CN105683803A - 片照明显微镜的***和方法 - Google Patents

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Abstract

根据一个方面，本发明涉及一种用于通过对样品的片照明而进行的对设置于样品支撑上的厚样品的显微镜方法。具体而言，所述方法包括：发射至少一个照明束(1)；从照明束形成照明表面；为了形成位于基本上与显微镜透镜的光轴成直角的平面中的横向照明表面，借助于显微镜透镜(120)聚焦样品中的照明表面并且偏转源自显微镜透镜的照射表面。所述方法还包括：在检测设备(130)的检测表面(131)上借助于所述显微镜透镜(120)形成通过横向照明表面照明的样品的区域的图像；扫描照明束，从而允许横向照明表面沿显微镜透镜的光轴移动；并通过包括与用于显微镜透镜和样品的相对轴向移动的装置分开的装置的聚焦装置重叠物体成像表面与横向照明表面。

Description

片照明显微镜的***和方法
技术领域
本发明涉及片照明显微镜***和方法。
背景技术
光学显微镜使得能够在活细胞的天生环境中跟踪活细胞。例如，已知的技术包括荧光显微镜，其允许直接观察薄生物样品；或显微镜技术，使得能够产生较厚样品的图像，诸如激光扫描共焦显微镜或多光子显微镜(非线性)。
近年来，已描述了用于厚样品的荧光显微镜装置，该荧光显微镜设备基于样品的片照明，并且被称为基于光片(lightsheet)照明的显微镜或SPIM(“单平面照明显微镜”)。SPIM显微镜在于选择性照射与显微镜透镜轴正交的样品平面，使得能够由此产生用于深度成像的样品的光学断面。例如，在采用Bessel束照明的美国专利申请2011/0304723中、在R.Jorand等的将SPIM技术与检测路径上的自适应光学回路组合以增强图像质量的文章(“DeepandClearOpticalImagingofThickInhomogeneousSamples”PlosOneVolume7Issue4(2012))中、在F.Zanacchi等的将SPIM技术应用于超分辨率显微镜的文章(“Live-cell3Dsuperresolutionimaginginthickbiologicalsamples”NatureMethods/Vol.8No.12(2011))中、以及在Gebhart等的提出具有平行轴的两个显微镜透镜和偏转镜的设置的文章(“Single-moleculeimagingoftranscriptionfactorbindingtoDNAinlivemammaliancells”NatureMethodsDOI:10.1038/NMETH2411(2013))中，描述了这种设备。
但是，迄今为止，SPIM技术总是需要使用以接近样品的距离放置的两个显微镜透镜。除了检测路径上的通常的显微镜透镜(其使得能够确保被光片照射的样品的边缘与检测面之间的光学共轭)以外，在样品照明路径上需要第二显微镜透镜，以确保样品中的光片的聚焦，由此分别形成两个独立的照明和检测路径。但是，该约束显著增加了实现的机械复杂性，不允许使用标准显微镜并且对使用的透镜的数值孔径施加限制。
本发明提出片照明显微镜***和方法，其尤其包括光片聚焦的原始控制，从而允许使用共用于照明和检测路径的单个显微镜透镜。
发明内容
根据第一方面，本发明涉及通过对样品进行片照明而用于厚样品的显微镜***，该显微镜***包括样品保持器、检测路径和样品照明路径。
检测路径包括：给定光轴的显微镜透镜；检测设备，其包括与显微镜透镜的物体空间中的物体成像表面光学共轭的检测表面；和用于显微镜透镜和样品保持器的相对轴向位移的装置。
