CN105687284A - 玛咖活性成分的提取分析及应用方法 - Google Patents

玛咖活性成分的提取分析及应用方法 Download PDF

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Abstract

玛咖活性成分的提取及分析方法，属于生物工程技术领域，包括以下步骤，步骤一、玛咖总提取物的制备，步骤二、五种极性提取物的制备，步骤三、玛咖提取物对二苯代苦味肼基自由基清除能力的分析，步骤四、玛咖提取物对***细胞增殖和促进睾丸禁止细胞分泌睾酮作用的分析，步骤五、玛咖提取物中单胺氧化酶免疫活性的分析，步骤六、玛咖提取物中乙酰胆碱酯酶作用的分析，步骤七、玛咖提取物中抗Glu-SY5Y损伤作用的分析。本发明将玛咖提取物的各活性部分进行分析，获得每种活性成分对不同疾病的最佳治疗效果，对玛咖活性成分的应用起到了促进的作用，同时为玛咖在定向功能开发和化学分离方面提供了有效参考。

Description

玛咖活性成分的提取分析及应用方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，特别是涉及到一种对玛咖提取物各活性成分的分析方法及应用。
背景技术
玛咖已有数千年的食用历史，在人类不断进步和发展中，玛咖不仅可以作为食物为人体提供营养成分，与此同时玛咖还具有强壮身体、提高生育力、促进***、改善性功能、抗疲劳、延缓衰老、抗抑郁等功效。
玛咖(LepidiummeyenniiWalp.)，又名“秘鲁人参”(PeruvianGinseng)，是十字花科(Brassicaceae)独行菜属(Lepidium)，为一年生草本植物。原产于秘鲁3500米以上的高原山区，玛咖生长需要一定的海拔高度，目前我国云南、吉林均有种植。玛咖还具有强壮身体、提高生育力、促进***、改善性功能、抗疲劳、抗贫血、抗白血病、抗抑郁、抗癌、治疗更年期综合症等功效。
目前，国内外研究学者对玛咖进行了大量研究，发现其含有生物碱类、羟基吡啶衍生物类、芥子油苷和异硫氰酸酯类、甾醇及其衍生物类和其他物质类等成分。
进入21世纪以来，伴随着经济的快速发展,医疗卫生事业得到显著的提高,全世界面临一个共同的问题:人口老龄化现象不断加重。按照***的传统标准，一个地区60岁以上老人达到总人口的10％或65岁老人占总人口的7％，即该地区视为进入老龄化社会。2010年11月底中国第六次人口普查，60岁及以上老年人口占人口总数的13.26％，其中65岁及以上人口占人口总数的8.87％。以上比例按国际标准衡量，均已进入了老年型社会。老年人容易患上各种精神类疾病,其中阿尔茨海默症(Alzheimer'sDisease)，抑郁症(Depression)和帕金森病(Parkinson'sDisease)的患病比例逐年上升，严重威胁着老年人的身体健康。
乙酰胆碱酯酶(Aceylcholinesterase，AChE)是一种丝氨酸水解酶，是脊椎和无脊椎动物正常的神经传导活动所必不可少的酶类，在人体中主要存在于神经肌肉组织的突触后膜上。它的主要功能是把胆碱能突触间隙内的乙酰胆碱(acetylcholine，Ach)水解为乙酸和胆碱，从而终止神经冲动的传递。
阿尔茨海默病(Alzheimer’sDisease，AD)是最常见的发生于老年和老年前期的大脑变性疾病，由德国病理学家阿尔茨海默于1907年发现。其症状主要表现为患者记忆力障碍、定向力障碍、计算力障碍、思维力判断障碍、情感障碍、行为异常、认知障碍等，严重影响着老年人的健康。
研究表明，AChE在认识障碍的形成中起重要作用，AD病理与患者神经间隙中AChE活性过高具有重要关系。AChE抑制剂能与AChE结合，使酶失去活性，内源性的ACh大量堆积，脑内神经突触间ACh含量增加，从而发挥治疗AD的作用。因此，AChE抑制剂的研究比较活跃，并且取得了重大的进展，已经从药用植物活性成分、微生物的代谢产物和化学合成的化合物库筛选出众多具有较强抑制活性的化合物。
在衰老过程中，各种单胺类神经递质对记忆形成和维持起着很重要的作用。机体内单胺氧化酶(MAO)的主要功能就是催化内源性和外源性单胺类物质的代谢，具有重要生理功能。人体中的MAO的活性异常会使细胞内单胺类神经递质转运出现紊乱，产生诸多衰老疾病。随着MAO活性的不断升高，不仅会导致脑生理功能的退化，而且还会引起整个机体逐步衰老。因此MAO被认为是老化的标志，故又称之为老化相关酶。因此现有技术当中亟需要一种新型的技术方案来解决这一问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种玛咖活性成分的提取分析及应用方法，将玛咖提取物的各活性部分进行分析，获得每种活性成分对不同疾病的最佳治疗效果，对玛咖活性成分的应用起到了促进的作用，同时为玛咖在定向功能开发和化学分离方面提供了有效参考。
玛咖活性成分的提取，其特征是：包括以下步骤，
步骤一、玛咖总提取物的制备
称取干燥玛咖成熟根500g，粉碎成粒径为40目的粗粉，按照固液比为1:10的比例加入浓度为70％～95％的乙醇溶液，进行回流提取三次，每次提取时间为1小时，每次提取后均进行过滤，合并三次回流的提取液；
采用旋转蒸发仪，回收提取液，至乙醇含量为5％以下，获得稠膏状的提取物后，将溶剂蒸干，获得玛咖总提取物的干膏，备用；
步骤二、五种极性提取物的制备
将所述步骤一中获得的稠膏状提取物，加水混悬，加入石油醚进行萃取后回收溶剂，得到石油醚层干膏；加入氯仿进行萃取后回收溶剂，得到氯仿层干膏；加入乙酸乙酯进行萃取后回收溶剂，得到乙酸乙酯层干膏；加入正丁醇萃取后，得到丁醇层干膏；同时获得水层干膏；
玛咖活性成分的分析方法，其特征是：
玛咖提取物对二苯代苦味肼基自由基清除能力的分析
步骤一、二苯代苦味肼基自由基DPPH溶液的配制
称取3.3mg的DPPH试剂，采用甲醇溶解定容至25ml的容量瓶中，获得储备液；取20ml储备液，转移至100ml的容量瓶中，采用甲醇进行稀释至100ml刻度线，获得DPPH溶液的最终浓度为26.4μg/ml，备用；
称取维生素E0.0092g，置于25ml容量瓶中，向容量瓶中加入甲醇至25ml刻度线，混合均匀后提取2ml，置于25ml容量瓶中，向容量瓶中加入甲醇至25ml刻度线，混合均匀后溶液浓度为29.44μg/mL，取此溶液1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL、3.5mL、4.0mL、4.5ml，分别加入八个10ml的棕色容量瓶中，向每个容量瓶中加入甲醇至10ml刻度线，得到八种浓度的维生素E供试品溶液；
