-ALK克隆到LV5载体中并测序鉴定；
步骤b，病毒包装：将步骤a中构建好的重组质粒LV5-EML4-ALK-GFP/Puro转入293T细胞，收集病毒液并进行滴度测定；
步骤c，细胞培养：人非小细胞肺癌细胞(A549细胞)使用含10％FBS的DMEM培养基，37℃5％CO2饱和湿度培养箱中培养。
步骤d，病毒侵染：胰酶消化处于生长对数期的A549细胞，离心后用无抗生素的培养基重悬细胞，取A549细胞接种于培养皿中，待细胞贴壁后，向培养皿中加入步骤b中的病毒上清液，加入聚凝胺进行培养；
步骤e，加药筛选：弃去病毒液，换上含有10％FBS的正常培养基进行培养，接着用添加嘌呤霉素的完全培养基换液，每1-2天换液并拍照观察荧光表达。持续培养7-14天后，侵染过的A549细胞正常生长，带上绿色荧光，得到稳定表达EML4-ALK基因的肺癌细胞株。
进一步，步骤a中，将目的基因EML4-ALK基因分成两个片段进行合成，其中两个片段分别为SEQNO:1和SEQNO:2。
进一步，步骤a中，利用EcoRV将两个片段分别克隆到pUC57中，单酶切克隆反应后挑选出EML4-ALK基因的两个片段的阳性克隆进行测序验证。
进一步，步骤b中，病毒包装质粒和重组质粒LV5-EML4-ALK-GFP/Puro通过Lipofectamine2000转入293T细胞，24小时后取出培养皿，弃去培养基，1×PBS清洗细胞3次，并轻柔地加入8ml新鲜的293T培养基，继续培养；细胞转染48小时后，收集培养基上清进行浓缩，更换新鲜培养基培养24小时后再次收集浓缩液，每次收集的病毒上清液用0.45μm的膜过滤。
进一步，步骤d中，取5×105个A549细胞接种于培养皿中，待细胞贴壁后，向培养皿中加入1.5ml配置好的病毒上清液，加入聚凝胺，终浓度为5μg/ml，培养24小时。
进一步，步骤e中，将融合度达到80％-90％的A549细胞消化，按照每孔5*104细胞的密度将其接种在24孔板中培养24小时后，加入提前配制好的病毒上清液，并加入终浓度为5μg/mL的聚凝胺，病毒液孵育24小时后将病毒液弃去，换上含有10％FBS的正常培养基，24小时后将每个孔中的细胞传至10cm的培养皿中，正常培养24小时后用添加嘌呤霉素的完全培养基换液；3-4天后，侵染病毒的细胞有部分死亡；继续用含有嘌呤霉素的培养基培养细胞，每1-2天换液并拍照观察荧光表达，持续培养7-14天后，侵染病毒的细胞正常生长、带上绿色荧光。
与现有技术相比，本技术方案具有以下优点：
本发明通过上述构建方法成功构建了肺癌细胞株。本发明构建的肺癌细胞株可以稳定表达EML4-ALK融合基因，为进一步研究EML4-ALK融合基因在肺癌发生、发展、治疗及后续耐药过程中提供基本且有力的研究工具。
附图说明
图1是LV5-EML4-ALK重组质粒的双酶切鉴定图。
图2是瞬时转染细胞的荧光定量PCR扩增曲线图。
图3是瞬时转染细胞的WB蛋白鉴定结果。
图4是稳转细胞株的荧光定量PCR扩增曲线图。
图5是稳转细胞株的WB蛋白鉴定结果。
具体实施方式
(1)EML4-ALK序列片段的合成
oligo设计，目的基因上下游引物分别加上NotI和NsiI及保护碱基，用于载体的亚克隆，将EML4-ALK基因分成两个片段进行合成，B687A(1-1602bp)，序列如SEQNO:1所示；B687B：(1564-3180bp)，序列如SEQNO:2所示。
两个片段分别通过两轮PCR反应合成得到，然后利用EcoRV将其分别克隆到pUC57中，单酶切克隆反应后挑选出EML4-ALK基因的A,B两个片段的阳性克隆进行测序验证。
(2)目的基因克隆到载体LV5中
用NotI和BspHI对EML4-ALK基因片段A、EML4-ALK基因片段B进行酶切，37℃酶切2小时，酶切体系为：10*buffer5μL，B687A15μL，NotI和BspHI各1μL，ddH2O28μL。用BspHI和NsiI对EML4-ALK基因片段B进行酶切，37℃酶切2小时，酶切体系为：10*buffer5μL，B687B15μL，NotI和BspHI各1μL，ddH2O28μL。用NotI和NsiI对慢病毒载体LV5进行酶切，37℃酶切2小时，酶切体系为：10*buffer5μL，LV55μL，NotI和NsiI各1μL，ddH2O38μL。酶切后电泳，用DNA凝胶回收试剂盒回收EML4-ALK基因片段A、EML4-ALK基因片段B和载体LV5，22℃连接2小时，连接体系为：T4DNAligasebuffer2μL，LV52μL，B687A5μLB687B5μL，T4DNAligase1μL，ddH2O5μL。