样品照明路径包括：照明束的至少一个发光源；用于从照明束形成照明表面的装置；所述显微镜透镜；偏转装置，使得能够偏转显微镜透镜的输出处的物体空间中的照明表面，以形成横向照明表面，其位于基本上与显微镜透镜的光轴成直角的平面中；和照明束扫描装置，其允许横向照明表面沿显微镜透镜的光轴位移。
根据第一方面的显微镜***还包括聚焦装置，其使得能够将物体成像表面与横向照明表面重叠，该聚焦装置包括与显微镜透镜和样品保持器的相对位移装置分开的装置。
如将在下文详细描述的那样，物体成像“表面”和横向照明“表面”不是文字上严格的几何意义上的表面，而是一般用于呈现尽可能薄的厚度(沿显微镜透镜的光轴的尺寸)的目的的平行六面体体积。
因此，“物体成像表面”与“横向照明表面”的“重叠”在于使两个平行六面体体积的中面进入同一面中并且侧向地使它们相对彼此居中。
由此制成的显微镜***的结构使得能够在具有单个显微镜透镜的SPIM类型的***中，控制横向照明表面或在显微镜透镜的物体空间中的“光片”的位置，使得它保持重叠于透镜的物体成像表面上，而不管沿显微镜透镜的光轴在显微镜透镜与样品保持器之间的相对位置如何。
根据变化例，聚焦装置包括位于检测路径中的波前空间调制设备。根据变化例，波前空间调制设备可进一步允许校正样品与检测表面之间的光学缺陷的至少一部分。
聚焦装置还可以包括用于改变照明束的聚焦的装置，从而使得能够将横向照明表面侧向地在物体成像表面上居中。在寻求样品中的光片的明显位移的情况下，这种装置是特别有利的。
例如，用于改变照明束的聚焦的装置可以包括具有固定焦度的光学***，该光学***与具有可变焦距的光学***耦合的。
根据一个例子，偏转装置可以被固定于样品保持器上。当显微镜透镜与样品保持器的相对轴向位移装置包括用于样品保持器的轴向位移装置时，这是特别有利的。因此，样品保持器的位移导致偏转装置的位移。
根据第二方面，本发明涉及适于显微镜的片照明设备，该显微镜包括具有物体成像表面的显微镜透镜、用于样品保持器与显微镜透镜的相对轴向位移的装置和具有与物体成像表面光学共轭的检测表面的检测器。
根据第二方面的照明设备包括照明束的至少一个发光源和用于从照明束形成照明表面的装置。它还包括样品保持器和固定于样品保持器上的偏转装置，该偏转装置旨在偏转显微镜透镜的输出处的照明表面，以形成横向照明表面，其位于基本上与显微镜透镜的光轴成直角的平面中。根据第二方面的照明设备还包括照明束扫描装置，其允许横向照明表面沿显微镜透镜的光轴位移；和用于改变照明束的聚焦的装置，从而使得能够将横向照明表面(124)侧向地在物体成像表面上居中。
这种设备使得能够很容易地将常规的宽场荧光显微镜转换成片照明显微镜***。具有偏转装置的样品保持器可以是可在使用之后被处置的部分，该部分替代通常的显微镜样品保持器。
有利地，可以通过分束器或二向色滤波器完成在显微镜中并入片照明设备，所述分束器或二向色滤波器可已形成显微镜的一部分或者与照明设备一起供给。
根据第三方面，本发明涉及使用片照明、用于设置在样品保持器上的厚样品的显微镜方法，该显微镜方法包括：
－发射至少一个照明束；
－从照明束形成照明表面；
－通过给定光轴的显微镜透镜聚焦样品中的照明表面，并且偏转源自显微镜透镜的照射表面，从而允许形成位于基本上与显微镜透镜的光轴成直角的平面中的横向照明表面；
－在检测设备的检测表面上，通过所述显微镜透镜，形成通过横向照明表面照明的样品的区域的图像；
－扫描照明束，从而允许横向照明表面沿显微镜透镜的光轴位移；
－通过包括与显微镜透镜和样品的相对轴向位移装置分开的装置的聚焦装置，将物体成像表面与横向照明表面重叠，所述物体成像表面在显微镜透镜的物体空间中与检测表面共轭。
根据变化例，将物体成像表面与横向照明表面重叠可以包括改变照明束的聚焦的步骤，从而允许横向照明表面在物体成像表面上侧向居中。