步骤二、玛咖提取物溶液的制备
称取所述步骤二获得的玛咖石油醚层干膏，分别加入甲醇溶液配置成浓度为0.075mg/mL、0.1mg/mL、0.125mg/mL、0.2mg/mL、0.25mg/mL、0.375mg/mL、0.5mg/mL、0.75mg/mL、0.875mg/mL、1mg/mL的供试品溶液；
称取所述步骤二获得的氯仿层干膏，分别加入甲醇溶液配置成浓度为0.025mg/mL、0.0375mg/mL、0.05mg/mL、0.0625mg/mL、0.1mg/mL、0.1875mg/mL、0.3125mg/mL、0.375mg/mL、0.4375mg/mL、0.5mg/mL的供试品溶液；
称取所述步骤二获得的乙酸乙酯层干膏，分别加入甲醇溶液配置成浓度为0.025mg/mL、0.0375mg/mL、0.0625mg/mL、0.1mg/mL、0.1875mg/mL、0.25mg/mL、0.3125mg/mL、0.375mg/mL、0.4375mg/mL、0.5mg/mL供试品溶液；
称取所述步骤二获得的正丁醇层干膏，分别加入甲醇溶液配置成浓度为0.05mg/mL、0.075mg/mL、0.125mg/mL、0.15mg/mL、0.2mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL、0.625mg/mL、0.875mg/mL、1mg/mL供试品溶液；
称取所述步骤二获得的水层干膏，分别加入甲醇溶液配置成浓度为0.05mg/mL、0.075mg/mL、0.1mg/mL、0.15mg/mL、0.25mg/mL、0.375mg/mL、0.5mg/mL、0.625mg/mL、0.75mg/mL、0.875mg/mL供试品溶液；
称取玛咖总提物干膏，分别加入甲醇溶液配置成浓度为0.025mg/mL、0.0375mg/mL、0.075mg/mL、0.1mg/mL、0.125mg/mL、0.1875mg/mL、0.3125mg/mL、0.375mg/mL、0.4375mg/mL、0.5mg/mL供试品溶液；
步骤三、玛咖各提取物抗氧化活性的测定
依次向试管中加入2.0mL浓度为26.40μg/ml的DPPH溶液和2.0mL甲醇，混匀，避光反应30min，在517nm处下用1cm比色皿测定吸光度A，记为A0；另取一个试管加入2.0mL浓度为26.40μg/mL的DPPH溶液和2.0mL供试验品溶液，混匀，避光放置30min后，用比色皿在517nm处测定吸光度，记为A1；再取一个试管加入2.0mL的甲醇和2.0mL供试液，混匀，避光放置30min后，用比色皿测量517nm处测定吸光度，记为A2；通过清除率(％)＝[1-(A1-A2)/A0]×100％，获得DPPH自由基清除率。
依据吸光度制作DPPH标准曲线和维生素E溶液DPPH清除率标准曲线；重复上述操作步骤，绘制玛咖各极性萃取部位对DPPH清除率标准曲线；
玛咖提取物对***细胞增殖和促进睾丸禁止细胞分泌睾酮作用的分析
步骤一、玛咖各提取物供试品的制备
分别称取0.001g所述步骤二中获得的石油醚层干膏、氯仿层干膏、乙酸乙酯层干膏、丁醇层干膏、水层干膏以及总提取物干膏，分别放置于1mL容量瓶中，加入含10％胎牛血清的培养基至1mL刻度线，配置成终浓度为1mg/mL的供试品溶液，分别用0.22μm的滤膜滤过，滤液待用；
步骤二、***细胞悬浮液的制备
取大鼠睾丸，用预冷的4℃、浓度为0.01mol/L、pH为7.2的磷酸缓冲盐溶液PBS缓冲液进行冲洗，除去白膜，置0.05％I型胶原酶吹打至使组织分散，在37℃的条件下，震荡水浴消化30min；加入等体积含10％胎牛血清的D-MEM/F12培养液终止消化，用吸管吹打至***细胞散开；用4层纱布过滤，收集滤液，在1000r/min的条件下离心10min，沉淀的细胞加入培养基吹打，冲洗细胞中残留的消化液，以1000r/min的速度进行离心10min，去除上清液，用含10％胎牛血清的D-MEM/F12培养基10mL吹打成均匀的悬浮细胞，接种于培养瓶中；在37℃、5％CO2培养箱内培养36h，待***细胞贴壁，倾出培养液，用PBS缓冲液冲洗至瓶壁上没有漂浮细胞，再加入培养液培养2d；定时观察细胞的生长状态，当细胞生长到在镜下观察覆盖80％～90％、细胞伸展后，用0.25％胰蛋白酶消化液进行消化，时间为4min～5.5min，至细胞缩小成圆形，且部分浮动，终止消化，去除消化液；向其中加入5mL培养基，用吸管吹下贴壁的***细胞；用含有10％胎牛血清的D-MEM/F12培养液调整细胞密度至105个/mL，取100μL/孔的细胞悬浮液接种于96孔板，放入37℃、5％CO2的培养箱内培养2d，给药进行实验；
步骤三、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐MTT法考察玛咖提取物对***细胞的增殖作用
制备MTT溶液，将***细胞悬浮液在96孔板培养板中加入100μL/孔，培养2d，去除培养液；样品组每组分别加入供试品溶液50μL/孔、100μL/孔、200μL/孔，每个样本设3个复孔；空白对照组加入100μLD-MEM/F12培养液，且设3个复孔；在37℃、含5％CO2条件下培养24h，每孔加入5mg/mL的MTT溶液10μL，孵育4h；取出培养板，将96孔培养板倾斜30°角，吸去上清液；然后每孔加入100μL的二甲基亚砜溶解MTT甲瓒，振荡10min，酶标仪490nm处测定光密度值；绘制玛咖各提取物的***细胞活性筛选图；
玛咖提取物中单胺氧化酶免疫活性的分析
步骤一、玛咖极性部位供试品的制备
分别称取0.001g所述步骤二中获得的石油醚层干膏、氯仿层干膏、乙酸乙酯层干膏、丁醇层干膏、水层干膏以及总提取物干膏，放置于1mL的容量瓶中，加入含10％胎牛血清的培养基定容至1mL刻度，配置成浓度为1mg/mL的供试品溶液，用0.22μm的滤膜滤过，滤液待用；
步骤二、小鼠脾淋巴细胞混悬液的制备