(3)连接产物转化至感受态细胞并鉴定
从-70℃中取出感受态细胞，冰上放置4分钟，待感受态细胞解冻后，加入10μL连接产物，轻柔混匀内容物，冰中放置30分钟；然后将之放到预加温到42℃的水浴锅中，静置90秒；快速将离心管转移到冰浴中，使细胞冷却3分钟；向离心管加入800μLLB培养基(不含抗生素)，然后转移到37℃摇床，250转/分钟，培育45分钟使细菌复苏；取200μL培育后的细胞均匀涂布于含50μg/mLAmpicillinLB平板上，平板上液体被吸收后，将平板倒置于37℃培养箱中，培养16小时；从培养好的平板上挑取4个单独、饱满的菌落，置于含有5mL(含50μg/mLAmpicillin)LB培养基的试管中，将试管置于细菌摇床中培养，37℃，250转/分钟，培养16小时；将培养好的菌液，用质粒小提试剂盒(天根生化，DP104-02)抽提质粒，对抽取好的质粒进行双酶切鉴定如图1所示，其中图1中泳道1是双酶切产物，泳道2是marker。
反应体系为：10×Buffer1μL，质粒1μL，NotI和NsiI各0.5μL，ddH2O7μL，酶切37℃，1小时后电泳，在目的条带大小对应区域有酶切得到的条带对应的克隆即为阳性克隆。取200μL阳性克隆对应的菌液送测序鉴定，并将剩余的菌液用甘油保存。
(4)慢病毒包装
将处于对数生长期的293T细胞消化，按照每个10cm的培养皿5×106个细胞数接种于培养皿中，37℃，5％CO2的培养箱中培养过夜。次日转染前弃去旧的培养基加入5mL新鲜的含10％血清DMEM培养液。准备一支无菌的5mL离心管，先加入1.5mL无血清Opti-MEM培养液，再加入pLV/helper-SL3、pLV/helper-SL4、pLV/helper-SL5、目的质粒(各4ug)，轻轻颠倒混匀；准备另外一支无菌的5mL离心管里，加入1.5mL无血清Opti-MEM培养液和40μL的Lipofectamine2000，轻轻颠倒混匀，室温孵育5分钟；将已稀释DNA加入到含有Lipofectamine2000的无血清Opti-MEM培养液，轻轻颠倒混匀，室温孵育20分钟；将DNA-Lipofectamine2000复合物一滴一滴地添加到293T细胞中，轻轻地前后摇晃培养皿以混匀复合物。放置37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中过夜培养；次日，更换10mL含10％血清DMEM培养液；转染后48小时收集培养上清进行浓缩；再加入10mL新鲜的培养液继续培养，72小时再次收集浓缩；浓缩过程：3000rpm低速离心15min，上清用0.45μm滤器进行过滤，以彻底去除细胞碎片；每个UT离心管装20mL滤液，50000×g高速离心90min沉淀病毒颗粒，弃去上清；每管沉淀用200μL培养液重悬病毒沉淀，取一部分用于滴度测定，剩余的分装并存放在-80℃冰箱。
(5)细胞培养：人非小细胞肺癌细胞(A549细胞)使用含10％FBS的DMEM培养基，37℃5％CO2饱和湿度培养箱中培养。
(6)LV5-EML4-ALK-GFP/Puro载体瞬时侵染A549细胞
实验材料：
正常培养培养基：DMEM+10％FBS
加药筛选培养基：DMEM+10％FBS+puromycin(终浓度1μg/ml)
PBS
Trypsin-EDTASolution(0.25％Trypsin-EDTA,Gibco)
病毒工作液：EML4-ALK病毒液(108TU/ml)，编号V4669
NC对照组(空载病毒组)：LV5-NC病毒液(108TU/ml)
胰酶消化A549细胞并计数，按照1×105cells/well的密度接种于6孔板中，DMEM(10％FBS,无抗生素)培养基培养细胞至融合度达到90％。将慢病毒原液和含10％FBS的DMEM培养液按1:5的浓度配比成病毒工作液，吸弃6孔板中培养基，加入病毒工作液(NC组:阴性对照组；v44669组：EML4-ALK病毒液)，培养96小时，培养条件为37℃，5％CO2。
(7)荧光定量PCR法检测瞬时侵染效果