根据变化例，将物体成像表面与横向照明表面重叠可以包括由照明表面照明的样品的区域发射的波前的空间调制步骤，从而使得能够将物体成像和照明表面带入到同一平面中。
根据变化例，从照明束形成照明表面包括产生光笔和扫描光笔。
附图说明
阅读通过以下附图示出的描述，本发明的其它优点和特征将显露：
-图1A是示出根据本发明的示例性实施方式的片照明显微镜***的示图；
-图1B是更详细地示出图1A的类型的显微镜***中的聚焦的示图；
-图2是示出沿显微镜透镜的物体空间中的轴线Z的光片的位移的示图；
-图3A～3C是在三个步骤中示出样品中的照明束的聚焦的示图。
为了一致，相同的要素在不同的附图中由相同的附图标记表示。
具体实施方式
图1A和图1B示出根据本说明书的示例性实施方式的片照明显微镜***100。图1B更详细地表示在图1A中以点线概括的***的部分。
在图1A和图1B的例子中，显微镜***100包括照明路径和检测路径，照明路径和检测路径通过例如二向色滤波器或分束器的板110分开，并且，在共用的部分中包括显微镜透镜120。
显微镜***还包括样品保持装置12，该样品保持装置12包括板10和用于样品保持器与显微镜透镜(图中未示出)的相对位移装置，从而使得能够覆盖要被成像的关注区域。保持器位移装置包括例如电动机驱动平台(未示出)，例如，压电平台，从而使得能够在与显微镜透镜的光轴(Δ)成直角的平面XY中并且沿与显微镜透镜的光轴(Δ)平行的轴线Z使显微镜透镜或要接收样品12的板10位移。显微镜***在平面XZ的图中被表示，在这里，XZ表示显微镜透镜的物体空间的参照系，也就是说，与样品12的板10的表面成直角的平面，其包括显微镜透镜的光轴。
检测路径意图在检测装置130的检测表面131上形成样品的关注区域的图像，例如，该检测装置130包括矩阵检测器，例如，EMCCD类型的放大照相机(EMCCD代表“ElectronMultiplyingChargeCoupledDisplay”)。检测路径包括显微镜透镜120，该显微镜透镜120意图例如在无限聚焦光学配置下工作，也就是说，在最佳工作配置中，由样品在显微镜透镜的物体场的中心的点F(称为“物体成像表面”)处发射的射束2是在显微镜透镜的输出处的无穷远点准直化的射束。检测路径还包括允许在检测表面上形成图像的光学元件，例如，光学器件132和偏转装置134。
照明路径包括样品照明束1的一个或多个发光源101，有利地包括空间相干光源，例如，单模式纤维中的拉丝源，例如，激光源。在本发明的一个实施方式中，可以设置多个发光源，以例如形成具有不同的波长的照明束，从而使得能够在荧光应用中激励不同的荧光，或者例如分别允许在PALM应用中的光子激活、光子转换和荧光蛋白质激励。透镜103使得能够从光源形成准直化束。
样品照明路径还包括用于从照明束形成照明表面的装置。这些装置可以非常简单地包括具有小的数值孔径的透镜(例如，透镜103)，从而使得能够形成给定衍射长度的光笔以形成表面，所述给定衍射长度的光笔与扫描装置(例如，通过旋转旋转镜111获得)相关联。可替代地，可以使用特定光学器件以形成光笔，例如轴锥镜型的非衍射光学元件或者适于形成Bessel束型的射束的元件。一般地，如后面详细描述的那样，照明表面将具有直接与衍射长度关联的厚度。用于形成照明表面的装置还可以包括与小的孔径透镜或非衍射光学元件组合的圆柱透镜，从而使得能够免去扫描装置。
照明路径还包括显微镜透镜120(在图1B中由会聚光学器件表示)，其出射光瞳由附图标记118表示。在图1A中，附图标记为P的平面表示显微镜透镜120的出射光瞳118的面的共轭面。一方面的透镜107、109和另一方面的113、115是中继光学器件，其确保照明束传送和光瞳平面P的共轭。
在显微镜透镜120的物体空间中，存在样品12和偏转装置125，由显微镜透镜和偏转装置形成的组件使得能够在横向照明表面124中将照明表面成像，所述横向照明表面124位于基本上与显微镜透镜的光轴成直角的平面126中。