取小鼠的脾放在已灭菌的培养皿中，加入5mL的FBS/1640完全培养基，用剪子将脾剪碎，经3层～4层纱布滤过，收集滤液，在1000r/min的条件下，离心10min，去除上层清液；加入10mL完全培养基吹打成均匀的悬浮细胞；用细胞计数板计数细胞的数目，再加入含胎牛血清的培养液调整细胞浓度为106个/mL；
称取MTT0.25克，溶于50ml的磷酸缓冲液，用0.22μm滤膜过滤除菌，取实验用量，放4℃避光保存备用；其余在无菌条件下，分装1.5ml到2mlEP管，置-20度长期保存；
在96孔培养板中加入100μL/孔的脾淋巴细胞悬浮液，培养2d；样品组每组分别加入供试品溶液50μL/孔、100μL/孔、200μL/孔，每个样本设3个复孔；空白对照组加入100μLFBS/1640培养液，设3个复孔；阳性组加入含复合蛋白的FBS/1640培养液100μL，设3个复孔；在37℃、含5％CO2的条件下培养24h，每孔加入5mg/mL的MTT溶液10μL，继续孵育4h；取出培养板，将96孔培养板倾斜30度，吸去上清液；每孔加入100μL的DMSO溶解MTT甲瓒，振荡10min，酶标仪490nm处测定光密度值；观察对小鼠脾淋巴细胞的体外增殖作用；
玛咖提取物中乙酰胆碱酯酶作用的分析
步骤一、溶液的制备：分别配制0.1M，pH＝8.0的磷酸盐PBS缓冲溶液100ml；溶液浓度为1mg/mL的样品溶液；酶活力为0.28U/mL的乙酰胆碱酯酶AChE；溶液浓度为0.075mol/L的5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)DTNB；溶液浓度为0.01mol/L的碘化硫代乙酰胆碱ATCI；
步骤二、在96孔酶标板中依次加入140μLPBS，20μL样品溶液，15μLAChE；
步骤三、将所述二中的96孔酶标板，在4℃的条件下，孵育20min，加入10μLDTNB及10μLATCI；在37℃的条件下，孵育20min，用酶标仪在405nm下测定其吸光度值，并计算抑制率；
玛咖提取物中抗人神经母细胞瘤细胞的谷氨酸Glu-SY5Y损伤作用的分析
步骤一、细胞培养与分组：
将人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y细胞用RPMI-1640培养基放入含有5％CO2，且温度为37℃的培养箱中进行培养；2d换一次液，3d～4d传代一次，待细胞处于对数生长期进行实验以和检测；将SH-SY5Y细胞分为对照组、模型组和样品组，细胞接种24h后，样品组给药预处理1h，向模型组和样品组分别给予浓度为20mol/LGlu继续孵育细胞24h，进行MTT试验；
步骤二、MTT法测定细胞存活率：
SH-SY5Y细胞以每孔1×105·mL-1接种于96孔板中，每组细胞3复孔，在培养结束前4h，分别向每孔加入20μLMTT，培养结束后吸去培养液，每孔加入150μL二甲基亚砜DMSO，震荡10min后，至结晶完全溶解，在490nm波长下测定吸光度值；计算其余各组细胞存活率。
所述ConA终质量浓度为5μg/mL。
所述抑制率通过抑制率(％)＝[(空白组-完全抑制组)-(样品-样品本底)]/(空白组-完全抑制组)×100％计算；
其中，空白组用20μLpH＝8.0的PBS代替20μL样品溶液；完全抑制组用20μL的0.125mg/mL石杉碱甲代替20μL样品溶液；样品本底组15μLpH＝8.0的PBS代替15μLAChE。
所述RPMI-1640培养基为10％胎牛血清、0.5％庆大霉素和1％两性B霉素。
玛咖活性成分的应用，其特征是：包括制备玛咖粉片剂、玛咖粉胶囊以及玛咖肠溶微囊，
制备玛咖粉片剂
取干燥玛咖，进行粉碎，过100目筛，得到玛咖粉；取份数比为50％～65％的玛咖粉、20％～30％的木糖醇、9％～19％的淀粉、10％～20％的麦芽糊精投入混合机中混合20分钟，过100目筛后加入85％乙醇，获得软材，将软材投入颗粒机中进行制粒，于60℃鼓风干燥1h，水分保持在5％～10％；过20目筛进行整粒；将经过整粒的颗粒与1％硬脂酸镁进行混合，混合均匀后制成玛咖片，包装；
制备玛咖粉胶囊
取干燥玛咖，进行粉碎，过100目筛，得到玛咖粉；取份数比为50％～65％的玛咖粉、9％～19％的预胶化淀粉、20％～30％的甘露醇、1％～5％的硬脂酸镁，投入混合机内混合15～35分钟，加入85％乙醇作为润湿剂，再混合10分钟，混合后的物料过20目筛制粒，于60℃鼓风干燥，加入1％二氧化硅，整粒，装胶囊填充，制备包装；
制备玛咖肠溶微囊
步骤一、取干燥玛咖粉，加入到浓度为2％-5％的丙烯酸树脂II乙醇溶液中，获得鹿茸总寡肽冻干粉的丙烯酸树脂II乙醇溶液；
步骤二、向步骤一中获得的溶液里添加占该溶液体积10％～20％的蓖麻油，并在磁力搅拌器中搅拌；
步骤三、将步骤二中搅拌后的溶液进行喷雾和干燥操作，获得玛咖肠溶微囊。
通过上述设计方案，本发明可以带来如下有益效果：玛咖活性成分的提取分析及应用方法，将玛咖提取物的各活性部分进行分析，获得每种活性成分对不同疾病的最佳治疗效果，对玛咖活性成分的应用起到了促进的作用，同时为玛咖在定向功能开发和化学分离方面提供了有效参考。玛咖各极性萃取部位均具有一定的DPPH清除能力玛咖6个极性部位的抗氧化能力的顺序依次为：氯仿层＞乙酸乙酯层＞总提物＞水层＞正丁醇层＞石油醚层；玛咖各极性部位均对大鼠***细胞有一定的其增殖能力的强弱顺序为氯仿层>总提物>石油醚>正丁醇>水>乙酸乙酯；在细胞水平研究上发现玛咖醇提物及其5个萃取部位中除醇提物和乙酸乙酯部位外均具有促进脾细胞增殖的作用，其中氯仿部位活性最强，正丁醇活性次之。
附图说明
以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的说明：
图1为本发明玛咖提取物的活性成分分析方法流程示意图。
图2为本发明玛咖提取物的活性成分分析方法不同提取物吸光值的曲线示意图。
图3为本发明玛咖提取物的活性成分分析方法对抗Glu-SY5Y损伤作用的柱形示意图。
具体实施方式
玛咖活性成分的提取分析及应用方法，如图1所示，
具体实施方式一、
玛咖提取物的制备包括以下步骤：
步骤一、精密称取玛咖干燥成熟根500g，粉成粗粉(40目)；
步骤二、得到的粗粉用10倍量70％乙醇回流提取三次，每次1小时，过滤，合并提取液；
步骤三、旋转蒸发仪回收溶剂至无醇味，得提取物稠膏，蒸干溶剂，的玛咖提总提物干膏，备用。
具体实施方式二、
玛咖提取物的制备包括以下步骤：