RNA提取：将病毒侵染96小时后的细胞拿出培养箱，用预冷PBS缓冲液洗2遍，每孔中加1mLEzol裂解液重悬并分别转移至1.5mLEP管中，然后加入0.2mL三氯甲烷，剧烈摇动10s，室温放置3分钟，4℃，12,000g离心20min。将上清水相转移至另一新的无RNA酶离心管中，并加入等体积的100％乙醇，吸取全部样品，加入带有2mL收集管的mini-spin离心柱。8,000g，室温离心15s，弃尽流穿液。往离心柱中加入700μLWB，轻盖盖子，8,000g，室温离心15s，弃尽流穿液。用500μLWB洗涤离心柱三次。将离心柱转移至一新的无RNA酶的1.5mL离心管中，往硅胶膜中央滴加50μLDEPC水，4℃，10,000xg离心3min洗脱RNA。
逆转录：取RNA2μL，向其中加入随机引物N6(100μM)5μL，混匀，置于75℃温浴5分钟，然后向其中分别加入2×逆转录缓冲液10μL，dNTP(2.5mM)3μL，MMLV逆转录酶(200U/μL)0.4μL，Rnasin(40U/μL)0.15μL置于PCR仪中反应。反应程序为：37℃，60min；85℃，10min；4℃，保持。
荧光定量PCR反应：按说明书配置反应体系，上机进行PCR扩增和检测。反应总体系为20μL，具体是2×定量PCRMasterMix10μL，上下游引物(20μM)各0.08μL，cDNA模板1μL，TaqDNA聚合酶(2.5U/μL)0.04μL，用灭菌水补足20μL体系。反应条件95℃3min预变性，循环内95℃30s变性，62℃退火40s，PCR反应设置40个循环，并在每个循环延伸末收集荧光信号，绘制扩增曲线如图2所示，由图2看可以看出，目的病毒侵染组并没有特异性的起峰。
(8)Westernblot检测瞬时侵染效果
细胞总蛋白提取：将病毒侵染96小时后的细胞拿出培养箱，，弃去培养基，预冷的1×PBS溶液1ml清洗细胞1次，加入蛋白裂解液150μl/well，冰上裂解10min，收集蛋白裂解液于1.5mLEP管中，并于4℃、12000rpm条件下离心10min,将上清转移至另一新的1.5mLEP管中，取少量蛋白裂解液用于总蛋白定量，其余蛋白裂解液加入4×SDS上样缓冲液(含0.01％w/v溴酚蓝)，100℃沸水浴10min变性。
Westernblot：制备8％分离胶和4％压缩胶，向加样孔中用加入变性后的蛋白裂解液(总蛋白20μg)，两端加样孔加入3μL蛋白Marker。压缩胶80V电泳30min，分离胶120V电泳70min。电泳结束后，将PVDF膜在甲醇中浸湿，再使用TransferBuffer浸泡凝胶、滤纸和在甲醇中润湿过的PVDF膜10分钟，然后将滤纸和PVDF膜在转膜夹中依次按顺序叠放，排除气泡，将转膜夹置于转膜缓冲液中，低温恒流，220mA转膜90min。转膜结束后，用5％BSA/TBST溶液，摇床缓慢摇动，封膜1h。用稀释比例为1:200的兔抗人EML4-ALK(一抗)4℃过夜孵育。TBST洗膜3次，每次10min。用稀释比例为1:8000的HRP标记的羊抗兔IgG抗体(二抗)摇床孵育2h。TBST洗膜3次，每次10min。用ECL底物进行化学发光检测，并对X光片曝光，经显影定影处理后，胶片用扫描仪扫描如图3所示，由图3可以看出，瞬时侵染组并没有检测到EML4-ALK蛋白的表达。
(9)稳转细胞株的筛选与鉴定
将融合度达到80％-90％的A549细胞消化，按照每孔5*104细胞的密度将其接种在24孔板中培养24小时后，加入提前配制好的病毒工作液(保留不被病毒侵染的空白对照组)，并加入终浓度为5μg/mL的Polybrene，病毒液孵育24小时后将病毒液弃去，换上含有10％FBS的正常培养基，24小时后将每个孔中的细胞传至10cm的培养皿中，正常培养24小时后用添加嘌呤霉素的完全培养基换液。大约3-4天后，空白对照细胞出现大量死亡，空载病毒(NC组)和携带目的基因的病毒液(EML-ALK组)侵染的细胞也有部分死亡。继续用含有puromycin的培养基培养细胞，每1-2天换液并拍照观察荧光表达，持续培养约7-14天后，等到空白对照细胞已无存活，侵染过的细胞正常生长、几乎全部带上绿色荧光。
将上述NC组和v4669组的细胞收集起来分别提取RNA和蛋白进行相关验证。荧光定量PCR法和蛋白鉴定Westernblot方法同上。由扩增曲线可以看出EML4-ALK(v4669)组有明显的起峰，而NC组没有(如图4所示)；由WB实验结果可知，EML4-ALK组中的EML4-ALK表达量远远高于NC组，分析灰度值可知两组中EML4-ALK表达量比值为53.945(如图5所示)，表明稳定表达EML4-ALK基因的肺癌细胞株构建成功。