横向照明表面的尺寸及其厚度由照明路径的参数定义。例如，如果采用图1B的参照系，那么在显微镜透镜的物体空间中，对于照明路径的给定光学***，两者择一地通过方向Y上照明束的扫描的振幅，或者通过由圆柱透镜引入的像散的振幅，定义照明表面的尺寸Y。照明表面的尺寸X和照明表面(沿轴线Z)的厚度直接与透镜输入上的激励束的尺寸以及与显微镜透镜的焦距相关。表达方式“照明表面的厚度”应被理解为意指衍射图的主瓣的轴线Z上的尺寸，但在Bessel型照明束的情况下，也意指集中于该衍射图的主瓣中的光能量与分散于二次瓣中的能量的比。因此，如果寻求薄的横向照明表面，其一般与物体成像表面的厚度同一量级，所述物体成像表面由显微镜透镜的场深定义，那么，与接受明显更大厚度的照明表面相比，将获得在X轴上更短的横向照明表面。一般地，对于数值孔径NA＝1.3的100倍显微镜透镜，场深小于1μm。横向照明表面的尺寸将一般在X轴上能够处于10μm与50μm之间，且在Y轴上为约100μm。在所有情况下，可以定义横向照明表面124的中心点123，其与X上的最佳聚焦点和Y轴上的几何中心点对应。在图1B的例子中，中心点123与显微镜透镜120的物体焦点F一致。
偏转装置包括，例如，相对于显微镜透镜的光轴倾斜45°的微镜子。偏转装置必须具有与高数值孔径的显微镜透镜相容的主体。在Y轴(参见图1B)上，反射表面的尺寸有利地基本上与使用的显微镜透镜的场尺寸相等。在倾斜45°的轴上，可用的反射表面的尺寸可以有利地介于显微镜透镜的场的四分之一与一半之间。因此，可用的反射表面针对高倍率透镜(60倍或100倍)可以为50×200＝10000μm2的大小量级，比针对小倍率透镜(10倍或20倍)的大5倍，反射表面周围的主体必须具有与反射表面相同的大小量级。因此，为了能够反射源自显微镜透镜的照明束，偏转装置的可用表面必须位于显微镜透镜的可用场中。
适当的偏转装置可以由原子力显微镜点(例如，参见Gebhart等的文章)的保持器(或“悬臂”)形成，其与显微镜透镜的光轴呈45°。它们也可以包括例如在公开的专利US7974003中描述的类型的结构板。根据变化例，如后面在说明书中解释的那样，偏转装置被设计为固定于样品保持器上。
照明路径还包括用于照明束1的扫描装置111，从而允许横向照明表面124沿显微镜透镜的光轴位移。
图2示出根据本说明书的显微镜***中的横向照明表面的轴向位移。
如图2所示，可以有利地通过入射照明束1的角扫描，获得横向照明表面124沿显微镜透镜的光轴Δ(与轴线Z平行)的位移，从而导致射束的横向位移(在图2的轴X上)。在显微镜透镜的物体空间中，该横向位移由入射束在偏转装置125上反射之后的照明表面的轴向位移反映。有利地，角扫描的旋转轴位于显微镜的光瞳的光学共轭面中。在显微镜透镜的空间中，关联位移ΔZ与射束的角变量Δθ的关系如下：ΔZ＝f×Δθ，这里，f是显微镜透镜的焦距，该表达式在角度的切线可以近似于角度自身的小角度的情况下是有效的。由于显微镜透镜的角场在常规情况下小于10°，因此这种近似对显微镜应用是有效的。因此，在图2中，射束1的旋转形成射束1′，这导致横向照明表面的位移ΔZ。可以通过照明路径的扫描装置111获得该旋转，该扫描装置111包括例如旋转光学器件，从而使得能够产生射束在X轴上的平移，以产生照明表面的轴向位移，并且，可选地，在Y轴上通过照明束的扫描产生照明表面。该旋转光学器件可以为，例如，检流计***的组合或MEMS镜(具有一个轴)的组合或具有两个轴的一个MEMS镜。在使用两个不同的镜子以产生这两个旋转的情况下，这两个镜子的旋转轴的光学共轭是有利的。