步骤一、精密称取玛咖干燥成熟根500g，粉成粗粉(40目)；
步骤二、得到的粗粉用10倍量85％乙醇回流提取三次，每次1小时，过滤，合并提取液；
步骤三、旋转蒸发仪回收溶剂至无醇味，得提取物稠膏，蒸干溶剂，的玛咖总提物干膏，备用。
具体实施方式三
玛咖提取物的制备包括以下步骤：
步骤一、精密称取玛咖干燥成熟根500g，粉成粗粉(40目)；
步骤二、得到的粗粉用10倍量95％乙醇回流提取三次，每次1小时，过滤，合并提取液；
步骤三、旋转蒸发仪回收溶剂至无醇味，得提取物稠膏，蒸干溶剂，的玛咖总提物干膏，备用。
具体实施方式四
玛咖不同极性提取物的制备：
用旋转蒸发仪减压回收溶剂至无醇味后，用水混悬，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，回收溶剂，得石油醚层干膏、氯仿层干膏、乙酸乙酯层干膏、正丁醇层干膏、水层干膏。
具体实施方式五
采用体外清除二苯代苦味肼基自由基法，对上述实施方式所得的玛咖不同提取物干膏进行二苯代苦味肼基自由基清除能力的分析，包括以下步骤：
步骤一、二苯代苦味肼基自由基(DPPH)(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl；)溶液的配制：
精密称取3.3×10-3g2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH)试剂，用甲醇溶解定容至25ml容量瓶中，摇匀，作为储备液。从储备液中吸取20ml，转移至100ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，得到DPPH溶液最终浓度为26.4μg/ml，备用。
维生素E供试液的配制：
精密称定维生素E0.0092g，置25mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。准确吸取2mL，置于25mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，使其浓度为29.44μg/mL，再分别精密吸取1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL、3.5mL、4.0mL、4.5ml，置10mL棕色容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得到不同浓度的维生素E供试品溶液。
标准溶液最大吸收波长的确定：
将紫外分光光度计的波长设定在200nm-800nm，测定3.1项中已配制好的DPPH溶液的进行全波长扫描，DPPH溶液在327nm和517nm处的吸光度都有极大值，当加入一定玛咖供试液，发现两个在327nm和517nm处吸光值都有降低，但517nm处的吸收值变化较明显，所以选用517nm作为检测波长。
步骤二、玛咖提取物溶液的制备：
精密称取玛咖石油醚层干膏，分别加入甲醇溶液配置成浓度为0.075mg·mL-1、0.1mg·mL-1、0.125mg·mL-1、0.2mg·mL-1、0.25mg·mL-1、0.375mg·mL-1、0.5mg·mL-1、0.75mg·mL-1、0.875mg·mL-1、1mg·mL-1的供试品溶液。
精密称取准确氯仿干膏，分别加入甲醇溶液配置成浓度为0.025mg·mL-1、0.0375mg·mL-1、0.05mg·mL-1、0.0625mg·mL-1、0.1mg·mL-1、0.1875mg·mL-1、0.3125mg·mL-1、0.375mg·mL-1、0.4375mg·mL-1、0.5mg·mL-1的供试品溶液
精密称取准确乙酸乙酯干膏，分别加入甲醇溶液配置成浓度为0.025mg·mL-1、0.0375mg·mL-1、0.0625mg·mL-1、0.1mg·mL-1、0.1875mg·mL-1、0.25mg·mL-1、0.3125mg·mL-1、0.375mg·mL-1、0.4375mg·mL-1、0.5mg·mL-1供试品溶液。
精密称取准确正丁醇干膏，分别加入甲醇溶液配置成浓度为0.05mg·mL-1、0.075mg·mL-1、0.125mg·mL-1、0.15mg·mL-1、0.2mg·mL-1、0.25mg·mL-1、0.5mg·mL-1、0.625mg·mL-1、0.875mg·mL-1、1mg·mL-1供试品溶液。
精密称取准确水层干膏，分别加入甲醇溶液配置成浓度为0.05mg·mL-1、0.075mg·mL-1、0.1mg·mL-1、0.15mg·mL-1、0.25mg·mL-1、0.375mg·mL-1、0.5mg·mL-1、0.625mg·mL-1、0.75mg·mL-1、0.875mg·mL-1供试品溶液。
精密称取准确总提物干膏，分别加入甲醇溶液配置成浓度为0.025mg·mL-1、0.0375mg·mL-1、0.075mg·mL-1、0.1mg·mL-1、0.125mg·mL-1、0.1875mg·mL-1、0.3125mg·mL-1、0.375mg·mL-1、0.4375mg·mL-1、0.5mg·mL-1供试品溶液。
步骤三、玛咖不同提取物抗氧化活性的测定：
依次向试管中加入2.0mL的DPPH溶液(26.40μg/ml)和2.0mL甲醇，混匀，避光反应30min，在517nm处下用1cm比色皿测定吸光度A，记为A0；另取1个试管加入2.0mL的DPPH溶液(26.40μg/mL)和2.0mL供试验品溶液，混匀，避光放置30min后，用比色皿在517nm处测定吸光度，记为A1；最后，再取一个试管加入2.0mL的甲醇和2.0mL供试液，混匀，避光放置30min后，用比色皿测量517nm处测定吸光度，记为A2。DPPH自由基清除率公式为：清除率(％)＝[1-(A1-A2)/A。]×100％。实验加样见表Tab.1-1
表Tab.1-1[DPPH·]试验加样表
Table1-1thesampleadditionof[DPPH·]test
DPPH溶液标准曲线的的制作：配制3.5μg/mL、7.0μg/mL、14.0μg/mL、28.0μg/mL、45.0μg/mL等5个浓度的DPPH溶液，测定其517nm的吸光度，依据吸光度制作DPPH标准曲线。其线性回归方程为y＝0.0219x+0.0034；R2＝0.9989；说明浓度在3.5～45μg/mL范围时，DPPH溶液呈良好的线性关系。
