CN105671184B - 一种培养基中菌体浓度的测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种复合培养基中测定菌体浓度的改进方法。该方法包括发酵液保温、酶解、TCA萃取、吸光度测定、计算等步骤。本发明改进点主要体现在：该方法通过对发酵液的适当酶解处理，较好避免了从培养基中提取菌体核酸时固体成分中如黄豆粉、花生粉等物料中所含核酸或类似物的干扰，可以较为准确和充分的提取发酵液中菌体的核酸，从而更为真实地反映发酵液中菌体量，从而为更好为发酵生产提供参考和指导，表现出较好地实用价值和推广应用意义。

Description

一种培养基中菌体浓度的测定方法
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种测定复合培养基中菌体浓度的改进的方法。
背景技术
菌体浓度的测定是反映微生物生长代谢情况的一项重要指标，需要较为准确的数据才能较好控制各项生产流程。现有工业化微生物发酵过程中，由于经常使用含有大量固休成分的发酵培养基，如黄豆饼粉、花生饼粉等，而这些固体成分与菌体混在一起，使发酵液中菌体浓度的测定成为一个复杂而又困难的问题，长期以来一直悬而未决。
目前大多数抗生素工厂测定发酵液菌体浓度时，一般均是采用装量体积法（细胞堆积容积测量法，离心压缩细胞体积法，The Packed-Cell volume Method）。但实际使用过程中，这种方法受发酵液中固体原料成分的影响较大，而且在菌体生长稳定期使用该方法时，所测菌体浓度值的增加主要是一些脂类及次级代谢产物合成的结果，并不能真正代表菌体浓度的变化。因而装量体积法测得的数值是菌体浓度及固体培养基成分两个变量互相加合的结果，并不能反应真正的菌体浓度。并且，使用该方法测定的数据在整个发酵过程中无明显规律，也无法反映菌体真正的生长规律。
现有菌体浓度测定中，另外一种较为准确和常用的测定方法是测定培养基中菌体所含核酸的浓度，把核酸的量作为衡量菌体浓度的指标，而菌体中核酸的提取主要通过TCA萃取法获得。但实际使用过程中，该方法受培养基成分影响较大。例如，发酵培养基中如果含有不溶性成分如黄豆粉、花生粉等，其可能含有少量核酸或核酸类似物，而这些物质与菌体中的核酸一起被萃取入TCA中，从而给测定带来一定程度的干扰；尤其是当培养基中采用胚芽粉类物质作为营养成分时，其含有高含量的核酸，经常会对测量值造成严重的干扰。因而对该方法尚需进一步地改进，以获得更为准确的菌体浓度数据。
发明内容
本发明的目的在于提供一种改进型的测定发酵液中核酸浓度的TCA测定法，从而更为准确的反映菌体浓度数据。
本发明采取的技术方案详述如下。
一种培养基中菌体浓度的测定方法，具体包括以下步骤：
（1）取待测发酵液，将发酵液在45℃~50℃保温20~40min，优选50℃保温30min；所述发酵液保温结束后发酵液粘度下降，流动性较好；
然后在保温结束后的发酵液中加入纤维素酶和果胶酶，混合均匀以对发酵液进行酶解，期间可每隔5min以颠倒混匀；
所述发酵液例如可为金霉素发酵液，具体例如正常发酵0~120h的金霉素发酵液或者培养0~36h的金霉素种子液；
所述纤维素酶和果胶酶的总加入量为发酵液质量的2%~4%；其中纤维素酶（酶活力≥25万U/g）和果胶酶（酶活力≥10万U/g）的质量比为1:1.5~2.0，酶解时温度控制在35℃~50℃，酶解时间≥1h，但不宜超过5h，以避免酶解过长时间从而影响发酵液品质；
（2）将步骤（1）中酶解完成后的发酵液，0℃、3000×g 离心10min，弃上清，保留沉淀物；
（3）向步骤（2）的沉淀物中加入2℃~4℃的5% (V/V)的TCA （三氯乙酸）溶液，充分搅拌洗涤沉淀物，0℃、3000×g离心10分钟，弃上清；重复此步骤一次；
TCA溶液比例与样品溶液（即步骤（1）中所取待测发酵液）的体积比例为1：1~1.5；优选比例为1：1.5，但由于此时TCA用量偏大，因而可根据实际情况适量调整；
（4）向步骤（3）的沉淀中加5%(V/V) TCA，充分搅拌，然后在100℃的水浴中搅拌抽提10~15min，再然后置于冰水中冷却，0℃、3000×g离心10分钟，取上清，弃沉淀物；
（5）将步骤（4）上清液用5% (V/V)TCA适当稀释，OD260测定吸光度，根据以下公式计算核酸浓度：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
式中：OD260nm为TCA萃取液在260nm处所测得的吸光值；N为TCA萃取液稀释的倍数；0.022表示核酸浓度为1微克/毫升时的吸光值，此数值为一常数。
本发明的主要技术思路为：纤维素酶和果胶酶的添加，破坏了复合培养基中部分植物物料（黄豆粉、玉米粉、花生粉等）的细胞壁（生物酶对微生物细胞没有影响），从而使植物胞内的核酸释放到细胞外，而所释放出来的植物内容物通过后续的离心、去上清等步骤随着其他杂质被去除，从而避免培养基原料中的核酸及其类似物对测量结果所造成的干扰。