因此，借助于扫描装置，能够通过横向照明表面124沿显微镜的光轴位移来探测样品。通过如图2所示的那样位移横向照明表面124，被照明的样品的区域不再位于显微镜透镜的物体工作平面中，例如为物体焦平面，并且不再与检测表面共轭。根据本说明书的显微镜***包括聚焦装置，该聚焦装置包括与显微镜透镜和样品的相对轴向位移装置分开的装置，这使得能够重叠横向照明表面与物体成像表面(显微镜透镜的物体平面中的检测表面的共轭表面)。
如果位移小，一般小于显微镜透镜的场深的10倍，那么能够仅简单通过位移检测表面而校正检测路径上所产生的散焦。聚焦装置被缩减为用于检测表面的轴向位移装置。聚焦装置还可以包括配置于检测路径上的波前空间调制设备。该空间调制设备可以包括位移以校正聚焦的单个光学透镜(例如，透镜132)，或者可以包括具有可变焦度的光学***、液晶阀、可变形镜等。检测路径上的聚焦装置提供不添加显微镜透镜和/或样品的约束和任何位移的优点。
但是，如果位移是显著的，那么横向照明表面离开为其而设计显微镜透镜的物体工作平面，例如，物体焦平面，并且，明显远离该配置可以不仅带来明显的光学像差而且带来数值孔径的变动。从而，聚焦装置有利地在照明路径中包括用于改变照明束的聚焦的装置105(参见图1A)，从而使得能够将横向照明表面124侧向地在物体成像表面上居中。
根据一个例子，图3A～3C示出根据本说明书的显微镜方法中的聚焦的调整，实现了用于改变照明束的聚焦的装置105。
图3A与前述的图1B对应，其中，射束1以横向照明表面124的形式聚焦于显微镜透镜的物体工作平面中，例如，聚焦于物体焦平面中。在该配置中，在检测路径中，通过样品发射的射束2(例如，荧光)在显微镜透镜的输出处的无穷远点准直化，并且，完美聚焦于检测器的检测表面上。因此，在显微镜透镜的物体空间中，横向照明表面和物体成像表面重叠，所述物体成像表面与显微镜透镜的物体空间中的检测表面共轭。
图3B示出为了位移样品中的横向照明表面而扫描射束1(在显微镜透镜的图像空间中)的情况。扫描后的附图标记为1′的射束，使得能够形成相对于横向照明表面的第一位置偏移位移Δz的横向照明表面124′，其相对于横向照明表面的第一位置偏移位移Δz。为了在显微镜的物体工作平面中重新定位横向检测表面124′，执行样品与显微镜透镜之间的在显微镜透镜的光轴上的相对位移。因此，在图3B中，以与图3A中的横向照明表面124相同的在显微镜透镜的轴线Z上的距离定位横向照明表面124′，也就是说，处于显微镜透镜的物体工作平面中，并且，在检测路径中，由样品发射的射束2′再一次在显微镜透镜的输出处的无穷远点准直化，然后完美聚焦于检测器的检测表面上。但是，如图3B所示，样品与显微镜透镜的相对轴向位移引起横向照明表面的横向位移。因此，与横向照明表面的中心对应的最佳焦点123，相对于显微镜透镜的光轴偏移，该偏移源自显微镜透镜与样品的相对轴向位移。换句话说，物体成像表面与横向照明表面确实在同一平面中，但是却偏离中心。然后，如图3C所示，用于改变照明束的聚焦的装置105使得能够在物体成像表面上侧向地使横向照明表面124重新居中。
用于改变聚焦的装置105包括，例如具有可变焦距的光学透镜(例如，或型的透镜)，或者其中一个或一组透镜可移动的透镜，或者可变形镜或者液晶阀。
有利地，用于改变聚焦的装置105位于与显微镜透镜的光瞳平面光学共轭的平面中，该光瞳平面一般位于显微镜透镜的图像焦平面上。以这种方式，照明束的聚焦平面的改变不改变显微镜透镜的光瞳的平面中的射束尺寸，并因此不改变照明表面的厚度。
在本发明的一个实施方式中，用于改变聚焦的装置105可以是与具有可变焦距的***耦合的具有固定焦度的***的组合。具有固定焦度的***可以用于补偿与使用偏转装置相关的平均聚焦距离(该距离约等于物体空间(样品的空间)中的透镜的视场的半径，即，对于100倍透镜，一般为40～60μm)。用于改变聚焦的装置被定尺寸为具有可调整的振幅，其足以覆盖用户所需的深度方向的成像范围。例如，如果在样品上所需的深度方向的偏移(excursion)场为50μm，那么将能够选择用于改变聚焦的装置，该装置允许围绕平均聚焦平面的在Z上的至少50μm的位移。