维生素E溶液DPPH清除率标准曲线:由上述方法得到维生素E的清除率曲线，在维生素E质量浓度测定范围内，对自由基具有显著的清除活性，且清除率与其浓度的关系呈正比，当达到一定浓度值后，清除率基本保持平稳。在浓度2.944μg/mL～8.832μg/mL范围内，维生素E浓度(x)与DPPH清除率(Y)之间基本呈线性关系，得其回归得方程，y＝8.3311x-3.1598，R2＝0.9936。
取玛咖提取物已配制好的样品溶液，按实验步骤，测定其吸光值，绘制标准曲线。如图2所示，由图可知：玛咖各极性萃取部位均具有一定的DPPH清除能力。
在一定浓度的范围内，清除能力随着样品浓度的增加而增强，当浓度达到一定值时，清除率不再增加，而是趋于平缓。玛咖氯仿层样品溶液清除DPPH能力最强，当浓度在25μg/ml-500μg/ml范围内呈线性关系,回归方程为：y＝4.0031x+0.2955，R2＝0.9944；正丁醇层浓度在50μg/ml-1000μg/ml范围呈成线性系,y＝1.1948x+0.1204，R2＝0.9784；乙酸乙酯浓度在25μg/ml-500μg/ml范围内呈线性关系,y＝2.9873x+0.3216，R2＝0.9934；石油醚层浓度在75μg/ml-1000μg/ml范围内呈线性关系，y＝0.8402x+0.1057，R2＝0.9836,水提物层浓度在50μg/ml-875μg/ml范围内呈线性关系，y＝2.3478x+0.0389，R2＝0.9991,总提物浓度在25μg/ml-500μg/ml范围内呈线性关系，y＝5.2439x-0.0487，R2＝0.9952。玛咖6个极性部位的抗氧化能力的顺序依次为：氯仿层＞乙酸乙酯层＞总提物＞水层＞正丁醇层＞石油醚层。
由清除率的计算公式计算出各供试品的IC50值，结果见表Tab.1-2。
表Tab.1-2。不同抗氧化剂的IC50
Table1-2IC50ofdifferentantioxidants
本发明通过以[DPPH·]自由基清活性对玛咖总提物和5个极性部位的抗氧化研究，依据半数清除率为评价指标筛选了玛咖的抗氧化活性部位，通过IC50值比较不同极性的抗氧化能力为氯仿层＞乙酸乙酯层＞总提物＞水层＞正丁醇层＞石油醚层。玛咖的氯仿层抗氧化活性最突出，可以确定为玛咖抗氧化活性的活性部位。确定了玛咖各极性部位清除50％自由基的样品浓度，为玛咖在抗氧化剂的应用开发商提供了有力依据，同时为玛咖在定向功能开发和化学分离提供了有效参考。
具体实施方式六
釆用MTT比色法和生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)对上述实施方式得到的玛咖提取物干膏进行***细胞增殖和促进***细胞分泌睾酮作用的分析，包括以下步骤：
步骤一、玛咖不同提取物供试品的制备：
分取玛咖各极性部位干膏，分别精密称定0.001g，放置于1mL容量瓶中，加入含10％胎牛血清的培养基至刻度，配置成终浓度为1mg/mL的供试品溶液，用0.22μm的滤膜滤过，滤液待用。
步骤二、***细悬浮液的制备：
取大鼠睾丸，用预冷的(4℃)PBS(0.01mol/L，pH7.2)缓冲液进行冲洗，除去白膜，置0.05％I型胶原酶(约用10mL)中轻轻吹打数次，使组织分散，37℃震荡水浴消化30min。加入等体积含10％胎牛血清的D-MEM/F12培养液终止消化，然后用吸管吹打，使***细胞充分散开。用4层纱布过滤，收集滤液，在1000r/min条件下离心10min，沉淀的细胞加入培养基吹打，冲洗细胞中残留的消化液，低速(1000r/min)离心10min，弃上清。用含10％胎牛血清的D-MEM/F12培养基10mL吹打成均匀的悬浮细胞，接种于培养瓶中。在37℃5％CO2培养箱条件下内培养36h，待***细胞贴壁，倾出培养液，用PBS缓冲液冲洗至瓶壁上没有漂浮细胞，再加入培养液培养2d。定时观察细胞的生长状态，当细胞生长到镜下观察覆盖80-90％、细胞伸展成不规则形态时，用0.25％胰蛋白酶消化液进行消化，时间约为5min，至细胞缩成小圆形，呈现部分轻轻浮动现象时，终止消化，弃去消化液。然后向其中加入5mL培养基，用吸管吹下贴壁的Leydig细胞。用含有10％胎牛血清的D-MEM/F12培养液调整细胞密度至105个/mL，取100μL/孔的细胞悬浮液接种于96孔板，放入37℃、5％CO2的培养箱内培养2d，给药进行实验。
步骤三、MTT法考察玛咖提取物对Leydig细胞的增殖作用：
MTT的配制：称取MTT0.25克，溶于50ml的磷酸缓冲液(PBS)，用0.22μm滤膜过滤除菌，取实验用量，放4℃避光保存备用。其余在无菌条件下，分装1.5ml到2mlEP管，置-20度长期保存。
将***细胞悬浮液在96孔板培养板中加入100μL/孔，培养2d，弃去培养液。样品组每组分别加入供试品溶液50μL、100μL、200μL/孔，每个样本设3个复孔。空白对照组加入100μLD-MEM/F12培养液，设3个复孔。在37℃、含5％CO2条件下培养24h，然后每孔加入5mg/mL的MTT溶液10μL，继续孵育4h。取出培养板，将96孔培养板倾斜30度角，小心吸去上清液。然后每孔加入100μL的DMSO溶解MTT甲瓒，振荡10min，酶标仪490nm处测定OD值。
细胞增殖率(％)＝(实验孔OD值-空白孔OD值)/空白孔OD值×100％
玛咖提取物对小鼠***细胞增殖率的实验结果见下表Tab.1-4。
表Tab.1-4玛咖各极性部位对小鼠***细胞增殖的影响
应用MTT法，在细胞水平研究上发现玛咖醇提物具有促进***细胞增殖的作用，绘制表格，由表中数据可知，在给药24h后除乙酸乙酯部位外，玛咖各极性部位均对大鼠***细胞有一定的其增殖能力的强弱顺序为氯仿层>总提物>石油醚>正丁醇>水>乙酸乙酯。
具体实施方式七
采用MTT比色法对上述实施方式得到的玛咖不同提取物干膏进行免疫活性的分析，包括以下步骤：
步骤一、玛咖极性部位供试品的制备：
分别精密称定玛咖石油醚层、氯仿层、乙酸乙酯层、正丁醇层、水层、总提物各0.001g，放置于1mL的容量瓶中，加入含10％胎牛血清的培养基定容至刻度，配置成浓度为1mg/mL的供试品溶液，用0.22μm的滤膜滤过，滤液待用。
步骤二、小鼠脾淋巴细胞混悬液的制备：