本发明虽然已以较佳实施例公开如上，但其并不是用来限定本发明，任何本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围内，都可以利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出可能的变动和修改，因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化及修饰，均属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (7)

1.一株稳定表达EML4-ALK基因的肺癌细胞株，其特征在于，所述肺癌细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNO:C2015193。
2.如权利要求1所述的稳定表达EML4-ALK基因的肺癌细胞株的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：
步骤a，过表达载体的构建：利用化学合成方法合成EML4-ALK序列片段，然后将目的基因EML4-ALK克隆到LV5载体中并测序鉴定；
步骤b，病毒包装：将步骤a中构建好的重组质粒LV5-EML4-ALK-GFP/Puro转入293T细胞，收集病毒液并进行滴度测定；
步骤c，细胞培养：A549细胞使用含10％FBS的DMEM培养基进行培养；
步骤d，病毒侵染：胰酶消化处于生长对数期的A549细胞，离心后用无抗生素的培养基重悬细胞，取A549细胞接种于培养皿中，待细胞贴壁后，向培养皿中加入步骤b中的病毒上清液，加入聚凝胺进行培养；
步骤e，加药筛选：弃去病毒液，换上含有10％FBS的正常培养基进行培养，接着用添加嘌呤霉素的完全培养基换液，每1-2天换液并拍照观察荧光表达。持续培养7-14天后，侵染过的A549细胞正常生长，带上绿色荧光，得到稳定表达EML4-ALK基因的肺癌细胞株。
3.根据权利要求2所述的稳定表达EML4-ALK基因的肺癌细胞株的构建方法，其特征在于，步骤a中，将目的基因EML4-ALK基因分成两个片段进行合成，其中两个片段分别为SEQNO:1和SEQNO:2。
4.根据权利要求3所述的稳定表达EML4-ALK基因的肺癌细胞株的构建方法，其特征在于，步骤a中，利用EcoRV将两个片段分别克隆到pUC57中，单酶切克隆反应后挑选出EML4-ALK基因的两个片段的阳性克隆进行测序验证。
5.根据权利要求2所述的稳定表达EML4-ALK基因的肺癌细胞株的构建方法，其特征在于，步骤b中，病毒包装质粒和重组质粒LV5-EML4-ALK-GFP/Puro转入293T细胞，24小时后取出培养皿，弃去培养基，1×PBS清洗细胞3次，并轻柔地加入8ml新鲜的293T培养基，继续培养；细胞转染48小时后，收集培养基上清进行浓缩，更换新鲜培养基培养24小时后再次收集浓缩液，每次收集的病毒上清液用0.45μm的膜过滤。
6.根据权利要求2所述的稳定表达EML4-ALK基因的肺癌细胞株的构建方法，其特征在于，步骤d中，取5×105个A549细胞接种于培养皿中，待细胞贴壁后，向培养皿中加入1.5ml配置好的病毒上清液，加入聚凝胺，终浓度为5μg/ml，培养24小时。
7.根据权利要求2所述的稳定表达EML4-ALK基因的肺癌细胞株的构建方法，其特征在于，步骤e中，将融合度达到80％-90％的A549细胞消化，按照每孔5*104细胞的密度将其接种在24孔板中培养24小时后，加入提前配制好的病毒上清液，并加入终浓度为5μg/mL的聚凝胺，病毒液孵育24小时后将病毒液弃去，换上含有10％FBS的正常培养基，24小时后将每个孔中的细胞传至10cm的培养皿中，正常培养24小时后用添加嘌呤霉素的完全培养基换液；3-4天后，侵染病毒的细胞有部分死亡；继续用含有嘌呤霉素的培养基培养细胞，每1-2天换液并拍照观察荧光表达，持续培养7-14天后，侵染病毒的细胞正常生长、带上绿色荧光。
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