在本发明的一个实施方式中，检测路径可以包括用于校正在检测路径上引入的光学像差(通过成像光学***以及通过样品自身)的设备。用于校正光学像差的设备包括例如可变形镜。它可由用于分析光学缺陷的设备控制，该设备例如为Shack-Hartmann型。如上面描述的那样，用于校正光学像差的设备还可以被用于聚焦调整。在点彩(pointilliste)型的3D显微镜(PALM/STORM/SPT)的情况下，用于校正像差的设备也可以被用于实施PSF的制作，以在PSF的形状与发光粒子在z上的位置之间建立双射关系(如例如申请FR2971693中描述的那样)。
因此，所描述的显微镜***使得能够通过借助于单个显微镜透镜产生在样品的深度方向的大量连续平面中的图像而制作体积的图像。
借助于根据本说明书的片照明设备，还使得能够改装用于二维成像的已知显微镜***来制作三维显微镜***。已知的用于二维成像的显微镜(宽场显微镜)一般包括具有物体成像表面的显微镜透镜、用于样品保持器与显微镜透镜的相对轴向位移装置和具有与物体成像表面光学共轭的检测表面的检测器。
片照明设备有利地包括：用于照明束的至少一个发光源；用于从照明束形成照明表面的装置；样品保持器和固定于样品保持器上的偏转装置，该偏转装置旨在偏转显微镜透镜的输出处的照明表面，以形成横向照明表面，其位于基本上与显微镜透镜的光轴成直角的平面中；用于扫描照明束的装置，其允许横向照明表面在显微镜透镜的光轴上位移；用于改变照明束的聚焦的装置，其使得能够将横向照明表面侧向地在物体成像表面上居中。以上关于片照明显微镜***描述了所有这些装置。
根据变化例，通过替换通常使用的样品保持器，将样品保持器和固定于样品保持器上的偏转装置供应给要改装的显微镜的照明设备。
在本申请中描述的片照明设备和显微镜***可以被应用于所有已受益于光片横向照明技术的优点的显微镜技术，特别是可被应用于宽场荧光显微镜和点彩(pointilliste)型超分辨率显微镜(PALM/STORM/SPT)。在这两种类型的显微镜中，光片横向照明使得能够获得光学“剖切”效果(仅照明关注的片层)，并且，由于只有成像的片层被照明，因此使得能够获得检测信号的更好的信噪比；因此，不存在源自样品的多个层的杂散光，所述样品的多个层位于成像平面的任一侧，从而使得能够将更大的深度上的各单个分子成像。该显微镜***也适用于非线性显微镜或者结构照明显微镜SIM。
虽然通过一定数量的示例性实施方式进行了描述，但是根据本发明的显微镜方法和用于实现所述方法的设备包括不同的变化例、修改和提炼，假定这些不同的变化例、修改和提炼形成由以下的权利要求限定的本发明的范围的一部分，那么这些变化例、修改和提炼对本领域技术人员来说是显而易见的。

Claims (13)

1.一种通过对样品进行片照明的、用于厚样品(12)的显微镜***(100)，包括：
－样品保持器；
－检测路径，所述检测路径包括：
－给定光轴(Δ)的显微镜透镜(120)；
－检测设备(130)，所述检测设备(130)包括与所述显微镜透镜的物体空间中的物体成像表面光学共轭的检测表面(131)；
－用于所述显微镜透镜和所述样品保持器的相对轴向位移的装置；
－样品照明路径，所述样品照明路径包括：
－照明束(1)的至少一个发光源(101)；
－用于从所述照明束形成照明表面的装置；
－所述显微镜透镜(120)；
－偏转装置(125)，使得能够偏转显微镜透镜的输出处的物体空间中的所述照明表面，以形成横向照明表面(124)，所述横向照明表面(124)位于基本上与所述显微镜透镜的光轴成直角的平面中；