取小鼠的脾，将脾取出放在已灭菌的培养皿中，加入5mL的FBS/1640完全培养基，用剪子将脾剪碎，经3-4层纱布滤过，收集滤液，1000r/min，离心10min,弃上层清液。加入10mL完全培养基吹打成均匀的悬浮细胞。用细胞计数板计数细胞的数目，再加入含FBS/1640的培养液调整细胞浓度为106个/mL。
步骤三、MTT的配制：
称取MTT0.25克，溶于50ml的磷酸缓冲液(PBS)，用0.22μm滤膜过滤除菌，取实验用量，放4℃避光保存备用。其余在无菌条件下，分装1.5ml到2mlEP管，置-20度长期保存。
在96孔培养板中加入100μL/孔的脾淋巴细胞悬浮液，培养2d。样品组每组分别加入供试品溶液50μL、100μL、200μL/孔，每个样本设3个复孔。空白对照组加入100μLFBS/1640培养液，设3个复孔。阳性组加入含ConA的FBS/1640培养液(含ConA终质量浓度为5μg/mL)100μL，设3个复孔。37℃、含5％CO2条件下培养24h，然后每孔加入5mg/mL的MTT溶液10μL，继续孵育4h。取出培养板，将96孔培养板倾斜30度，小心吸去上清液。然后每孔加入100μL的DMSO溶解MTT甲瓒，振荡10min，酶标仪490nm处测定OD值。
细胞增殖率(％)＝(实验孔OD值-空白孔OD值)/空白孔OD值×100％玛咖不同极性部位对小鼠脾细胞体外增殖活性的影响具体数据见表Tab.1-3
表Tab.1-3玛咖各极性部位对小鼠脾淋巴细胞体外增殖的影响
应用MTT法，在细胞水平研究上发现玛咖醇提物及其5个萃取部位中除醇提物和乙酸乙酯部位外均具有促进脾细胞增殖的作用，其中氯仿部位活性最强，正丁醇活性次之。
本发明以小鼠的脾淋巴细胞增殖率作为评价指标，研究了玛咖各极性部位对人体免疫细胞的作用，以ConA作为阳性对照，通过观察对小鼠脾淋巴细胞的体外增殖作用，发现玛咖不同极性部位中出醇提物和乙酸乙酯部位外，均具有不同程度的促进小鼠脾淋巴细胞体外增殖的作用，其中氯仿和正丁醇部位活性最强。推测玛咖氯仿层和正丁醇层是其免疫增强的活性部位。
具体实施方式八
采用改进的Ellman方法对上述实施方式得到的玛咖提取物干膏进行乙酰胆碱酯酶抑制活性的分析，包括以下步骤：
步骤一、溶液的制备：分别配制0.1MpH＝8.0的磷酸盐缓冲溶液(下称PBS)100ml；溶液浓度为1mg/mL的样品溶液；酶活力为0.28U/mL的乙酰胆碱酯酶(下称AChE)(pH＝8.0PBS溶解稀释)；溶液浓度为0.075mol/L的5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(下称DTNB)；溶液浓度为0.01mol/L的碘化硫代乙酰胆碱(下称ATCI)。
步骤二、在96孔酶标板中依次加入140μLPBS，20μL样品溶液(1mg/mL)，15μLAChE。
步骤三、将步骤二中的96孔酶标板，4℃孵育20min后，加10μLDTNB及10μLATCI。37℃孵育20min后，用酶标仪在405nm下测定其吸光度值。
步骤四、根据下式计算抑制率：
抑制率(％)＝[(空白组-完全抑制组)-(样品-样品本底)]/(空白组-完全抑制组)×100％
其中，空白组用20μLPBS(pH＝8.0)代替20μL样品溶液；完全抑制组用20μL石杉碱甲(0.125mg/mL)代替20μL样品溶液。样品本底组用15μLPBS(pH＝8.0)代替15μLAChE(0.28U/mL，pH＝8.0PBS溶解稀释)。
玛咖不同极性部位对乙酰胆碱酶抑制活性的影响具体数据见下表。
具体实施方式九
运用MTT法对上述实施方式得到的玛咖不同提取物干膏进行抗Glu-SY5Y损伤作用的分析，包括以下步骤：
步骤一、细胞培养与分组：
将SH-SY5Y细胞用RPMI-1640培养基(10％胎牛血清，0.5％庆大霉素，1％两性B霉素)放入含有5％CO2，37℃培养箱中进行培养。2d换一次液，3-4d传代一次，待细胞处于对数生长期进行实验以及相关检测。SH-SY5Y细胞分为对照组、模型组、样品组。细胞接种24后，样品组给药预处理1h后，然后除对照组外，均给予浓度为20mmol·L-1Glu继续孵育细胞24h，进行MTT试验。
步骤二、MTT法测定细胞存活率：
SH-SY5Y细胞以每孔1×105·mL-1接种于96孔板中，每组细胞3复孔，与培养结束前4h每孔加入20μLMTT，培养结束后吸去培养液，每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO)，震荡10min后，使结晶完全溶解，在490nm波长下测定吸光度(A)值。对照组细胞存活率设为100％，根据公式：细胞增殖率＝(各组组A值/对照组A值)×100％计算其余各组细胞存活率，对比结果如图3及下表所示。
通过上述对玛咖活性成分提取分析，对玛咖粉进行了应用，制作玛咖粉片剂和玛咖粉胶囊；
制备玛咖粉片剂
取干燥玛咖，进行粉碎，过100目筛，得到玛咖粉；取份数比为50％～65％的玛咖粉、20％～30％的木糖醇、9％～19％的淀粉、10％～20％的麦芽糊精投入混合机中混合20分钟，过100目筛后加入85％乙醇，获得软材，将软材投入颗粒机中进行制粒，于60℃鼓风干燥1h，水分保持在5％～10％；过20目筛进行整粒；将经过整粒的颗粒与1％硬脂酸镁进行混合，混合均匀后制成玛咖片，包装；
制备玛咖粉胶囊
取干燥玛咖，进行粉碎，过100目筛，得到玛咖粉；取份数比为50％～65％的玛咖粉、9％～19％的预胶化淀粉、20％～30％的甘露醇、1％～5％的硬脂酸镁，投入混合机内混合15～35分钟，加入85％乙醇作为润湿剂，再混合10分钟，混合后的物料过20目筛制粒，于60℃鼓风干燥，加入1％二氧化硅，整粒，装胶囊填充，制备包装。
制备玛咖肠溶微囊
步骤一、取干燥玛咖粉，加入到浓度为2％-5％的丙烯酸树脂II乙醇溶液中，获得鹿茸总寡肽冻干粉的丙烯酸树脂II乙醇溶液；
步骤二、向步骤一中获得的溶液里添加占该溶液体积10％～20％的蓖麻油，并在磁力搅拌器中搅拌均匀；
步骤三、将步骤二中搅拌均匀的溶液进行喷雾和干燥操作，最后获得玛咖肠溶微囊。
本发明的活性成分研究可应用于不同机型中，不仅仅限于片剂、胶囊剂和微囊。

Claims (6)

1.玛咖活性成分的提取，其特征是：包括以下步骤，
步骤一、玛咖总提取物的制备