总体而言，本发明属于一种测定发酵液中核酸浓度的改进型的TCA法，其改进点主要体现在：该方法通过对发酵液的适当酶解处理，较好避免了从培养基中提取菌体核酸时固体成分中如黄豆粉、花生粉等物料中所含核酸或类似物的干扰，可以较为准确和充分的提取发酵液中菌体的核酸，从而更为真实地反映发酵液中菌体量，从而为更好为发酵生产提供参考和指导，表现出较好地实用价值和推广应用意义。
附图说明
图1为本发明与现有测定方法对某批次金霉素发酵液中不同发酵时间的核酸浓度的测定结果对比图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步解释说明。在介绍具体实施例前，对本发明中部分试验设备及物料情况简要介绍如下。
下述实施例中金霉素发酵液由驻马店华中正大有限公司提供，采用金色链霉菌制备而成，金霉素发酵液的制备流程大致如下所述：
（1）斜面菌丝制备，将沙土管保存的金色链霉菌孢子采用斜面培养方式，32℃±1℃培养3~5天制备母瓶斜面菌丝；
（2）种子液制备，将步骤（1）中母瓶内的斜面菌丝接种培养瓶，26℃~32℃、230 转/分摇瓶培养18~24h制备种子液；
（3）金霉素发酵液制备，将步骤（2）中种子液接种于发酵罐内，26℃~30℃、pH 5.4~6.5 条件下进行培养，即为金霉素发酵液；
发酵罐内金霉素发酵培养基的具体成分为（1L）：花生饼粉 20g、黄豆饼粉18g、玉米淀粉80g、酵母粉 7.0g、玉米浆12g、豆油 3g、淀粉酶0.1g、氯化钠 2.0g、硫酸铵6g、碳酸钙 7.0g、硫酸镁 0.2g、磷酸二氢钾 0.3g ，pH 自然。
实施例1
本实施例所提供的培养基中菌体浓度的测定方法，具体包括以下步骤：
（1）取发酵0h(即发酵罐内金霉素发酵培养基消毒后尚未接种前)的金霉素发酵液5mL，将发酵液在50℃保温30min；保温结束后发酵液粘度下降，流动性较好，3min内无大量沉淀现象。
需要解释的是，不同发酵时间的发酵液的粘度差异较大，未接种时粘度在1s以内，而正常发酵过程中的发酵液的粘度在1~15s左右，发酵液粘度采用毛细管粘度计进行检测。
然后加入纤维素酶和果胶酶，混合均匀以对发酵液进行酶解，期间可每隔5min以颠倒混匀；
纤维素酶和果胶酶的总加入量为发酵液质量的2.6%，其中纤维素酶（酶活力=25万U/g）和果胶酶（酶活力=10万U/g）用量分别为0.05、0.08g，酶解温度控制在40℃，酶解时间3h；
（2）将步骤（1）中酶解完成后发酵液，0℃、3000×g 离心10min，弃上清；
（3）向步骤（2）的沉淀物中加入4℃的5% （V/V）的TCA 溶液5mL，充分搅拌洗涤沉淀物，0℃、3000×g离心10分钟，弃上清；重复此步骤一次；
（4）向步骤（3）的沉淀中加5% TCA 5mL，充分搅拌，然后在100℃的水浴中搅拌抽提15min，再然后置于冰水中冷却，0℃、3000×g离心10分钟，取上清，弃沉淀物；
（5）将步骤（4）上清液用5% TCA适当稀释，OD260测定吸光度，根据以下公式计算核酸浓度：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
。
计算表明，此时金霉素发酵液中核酸浓度为0.17mg/mL。由于此时发酵液中尚未接种金霉素发酵菌株，因而可以认为培养基中的花生饼粉、黄豆饼粉等固体物料中含有微量核酸物质，从而容易对后续发酵过程中核酸浓度测定造成一定影响。
对比例
同样操作方法下，在省略保温和酶解操作前提下（即省略上述步骤（1）），对同一批次金霉素发酵培养基中核酸浓度进行测定，结果表明，核酸浓度为2.73 mg/mL。
从本实施例和对比例的检测结果可以看出，通过酶解处理后，可大幅度降低原有发酵液中核酸的影响，可为生产过程中真实的菌体浓度检测提供较好保障。
实施例2
与实施例1相同，对同一批次的金霉素发酵液中核酸浓度进行测定，仅调整步骤（1）中发酵液保温温度为45℃，保温时间30min。最后计算结果表明，菌丝体核酸浓度为0.29mg/mL。
实施例3
与实施例1相同，对同一批次的金霉素发酵液中核酸浓度进行测定，仅调整酶解时生物酶的比例，生物酶的具体用量为：纤维素酶0.07g、果胶酶0.13g，最后计算核酸浓度为0.06mg/mL。从此结果可以看出，此时发酵液中原有的核酸量对于后续测定几乎没有影响。
依据此操作方法，对金霉素发酵液不同发酵时间后发酵液中菌体浓度进行测定，同时按照现有（即对比例中操作方法）操作方法进行测定，相关测定结果如图1所示。从图1可以看出，本发明所提供的改进后的TCA测定法，可较好解决发酵培养前期菌株浓度测量不准确的弊端，更能反映菌体真实的生长规律，因而可以更好指导发酵生产。