－允许所述横向照明表面(124)沿所述显微镜透镜的所述光轴位移的照明束扫描装置(111)；
所述显微镜***还包括使得能够重叠所述物体成像表面与所述横向照明表面的聚焦装置，所述聚焦装置包括与所述显微镜透镜和所述样品保持器的相对轴向位移装置分开的装置。
2.根据权利要求1所述的显微镜***，其中，所述聚焦装置包括用于改变所述照明束的聚焦的装置(105)，从而使得能够将所述横向照明表面(124)侧向地在所述物体成像表面上居中。
3.根据权利要求2所述的显微镜***，其中，所述用于改变所述照明束的聚焦的装置(105)包括与具有可变焦距的光学***耦合的具有固定焦度的光学***。
4.根据前面的权利要求中的任一项所述的显微镜***，其中，所述聚焦装置包括位于所述检测路径中的波前空间调制设备。
5.根据权利要求4所述的显微镜***，其中，所述波前空间调制设备进一步允许校正所述样品与所述检测表面之间的光学缺陷的至少一部分。
6.根据前面的权利要求中的任一项所述的显微镜***，其中，所述偏转装置被固定于所述样品保持器上。
7.根据前面的权利要求中的任一项所述的显微镜***，其中，所述用于形成照明表面的装置包括用于产生光笔的装置和用于扫描所述光笔的装置。
8.根据权利要求1～6中的任一项所述的显微镜***，其中，所述用于形成照明表面的装置包括圆柱透镜。
9.一种适用于显微镜的片照明设备，所述显微镜包括具有物体成像表面的显微镜透镜、用于样品保持器与显微镜透镜的相对轴向位移的装置、和具有与所述物体成像表面光学共轭的检测表面的检测器，所述照明设备包括：
－照明束(1)的至少一个发光源(101)；
－用于从所述照明束形成照明表面的装置；
－样品保持器和固定于所述样品保持器上的偏转装置(125)，所述偏转装置旨在偏转所述显微镜透镜的输出处的所述照明表面，以形成横向照明表面(124)，所述横向照明表面(124)位于基本上与所述显微镜透镜的光轴成直角的平面中；
－允许所述横向照明表面(124)沿所述显微镜透镜的所述光轴位移的照明束扫描装置(111)；
－用于改变所述照明束的聚焦的装置(105)，从而使得能够将所述横向照明表面(124)侧向地在所述物体成像表面上居中。
10.一种通过样品的片照明而用于设置于样品保持器上的厚样品(12)的显微镜方法，包括：
－发射至少一个照明束(1)；
－从所述照明束形成照明表面；
－通过给定光轴(Δ)的显微镜透镜(120)聚焦样品中的所述照明表面，并且偏转源自所述显微镜透镜的所述照射表面，从而允许形成横向照明表面(124)，所述横向照明表面(124)位于基本上与所述显微镜透镜的光轴成直角的平面中；
－通过所述显微镜透镜，在检测设备(130)的检测表面(131)上形成通过所述横向照明表面照明的样品的区域的图像；
－扫描所述照明束从而允许所述横向照明表面(124)沿所述显微镜透镜的所述光轴位移；
－通过聚焦装置将所述物体成像表面与所述横向照明表面重叠，其中所述聚焦装置包括与所述显微镜透镜和所述样品的相对轴向位移装置分开的装置，所述物体成像表面在所述显微镜透镜的物体空间中与所述检测表面共轭。
11.如权利要求10所述的显微镜方法，其中，将所述物体成像表面与所述横向照明表面重叠包括改变所述照明束的聚焦，从而允许将所述横向照明表面侧向地在所述物体成像表面上居中。
12.如权利要求10或11中的任一项所述的显微镜方法，其中，将所述物体成像表面与所述横向照明表面重叠包括对通过由所述照明表面照明的样品的区域发射的所述波前进行空间调制。
13.如权利要求10～12中的任一项所述的显微镜方法，其中，从所述照明束形成所述照明表面包括产生光笔和扫描所述光笔。
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