称取干燥玛咖成熟根500g，粉碎成粒径为40目的粗粉，按照固液比为1:10的比例加入浓度为70％～95％的乙醇溶液，进行回流提取三次，每次提取时间为1小时，每次提取后均进行过滤，合并三次回流的提取液；
采用旋转蒸发仪，回收提取液，至乙醇含量为5％以下，获得稠膏状的提取物后，将溶剂蒸干，获得玛咖总提取物的干膏，备用；
步骤二、五种极性提取物的制备
将所述步骤一中获得的稠膏状提取物，加水混悬，加入石油醚进行萃取后回收溶剂，得到石油醚层干膏；加入氯仿进行萃取后回收溶剂，得到氯仿层干膏；加入乙酸乙酯进行萃取后回收溶剂，得到乙酸乙酯层干膏；加入正丁醇萃取后，得到丁醇层干膏；同时获得水层干膏。
2.玛咖活性成分的分析方法，其特征是：
玛咖提取物对二苯代苦味肼基自由基清除能力的分析
步骤一、二苯代苦味肼基自由基DPPH溶液的配制
称取3.3mg的DPPH试剂，采用甲醇溶解定容至25ml的容量瓶中，获得储备液；取20ml储备液，转移至100ml的容量瓶中，采用甲醇进行稀释至100ml刻度线，获得DPPH溶液的最终浓度为26.4μg/ml，备用；
称取维生素E0.0092g，置于25ml容量瓶中，向容量瓶中加入甲醇至25ml刻度线，混合均匀后提取2ml，置于25ml容量瓶中，向容量瓶中加入甲醇至25ml刻度线，混合均匀后溶液浓度为29.44μg/mL，取此溶液1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL、3.5mL、4.0mL、4.5ml，分别加入八个10ml的棕色容量瓶中，向每个容量瓶中加入甲醇至10ml刻度线，得到八种浓度的维生素E供试品溶液；
步骤二、玛咖提取物溶液的制备
称取所述步骤二获得的玛咖石油醚层干膏，分别加入甲醇溶液配置成浓度为0.075mg/mL、0.1mg/mL、0.125mg/mL、0.2mg/mL、0.25mg/mL、0.375mg/mL、0.5mg/mL、0.75mg/mL、0.875mg/mL、1mg/mL的供试品溶液；
称取所述步骤二获得的氯仿层干膏，分别加入甲醇溶液配置成浓度为0.025mg/mL、0.0375mg/mL、0.05mg/mL、0.0625mg/mL、0.1mg/mL、0.1875mg/mL、0.3125mg/mL、0.375mg/mL、0.4375mg/mL、0.5mg/mL的供试品溶液；
称取所述步骤二获得的乙酸乙酯层干膏，分别加入甲醇溶液配置成浓度为0.025mg/mL、0.0375mg/mL、0.0625mg/mL、0.1mg/mL、0.1875mg/mL、0.25mg/mL、0.3125mg/mL、0.375mg/mL、0.4375mg/mL、0.5mg/mL供试品溶液；
称取所述步骤二获得的正丁醇层干膏，分别加入甲醇溶液配置成浓度为0.05mg/mL、0.075mg/mL、0.125mg/mL、0.15mg/mL、0.2mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL、0.625mg/mL、0.875mg/mL、1mg/mL供试品溶液；
称取所述步骤二获得的水层干膏，分别加入甲醇溶液配置成浓度为0.05mg/mL、0.075mg/mL、0.1mg/mL、0.15mg/mL、0.25mg/mL、0.375mg/mL、0.5mg/mL、0.625mg/mL、0.75mg/mL、0.875mg/mL供试品溶液；
称取玛咖总提物干膏，分别加入甲醇溶液配置成浓度为0.025mg/mL、0.0375mg/mL、0.075mg/mL、0.1mg/mL、0.125mg/mL、0.1875mg/mL、0.3125mg/mL、0.375mg/mL、0.4375mg/mL、0.5mg/mL供试品溶液；
步骤三、玛咖各提取物抗氧化活性的测定
依次向试管中加入2.0mL浓度为26.40μg/ml的DPPH溶液和2.0mL甲醇，混匀，避光反应30min，在517nm处下用1cm比色皿测定吸光度A，记为A0；另取一个试管加入2.0mL浓度为26.40μg/mL的DPPH溶液和2.0mL供试验品溶液，混匀，避光放置30min后，用比色皿在517nm处测定吸光度，记为A1；再取一个试管加入2.0mL的甲醇和2.0mL供试液，混匀，避光放置30min后，用比色皿测量517nm处测定吸光度，记为A2；通过清除率(％)＝[1-(A1-A2)/A0]×100％，获得DPPH自由基清除率。
依据吸光度制作DPPH标准曲线和维生素E溶液DPPH清除率标准曲线；重复上述操作步骤，绘制玛咖各极性萃取部位对DPPH清除率标准曲线；
玛咖提取物对***细胞增殖和促进睾丸禁止细胞分泌睾酮作用的分析
步骤一、玛咖各提取物供试品的制备
分别称取0.001g所述步骤二中获得的石油醚层干膏、氯仿层干膏、乙酸乙酯层干膏、丁醇层干膏、水层干膏以及总提取物干膏，分别放置于1mL容量瓶中，加入含10％胎牛血清的培养基至1mL刻度线，配置成终浓度为1mg/mL的供试品溶液，分别用0.22μm的滤膜滤过，滤液待用；
步骤二、***细胞悬浮液的制备
取大鼠睾丸，用预冷的4℃、浓度为0.01mol/L、pH为7.2的磷酸缓冲盐溶液PBS缓冲液进行冲洗，除去白膜，置0.05％I型胶原酶吹打至使组织分散，在37℃的条件下，震荡水浴消化30min；加入等体积含10％胎牛血清的D-MEM/F12培养液终止消化，用吸管吹打至***细胞散开；用4层纱布过滤，收集滤液，在1000r/min的条件下离心10min，沉淀的细胞加入培养基吹打，冲洗细胞中残留的消化液，以1000r/min的速度进行离心10min，去除上清液，用含10％胎牛血清的D-MEM/F12培养基10mL吹打成均匀的悬浮细胞，接种于培养瓶中；在37℃、5％CO2培养箱内培养36h，待***细胞贴壁，倾出培养液，用PBS缓冲液冲洗至瓶壁上没有漂浮细胞，再加入培养液培养2d；定时观察细胞的生长状态，当细胞生长到在镜下观察覆盖80％～90％、细胞伸展后，用0.25％胰蛋白酶消化液进行消化，时间为4min～5.5min，至细胞缩小成圆形，且部分浮动，终止消化，去除消化液；向其中加入5mL培养基，用吸管吹下贴壁的***细胞；用含有10％胎牛血清的D-MEM/F12培养液调整细胞密度至105个/mL，取100μL/孔的细胞悬浮液接种于96孔板，放入37℃、5％CO2的培养箱内培养2d，给药进行实验；
步骤三、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐MTT法考察玛咖提取物对***细胞的增殖作用