Claims (2)

1.一种培养基中菌体浓度的测定方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：
（1）取待测发酵液，将发酵液在45℃~50℃下保温20~40min；然后加入纤维素酶和果胶酶，以对发酵液进行酶解；
所述纤维素酶和果胶酶的总加入量为发酵液质量的2%~4%；
以质量比计，纤维素酶︰果胶酶=1:1.5~2.0，其中纤维素酶酶活≥25万U/g，果胶酶酶活≥10万U/g；
酶解温度控制在35℃~50℃，酶解时间≥1h，但不超过5h；
所述发酵液为金霉素发酵液；
所述金霉素发酵液中，金霉素发酵培养基的具体成分为，每L中：花生饼粉 20g、黄豆饼粉18g、玉米淀粉80g、酵母粉 7.0g、玉米浆12g、豆油 3g、淀粉酶0.1g、氯化钠 2.0g、硫酸铵6g、碳酸钙7.0g、硫酸镁 0.2g、磷酸二氢钾 0.3g ，pH 自然；
（2）将步骤（1）中酶解完成后的发酵液离心，弃上清，保留沉淀物；
（3）向步骤（2）的沉淀物中加入2℃~4℃的5% 体积分数的TCA 溶液，洗涤沉淀物，离心，弃上清；重复此步骤一次；
TCA溶液与步骤（1）中所取待测发酵液的体积比例为1：1~1.5；
（4）向步骤（3）的沉淀中加5% 体积分数的TCA溶液，搅拌，然后在100℃的水浴中抽提10~15min，再置于冰水中冷却，离心，取上清液，弃沉淀物；
（5）将步骤（4）所得上清液用5% TCA溶液稀释，OD260测定吸光度，根据以下公式计算核酸浓度：
Figure 999807DEST_PATH_IMAGE001
；
式中：OD260为TCA萃取液在260nm处所测得的吸光值；N为TCA萃取液稀释的倍数。
2.如权利要求1中所述培养基中菌体浓度的测定方法，所述金霉素发酵液，具体为发酵0~120h的金霉素发酵液。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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US4969741A (en) * 1989-07-21 1990-11-13 Massachusetts Institute Of Technology Measurement of solid particle concentration in presence of a second particle type

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Title
复合培养基中菌体浓度的测定研究-总核酸测定法;李树瑞等;《华东化工学院学报》;19821231(第2期);第177页倒数第2段至第186页第1段 *

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