制备MTT溶液，将***细胞悬浮液在96孔板培养板中加入100μL/孔，培养2d，去除培养液；样品组每组分别加入供试品溶液50μL/孔、100μL/孔、200μL/孔，每个样本设3个复孔；空白对照组加入100μLD-MEM/F12培养液，且设3个复孔；在37℃、含5％CO2条件下培养24h，每孔加入5mg/mL的MTT溶液10μL，孵育4h；取出培养板，将96孔培养板倾斜30°角，吸去上清液；然后每孔加入100μL的二甲基亚砜溶解MTT甲瓒，振荡10min，酶标仪490nm处测定光密度值；绘制玛咖各提取物的***细胞活性筛选图；
玛咖提取物中单胺氧化酶免疫活性的分析
步骤一、玛咖极性部位供试品的制备
分别称取0.001g所述步骤二中获得的石油醚层干膏、氯仿层干膏、乙酸乙酯层干膏、丁醇层干膏、水层干膏以及总提取物干膏，放置于1mL的容量瓶中，加入含10％胎牛血清的培养基定容至1mL刻度，配置成浓度为1mg/mL的供试品溶液，用0.22μm的滤膜滤过，滤液待用；
步骤二、小鼠脾淋巴细胞混悬液的制备
取小鼠的脾放在已灭菌的培养皿中，加入5mL的FBS/1640完全培养基，用剪子将脾剪碎，经3层～4层纱布滤过，收集滤液，在1000r/min的条件下，离心10min，去除上层清液；加入10mL完全培养基吹打成均匀的悬浮细胞；用细胞计数板计数细胞的数目，再加入含胎牛血清的培养液调整细胞浓度为106个/mL；
称取MTT0.25克，溶于50ml的磷酸缓冲液，用0.22μm滤膜过滤除菌，取实验用量，放4℃避光保存备用；其余在无菌条件下，分装1.5ml到2mlEP管，置-20度长期保存；
在96孔培养板中加入100μL/孔的脾淋巴细胞悬浮液，培养2d；样品组每组分别加入供试品溶液50μL/孔、100μL/孔、200μL/孔，每个样本设3个复孔；空白对照组加入100μLFBS/1640培养液，设3个复孔；阳性组加入含复合蛋白的FBS/1640培养液100μL，设3个复孔；在37℃、含5％CO2的条件下培养24h，每孔加入5mg/mL的MTT溶液10μL，继续孵育4h；取出培养板，将96孔培养板倾斜30度，吸去上清液；每孔加入100μL的DMSO溶解MTT甲瓒，振荡10min，酶标仪490nm处测定光密度值；观察对小鼠脾淋巴细胞的体外增殖作用；
玛咖提取物中乙酰胆碱酯酶作用的分析
步骤一、溶液的制备：分别配制0.1M，pH＝8.0的磷酸盐PBS缓冲溶液100ml；溶液浓度为1mg/mL的样品溶液；酶活力为0.28U/mL的乙酰胆碱酯酶AChE；溶液浓度为0.075mol/L的5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)DTNB；溶液浓度为0.01mol/L的碘化硫代乙酰胆碱ATCI；
步骤二、在96孔酶标板中依次加入140μLPBS，20μL样品溶液，15μLAChE；
步骤三、将所述二中的96孔酶标板，在4℃的条件下，孵育20min，加入10μLDTNB及10μLATCI；在37℃的条件下，孵育20min，用酶标仪在405nm下测定其吸光度值，并计算抑制率；
玛咖提取物中抗人神经母细胞瘤细胞的谷氨酸Glu-SY5Y损伤作用的分析
步骤一、细胞培养与分组：
将人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y细胞用RPMI-1640培养基放入含有5％CO2，且温度为37℃的培养箱中进行培养；2d换一次液，3d～4d传代一次，待细胞处于对数生长期进行实验以和检测；将SH-SY5Y细胞分为对照组、模型组和样品组，细胞接种24h后，样品组给药预处理1h，向模型组和样品组分别给予浓度为20mol/LGlu继续孵育细胞24h，进行MTT试验；
步骤二、MTT法测定细胞存活率：
SH-SY5Y细胞以每孔1×105·mL-1接种于96孔板中，每组细胞3复孔，在培养结束前4h，分别向每孔加入20μLMTT，培养结束后吸去培养液，每孔加入150μL二甲基亚砜DMSO，震荡10min后，至结晶完全溶解，在490nm波长下测定吸光度值；计算其余各组细胞存活率。
3.根据权利要求2所述的玛咖活性成分的分析方法，其特征是：所述ConA终质量浓度为5μg/mL。
4.根据权利要求2所述的玛咖活性成分的分析方法，其特征是：所述抑制率通过抑制率(％)＝[(空白组-完全抑制组)-(样品-样品本底)]/(空白组-完全抑制组)×100％计算；
其中，空白组用20μLpH＝8.0的PBS代替20μL样品溶液；完全抑制组用20μL的0.125mg/mL石杉碱甲代替20μL样品溶液；样品本底组15μLpH＝8.0的PBS代替15μLAChE。
5.根据权利要求2所述的玛咖活性成分的分析方法，其特征是：所述RPMI-1640培养基为10％胎牛血清、0.5％庆大霉素和1％两性B霉素。
6.玛咖活性成分的应用，其特征是：包括制备玛咖粉片剂、玛咖粉胶囊以及玛咖肠溶微囊，
制备玛咖粉片剂
取干燥玛咖，进行粉碎，过100目筛，得到玛咖粉；取份数比为50％～65％的玛咖粉、20％～30％的木糖醇、9％～19％的淀粉、10％～20％的麦芽糊精投入混合机中混合20分钟，过100目筛后加入85％乙醇，获得软材，将软材投入颗粒机中进行制粒，于60℃鼓风干燥1h，水分保持在5％～10％；过20目筛进行整粒；将经过整粒的颗粒与1％硬脂酸镁进行混合，混合均匀后制成玛咖片，包装；
制备玛咖粉胶囊
取干燥玛咖，进行粉碎，过100目筛，得到玛咖粉；取份数比为50％～65％的玛咖粉、9％～19％的预胶化淀粉、20％～30％的甘露醇、1％～5％的硬脂酸镁，投入混合机内混合15～35分钟，加入85％乙醇作为润湿剂，再混合10分钟，混合后的物料过20目筛制粒，于60℃鼓风干燥，加入1％二氧化硅，整粒，装胶囊填充，制备包装；
制备玛咖肠溶微囊
步骤一、取干燥玛咖粉，加入到浓度为2％-5％的丙烯酸树脂II乙醇溶液中，获得鹿茸总寡肽冻干粉的丙烯酸树脂II乙醇溶液；
步骤二、向步骤一中获得的溶液里添加占该溶液体积10％～20％的蓖麻油，并在磁力搅拌器中搅拌；
步骤三、将步骤二中搅拌后的溶液进行喷雾和干燥操作，获得玛咖肠溶微囊。
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